Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Optimeret Griess reaktion for UV-Vis og nøgen-øje bestemmelse af anti-malaria Primaquine

doi: 10.3791/60136 Published: October 11, 2019
* These authors contributed equally

Summary

Denne protokol beskriver en ny kolorimetrisk metode til malaria primaquin (pmq) detektion i syntetiske uriner og humane sera.

Abstract

Primaquine (PMQ), en vigtig anti-malaria stof, er blevet anbefalet af Verdenssundhedsorganisationen (WHO) til behandling af livstruende infektioner forårsaget af P. vivax og ovale. PMQ har imidlertid uønskede bivirkninger, der fører til akut hæmolyse hos patienter med glucose-6-fosfat dehydrogenase (G6PD-)-mangel. Der er behov for at udvikle enkle og pålidelige metoder til PMQ-bestemmelse med henblik på doserings overvågning. I begyndelsen af 2019, vi har rapporteret en UV-Vis og nøgen-øje baseret tilgang til pmq kolorimetriske kvantificering. Påvisning var baseret på en Griess-lignende reaktion mellem PMQ og aniliner, som kan generere farvede AZO produkter. Detektionsgrænsen for direkte måling af pmq i syntetisk urin er i nanomolær området. Desuden har denne metode vist et stort potentiale for PMQ-kvantificering fra humane serumprøver ved klinisk relevante koncentrationer. I denne protokol vil vi beskrive de tekniske detaljer vedrørende synteser og karakterisering af farvede AZO-produkter, reagens præparatet og procedurerne for PMQ-bestemmelse.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Pmq er en af de vigtigste malaria medicin, det virker ikke kun som en vævs schizontocide at forhindre tilbagefald, men også som en gametocytocide at afbryde sygdoms transmission1,2,3,4. Intravaskulær hæmolyse er en af de om bivirkninger af PMQ, som bliver meget alvorlig i dem mangelfuld i G6PD-. Det er kendt, at den G6PD-genetiske lidelse er fordelt over hele verden med en genfrekvens mellem 3-30% i malaria endemiske områder. Sværhedsgraden af pmq svaghed afhænger af graden af G6PD-mangel samt dosis og varigheden af pmq eksponering5,6. For at sænke risikoen, WHO har anbefalet en enkelt lav dosis (0,25 mg base/kg) af PMQ til malariabehandling. Men, dette er stadig udfordret af variationerne i patientens stof følsomhed5,7. Dosisovervågning er nødvendig for at vurdere farmakokinetikken efter PMQ administration, som kan påvirke dosisjustering for en vellykket behandling med begrænset toksicitet.

Højtydende væskekromatografi (HPLC) er den mest udbredte teknik til PMQ-klinisk bestemmelse. Endoh et al. rapporterede et HPLC-system med en UV-detektor for serum PMQ-kvantificering ved hjælp af en C-18 polymer gel kolonne8. I deres system blev serumproteiner først fældet med acetonitril, og derefter blev PMQ i supernatanten udskilt for HPLC. Kalibreringskurven var lineær over koncentrationsintervallet fra 0,01-1,0 μg/mL8. En anden metode baseret på en reverse-fase HPLC med UV-detektion ved 254 nm er blevet rapporteret for kvantificering af PMQ og dets vigtigste metabolitter9. Kalibreringskurven for PMQ var lineær i intervallet mellem 0,025-100 μg/mL. En yderligere væske-væskeekstraktion med blandet hexan og ethylacetat som organisk fase blev anvendt til PMQ-separation med en procentvis bedring nået til 89%9. For nylig udviklede Miranda et al. en UPLC-metode med UV-detektion ved 260 nm for PMQ-analyse i tabletformuleringer med en detektionsgrænse på 3 μg/mL10.

