Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine neuartige kolorimetrische Methode zum Nachweis von Malaria-Primärquin (PMQ) in synthetischen Urinen und menschlichen Seren.
Abstract
Primaquine (PMQ), ein wichtiges Malariamedikament, wurde von der Weltgesundheitsorganisation (WHO) zur Behandlung lebensbedrohlicher Infektionen durch P. vivax und ovaleempfohlen. PMQ hat jedoch unerwünschte Nebenwirkungen, die bei Patienten mit Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase-Mangel (G6PD) zu einer akuten Hämolyse führen. Es ist notwendig, einfache und zuverlässige Methoden für die PMQ-Bestimmung mit dem Zweck der Dosierungsüberwachung zu entwickeln. Anfang 2019 haben wir einen UV-Vis- und Nacktaugen-basierten Ansatz für die kolorimetrische PMQ-Quantifizierung gemeldet. Die Detektion beruhte auf einer Griess-ähnlichen Reaktion zwischen PMQ und Anilines, die farbige Azoprodukte erzeugen kann. Die Nachweisgrenze für die direkte Messung von PMQ im synthetischen Urin liegt im Nanomolarbereich. Darüber hinaus hat diese Methode ein großes Potenzial für die PMQ-Quantifizierung aus menschlichen Serumproben in klinisch relevanten Konzentrationen gezeigt. In diesem Protokoll werden wir die technischen Details über die Synthesen und Charakterisierung von farbigen Azoprodukten, die Reagenzzubereitung und die Verfahren zur PMQ-Bestimmung beschreiben.
Introduction
PMQ ist eines der wichtigsten Malariamedikamente, es wirkt nicht nur als Gewebeschizontozid, um einen Rückfall zu verhindern, sondern auch als Gametozytozid zur Unterbrechung der Krankheitsübertragung1,2,3,4. Intravaskuläre Hämolyse ist eine der bezugsgemäßen Nebenwirkungen von PMQ, die bei G6PD-Defiziten äußerst schwerwiegend wird. Es ist bekannt, dass die genetische Erkrankung G6PD weltweit mit einer Genhäufigkeit zwischen 3-30% in endemischen Malariagebieten verteilt wird. Der Schweregrad der PMQ-Schwäche hängt vom Grad des G6PD-Mangels sowie der Dosis und der Dauer der PMQ-Exposition5,6ab. Um das Risiko zu senken, hat die WHO eine einzelne niedrige Dosis (0,25 mg Base/kg) PMQ für die Malariabehandlung empfohlen. Dies wird jedoch immer noch durch die Variationen der Patientenarzneimittelempfindlichkeitin Fragegestellt 5,7. Dosisüberwachung ist notwendig, um die Pharmakokinetik nach der PMQ-Verabreichung zu bewerten, die Dosierungsanpassung für eine erfolgreiche Behandlung mit begrenzter Toxizität bewirken kann.
Die Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) ist die am weitesten verbreitete Technik zur klinischen PMQ-Bestimmung. Endoh et al. berichteten über ein HPLC-System mit einem UV-Detektor zur Serum-PMQ-Quantifizierung mit einer C-18-Polymer-Gelsäule8. In ihrem System wurden Serumproteine zuerst mit Acetonitril ausgefällt, und dann wurde der PMQ im Überstand für HPLC getrennt. Die Kalibrierkurve war linear über den Konzentrationsbereich von 0,01-1,0 g/ml8. Für die Quantifizierung von PMQ und seinen Hauptmetaboliten9wurde eine weitere Methode auf Basis einer Reverse-Phase-HPLC mit UV-Erkennung bei 254 nm berichtet. Die Kalibrierkurve für PMQ lag linear im Bereich zwischen 0,025-100 g/ml. Für die PMQ-Trennung wurde eine zusätzliche flüssigkeits-flüssige Extraktion mit gemischtem Hexan und Ethylacetat als organische Phase verwendet, wobei die prozentuale Rückgewinnung bis zu 89%9erreicht wurde. In jüngerer Zeit haben Miranda et al. ein UPLC-Verfahren mit UV-Detektion bei 260 nm für die PMQ-Analyse in Tablettenformulierungen mit einer Nachweisgrenze von 3 g/ml10entwickelt.
