Summary
このプロトコルは、合成尿およびヒト血清における抗マラリアプリマキン(PMQ)検出のための新しい色分法について説明する。
Abstract
重要な抗マラリア薬であるプリマキン(PMQ)は、P.vivaxおよび楕円形によって引き起こされる生命を脅かす感染症の治療のために世界保健機関(WHO)によって推奨されている。しかし、PMQは、グルコース-6-リン酸脱水素酵素(G6PD)欠乏症患者の急性消読につながる望ましくない副作用を有する。投与量モニタリングを目的としたPMQ判定のための簡素で信頼性の高い方法を開発する必要がある。2019年初頭には、PMQ色分化のUV-Visと肉眼ベースのアプローチを報告しました。検出は、色付きのアゾ製品を生成することができるPMQとアニリンの間のグリースのような反応に基づいていました。合成尿中のPMQの直接測定のための検出限界は、ナノモルの範囲にある。さらに、この方法は、臨床的に関連する濃度でヒト血清サンプルからのPMQ定量に大きな可能性を示した。このプロトコルでは、着色アゾ製品の合成と特性に関する技術的な詳細、試薬の調製、およびPMQ決定の手順について説明します。
Introduction
PMQは、最も重要な抗マラリア薬の一つであり、再発を防ぐための組織シゾントシクシドとしてだけでなく、疾患の伝染を中断するゲームトサイトシトシドとしても機能する1、2、3、4。血管内出血は、G6PDの欠乏に非常に深刻になるPMQの副作用に関する一つである。G6PD遺伝性疾患は、マラリア流行地域で3〜30%の間の遺伝子頻度で世界中に分布していることが知られています。PMQ弱さの重症度は、G6PD欠乏の程度だけでなく、用量とPMQ暴露5、6の持続時間に依存する。リスクを下げるために、WHOはマラリア治療のためにPMQの単一の低用量(0.25 mg塩基/kg)を推奨しています。しかし、これは依然として患者薬物感受性5、7の変動によって挑戦される。用量モニタリングは、PMQ投与後の薬物動態を評価するために必要であり、これは限られた毒性を有する治療の成功のための投与量調整に影響を与える可能性がある。
高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)は、PMQ臨床決定のために最も広く使用されている技術です。Endohらは、C-18ポリマーゲルカラム8を用いた血清PMQ定量用UV検出器を用いたHPLCシステムを報告した。彼らのシステムでは、血清タンパク質は最初にアセトニトリルで沈殿し、次いで上清中のPMQをHPLCのために分離した。キャリブレーション曲線は0.01-1.0 μg/mL8の濃度範囲にわたって線形であった。254 nmでのUV検出を有する逆相HPLCに基づく別の方法は、PMQおよびその主要代謝産物9の定量のために報告されている。PMQのキャリブレーション曲線は0.025~100 μg/mLの範囲で直線的であった。有機相としてヘキサンと酢酸エチルを混合した追加の液体液抽出を使用し、PMQ分離に使用し、回収率は89%9に達した。さらに最近では、ミランダらが3μg/mL10で検出限界を持つ錠剤製剤におけるPMQ分析用の260nmでUV検出を用いてUPLC法を開発した。
HPLC法は薬剤決定において有望な感度を示し、HPLCが質量分析計を装備すれば感度はさらに向上するが、それでもいくつかの欠点がある。多くの生体分子が分析に大きな影響を与える可能性があるため、生体液中の直接薬物測定は通常HPLCではアクセスできません。HPLC分析11、12の前に内因性分子を除去するために追加の抽出が必要です。さらに、HPLC-UV検出器によるPMQ検出は、通常、その最大吸収波長(260nm)で行われる。しかし、260nm(アミノ酸、ビタミン、核酸、ウロクロム顔料など)で強い吸光度を持つ生体液には多くの内因性分子があり、PMQ UV検出を妨げています。合理的な感度と選択性を持つPMQ判定のためのシンプルで費用対効果の高い方法を開発する必要があります。