Selvom HPLC metoder udviser lovende følsomhed i narkotika bestemmelse og følsomheden kan forbedres yderligere, hvis HPLC er udstyret med et massespektrometer, der er stadig nogle ulemper. Direkte lægemiddel målinger i biologiske væsker er sædvanligvis utilgængelige for HPLC, da mange biomolekyler i høj grad kan påvirke analysen. Yderligere ekstraktioner er nødvendige for at fjerne endogene molekyler før HPLC-analyse11,12. Desuden udføres PMQ-detektion ved en HPLC-UV-detektor typisk ved dens maksimale absorptions bølgelængde (260 nm). der er dog mange endogene molekyler i biologiske væsker med en stærk absorbans ved 260 nm (f. eks. aminosyrer, vitaminer, nukleinsyrer og urochrompigmenter), hvilket forstyrrer PMQ UV-detektion. Der er behov for at udvikle enkle og omkostningseffektive metoder til PMQ-bestemmelse med rimelig følsomhed og selektivitet.

Den griess reaktion blev først præsenteret i 1879 som en kolorimetrisk test for nitrit detektion13,14,15,16. For nylig er denne reaktion blevet grundigt udforsket for at detektere ikke kun nitrit, men også andre biologisk relevante molekyler17,18,19,20. Vi har tidligere rapporteret den første systematiske undersøgelse af en uventet Griess reaktion med PMQ (figur 1). I dette system, PMQ er i stand til at danne farvede Azos, når kombineret med substituerede aniliner i nærværelse af nitrit ioner under sure betingelser. Vi har yderligere konstateret, at farven på Azos varierede fra gul til blå, når du øger elektron donere effekt af substituent på anilines21. En UV-Vis absorption baseret kolorimetrisk metode til PMQ kvantificering er blevet udviklet gennem den optimerede reaktion mellem 4-methoxyanilin og PMQ. Denne metode har vist et stort potentiale for følsom og selektiv påvisning af PMQ i Bio-relevante væsker. Her sigter vi mod at beskrive de detaljerede procedurer for PMQ-bestemmelse baseret på denne kolorimetriske strategi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. syntese af farvede Azos

  1. I en 25 mL rund bund kolbe (RBF) opløses anilin (0,1 mmol) og primaquinbisphosphat (45,5 mg, 0,1 mmol) til 10 mL H3po4 opløsning (5% v/v). Put RBF på et isbad, tilsæt en Stir bar med den rigtige størrelse i opløsningen, og sætte RBF på en røre plade.
    Bemærk: Til syntese af AZO 3g (figur 2), brug 0,2 mmol af primaquin bisphosphat.
  2. NaNO2 (6,9 mg, 0,1 mmol) opløses i 1 ml afkølet vand og tilsættes derefter dropwise i reaktionsblandingen. Fjern isbadet, og hold reaktionsblandingen omrørt ved stuetemperatur.
  3. Overvåg reaktionen med en silicagel belagt tyndtlagkromatografi (TLC) plade. Brug en dichlormethan (DCM)/methanol (MeOH) blanding (Vol/Vol = 5:1) som elueringsvæske for TLC. AZO-produktet udstiller farvede pletter på TLC-pladen, som er let at skelne med nøgne øjne. Stop reaktionen, når PMQ pletter forsvinder på TLC.
  4. Reaktionsblandingen justeres til pH > 10 ved NaOH (2 M) på et isbad. Brug en 50 mL separations tragt til at udtrække blandingen 3 gange med 20 mL ethylacetat for hver, Kombiner og koncentrer den organiske fase under vakuum ved hjælp af en rotationsfordamper.
    Bemærk: Før ekstraktion justeres pH-værdien af reaktions opløsninger over 10. Dette kan opretholde den primære Amin som sin ikke-ioniseret form, hvilket letter ekstraktion.
  5. Rester ved Flash kromatografi med reversefaset silica gel under normalt tryk ved hjælp af MeOH/H2O som eluent. Tør produkt opløsningen gennem lyofilisering for at give de ønskede AZO-produkter.
    Bemærk: Den samme reaktion kan også udføres i fortyndede HCl opløsninger (0,2 M).