Obwohl HPLC-Methoden eine vielversprechende Empfindlichkeit bei der Wirkstoffbestimmung aufweisen und die Empfindlichkeit weiter verbessert werden kann, wenn das HPLC mit einem Massenspektrometer ausgestattet ist, gibt es noch einige Nachteile. Direkte Arzneimittelmessungen in biologischen Flüssigkeiten sind von HPLC in der Regel unzugänglich, da viele Biomoleküle die Analyse stark beeinflussen können. Zusätzliche Extraktionen sind erforderlich, um endogene Moleküle vor der HPLC-Analyse zu entfernen11,12. Darüber hinaus wird die PMQ-Erkennung durch einen HPLC-UV-Detektor in der Regel bei seiner maximalen Absorptionswellenlänge (260 nm) durchgeführt;; Es gibt jedoch viele endogene Moleküle in biologischen Flüssigkeiten mit einer starken Absorption bei 260 nm (z. B. Aminosäuren, Vitamine, Nukleinsäuren und Urochrompigmente), wodurch der PMQ-UV-Nachweis beeinträchtigt wird. Es ist notwendig, einfache und kostengünstige Methoden für die PMQ-Bestimmung mit angemessener Empfindlichkeit und Selektivität zu entwickeln.
Die Griess-Reaktion wurde erstmals 1879 als kolorimetrischer Test zur Nitritdetektion13,14,15,16vorgestellt. Kürzlich wurde diese Reaktion ausgiebig erforscht, um nicht nur Nitrit, sondern auch andere biologisch relevante Moleküle17,18,19,20zu erkennen. Wir haben bereits über die erste systematische Studie einer unerwarteten Griess-Reaktion mit PMQ berichtet (Abbildung 1). In diesem System ist PMQ in der Lage, farbige Azos zu bilden, wenn es mit substituierten Anilines in Gegenwart von Nitritionen unter sauren Bedingungen gekoppelt ist. Wir haben weiter festgestellt, dass die Farbe von Azos von gelb bis blau variierte, wenn die Elektronen-Donier-Wirkung des Substituenten auf anilines21erhöht wurde. Durch die optimierte Reaktion zwischen 4-Methoxyaniline und PMQ wurde eine auf UV-Vis-Absorption basierende kolorimetrische Methode zur PMQ-Quantifizierung entwickelt. Diese Methode hat ein großes Potenzial für den empfindlichen und selektiven Nachweis von PMQ in biorelevanten Flüssigkeiten gezeigt. Hier wollen wir die detaillierten Verfahren für die PMQ-Bestimmung auf der Grundlage dieser kolorimetrischen Strategie beschreiben.
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Protocol
1. Synthese von farbigen Azoen
- In einem 25 ml runden Bodenkolben (RBF) Anilin (0,1 mmol) und Primaquinbisphosphat (45,5 mg, 0,1 mmol) in 10 mlH3PO4 Lösung (5% v/v) auflösen. Legen Sie den RBF auf ein Eisbad, fügen Sie eine Rührstange mit der richtigen Größe in die Lösung ein und legen Sie den RBF auf eine Rührplatte.
HINWEIS: Für die Synthese von Azo 3g (Abbildung 2) verwenden Sie 0,2 mmol Primaquinbisphosphat. - NaNO2 (6,9 mg, 0,1 mmol) in 1 ml gekühltem Wasser auflösen und dann tropfenweise in das Reaktionsgemisch geben. Entfernen Sie das Eisbad, und halten Sie die Reaktionsmischung bei Raumtemperatur gerührt.
- Überwachen Sie die Reaktion mit einer Mitglasgel-beschichteten Dünnschichtchromatographie (TLC) Platte. Verwenden Sie ein Dichlormethan -gemisch (DCM)/Methanol (MeOH) (vol/vol = 5:1) als Eluent für TLC. Das Azo-Produkt weist farbige Flecken auf der TLC-Platte auf, die sich leicht durch nackte Augen unterscheiden lässt. Beenden Sie die Reaktion, wenn die PMQ-Spots auf TLC verschwinden.