Griess反応は、亜硝酸塩検出13、14、15、16の色分け試験として1879年に最初に提示された。最近、この反応は、亜硝酸塩だけでなく、他の生物学的に関連する分子17、18、19、20を検出するために広範囲に探索されている。我々は以前にPMQとの予期しないグリース反応の最初の系統的研究を報告しました(図1)。このシステムでは、PMQは、酸性条件下で亜硝酸イオンの存在下で置換されたアニリンと組み合わせると着色アゾを形成することができる。さらに、アニリン21上の置換の電子寄付効果を高めると、アゾスの色が黄色から青色に変化することがわかった。PMQ定量のためのUV-vis吸収ベースの色彩測定法は、4-メトキシアニリンとPMQの間の最適化された反応を通じて開発されました。この方法は、生体関連流体におけるPMQの感受性および選択的検出に大きな可能性を示した。ここでは、この色彩戦略に基づいてPMQ判定の詳細な手順を説明することを目的とする。
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Protocol
1. 着色アゾスの合成
- 25 mLの丸底フラスコ(RBF)で、アニリン(0.1 mmol)とプリマキンビスリン酸(45.5mg、0.1 mmol)をH3PO4溶液の10mL(5%v/v)に溶解する。RBFを氷浴に入れ、適切なサイズの攪拌棒を溶液に加え、RBFを攪拌プレートに置きます。
注:アゾ3g(図2)の合成には、0.2 mmolのプリマキンビスホスフェートを使用します。 - 冷却水の1mLにNaNO 2(6.9mg、0.1 mmol)を溶解し、反応混合物を滴下します。氷浴を取り出し、反応混合物を室温で撹拌しておきます。
- シリカゲルコーティングされた薄層クロマトグラフィー(TLC)プレートで反応を監視します。TLCの溶出剤としてジクロロメタン(DCM)/メタノール(MeOH)混合物(vol/vol = 5:1)を使用します。アゾ製品は、肉眼で見分けやすいTLCプレートに着色された斑点を展示しています。PmQスポットがTLC上で消失した場合の反応を停止します。
- 反応混合物を氷浴でNaOH(2M)でpH>10に調整します。50mLの分離漏斗を使用して、それぞれに酢酸エチルの20 mLで混合物を3回抽出し、ロータリーエバポレーターを使用して真空下の有機相を組み合わせて濃縮する。
注:抽出する前に、反応溶液のpH値を10以上に調整する。これにより、一次アミンを非イオン化形態として維持することができ、したがって抽出を容易にすることができる。 - 溶出剤としてMeOH/H2 Oを用いて、逆相シリカゲルを通常の圧力下でフラッシュクロマトグラフィーで精製します。凍結乾燥を通じて製品溶液を乾燥し、所望のアゾ製品を提供します。
注:同じ反応は、希釈されたHCl溶液(0.2M)においても行うことができる。
2. UV-Vis測定と理論計算
- 蒸留水または5%H3 PO4溶液(pH 1.1)に純粋なアゾ(50μM)をそれぞれ溶解します。室温(25°C)の分光光度計でUV-vis吸収スペクトル(250~700nm)を記録します。さらなる分析のために、データを.xls/.xlsxファイルとしてエクスポートします。
-
ガウス16プログラムを使用して、PMQ自体とアゾ製品のすべての理論計算を実行します。6-31G基準を設定した時間依存密度関数理論(TD-DFT)を使用します。水を用いた偏極連続モデル(PCM)ホルディズムによる溶媒効果を含む。
- ソフトウェア (Chemdraw Office など) を使用して構造を描画し、構造をガウス入力ファイル (.gif) として保存します。
- ガウスビューでGIFファイルを開き、[計算]ボタンをクリックします。ガウス計算設定、オプト+フリーク、およびグランドステート-DFT-B3LYP-6-31G を選択します。次に、[送信]をクリックします。ジオメトリの最適化では、.log ファイルが生成されます。
- 上記の手順に従って、ガウス ビューを使用してこのログ ファイルを開きます。[計算ガウス計算設定]をクリックし、エネルギーとTD-SCF-DFT-B3LYP-6-31G-シングルトのみを選択します。次に、 を送信します。エネルギー計算では、別のログ ファイルとキューブ ファイルが生成されます。
- ガウス ビューを使用して、エネルギー計算からログ ファイルを開きます。[結果-UV/Vis]をクリックすると、予測吸収が表示されます。
- ガウス ビューを使用して、キューブ ファイルを開きます。[結果]をクリックし、サーフェスと輪郭サーフェスアクションと新しいサーフェスを選択して、軌道を表示します。
-