2. UV-Vis-målinger og teoretisk beregning

  1. Pure AZO (50 μM) opløses i destilleret vand eller i 5% H3po4 opløsning (pH 1,1). Optag UV-Vis absorptionsspektre (250-700 nm) på et spektrofotometer ved stuetemperatur (25 °C). Eksporter dataene som. xls/. xlsx-filer til yderligere analyse.
  2. Udfør alle teoretiske beregninger for PMQ selv og AZO-produkter ved hjælp af Gaussian 16-programmet. Brug time afhængige tæthed funktionel teori (TD-DFT) med en 6-31G basis sæt. Medtag opløsningsmiddel effekter ved polariserbar kontinuum model (PCM) formalisme ved hjælp af vand.
    1. Brug software (f. eks. Chemdraw Office) til at tegne strukturerne og derefter gemme strukturen som en Gaussian input-fil (. gif).
    2. Åbn GIF-filen med Gauss-visning, og klik på knappen Beregn. Vælg Gaussian beregning setup, opt + freq, og Ground State-DFT-B3LYP-6-31g; Klik derefter på Send. Geometri optimeringen vil generere en. log-fil.
    3. Brug Gauss View til at åbne denne logfil ved at følge ovenstående fremgangsmåde. Klik på Beregn-Gaussian beregning opsætning og vælg energi og TD-SCF-DFT-B3LYP-6-31g-singlet kun. Derefter indsende. Energi beregningen vil generere en anden logfil og en kubefil.
    4. Brug Gauss-visning til at åbne logfilen fra energi beregningen. Klik på resultater-UV/Vis for at se den forventede absorption.
    5. Brug Gauss-visning til at åbne kubefilen. Klik på resultats, og vælg overflade og konturer-Surface-handlinger og ny Surface for at se orbits.
  3. Sammenlign resultaterne fra både eksperimentel måling og Gaussian beregning. Beregn procent fejl mellem de beregnede og målte værdier i henhold til følgende ligning.
                  Fejl = | (WMax Cal.-wMaxExper.) /WMaxExper. | × 100%
    hvor WMax Cal. repræsenterer den maksimale absorbans bølgelængde fra teoretisk beregning og wMax Exper. repræsenterer bølgelængden fra eksperimentelt resultat.