- Stellen Sie die Reaktionsmischung auf pH >10 von NaOH (2 M) auf einem Eisbad ein. Verwenden Sie einen 50 ml Trenntrichter, um das Gemisch 3 mal mit 20 ml Ethylacetat für jeweils zu extrahieren, die organische Phase unter Vakuum mit einem Rotationsverdampfer zu kombinieren und zu konzentrieren.
HINWEIS: Passen Sie vor der Extraktion den pH-Wert von Reaktionslösungen über 10 an. Dies kann das primäre Amin als seine nicht-ionisierte Form beibehalten, wodurch die Extraktion erleichtert wird. - Reinigen Sie die Rückstände durch Blitzchromatographie mit Reverse-Phase-Kieselgel unter Normaldruck, wobei MeOH/H2 O als Eluent verwendet wird. Trocknen Sie die Produktlösung durch Lyophilisierung, um gewünschte Azoprodukte zu erhalten.
HINWEIS: Die gleiche Reaktion kann auch in verdünnten HCl-Lösungen (0,2 M) durchgeführt werden.
2. UV-Vis-Messungen und theoretische Berechnung
- Reiner Azo (50 m) in destilliertem Wasser bzw. in 5%H3PO4 Lösung (pH 1,1) auflösen. Erfassen Sie UV-Vis-Absorptionsspektren (250-700 nm) auf einem Spektralphotometer bei Raumtemperatur (25 °C). Exportieren Sie die Daten zur weiteren Analyse als .xls/.xlsx-Dateien.
-
Führen Sie alle theoretischen Berechnungen für PMQ selbst und Azo-Produkte mit dem Gaussian 16 Programm durch. Verwenden Sie die zeitabhängige Dichtefunktionstheorie (TD-DFT) mit einem 6-31G-Basissatz. Fügen Sie Lösungsmitteleffekte durch polarisierbaren Kontinuumsmodell (PCM)-Formalismus mit Wasser ein.
- Verwenden Sie Software (z. B. Chemdraw Office), um die Strukturen zu zeichnen und dann die Struktur als Gaußsche Eingabedatei (.gif) zu speichern.
- Öffnen Sie die GIF-Datei mit Gauß Ansicht und klicken Sie auf die Schaltfläche Berechnen. Wählen Sie Gaussian Calculation Setup, Opt+Freqund ground state-DFT-B3LYP-6-31G; klicken Sie dann auf Senden. Die Geometrieoptimierung generiert eine .log-Datei.
- Verwenden Sie das obige Verfahren, um diese Protokolldatei zu öffnen. Klicken Sie auf Calculate-Gaussian Calculation Setup and select energy and TD-SCF-DFT-B3LYP-6-31G-Singlet only. Dann senden. Bei der Energieberechnung wird eine weitere Protokolldatei und eine Cubedatei generiert.
- Verwenden Sie Gaußansicht, um die Protokolldatei aus der Energieberechnung zu öffnen. Klicken Sie auf Ergebnisse-UV/Vis, um die vorhergesagte Absorption anzuzeigen.
- Verwenden Sie Gaußansicht, um die Cubedatei zu öffnen. Klicken Sie auf Ergebniss, und wählen Sie Flächen- und Konturlinien-Oberflächenaktionen und neue Oberfläche aus, um die Umlaufbahnen anzuzeigen.
-
Vergleichen Sie die Ergebnisse sowohl der experimentellen Messung als auch der Gaußschen Berechnung. Berechnen Sie den Prozentfehler zwischen den berechneten und den gemessenen Werten gemäß der folgenden Gleichung.
Fehler = | (Wmax cal.-Wmaxexper.) / Wmaxexper. | • 100%
wobei Wmax cal. die maximale Absorptionswellenlänge aus theoretischer Berechnung und Wmax exper darstellt. stellt die Wellenlänge des experimentellen Ergebnisses dar.