実験測定とガウス計算の両方の結果を比較します。次の式に従って、計算値と測定値の間の誤差のパーセントを計算します。
エラー = |(W最大cal.-W最大エクスパー)/W最大エクスパー。|× 100%
ここで、Wmax cal. は理論計算と W最大エクスパーからの最大吸光度波長を表します。は実験結果からの波長を表します。
3. PMQ判定
- 96ウェルプレートを用したPMQ測定(図5)
- 200 mMアニリン溶液R1のために0.2 M HClで4-メトキシアニリンを溶解します。蒸留水中に亜硝酸ナトリウムを溶解し、5mM溶液R2を得た。使用前に冷蔵庫にすべての溶液を4°Cに保管してください。
- 96ウェルプレートにR1の100 μLを加え、50μLのPMQ含有サンプルをプレートに加えてR1と混合します。次に、プレートにR2の50 μLを追加します。繰り返しピペッティングで溶液を混ぜます。
- プレートを室温で15分間保持し、UV-vis吸光度を504nmで記録します。各テストに対して 3 倍を繰り返します。 アゾ製品は、部屋の光の露出で安定しています。それは暗い下でプレートを維持する必要はありません。
- さらなる分析のために、データを.xls/.xlsxファイルとしてエクスポートします。
- 尿サンプル中の直接PMQ測定のための校正曲線
- PMQ濃度の合成尿を用いたPMQ溶液をそれぞれ0、1、2、5、10、50、100、200μMで調製する。
- 96ウェルプレートにR1の100 μLを加え、50 μLのPMQ尿溶液を加えてR1と混合します。次に、上記混合物にR2の50μLを添加する。繰り返しピペッティングで溶液を混ぜます。プレートを室温で15分間保持し、UV-vis吸光度を504nmで記録します。
- 吸光度I504およびPMQ濃度に基づいてキャリブレーション曲線を生成する。PMQ のないウェルの値をブランクとして使用し、データ処理の前にすべてのテストからブランク値を減算します。
- Y = aX+bとして線形方程式を生成するために線形適合を実行し、Y は 504 nm の吸光度、Xは PMQ の濃度、aは勾配、bは線形線の y 切片です。
- ヒト血清サンプル中の直接PMQ測定用校正曲線
- PMQ濃度のヒト血清を用いてPMQ溶液をそれぞれ0、1、2、5、10、200、200、μMで調剤する。
- 96ウェルプレートに100μLのR1を加え、50μLのPMQ血清溶液を加えてR1と混合します。上記の混合物にR2の50 μLを追加し、繰り返しピペッティングによって溶液を混合します。プレートを室温で15分間保持し、UV-vis吸光度を504nmで記録します。さらに分析するために、データを .xls/.xlsx ファイルとしてエクスポートします。
- 吸光度I504およびPMQ濃度に基づいてキャリブレーション曲線を生成する。PMQ のないウェルの値をブランクとして使用し、データ処理の前にすべてのテストからブランク値を減算します。
- Y = aX+bとして線形方程式を生成するために線形適合を実行し、Y は 504 nm の吸光度、Xは PMQ の濃度、aは勾配、bは線形線の y 切片です。
- 血清からのPMQ抽出
- 一定量のPMQをヒト血清に加えて、PMQ含有血清をシミュレートします。PMQ抽出の場合、15mL遠心管にPMQ含有血清の2mLに酢酸エチル/ヘキサン(7:1 v/v)の混合物6mLを加えます。
- 抽出システムに水酸化ナトリウム(2M)溶液を100μL添加します。30 s.の渦ミキサーを使用してチューブを激しく振る有機層を収集し、真空下のロータリーエバポレータを使用して濃縮します。
- 蒸留水の200 μLで残渣を再溶解し、220nmの細孔サイズの円盤状の膜を通して濾過することにより不溶性脂質成分を除去します。テストの最終ソリューションを使用します。
- 抽出で血清からPMQを決定する
- ステップ 3.2 または 3.3 に従って、蒸留水中の PMQ のキャリブレーション カーブを生成します。ステップ3.4に従ってPMQ含有血清からPMQを抽出する。
- 96ウェルプレートに100μLのR1と50 μLのPMQ溶液を加えます。上記の混合物にR2の50 μLを追加し、繰り返しピペッティングによって溶液を混合します。