3. PMQ-bestemmelse

  1. Pmq-måling ved hjælp af en 96-brønd plade (figur 5)
    1. 4-methoxyanilin opløses i 0,2 M HCl for en 200 mM anilin opløsning, R1. Natriumnitrit opløses i destilleret vand for at opnå en 5 mM opløsning, R2. Opbevar alle opløsninger i køleskab ved 4 °C før brug.
    2. Tilsæt 100 μL R1 til en 96-brønd plade, og tilsæt 50 μL PMQ-prøve i pladen for at blande med R1. Tilsæt derefter 50 μL R2 i pladen. Bland løsningerne ved gentagen pipettering.
    3. Opbevar pladen ved stuetemperatur i 15 minutter, og optag derefter UV-Vis absorbans ved 504 nm. Gentag 3x for hver test.  AZO-produktet er stabilt med udsættelse for rum-lys; Det er ikke nødvendigt at holde pladen under mørke.
    4. Eksporter dataene som. xls/. xlsx-filer til yderligere analyse.
  2. Kalibreringskurve til direkte PMQ-måling i en urinprøve
    1. PMQ-opløsninger forberedes ved hjælp af syntetisk urin med PMQ-koncentrationer ved henholdsvis 0, 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200 μM.
    2. Tilsæt 100 μL R1 til en 96-brønd plade, og tilsæt 50 μL PMQ-urin opløsning for at blande med R1. Tilsæt derefter 50 μL R2 til ovenstående blanding. Bland løsningerne ved gentagen pipettering. Opbevar pladen ved stuetemperatur i 15 minutter, og optag derefter UV-Vis absorbans ved 504 nm.
    3. Der genereres en kalibreringskurve baseret på absorbans i504 og pmq-koncentrationerne. Brug værdierne fra brøndene uden PMQ som en tom, og fratræk de tomme værdier fra alle tests før databehandling.
    4. Udfør en lineær pasform for at generere de lineære ligninger som y = ax + b, hvor y er absorbansintensiteten ved 504 nm, X er koncentrationen af pmq, a er hældningen, og b er y-skæringspunktet for den lineære linje.
  3. Kalibreringskurve til direkte PMQ-måling i en human serum prøve
    1. PMQ-opløsninger forberedes ved hjælp af humant serum med PMQ-koncentrationer ved henholdsvis 0, 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200, μM.
    2. Tilsæt 100 μL R1 til en 96-brønd plade, og tilsæt 50 μL PMQ serum opløsning for at blande med R1. Tilsæt 50 μL R2 til ovenstående blanding og bland løsningerne ved gentagen pipettering. Opbevar pladen ved stuetemperatur i 15 minutter, og optag derefter UV-Vis-absorbans ved 504 nm. Eksporter dataene som. xls/. xlsx-fil til yderligere analyse.
    3. Der genereres en kalibreringskurve baseret på absorbans i504 og pmq-koncentrationerne. Brug værdierne fra brøndene uden PMQ som en tom, og fratræk de tomme værdier fra alle tests før databehandling.
    4. Udfør en lineær pasform for at generere de lineære ligninger som y = ax + b, hvor y er absorbansintensiteten ved 504 nm, X er koncentrationen af pmq, a er hældningen, og b er y-skæringspunktet for den lineære linje.
  4. PMQ-ekstraktion fra serum
    1. Tilføj en vis mængde PMQ i humant serum for at simulere PMQ-holdige serum. Ved PMQ-ekstraktion tilsættes 6 mL blanding af ethylacetat/hexan (7:1 v/v) i 2 mL PMQ-indeholdende serum i et 15 mL centrifugeglas.
    2. Tilsæt 100 μL natriumhydroxid (2 M) opløsning til ekstraktions systemet. Ryst røret med en vortex mixer i 30 s. Saml det organiske lag og koncentrer det ved hjælp af en rotationsfordamper under vakuum.
    3. Remanensen opløses med 200 μL destilleret vand og fjernes uopløselige lipid-komponenter ved filtrering gennem en disk formet membran med 220 nm porestørrelse. Brug den endelige løsning til test.
  5. Bestem PMQ fra serum med ekstraktion
    1. Følg trin 3,2 eller 3,3 for at generere kalibreringskurven for PMQ i destilleret vand. Uddrag PMQ fra PMQ-holdige sera i henhold til trin 3,4.
    2. Der tilsættes 100 μL R1 og 50 μL PMQ-opløsning til en 96-brønd plade. Tilsæt 50 μL R2 til ovenstående blanding, og bland løsningerne ved gentagen pipettering.
    3. Opbevar pladen ved stuetemperatur i 15 minutter og Optag UV-Vis absorbans ved 504 nm. Brug brøndene med R1 og R2, men uden PMQ som kontrol. Eksporter dataene som. xls/. xlsx-filer til yderligere analyse.
    4. Trækkontrol værdierne fra absorbansværdierne I504 for hver test, og brug derefter resultatet for koncentrations beregninger i henhold til liner ligningen fra kalibreringskurven.
      Bemærk: Detektionsgrænsen (LOD) for PMQ kan i alle tilfælde beregnes efter en standardmetode22. Beregningen var baseret på kalibreringsfunktionen: LOD = 3,3 × SD/b, hvor SD er standardafvigelsen for blank og b er hældningen af regressionslinjen

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

For at optimere reaktions forholdene (figur 2) blev forskellige anilin brugt til at parret med pmq gennem den griess reaktion. Vi har opnået en række Azos med forskellige farver. Det er blevet konstateret, at aniliner med en elektron donere substituent kan forårsage et rødt skift i UV-Vis absorption spektrum. Teoretiske beregninger blev udført ved hjælp af time afhængig tæthed funktionel teori (TD-DFT). Som det fremgår af figur 2a, var beregningsresultatet i god enighed med optiske målinger med en gennemsnitlig fejl på 3,1%. 4-methoxyanilin blev derefter brugt til at gennemføre PMQ afsløring reaktion på grund af sin gode resultater i reaktionshastigheden, produktets opløselighed, og stabilitet21. Desuden er AZO-produktet fra 4-methoxyanilin rødt i farve, hvilket er let at skelne med nøgne øjne. Derfor, denne reaktion giver mulighed for blotte øje PMQ detektion (figur 3).