3. PMQ-Bestimmung
- PMQ-Messung mit einer 96-Well-Platte (Abbildung 5)
- 4-Methoxyaniin in 0,2 M HCl für eine 200 mM Aniinlösung, R1, auflösen. Natriumnitrit in destilliertem Wasser auflösen, um eine 5 mM Lösung, R2, zu erhalten. Halten Sie alle Lösungen vor Gebrauch bei 4 °C im Kühlschrank auf.
- Fügen Sie 100 l R1 in eine 96-Well-Platte und fügen Sie 50 l PMQ enthaltende Probe in die Platte, um sie mit R1 zu mischen. Fügen Sie dann 50 l R2 in die Platte ein. Mischen Sie die Lösungen durch wiederholtepipetieren.
- Halten Sie die Platte 15 min bei Raumtemperatur auf und notieren Sie dann die UV-Vis-Absorption bei 504 nm. Wiederholen Sie 3x für jeden Test. Das Azo-Produkt ist stabil mit Raumlichtbelichtung; es ist nicht notwendig, die Platte unter Dunkel zu halten.
- Exportieren Sie die Daten zur weiteren Analyse als .xls/.xlsx-Dateien.
- Kalibrierkurve zur direkten PMQ-Messung in einer Urinprobe
- Bereiten Sie PMQ-Lösungen mit synthetischem Urin mit PMQ-Konzentrationen bei 0, 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200 m vor.
- Fügen Sie 100 l R1 in eine 96-Well-Platte und fügen Sie 50 l PMQ-Urinlösung hinzu, um sie mit R1 zu mischen. Fügen Sie dann 50 l R2 in die obige Mischung ein. Mischen Sie die Lösungen durch wiederholtepipetieren. Halten Sie die Platte 15 min bei Raumtemperatur auf und notieren Sie dann die UV-Vis-Absorption bei 504 nm.
- Generieren Sie eine Kalibrierkurve basierend auf der Absorptions- undPMQ-Konzentration. Verwenden Sie die Werte aus den Brunnen ohne PMQ als Leerzeichen, und subtrahieren Sie die leeren Werte von allen Tests vor der Datenverarbeitung.
- Führen Sie eine lineare Anpassung aus, um die linearen Gleichungen als Y = aX+bzu erzeugen, wobei Y die Absorptionsintensität bei 504 nm, X die Konzentration von PMQ, a die Steigung und b der y-Abschnitt der linearen Linie ist.
- Kalibrierkurve zur direkten PMQ-Messung in einer menschlichen Serumprobe
- Bereiten Sie PMQ-Lösungen mit humanem Serum mit PMQ-Konzentrationen bei 0, 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200, m vor.
- Fügen Sie 100 l R1 in eine 96-Well-Platte und fügen Sie 50 l PMQ-Serumlösung hinzu, um sie mit R1 zu mischen. Fügen Sie der oben genannten Mischung 50 l R2 hinzu und mischen Sie die Lösungen durch wiederholtes Pipettieren. Halten Sie die Platte 15 min bei Raumtemperatur und notieren Sie dann die UV-Vis-Absorption bei 504 nm. Exportieren Sie die Daten zur weiteren Analyse als .xls/.xlsx-Datei.
- Generieren Sie eine Kalibrierkurve basierend auf der Absorptions- undPMQ-Konzentration. Verwenden Sie die Werte aus den Brunnen ohne PMQ als Leerzeichen, und subtrahieren Sie die leeren Werte von allen Tests vor der Datenverarbeitung.
- Führen Sie eine lineare Anpassung aus, um die linearen Gleichungen als Y = aX+bzu erzeugen, wobei Y die Absorptionsintensität bei 504 nm, X die Konzentration von PMQ, a die Steigung und b der y-Abschnitt der linearen Linie ist.