- プレートを室温で15分間保持し、UV-vis吸光度を504nmで記録します。コントロールとしてPMQなしで、R1とR2と井戸を使用してください。さらなる分析のために、データを.xls/.xlsxファイルとしてエクスポートします。
- 各検定の吸光度値I504から制御値を減算し、その結果をキャリブレーション曲線のライナー方程式に従って濃度計算に使用します。
注:すべての場合におけるPMQの検出限界(LOD)は、標準的な方法22に従って計算することができる。計算はキャリブレーション関数に基づいていました: LOD = 3.3 × SD/b,SDはブランクの標準偏差であり、bは回帰線の傾きです
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Representative Results
反応条件を最適化するために(図2)、様々なアニリンを用いた様々なアニリンをGriess反応を介してPMQと組み合わせて使用した。色の異なるアゾスシリーズを実現しました。電子寄付置換を伴うアニリンは、UV-vis吸収スペクトルに赤シフトを引き起こす可能性があることがわかった。理論計算は、時間依存密度関数理論(TD-DFT)を介して行った。図2Aに示すように、計算結果は平均誤差3.1%の光学測定値と良好に一致した。4-メトキシアニリンは、次いで反応速度、製品溶解度、および安定性21における良好な性能に起因するPMQ検出反応を行うために使用された。また、4-メトキシアニリンのアゾ製品は赤色で、肉眼で区別しやすい色です。したがって、この反応は肉眼PMQ検出の可能性を提供する(図3)。
図4Aは、アゾ産物3dのUV-vis吸収スペクトルに対するpH効果を示す。pHを1.0から6.0に増やすと、I504は変わりません。pH7.0の下でI504はわずかな減少を示すが、基本pH(8.0および9.0)は吸収に大きく影響する。図4Bは、グリース反応に対するPMQ溶液のpH効果を示す。様々なpHs(4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)を含むPBSバッファのPMQ(50 μM)を、セクション3.1に記載の通り、試験試薬と個別に混合した。I504は、次いで室温で15分後に測定した。示されているように、PMQ溶液の基本的なpHs(8.0,9.0)は反応に影響を与える可能性があります。図5は、PMQ検出のためのグリース反応を実行するための一般的な手順を示す。プロトコルセクションで説明するように、分析のために吸収データI504を得るために4つのステップが必要である。図6Aおよび図6Bは、サンプル前処理を行わずに、尿および血清試料からのPMQをそれぞれ直接検出するための較正曲線を示す。合成尿中のPMQが0~200 μMの範囲である場合、優れた線形関係(R2 = 0.998)が見つかりました。血清試料の用語では、10~200μMの濃度で線形関係が見出された。
図7Aは、血清からPMQを抽出する手順を示す。残渣を抽出および濃縮後に蒸留水に再溶解し、濾過した。実際のPMQ含有血清をシミュレートするために、PMQは0,0.2,0.5,1.0,2.0 μMで最終濃度でヒト血清に添加した。ステップ3.4および3.5を用いて、血清中のPMQ濃度はそれぞれ0.02、0.14、0.44、0.90および1.78 μMであることが判明した(図7C)。その結果、PMQ回収率は、PMQが血清中で0.5μMを超えると約90%であることが判明し、これは以前の報告9と同等であった。
図1:PMQに対するグリース反応の概略図(A)亜硝酸塩分析のための古典的なグリース反応。(B)提案されたPMQ検出方法におけるグリース反応。この図は、前の作業21の許可を受けて変更されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:合成アゾスの光物理的特性(A)異なるアニリンから発生したアゾスの最大吸収量のUV-vis測定と理論計算。ブラケットの外側の数字は、中性pH条件付近の蒸留H2Oにおける最大吸光度測定を表します。角かっこ内の数値は、5% H3PO4溶液(pH ≥ 1.1)での測定値を参照します。λabs/nm エクスパー。実験データを表し、λabs/calc.は理論計算データを表します。Eexcは励起エネルギー(eV)であり、fは発振器の強度である。