Figur 4a viser pH-effekten på UV-Vis-absorptions spektret i AZO-produktet 3D. I504 ændres ikke, når pH-værdien øges fra 1,0 til 6,0. I504 under pH 7,0 udviser en lille nedgang, mens en grundlæggende pH (8,0 og 9,0) i høj grad påvirker absorptionen. Figur 4b viser pH-effekten af pmq-opløsninger på griess-reaktionen. PMQ (50 μM) i PBS-buffer med forskellige pHs (4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0) blev individuelt blandet med test reagenset som beskrevet i afsnit 3,1. I504 blev derefter målt efter 15 minutter ved stuetemperatur. Som angivet har grundlæggende pHs (8,0, 9,0) af PMQ-opløsninger potentielt indflydelse på reaktionen. Figur 5 viser den generelle procedure til at udføre den griess reaktion for pmq detektion. Som beskrevet i afsnittet protokol, kræves der fire trin for at få absorptions dataene i504 til analyse. Figur 6a og 6b viser kalibreringskurverne for direkte detektion af pmq fra henholdsvis urin-og serumprøver uden prøve forbehandling. Et fremragende lineært forhold (R2 = 0,998) blev fundet, når pmq i syntetisk urin spænder fra 0 til 200 μM. I løbet af serumprøven blev der fundet et lineært forhold ved koncentrationen fra 10 til 200 μM.

Figur 7a viser proceduren for at udtrække pmq fra serum. Resterne blev opløst i destilleret vand efter ekstraktion og koncentration og derefter filtreret. For at simulere et ægte PMQ-holdige serum blev PMQ føjet til humant serum med endelige koncentrationer ved 0, 0,2, 0,5, 1,0, 2,0 μM. Ved hjælp af trin 3,4 og 3,5 fandtes koncentrationerne af PMQ i Serummer at være henholdsvis 0,02, 0,14, 0,44, 0,90 og 1,78 μM (figur 7c). Baseret på resultatet blev procentdelen af PMQ-genoprettelse fundet at være omkring 90%, når PMQ var over 0,5 μM i serum, hvilket var sammenligneligt med tidligere rapporter9.