- PMQ-Extraktion aus Serum
- Fügen Sie eine bestimmte Menge an PMQ in das menschliche Serum ein, um PMQ-haltiges Serum zu simulieren. Zur PMQ-Extraktion 6 ml Mischung aus Ethylacetat/Hexan (7:1 v/v) in 2 ml PMQ-haltiges Serum in einem 15 ml Zentrifugenrohr geben.
- Fügen Sie dem Extraktionssystem 100 l Natriumhydroxid (2 M) Lösung hinzu. Schütteln Sie das Rohr mit einem Wirbelmischer 30 s. Sammeln Sie die organische Schicht und konzentrieren Sie sie mit einem Rotationsverdampfer unter Vakuum.
- Lösen Sie den Rückstand mit 200 l destilliertem Wasser auf und entfernen Sie unlösliche Lipidkomponenten durch Filtration durch eine scheibenförmige Membran mit 220 nm Porengröße. Verwenden Sie die endgültige Lösung für den Test.
- PMQ aus dem Serum mit Extraktion bestimmen
- Befolgen Sie die Schritte 3.2 oder 3.3, um die Kalibrierkurve für PMQ in destilliertem Wasser zu generieren. Extrahieren Sie PMQ aus PMQ-haltigen Seren nach Schritt 3.4.
- Fügen Sie 100 l R1 und 50 l PMQ-Lösung in eine 96-Well-Platte ein. Fügen Sie 50 l R2 zu oben Gemisch hinzu und mischen Sie die Lösungen durch wiederholtes Pipettieren.
- Halten Sie die Platte 15 min bei Raumtemperatur und notieren Sie die UV-Vis-Absorption bei 504 nm. Verwenden Sie die Bohrungen mit R1 und R2, aber ohne PMQ als Steuerung. Exportieren Sie die Daten zur weiteren Analyse als .xls/.xlsx-Dateien.
- Subtrahieren Sie die Regelwerte von den Absorptionswerten I504 für jeden Test, und verwenden Sie dann das Ergebnis für Konzentrationsberechnungen gemäß der Linergleichung aus der Kalibrierkurve.
HINWEIS: Die Nachweisgrenze (LOD) für PMQ kann in allen Fällen nach einer Standardmethode22berechnet werden. Die Berechnung basierte auf der Kalibrierfunktion: LOD = 3,3 x SD/b, wobei SD die Standardabweichung des Rohlings und b die Steigung der Regressionslinie ist
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Representative Results
Zur Optimierung der Reaktionsbedingungen (Abbildung 2) wurden verschiedene Aniline verwendet, um pmQ durch die Griess-Reaktion zu koppeln. Wir haben eine Reihe von Azos mit verschiedenen Farben erreicht. Es wurde festgestellt, dass Anilines mit einem Elektronen-Stifter-Substituenten eine Rotverschiebung im UV-Vis-Absorptionsspektrum verursachen können. Theoretische Berechnungen wurden durch zeitabhängige Dichtefunktionstheorie (TD-DFT) durchgeführt. Wie in Abbildung 2Adargestellt, stimmte das Berechnungsergebnis in gutem Verhältnis zu optischen Messungen mit einem durchschnittlichen Fehler von 3,1 %. 4-Methoxyaniin wurde dann verwendet, um die PMQ-Erkennungsreaktion aufgrund seiner guten Leistung in Reaktionsgeschwindigkeit, Produktlöslichkeit und Stabilität21durchzuführen. Darüber hinaus ist das Azo-Produkt aus 4-Methoxyaniline rot gefärbt, was mit bloßen Augen leicht zu unterscheiden ist. Daher bietet diese Reaktion Potenzial für die PMQ-Erkennung mit bloßen Augen (Abbildung 3).