(B)PMQとアゾ産物の写真画像は、異なる置換基を持ち、5%リン酸溶液中で50μMである。(C)合成製品のUV-visスペクトル。値は 0 ~ 1 の範囲に正規化されました。この図は、前の作業21の許可を受けて変更されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:PMQの色分法決定(A)吸光度変化を最大I504で監視する時間依存の方法。反応は4-メトキシアニリンを用いて行い、PMQは100μMで使用した。(B)PMQの異なる濃度を有する反応の色変化:4-メトキシアニリン溶液の400 μL(0.2M HClで200mM)、水中の亜硝酸ナトリウム200μL(5mM)、異なる濃度のPMQ溶液200μL(0、1、2、5)、10、20、50、100 μM)。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:PMQ検出に対するpH効果(A)アゾ産物3d(50μM)のUV-vis吸光度に対するpH効果; (B)異なるpHsを持つPBSバッファー内のPMQ(50 μM)(4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)を用いて、ステップ3.1に記載の反応を行った。15分後、504nmでの吸光度を測定した。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:96ウェルプレートベースのシステム上のグリース反応を介したPMQ判定。R1は0.2 M HClにおける200mM 4-メトキシアニリン溶液を指す。R2は、蒸留水中の5mM亜硝酸ナトリウムをいう。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:(A)合成尿および(B)ヒト血清試料サンプルからのPMQ決定のための較正曲線。PMQの濃度は0~200 μMの範囲です。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図7:血清試料からのPMQ判定.(A)定量分析用血清試料からのPMQ抽出の概略図。(B)0 ~ 100 μM の範囲内のI504と PMQ 濃度の間に見られる線形関係。(C)血清中のPMQを、血清に添加した正確な量と比較してGries反応ベース法により定量した。この図は、前の作業21の許可を受けて変更されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
表 1.ログDの理論計算とPMQとCPMQの水分布の割合。
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Discussion
便利なPMQ定量のための色彩法について述べた。これは、潜在的に最もシンプルで費用対効果の高い現在の方法です。さらに重要なことに、この方法は、任意の機器を使用せずに肉眼ベースのPMQ測定を可能にします。
PMQ検出用に最適化されたGriess反応は、504 nmで最大吸収性の赤色アゾを生成することができます。内因性生体分子のUV-vis吸収による潜在的な影響は限られており、生体流体中のPMQの直接測定に有望な方法となる。その結果、0-200 μM(図6A)の濃度範囲にわたって尿PMQ検出に対して優れた線形関係(R2= 0.998)が見出された。PMQの検出限界(LOD)は0.63 μMであることが判明した。この方法はまた、ヒト血清におけるPMQの直接測定のための大きな可能性を示した。血清PMQ検出のための10から200 μMの範囲の濃度で優れた線形関係が見出された(図6B)。抽出と濃度を通じて血清試料を前処理することにより、さらに感度を向上させることができる。図7が簡単な抽出プロセスで示すように、この方法は臨床的に関連する範囲で血清PMQを定量することができる。反応機構に基づいて、PMQ(CPMQ)の主なカルボキシル代謝産物は、潜在的に同様のUV-Vis特性を有するアゾ産物を形成することができる。しかし、基本的なpH条件下での液体-液体抽出は、CPMQからの干渉を最小限に抑えることができる可能性があります。表 1 は、計算されたログ D と PMQ と CPMQ の両方の水分布を示しています。図に示すように、pH >10 では、PMQ の 6.33% 未満が水相に見られるのに対し、CPMQ の 98.54% 以上が水相になります。したがって、理論的には、PMQの93.7%以上、CPMQの1.56%未満を試験用に抽出することができました。主代謝産物CPMQからの干渉は限られていると結論付けることができる。