Figure 1
Figur 1: skematisk af den griess reaktion på pmq. (a) en klassisk griess reaktion for nitrit analyse. B) den griess reaktion i den foreslåede pmq-detekterings metode. Dette tal er blevet ændret med tilladelse fra tidligere arbejde21. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: photophysical egenskaber af syntetiske Azos. A) UV-Vis-måling og teoretisk beregning af den maksimale absorption af Azos genereret fra forskellige aniliner. Numrene uden for parenteserne repræsenterer den maksimale absorbans måling i destilleret H2O nær neutrale pH-forhold. tallene i parenteserne refererer til målingen i 5% H3po4 opløsning (pH ≈ 1,1). λABS/nm Exper. repræsenterer eksperimentdata og λABS/calc. repræsenterer de teoretiske beregningsdata. Eexc er excitation Energy (EV), og f er oscillator styrke. B) foto billeder af pmq og AZO-produkterne med forskellige substituenter, 50 μM i 5% phosphorsyreopløsning. C) UV-Vis-spektre af de syntetiske produkter. Værdierne blev normaliseret til et område mellem 0 og 1. Dette tal er blevet ændret med tilladelse fra tidligere arbejde21. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: kolorimetrisk bestemmelse af pmq. A) overvågning af absorbansændringer ved maksimum i504 på en tidsafhængig måde. Reaktionen blev udført ved hjælp af 4-methoxyanilin, og PMQ blev brugt ved 100 μM; B) farveændringer af reaktionen med forskellige koncentrationer af pmq: 400 μl 4-methoxyanilin-opløsning (200 mM i 0,2 M HCL) og 200 μl natriumnitrit i vand (5 mm), med 200 ΜL pmq-opløsning af forskellige koncentrationer (0, 1, 2, 5 , 10, 20, 50, 100 μM). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: pH-effekt på pmq-detektering. A) pH-virkninger på UV-Vis-absorbans af AZO-produkt 3D (50 μM) (B) pmq (50 μM) i PBS-buffer med forskellige pHs (4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0) blev anvendt til at udføre reaktionen som beskrevet i trin 3,1. 15 minutter senere blev absorbansen ved 504 nm målt. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: pmq-bestemmelse gennem en griess reaktion på en 96-brønd plade baseret system. R1 refererer til 200 mM 4-methoxyanilinopløsning i 0,2 M HCl; R2 refererer til 5 mM natriumnitrit i destilleret vand. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: KALIBRERINGSKURVER for pmq-bestemmelse fra (A) syntetisk urin og (B) humane serumprøver. Koncentrationen af PMQ spænder fra 0-200 μM. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: pmq-bestemmelse fra serumprøver. a) skematisk illustration af pmq-ekstraktion fra serumprøver til den kvantitative analyse. B) det lineære forhold mellem i504 og pmq-koncentrationen inden for intervallet fra 0 til 100 μM. C) pmq i serum blev kvantificeres ved hjælp af den griess-reaktionsbaserede metode sammenlignet med det nøjagtige beløb, som blev tilsat i serum. Dette tal er blevet ændret med tilladelse fra tidligere arbejde21. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Table 1
Tabel 1. Teoretisk beregning af log D og procentdelen af vandfordelingen af PMQ og CPMQ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Vi beskrev en kolorimetrisk metode til bekvem PMQ kvantificering. Det er potentielt den mest enkle og omkostningseffektive nuværende metode. Endnu vigtigere er, at denne metode giver mulighed for nøgen-øje baseret PMQ-måling uden brug af udstyr.

Den optimerede Griess-reaktion for PMQ-detektion kan generere en rød farve AZO med en maksimal absorption ved 504 nm. Den potentielle påvirkning fra UV-Vis absorption af endogene biomolekyler er begrænset, hvilket gør metoden lovende for direkte måling af PMQ i biologiske væsker. Som indikeret af resultatet blev et fremragende lineært forhold (R2 = 0,998) fundet for pmq-urin detektering i koncentrationsintervallet på 0-200 ΜM (figur 6a). Detektionsgrænsen (LOD) for PMQ blev fundet at være 0,63 μM. Denne metode har også vist store potentialer for direkte måling af PMQ i humant serum. En fremragende lineær forbindelse blev fundet i koncentrationen spænder fra 10 til 200 μM for serum PMQ detektion (figur 6b). Vi kan yderligere forbedre følsomheden ved at forbehandle serumprøven gennem ekstraktion og koncentration. Som figur 7 viser med en simpel ekstraktionsproces, denne metode kan kvantificere serum pmq i klinisk relevante intervaller. Baseret på reaktions mekanismen kan den vigtigste carboxylmetabolit af PMQ (CPMQ) potentielt danne et AZO-produkt med lignende UV-Vis-egenskaber. Imidlertid kan væske-væskeekstraktion undergrund læggende pH-betingelser potentielt minimere interferensen fra CPMQ. Tabel 1 viser den beregnede log D-og vandfordeling for både pmq og CPMQ. Som vist ved pH > 10 vil mindre end 6,33% PMQ blive fundet i vandfasen, hvorimod over 98,54% af CPMQ vil være i vandfasen. Teoretisk set kunne mere end 93,7% PMQ og mindre end 1,56% af CPMQ udtrækkes til test. Det kan konk ¦ nses, at interferensen fra hovedmetabolitten CPMQ er begrænset.