Abbildung 4A zeigt den pH-Effekt auf das UV-Vis-Absorptionsspektrum des Azoprodukts 3d. I504 ändert sich nicht, wenn der pH-Wert von 1,0 auf 6,0 erhöht wird. I504 unter pH 7,0 weist eine leichte Abnahme auf, während ein grundiger pH (8,0 und 9,0) die Absorption stark beeinflusst. Abbildung 4B zeigt die pH-Effekte von PMQ-Lösungen auf die Griess-Reaktion. PMQ (50 'M) im PBS-Puffer mit verschiedenen pKs (4.0, 5.0 ,6.0, 7.0, 8.0, 9.0) wurden einzeln mit dem Prüfreagenz wie in Abschnitt 3.1 beschrieben gemischt. I504 wurde dann nach 15 min bei Raumtemperatur gemessen. Wie bereits angedeutet, beeinflussen grundlegende pKs (8,0, 9,0) von PMQ-Lösungen potenziell die Reaktion. Abbildung 5 zeigt das allgemeine Verfahren zur Durchführung der Griess-Reaktion zur PMQ-Erkennung. Wie im Protokollabschnitt beschrieben, sind vier Schritte erforderlich, um die Absorptionsdaten I504 für die Analyse zu erhalten. Abbildung 6A und 6B zeigen die Kalibrierkurven für den direkten Nachweis von PMQ aus Urin- bzw. Serumproben ohne Probenvorbehandlungen. Eine ausgezeichnete lineare Beziehung (R2 = 0,998) wurde gefunden, wenn PMQ im synthetischen Urin zwischen 0 und 200 m liegt. In der Serumprobe wurde eine lineare Beziehung in der Konzentration von 10 bis 200 M gefunden.
Abbildung 7A zeigt das Verfahren zum Extrahieren von PMQ aus dem Serum. Die Rückstände wurden nach Extraktion und Konzentration in destilliertem Wasser wieder aufgelöst und anschließend filtriert. Um ein echtes PMQ-haltiges Serum zu simulieren, wurde PMQ in das humane Serum mit endletzten Konzentrationen bei 0, 0,2, 0,5, 1,0, 2,0 m zugegeben. Anhand der Schritte 3.4 und 3.5 wurden die PMQ-Konzentrationen in Seren bei 0,02, 0,14, 0,44, 0,90 bzw. 1,78 M festgestellt (Abbildung 7C). Basierend auf dem Ergebnis lag der Prozentsatz der PMQ-Erholung bei etwa 90 %, wenn pmQ mehr als 0,5 M im Serum betrug, was mit früheren Berichten vergleichbar war9.
Abbildung 1: Schemat der Griess-Reaktion auf PMQ. (A) Eine klassische Griess-Reaktion zur Nitritanalyse. (B) Die Griess-Reaktion in der vorgeschlagenen PMQ-Erkennungsmethode. Diese Zahl wurde mit Genehmigung von früheren Arbeiten geändert21. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2:Photophysikalische Eigenschaften synthetischer Azoen. (A) UV-vis-Messung und theoretische Berechnung der maximalen Absorption von Azoen, die aus verschiedenen Anilines erzeugt werden. Die Zahlen außerhalb der Klammern stellen für die maximale Absorptionsmessung bei destilliertenH2O nahezu neutralen pH-Bedingungen dar; die Zahlen in den Klammern beziehen sich auf die Messung in 5% H3PO4 Lösung (pH-Wert 1,1). abs/nm exper. stellt die Versuchsdaten dar, und dietheoretischenBerechnungsdatensind die theoretischen Berechnungsdaten. Eexc ist die Anregungsenergie (eV), und f ist die Oszillatorstärke. (B) Fotobilder von PMQ und den Azo-Produkten mit unterschiedlichen Substituenten, 50 m in 5% Phosphorsäurelösung. (C) UV-Vis-Spektren der synthetischen Produkte. Die Werte wurden auf einen Bereich zwischen 0 und 1 normalisiert. Diese Zahl wurde mit Genehmigung von früheren Arbeiten geändert21. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3:Farbmetrische Bestimmung von PMQ. (A) Überwachung der Absorptionsänderungen bei maximal I504 zeitabhängig. Die Reaktion wurde mit 4-Methoxyaniin durchgeführt, und PMQ wurde bei 100 M verwendet; (B) Farbveränderungen der Reaktion mit unterschiedlichen PMQ-Konzentrationen: 400 l 4-Methoxyaniin-Lösung (200 mM in 0,2 M HCl) und 200 l Natriumnitrit in Wasser (5 mM), mit 200 l PMQ-Lösung mit unterschiedlichen Konzentrationen (0, 1, 2, 5 , 10, 20, 50, 100 m). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4:pH-Effekt auf die PMQ-Erkennung. (A) pH-Effekte auf die UV-Vis-Absorption des Azoprodukts 3d (50 m); (B) PMQ (50 'M) im PBS-Puffer mit verschiedenen pKs (4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0) wurden verwendet, um die Reaktion wie in Schritt 3.1 beschrieben auszuführen. Fünfzehn Min. wurde die Absorption bei 504 nm gemessen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: PMQ-Bestimmung durch eine Griess-Reaktion auf einem 96-Well-Platten-basierten System. R1 bezieht sich auf 200 mM 4-Methoxyaniin-Lösung in 0,2 M HCl; R2 bezieht sich auf 5 mM Natriumnitrit in destilliertem Wasser. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Kalibrierkurven zur PMQ-Bestimmung aus (A) synthetischem Urin und (B) menschlichen Serumproben. Die PMQ-Konzentration liegt zwischen 0 und 200 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 7: PMQ-Bestimmung aus Serumproben. (A) Schematische Darstellung der PMQ-Extraktion aus Serumproben für die quantitative Analyse. (B) Die lineare Beziehung zwischen I504 und PMQ-Konzentration im Bereich von 0 bis 100 m. (C) PMQ im Serum wurde nach der Griess-Reaktionsmethode im Vergleich zur genauen Menge, die dem Serum zugesetzt wurde, quantifiziert. Diese Zahl wurde mit Genehmigung von früheren Arbeiten geändert21. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Tabelle 1. Theoretische Berechnung von Log D und prozentsatz der Wasserverteilung von PMQ und CPMQ.
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Discussion
Wir beschrieben eine kolorimetrische Methode für die bequeme PMQ-Quantifizierung. Es ist potenziell die einfachste und kostengünstigste aktuelle Methode. Noch wichtiger ist, dass diese Methode eine PMQ-Messung mit bloßen Augen ohne Verwendung von Geräten ermöglicht.
Die optimierte Griess-Reaktion zur PMQ-Erkennung kann einen roten Azo mit einer maximalen Absorption von 504 nm erzeugen. Der potenzielle Einfluss der UV-Vis-Absorption endogener Biomoleküle ist begrenzt, so dass das Verfahren für die direkte Messung von PMQ in biologischen Flüssigkeiten vielversprechend ist. Wie das Ergebnis zeigt, wurde eine ausgezeichnete lineare Beziehung (R2 = 0,998) für den Urin-PMQ-Nachweis über den Konzentrationsbereich von 0-200 m gefunden (Abbildung 6A). Die Nachweisgrenze (LOD) für PMQ lag bei 0,63 M. Diese Methode hat auch große Potenziale für die direkte Messung von PMQ im menschlichen Serum gezeigt. Eine ausgezeichnete lineare Beziehung wurde in der Konzentration von 10 bis 200 m für die Serum-PMQ-Erkennung gefunden (Abbildung 6B). Wir können die Empfindlichkeit weiter verbessern, indem wir die Serumprobe durch Extraktion und Konzentration vorbehandeln. Wie Abbildung 7 mit einem einfachen Extraktionsprozess zeigt, kann diese Methode Serum PMQ in klinisch relevanten Bereichen quantifizieren. Basierend auf dem Reaktionsmechanismus kann der Haupt-Carboxylmetabolit von PMQ (CPMQ) potenziell ein Azoprodukt mit ähnlichen UV-Vis-Eigenschaften bilden. Die Flüssigkeits-Flüssig-Extraktion unter pH-Grundbedingungen kann jedoch die Interferenzen von CPMQ potenziell minimieren. Tabelle 1 zeigt die berechnete Log D- und Wasserverteilung von PMQ und CPMQ. Wie gezeigt, werden bei pH >10 weniger als 6,33 % des PMQ in der Wasserphase zu finden sein, während über 98,54 % des CPMQ in der Wasserphase liegen. Theoretisch könnten daher mehr als 93,7 % des PMQ und weniger als 1,56 % des CPMQ für Tests extrahiert werden. Es kann der Schluss gezogen werden, dass die Interferenz des Hauptmetaboliten CPMQ begrenzt ist.