PMQ検出の手順は非常に扱いやすいです。96ウェルプレートベースのシステムを例にとると、全体の手順は4つのステップで構成されています:1)4-メトキシアニリン溶液の100 μL(0.2 M HClで200 mM)R1を96ウェルプレートに加えます。2)R1と混合するPMQ濃度不明サンプルの50 μLを追加します。3)室温で反応を行うためにR2(5 mM亜硝酸ナトリウム溶液)の50 μLを添加する。4)分光計を用いて504nmでUV-vis吸収を記録する。未知の試料からのPMQ濃度は、吸収強度I504と較正曲線からの線形方程式に基づいて計算することができる。全体のプロシージャはインキュベーションの必要性なしで室温で行われる。着色された製品は室内光に敏感ではないため、暗い環境は、全体の手順のために必要ではありません。
なお、反応溶液が飽和I504に到達するまでの時間は温度依存性である。図3に示すように、室温(25°C)で少なくとも12分が必要であった。反応時間は25°C以下の温度で反応を行う場合に長くなります。PMQ溶液の基本的なpH条件は、吸光度I504に影響を与える可能性がある。この問題に対処するには、PMQ ソリューションの pH を 7.0 未満に調整します。それ以外の場合は、7.0 を超える pH を持つソリューションには新しいキャリブレーション曲線が必要です。さらに、試験されたサンプルの組み込み亜硝酸塩は検出に影響を与える可能性があります。しかし、これは、標準試験で高濃度の亜硝酸塩(5mM)を使用した場合にのみ、固有の亜硝酸塩の濃度が非常に高い場合にのみ発生する可能性があります。
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Disclosures
著者は宣言するものが何もありません。
Acknowledgments
著者らは、広州中国医学大学のスタートアップ助成金とGZUCMの青少年科学研究研修プロジェクト(2019QNPY06)を認めている。また、広州中国医学大学の寧南医学研究センターが施設の支援を行っていることも認めます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-Methoxyaniline | Aladdin | K1709027 | |
| 2,4-Dimethoxyaniline | Heowns | 10154207 | |
| 3,4-Dimethoxyaniline | Bidepharm | BD21914 | |
| 4-Methylaniline | Adamas-beta | P1414526 | |
| 4-Nitroaniline | Macklin | C10191447 | |
| 96-wells,Flat Botton | Labserv | 310109008 | |
| Gaussian@16 software | Gaussian, Inc | Version:x86-64 SSE4_2-enabled/Linux | |
| Hydrochloric acid | GCRF | 20180902 | |
| Marvin sketch (software) | CHEMAXON | free edition: 15.6.29 | |
| Phosphoric acid | Macklin | C10112815 | |
| Primaquine bisiphosphate | 3A Chemicals | CEBK200054 | |
| Sodium nitrite | Alfa Aesar | 5006K18R | |
| Sulfonamides | TCI(shanghai) | GCPLO-BP | |
| Varioskan LUX Plate reader | Thermo Fisher | Supplied with SkanIt Software 4.1 |
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