Proceduren for PMQ-detektion er meget nem at håndtere. At tage 96-brønd plade-baserede system som et eksempel, hele proceduren består af fire trin: 1) tilsætning 100 μL af 4-methoxyaniline opløsning (200 mM i 0,2 M HCl) R1 i en 96-brønd plade; 2) tilsætning af 50 μL PMQ-koncentration-ukendt prøve til blanding med R1; 3) tilsætning af 50 μL R2 (5 mM natriumnitrit opløsning) til at udføre reaktionen ved stuetemperatur; og 4) optagelse af UV-Vis absorption ved 504 nm ved hjælp af et spektrometer. Koncentrationen af PMQ fra en ukendt prøve kan beregnes på grundlag af absorptions intensiteten i504 og den lineære ligning fra kalibreringskurven. Hele proceduren udføres ved stuetemperatur uden behov for inkubation. Et mørkt miljø er ikke nødvendigt for hele proceduren, da det farvede produkt ikke er følsomt for lys i rummet.

Det skal bemærkes, at tiden for reaktions opløsningen til at nå sin mættede I504 er temperaturafhængig. Som vist i figur 3var mindst 12 minutter påkrævet ved stuetemperatur (25 °c). Reaktionstiden vil være længere, hvis reaktionen udføres ved temperaturer under 25 °C. Den grundlæggende pH-tilstand af PMQ-opløsninger kan potentielt påvirke absorbans i504. For at løse dette problem skal pH-værdien af PMQ-opløsningen justeres til mindre end 7,0. Ellers er der behov for en ny kalibreringskurve for opløsningen med pH over 7,0. Desuden kan iboende nitrit i de testede prøver påvirke påvisning. Dette kan dog kun forekomme, når koncentrationen af iboende nitrit er ekstremt høj, da en høj koncentration af nitrit (5 mM) blev anvendt i en standard test.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at erklære.