Das Verfahren zur PMQ-Erkennung ist sehr einfach zu handhaben. Am Beispiel des 96-Well-Plattensystems besteht das gesamte Verfahren aus vier Schritten: 1) Zugabe von 100 l 4-Methoxyanilin-Lösung (200 mM in 0,2 M HCl) R1 in eine 96-Well-Platte; 2) Zugabe von 50 l PMQ-Konzentrations-unbekannte Probe, um sie mit R1 zu mischen; 3) Zugabe von 50 l R2 (5 mM Natriumnitritlösung), um die Reaktion bei Raumtemperatur durchzuführen; und 4) Aufzeichnung der UV-Vis-Absorption bei 504 nm mit einem Spektrometer. Die PMQ-Konzentration aus einer unbekannten Probe kann anhand der Absorptionsintensität I504 und der linearen Gleichung aus der Kalibrierkurve berechnet werden. Der gesamte Vorgang wird bei Raumtemperatur ohne Inkubation durchgeführt. Eine dunkle Umgebung ist für den gesamten Eingriff nicht notwendig, da das farbige Produkt nicht empfindlich auf Raumlicht reagiert.
Es sei darauf hingewiesen, dass die Zeit für die Reaktionslösung, um ihre gesättigte I504 zu erreichen, temperaturabhängig ist. Wie in Abbildung 3dargestellt, wurden bei Raumtemperatur (25 °C) mindestens 12 min erforderlich. Die Reaktionszeit wäre länger, wenn die Reaktion bei Temperaturen unter 25 °C durchgeführt würde. Der pH-Grundzustand von PMQ-Lösungen kann die Absorption I504potenziell beeinflussen. Um dieses Problem zu beheben, passen Sie den pH-Wert der PMQ-Lösung auf weniger als 7,0 an. Andernfalls wird für die Lösung mit pH-Wert über 7,0 eine neue Kalibrierkurve benötigt. Darüber hinaus können intrinsische Nitrite in den getesteten Proben die Detektion beeinflussen. Dies kann jedoch nur auftreten, wenn die Konzentration von intrinsischen Nitriten extrem hoch ist, da in einem Standardtest eine hohe Nitritkonzentration (5 mM) verwendet wurde.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu erklären.
Acknowledgments
Die Autoren würdigen den Start-Up Grant der Guangzhou University of Chinese Medicine und das Jugendwissenschaftliche Forschungstrainingsprojekt gZUCM (2019QNPY06). Wir würdigen auch das Lingnan Medical Research Center der Guangzhou University of Chinese Medicine für die Unterstützung von Einrichtungen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-Methoxyaniline | Aladdin | K1709027 | |
| 2,4-Dimethoxyaniline | Heowns | 10154207 | |
| 3,4-Dimethoxyaniline | Bidepharm | BD21914 | |
| 4-Methylaniline | Adamas-beta | P1414526 | |
| 4-Nitroaniline | Macklin | C10191447 | |
| 96-wells,Flat Botton | Labserv | 310109008 | |
| Gaussian@16 software | Gaussian, Inc | Version:x86-64 SSE4_2-enabled/Linux | |
| Hydrochloric acid | GCRF | 20180902 | |
| Marvin sketch (software) | CHEMAXON | free edition: 15.6.29 | |
| Phosphoric acid | Macklin | C10112815 | |
| Primaquine bisiphosphate | 3A Chemicals | CEBK200054 | |
| Sodium nitrite | Alfa Aesar | 5006K18R | |
| Sulfonamides | TCI(shanghai) | GCPLO-BP | |
| Varioskan LUX Plate reader | Thermo Fisher | Supplied with SkanIt Software 4.1 |
References
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