Acknowledgments

Forfatterne anerkender start-up Grant fra Guangzhou University of kinesisk medicin og ungdoms videnskabelige forskning uddannelse projekt af GZUCM (2019QNPY06). Vi anerkender også Lingnan Medical Research Center af Guangzhou University of kinesisk medicin for støtte på faciliteter.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-Methoxyaniline Aladdin K1709027
2,4-Dimethoxyaniline Heowns 10154207
3,4-Dimethoxyaniline Bidepharm BD21914
4-Methylaniline Adamas-beta P1414526
4-Nitroaniline Macklin C10191447
96-wells,Flat Botton Labserv 310109008
Gaussian@16 software Gaussian, Inc Version:x86-64 SSE4_2-enabled/Linux
Hydrochloric acid GCRF 20180902
Marvin sketch (software) CHEMAXON free edition: 15.6.29
Phosphoric acid Macklin C10112815
Primaquine bisiphosphate 3A Chemicals CEBK200054
Sodium nitrite Alfa Aesar 5006K18R
Sulfonamides TCI(shanghai) GCPLO-BP
Varioskan LUX Plate reader Thermo Fisher Supplied with SkanIt Software 4.1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fernando, D., Rodrigo, C., Rajapakse, S. Primaquine in vivax malaria: an update and review on management issues. Malar Journal. 10, 351 (2011).
  2. Deng, C., et al. Large-scale Artemisinin-Piperaquine Mass Drug Administration With or Without Primaquine Dramatically Reduces Malaria in a Highly Endemic Region of Africa. Clinical Infectious Diseases. 67, (11), 1670-1676 (2018).
  3. Pavic, K., et al. Primaquine hybrids as promising antimycobacterial and antimalarial agents. European Journal of Medical Chemistry. 143, 769-779 (2018).
  4. McQueen, A., et al. Synthesis, characterization, and cellular localization of a fluorescent probe of the antimalarial 8-aminoquinoline primaquine. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 27, (20), 4597-4600 (2017).
  5. Ashley, E. A., Recht, J., White, N. J. Primaquine: the risks and the benefits. Malaria Journal. 13, (1), 418 (2014).
  6. Watson, J., Taylor, W. R., Menard, D., Kheng, S., White, N. J. Modelling primaquine-induced haemolysis in G6PD deficiency. Elife. 6, (2017).
  7. Beutler, E. Glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency: a historical perspective. Blood. 111, (1), 16-24 (2008).
  8. Endoh, Y. S., et al. High-performance liquid chromatographic determination of pamaquine, primaquine and carboxy primaquine in calf plasma using electrochemical detection. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. 579, (1), 123-129 (1992).
  9. Dua, V. K., Kar, P. K., Sarin, R., Sharma, V. P. High-performance liquid chromatographic determination of primaquine and carboxyprimaquine concentrations in plasma and blood cells in Plasmodium vivax malaria cases following chronic dosage with primaquine. Journal of Chromatography B: Biomedical Applications. 675, (1), 93-98 (1996).
  10. Miranda, T. A., Silva, P. H. R., Pianetti, G. A., César, I. C. Simultaneous quantitation of chloroquine and primaquine by UPLC-DAD and comparison with a HPLC-DAD method. Malaria Journal. 14, 29 (2015).
  11. Tatsuno, M., Nishikawa, M., Katagi, M., Tsuchihashi, H. Simultaneous determination of illicit drugs in human urine by liquid chromatography-mass spectrometry. Journal of Analytical Toxicology. 20, (5), 281-286 (1996).
  12. Erni, F. Use of high-performance liquid chromatography in the pharmaceutical industry. Journal of Chromatography A. 507, 141-149 (1990).
  13. Tsikas, D. Analysis of nitrite and nitrate in biological fluids by assays based on the Griess reaction: Appraisal of the Griess reaction in the l-arginine/nitric oxide area of research. Journal of Chromatography B. 851, (1), 51-70 (2007).
  14. Zurcher, D. M., Adhia, Y. J., Romero, J. D., McNeil, A. J. Modifying a known gelator scaffold for nitrite detection. Chemical Communications. 50, (58), 7813-7816 (2014).
  15. Kunduru, K. R., Basu, A., Tsah, T., Domb, A. J. Polymer with pendant diazo-coupling functionality for colorimetric detection of nitrates. Sensors and Actuators B: Chemical. 251, 21-26 (2017).
  16. Li, D., Ma, Y., Duan, H., Deng, W., Li, D. Griess reaction-based paper strip for colorimetric/fluorescent/SERS triple sensing of nitrite. Biosensors and Bioelectronics. 99, 389-398 (2018).
  17. Deng, T., et al. A novel strategy for colorimetric detection of hydroxyl radicals based on a modified Griess test. Talanta. 195, 152-157 (2019).
  18. Pang, H., et al. A photo-responsive macroscopic switch constructed using a chiral azo-calix[4]arene functionalized silicon surface. Chemical Communications (Camb). 54, (24), 2978-2981 (2018).
  19. Kaur, N., Dhaka, G., Singh, J. Simple naked-eye ratiometric and colorimetric receptor for anions based on azo dye featuring with benzimidazole unit. Tetrahedron Letters. 56, (9), 1162-1165 (2015).
  20. Liu, F., Lou, J., Hristov, D. X-Ray responsive nanoparticles with triggered release of nitrite, a precursor of reactive nitrogen species, for enhanced cancer radiosensitization. Nanoscale. 9, (38), 14627-14634 (2017).
  21. Deng, T., et al. An unexpected Griess reaction on the important anti-malarial drug primaquine and its application for drug determination. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 171, 8-14 (2019).
  22. Shrivastava, A., Gupta, V. Methods for the determination of limit of detection and limit of quantitation of the analytical methods. Chronicles of Young Scientists. 2, (1), 21-25 (2011).
Optimeret Griess reaktion for UV-Vis og nøgen-øje bestemmelse af anti-malaria Primaquine
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wu, Y., Wu, S., Huang, X. a., Zeng, Q., Deng, T., Liu, F. Optimized Griess Reaction for UV-Vis and Naked-eye Determination of Anti-malarial Primaquine. J. Vis. Exp. (152), e60136, doi:10.3791/60136 (2019).More

Wu, Y., Wu, S., Huang, X. a., Zeng, Q., Deng, T., Liu, F. Optimized Griess Reaction for UV-Vis and Naked-eye Determination of Anti-malarial Primaquine. J. Vis. Exp. (152), e60136, doi:10.3791/60136 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter