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Medicine

यूवी-विस और एंटी-मलेरिया प्राइमाक्विन के नग्न-आंख निर्धारण के लिए अनुकूलित ग्रिस रिएक्शन

doi: 10.3791/60136 Published: October 11, 2019
* These authors contributed equally

Summary

इस प्रोटोकॉल सिंथेटिक मूत्र और मानव serums में antimalarial प्राइमक्विन (PMQ) का पता लगाने के लिए एक उपन्यास colorimetric विधि का वर्णन करता है.

Abstract

प्राइमाक्वीन (पीएमक्यू), एक महत्वपूर्ण मलेरिया रोधी दवा, विश्व स्वास्थ्य संगठन (डब्ल्यूएचओ) द्वारा पी वाइवक्स और अंडाकारके कारण जीवन-धमकी देने वाले संक्रमणों के उपचार के लिए सिफारिश की गई है। हालांकि, PMQ अवांछित प्रतिकूल प्रभाव है कि ग्लूकोज-6-फॉस्फेट dehydrogenase (G6PD) की कमी के साथ रोगियों में तीव्र हेमोलिसिस के लिए नेतृत्व किया है. खुराक की निगरानी के उद्देश्य के साथ PMQ निर्धारण के लिए सरल और विश्वसनीय तरीकों को विकसित करने की आवश्यकता है. जल्दी में 2019, हम एक यूवी-Vis और नग्न आँख PMQ colorimetric परिमाणीकरण के लिए आधारित दृष्टिकोण की सूचना दी है. पता लगाने के रंग का azo उत्पादों उत्पन्न कर सकते हैं जो PMQ और anilines, के बीच एक Gries की तरह प्रतिक्रिया पर आधारित था. सिंथेटिक मूत्र में PMQ के प्रत्यक्ष माप के लिए पता लगाने की सीमा नैनोमोलर रेंज में है। इसके अलावा, इस विधि नैदानिक रूप से प्रासंगिक सांद्रता में मानव सीरम नमूनों से PMQ परिमाणीकरण के लिए महान क्षमता दिखाया गया है. इस प्रोटोकॉल में, हम syntheses और रंगीन azo उत्पादों की विशेषता के बारे में तकनीकी विवरण का वर्णन करेंगे, अभिकर्मक तैयारी, और PMQ निर्धारण के लिए प्रक्रियाओं.

Introduction

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पीएमक्यू सबसे महत्वपूर्ण मलेरिया रोधी दवाओं में से एक है , यह न केवल पतन को रोकने के लिए एक ऊतक शाइजोंटोसाइड के रूप में काम करता है बल्कि रोग संचरण1,2,3,4को बाधित करने के लिए एक गेम्टोसाइटोसाइड के रूप में भी काम करता है । इंट्रावास्कुलर हेमोलिसिस पीएमक्यू के दुष्प्रभावों से संबंधित में से एक है, जो G6PD में कमी वाले लोगों में बेहद गंभीर हो जाता है। यह ज्ञात है कि G6PD आनुवंशिक विकार मलेरिया स्थानिकमारी क्षेत्रों में 3-30% के बीच एक जीन आवृत्ति के साथ दुनिया भर में वितरित किया जाता है. PMQ कमजोरी की गंभीरता G6PD की कमी की डिग्री के साथ ही खुराक और PMQ जोखिम5,6 की अवधि पर निर्भर करताहै. जोखिम को कम करने के लिए, डब्ल्यूएचओ ने मलेरिया के उपचार के लिए पीएमक्यू की एक कम खुराक (0.25 मिलीग्राम बेस/किलोग्राम) की सिफारिश की है। तथापि, यह अभी भी रोगी दवा संवेदनशीलता5,7 में बदलाव से चुनौती दीहै. खुराक निगरानी PMQ प्रशासन के बाद फार्माकोकाइनेटिक्स का आकलन करने के लिए आवश्यक है, जो सीमित विषाक्तता के साथ एक सफल उपचार के लिए खुराक समायोजन को प्रभावित कर सकता है।

उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (HPLC) PMQ नैदानिक दृढ़ संकल्प के लिए सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया तकनीक है. Endoh एट अल एक सी-18 बहुलक जेल कॉलम8का उपयोग कर सीरम PMQ परिमाणीकरण के लिए एक यूवी डिटेक्टर के साथ एक HPLC प्रणाली की सूचना दी. उनके सिस्टम में, सीरम प्रोटीन पहले एसीटोनिट्रिल के साथ वेग से थे, और फिर सुपरनेंट में पीएमक्यू को एचपीएलसी के लिए अलग किया गया था। अंशांकन वक्र सांद्रता श्रेणी से 0ण्01-1ण्0 g/mL8से अधिक रेखीय था। 254 एनएम पर यूवी डिटेक्शन के साथ रिवर्स फेज एचपीएलसी पर आधारित एक अन्य विधि पीएमक्यू और इसके प्रमुख चयापचयों9के परिमाणीकरण के लिए सूचित की गई है। PMQ के लिए अंशांकन वक्र 0.025-100 g/mL के बीच की श्रेणी में रैखिक था। मिश्रित हेक्सेन और एथिल एसीटेट के साथ एक अतिरिक्त तरल-तरल निष्कर्षण जैविक चरण के रूप में PMQ जुदाई के लिए इस्तेमाल किया गया था प्रतिशत वसूली के साथ 89%9तक पहुँच गया। हाल ही में, मिरांडा एट अल 3 डिग्री / एमएल10पर एक पहचान सीमा के साथ गोली योगों में PMQ विश्लेषण के लिए 260 एनएम पर यूवी का पता लगाने के साथ एक UPLC विधि विकसित की है।

हालांकि HPLC तरीकों दवा निर्धारण में आशाजनक संवेदनशीलता प्रदर्शन और संवेदनशीलता आगे सुधार किया जा सकता है अगर HPLC एक बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमीटर से लैस है, वहाँ अभी भी कुछ नुकसान कर रहे हैं. जैविक तरल पदार्थ में प्रत्यक्ष दवा माप आमतौर पर HPLC द्वारा दुर्गम हैं, के बाद से कई जैव अणुओं बहुत विश्लेषण को प्रभावित कर सकते हैं. एच . एल . सी विश्लेषण11,12से पहले अंतर्जात अणुओं को हटाने के लिए अतिरिक्त निष्कर्षणों की आवश्यकता होती है . इसके अलावा, एक HPLC-यूवी डिटेक्टर द्वारा PMQ का पता लगाने आम तौर पर अपनी अधिकतम अवशोषण तरंगदैर्ध्य (260 एनएम) पर किया जाता है. हालांकि, 260 एनएम (उदा., एमिनो एसिड, विटामिन, न्यूक्लिक एसिड और यूरोक्रोम पिगमेंट) में एक मजबूत अवशोषण के साथ जैविक तरल पदार्थ में कई अंतर्जात अणु हैं, इस प्रकार पीएमक्यू यूवी का पता लगाने के साथ हस्तक्षेप कर ते। उचित संवेदनशीलता और चयनात्मकता के साथ PMQ निर्धारण के लिए सरल और लागत प्रभावी तरीकों को विकसित करने की आवश्यकता है।

ग्रिस प्रतिक्रिया पहली बार 1879 में नाइट्राइट का पता लगाने के लिए एक colorimetric परीक्षण के रूप में प्रस्तुत किया गया था13,14,15,16. हाल ही में , इस अभिक्रिया का व्यापक रूप से पता लगाया गया है कि न केवल नाइट्राइट बल्कि जैविक रूप से संबंधित अन्य अणुओं का भी पता लगाया जा सकताहै 17,18,19,20. हमने पहले पीएमक्यू के साथ अप्रत्याशित ग्रिस प्रतिक्रिया के पहले व्यवस्थित अध्ययन की सूचना दी है (चित्र 1)। इस प्रणाली में, PMQ रंगीन azos फार्म जब अम्लीय परिस्थितियों में नाइट्राइट आयनों की उपस्थिति में प्रतिस्थापित anilines के साथ युग्मित करने में सक्षम है. हमने यह भी पाया है कि ऐनिलाइन्स21पर प्रतिस्थापक के इलेक्ट्रॉन दान प्रभाव को बढ़ाते समय अज़ोस का रंग पीले से नीले रंग में होता है. पीएमक्यू परिमाणीकरण के लिए एक यूवी-विस अवशोषण आधारित रंगमितीय विधि को 4-मेथॉक्सीलाइन और पीएमक्यू के बीच अनुकूलित प्रतिक्रिया के माध्यम से विकसित किया गया है। इस विधि जैव प्रासंगिक तरल पदार्थ में PMQ के संवेदनशील और चयनात्मक पता लगाने के लिए महान क्षमता दिखाई है. यहाँ, हम इस colorimetric रणनीति के आधार पर PMQ निर्धारण के लिए विस्तृत प्रक्रियाओं का वर्णन करना है.

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Protocol

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1. रंगीन Azos का संश्लेषण

  1. 25 एमएल गोल तल फ्लास्क (आरबीएफ) में एनिलाइन (0.1 एममोल) और प्राइमाक्विन बिस्फॉस्फेट (45.5 मिलीग्राम, 0.1 एममोल) को 10 एमएल में एच3पीओ4 घोल (5% v/ एक बर्फ स्नान पर RBF रखो, समाधान में उचित आकार के साथ एक हलचल बार जोड़ने के लिए, और एक हलचल थाली पर RBF डाल दिया.
    नोट: एजो 3ह के संश्लेषण के लिए (चित्र 2) , प्राइमाक्वीन बिस्फॉस्फेट के 0ण्2 ममोल का उपयोग करें।
  2. 1 एमएल ठंडे पानी में नानो2 (6.9 मिलीग्राम, 0.1 एममोल) को घोल कर रिएक्शन मिश्रण में बूंद-बूंद मिला दीजिये। बर्फ स्नान निकालें, और प्रतिक्रिया मिश्रण कमरे के तापमान पर हलचल रखने के लिए.
  3. एक सिलिका जेल लेपित पतली परत क्रोमैटोग्राफी (टीएलसी) प्लेट के साथ प्रतिक्रिया की निगरानी करें। टीएलसी के लिए एल्यूएंट के रूप में डाइक्लोरोमेथेन (डीसीएम)/मेथेनॉल (MeOH) मिश्रण (vol/vol ] 5:1) का उपयोग करें। एज़ो उत्पाद टीएलसी प्लेट पर रंगीन धब्बे प्रदर्शित करता है, जो नग्न आंखों से भेद करना आसान है। PMQ स्पॉट TLC पर गायब हो जाते हैं, जब प्रतिक्रिया बंद करो.
  4. एक बर्फ स्नान पर NaOH (2 M) द्वारा पीएच और 10 के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण समायोजित करें। प्रत्येक के लिए एथिल एसीटेट के 20 एमएल के साथ 3 बार मिश्रण निकालने के लिए एक 50 एमएल जुदाई कीप का उपयोग करें, गठबंधन और एक रोटरी वाष्पित्र का उपयोग वैक्यूम के तहत कार्बनिक चरण ध्यान केंद्रित।
    नोट: निष्कर्षण से पहले, 10 से अधिक प्रतिक्रिया समाधान के पीएच मान को समायोजित करें। यह अपने गैर आयनित रूप के रूप में प्राथमिक amine बनाए रख सकते हैं, इस प्रकार निष्कर्षण की सुविधा.
  5. सामान्य दबाव के तहत रिवर्स चरण सिलिका जेल के साथ फ्लैश क्रोमैटोग्राफी द्वारा अवशेषों को शुद्ध करें, एल्यूएंट के रूप में MeOH/H2हे का उपयोग करें। वांछित एजो उत्पादों को देने के लिए lyophilization के माध्यम से उत्पाद समाधान सूखी।
    नोट: एक ही प्रतिक्रिया भी पतला एचसीएल समाधान (0.2 एम) में किया जा सकता है।

2. यूवी-विस माप और सैद्धांतिक गणना

  1. क्रमशः आसुत जल में शुद्ध ऐजो (50 डिग्री सेल्सियस) अथवा 5% एच3पीओ4 विलयन (चह 1.1) को भंग करें। कमरे के तापमान पर एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर पर रिकॉर्ड यूवी-वीस अवशोषण स्पेक्ट्रम (250-700 एनएम)। आगे के विश्लेषण के लिए डेटा को .xls/.xlsx फ़ाइलों के रूप में निर्यात करें.
  2. PMQ ही और azo उत्पादों के लिए सभी सैद्धांतिक गणना प्रदर्शन गाऊसी 16 कार्यक्रम का उपयोग कर. 6-31G आधार सेट के साथ समय पर निर्भर घनत्व कार्यात्मक सिद्धांत (टीडी-DFT) का उपयोग करें। पानी का उपयोग कर polarizable सातत्य मॉडल (पीसीएम) औपचारिकता द्वारा विलायक प्रभाव शामिल करें।
    1. संरचनाएँ आरेखित करें और तब संरचना को एक गाऊसी इनपुट फ़ाइल (.gif) के रूप में सहेजने के लिए सॉफ़्टवेयर (उदा., Chemdraw Office) का उपयोग करें.
    2. गॉस व्यू के साथ GIF फ़ाइल खोलें और बटन गणनाक्लिक करें। गाऊसी गणना सेटअपका चयन करें , ऑप्ट + फ्रेक, और जमीन राज्य-DFT-B3LYP-6-31G; उसके बाद सबमिट करेंक्लिक करें. ज्यामिति ऑप्टिमाइज़ेशन .log फ़ाइल जनरेट करेगा।
    3. ऊपर की प्रक्रिया के बाद, इस लॉग फ़ाइल को खोलने के लिए GausS दृश्य का उपयोग करें। क्लिक करें Calculate-Gausian गणना सेटअप और चुनें ऊर्जा और TD-SCF-DFT-B3LYP-6-31G-एकल केवल. तो जमा करें. ऊर्जा गणना एक और लॉग फ़ाइल और एक घन फ़ाइल उत्पन्न करेगा.
    4. ऊर्जा गणना से लॉग फ़ाइल को खोलने के लिए Gausदृश्य का उपयोग करें। पूर्वानुमानित अवशोषण देखने के लिए परिणाम-यूवी/Vis क्लिक करें.
    5. घन फ़ाइल को खोलने के लिए गॉस व्यू का उपयोग करें। क्लिक करें परिणामs और सतह और आकृति सतह कार्रवाई और नई सतह का चयन कक्षाओं को देखने के लिए.
  3. दोनों प्रयोगात्मक माप और गाऊसी गणना से परिणामों की तुलना करें। परिकलित और मापे गए मानों के बीच प्रतिशत त्रुटि की गणना, निम्न समीकरण के अनुसार.
                  त्रुटि [ ] (Wअधिकतम cal.-Wअधिकतमएक्सपर.) / डब्ल्यूअधिकतमएक्सपर्ट। | $ 100%
    जहाँ Wअधिकतम cal. सैद्धांतिक गणना और Wअधिकतम एक्सपर्ट से अधिकतम अवशोषण तरंगदैर्ध्य का प्रतिनिधित्व करता है. प्रयोगात्मक परिणाम से तरंगदैर्ध्य का प्रतिनिधित्व करता है.

3. पीएमक्यू निर्धारण

  1. 96-वेल प्लेट का उपयोग करके PMQ माप (चित्र 5)
    1. 200 मीटर एनिलाइन विलयन, त्1 के लिए 0ण्2 एम एचसीएल में 4-मेथॉक्सीलाइन को भंग करें। 5 एमएम घोल, R2 प्राप्त करने के लिए सोडियम नाइट्राइट को आसुत जल में घोलदें। उपयोग करने से पहले सभी समाधानों को फ्रिज में 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
    2. एक 96 अच्छी तरह से थाली में R1 के 100 डिग्री एल जोड़ें, और R1 के साथ मिश्रण करने के लिए थाली में नमूना युक्त PMQ के 50 डिग्री एल जोड़ें. फिर प्लेट में 50 डिग्री रु2 डालें। बार-बार पाइपिंग द्वारा समाधानों को मिलाएं।
    3. 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर प्लेट रखें, और फिर 504 एनएम पर यूवी-वीज़ अवशोषण रिकॉर्ड करें। प्रत्येक परीक्षण के लिए 3x दोहराएँ.  azo उत्पाद कमरे प्रकाश जोखिम के साथ स्थिर है; यह अंधेरे में थाली रखने के लिए आवश्यक नहीं है।
    4. आगे के विश्लेषण के लिए डेटा को .xls/.xlsx फ़ाइलों के रूप में निर्यात करें.
  2. मूत्र नमूने में प्रत्यक्ष PMQ माप के लिए अंशांकन वक्र
    1. क्रमशः 0, 1, 2, 5, 10, 20, 50, 10, 200, 200 डिग्री सेल्सियस पर PMQ सांद्रता के साथ सिंथेटिक मूत्र का उपयोग करPMQ समाधान तैयार करें।
    2. एक 96 अच्छी तरह से थाली में R1 के 100 डिग्री एल जोड़ें, और R1 के साथ मिश्रण करने के लिए PMQ मूत्र समाधान के 50 डिग्री सेल्सियस जोड़ें. इसके बाद, उपरोक्त मिश्रण में 50 डिग्री सेल्सियस का मिश्रण मिलाइए। बार-बार पाइपिंग द्वारा समाधानों को मिलाएं। 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर प्लेट रखें, और फिर 504 एनएम पर यूवी-वीज़ अवशोषण रिकॉर्ड करें।
    3. अवशोषण मैं504 और PMQ सांद्रता के आधार पर एक अंशांकन वक्र उत्पन्न करें। एक रिक्त के रूप में PMQ के बिना कुओं से मानका उपयोग करें, और डेटा संसाधन से पहले सभी परीक्षणों से रिक्त मान घटाएँ।
    4. रैखिक समीकरणों को ट के रूप में उत्पन्न करने के लिए रैखिक समीकरणों को निष्पादित करें,जहाँ ज् 504 दउ पर अवशोषण तीव्रता है, ं ं ं ं ं ं ं ं ं ं ं ं ं ं ं ं ं ं ं ं ं ं ं ं ं ं ं ं ं ं ं ं ं ं ं ं ं ं ं ं ं ं ं ं ं ं ं ं ं ं ं ं ं ं ं ं
  3. एक मानव सीरम नमूने में प्रत्यक्ष PMQ माप के लिए अंशांकन वक्र
    1. PMQ समाधान 0, 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200, $M पर PMQ सांद्रता के साथ मानव सीरम का उपयोग कर तैयार करें।
    2. एक 96 अच्छी तरह से थाली में R1 के 100 डिग्री एल जोड़ें और R1 के साथ मिश्रण करने के लिए PMQ सीरम समाधान के 50 डिग्री एल जोड़ें। ऊपर मिश्रण करने के लिए R2 के 50 डिग्री एल जोड़ें और दोहराया pipeting द्वारा समाधान मिश्रण. 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर प्लेट रखें और फिर 504 एनएम पर यूवी-वीज़ अवशोषण रिकॉर्ड करें। आगे के विश्लेषण के लिए डेटा को .xls/.xls/.xlsx फ़ाइल के रूप में निर्यात करें.
    3. अवशोषण मैं504 और PMQ सांद्रता के आधार पर एक अंशांकन वक्र उत्पन्न करें। एक रिक्त के रूप में PMQ के बिना कुओं से मानका उपयोग करें, और डेटा संसाधन से पहले सभी परीक्षणों से रिक्त मान घटाएँ।
    4. रैखिक समीकरणों को ट के रूप में उत्पन्न करने के लिए रैखिक समीकरणों को निष्पादित करें,जहाँ ज् 504 दउ पर अवशोषण तीव्रता है, ं ं ं ं ं ं ं ं ं ं ं ं ं ं ं ं ं ं ं ं ं ं ं ं ं ं ं ं ं ं ं ं ं ं ं ं ं ं ं ं ं ं ं ं ं ं ं ं ं ं ं ं ं ं ं ं
  4. सीरम से PMQ निष्कर्षण
    1. PMQ युक्त सीरम अनुकरण करने के लिए मानव सीरम में PMQ की एक निश्चित राशि जोड़ें. पीएमक्यू निष्कर्षण के लिए, 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में पीएमक्यू युक्त सीरम के 2 एमएल में एथिल एसीटेट/हेक्सेन (7:1 v/v) के मिश्रण का 6 एमएल जोड़ें।
    2. निष्कर्षण प्रणाली में सोडियम हाइड्रॉक्साइड (2 ड) विलयन का 100 डिग्री सेल्सियस घोल मिलाएं। हिंसक रूप से 30 s के लिए एक भंवर मिक्सर का उपयोग कर ट्यूब हिला. कार्बनिक परत लीजिए और वैक्यूम के तहत एक रोटरी वाष्पित्र का उपयोग कर ध्यान केंद्रित.
    3. आसुत पानी के 200 डिग्री सेल्सियस के साथ अवशेषों को फिर से भंग और 220 एनएम छिद्र आकार के साथ एक डिस्क के आकार की झिल्ली के माध्यम से निस्पंदन द्वारा अघुलनशील लिपिड घटकों को हटा दें। परीक्षण के लिए अंतिम समाधान का उपयोग करें.
  5. निष्कर्षण के साथ सीरम से PMQ निर्धारित
    1. आसुत जल में PMQ के लिए अंशांकन वक्र जनरेट करने के लिए चरणों 3.2 या 3.3 का पालन करें। चरण 3.4 के अनुसार PMQ युक्त serums से PMQ निकालें.
    2. एक 96 अच्छी तरह से थाली में R1 के 100 $L और PMQ समाधान के 50 डिग्री सेल्सियस जोड़ें. ऊपर मिश्रण करने के लिए R2 के 50 डिग्री एल जोड़ें, और दोहराया pipeting द्वारा समाधान मिश्रण.
    3. 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर प्लेट रखें और 504 एनएम पर यूवी-वीज़ अवशोषण रिकॉर्ड। नियंत्रण के रूप में R1 और R2 लेकिन PMQ के बिना के साथ कुओं का प्रयोग करें. आगे के विश्लेषण के लिए डेटा को .xls/.xlsx फ़ाइलों के रूप में निर्यात करें.
    4. प्रत्येक परीक्षण के लिए मैं 504 अवशोषण मूल्यों से नियंत्रण मूल्यों घटाना, और फिर अंशांकन वक्र से लाइनर समीकरण के अनुसार एकाग्रता गणना के लिए परिणाम का उपयोग करें।
      नोट: सभी मामलों में PMQ के लिए पता लगाने (LOD) की सीमा एक मानक विधि22के अनुसार गणना की जा सकती है। गणना अंशांकन समारोह पर आधारित था: लोड $ 3.3 ] एसडी /बी,जहां एसडी रिक्त के मानक विचलन है और प्रतिगमन लाइन की ढलान है

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Representative Results

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अभिक्रिया दशाएँ अनुकूलित करने के लिए (चित्र 2), विभिन्न ऐनिलाइन्स का प्रयोग Gries अभिक्रिया के माध्यम से PMQ के साथ युग्म करने के लिए किया जाता था। हम अलग अलग रंग के साथ azos की एक श्रृंखला हासिल की है. यह पाया गया है कि एक इलेक्ट्रॉन दान प्रतिस्थापन के साथ anilines यूवी-विस अवशोषण स्पेक्ट्रम में एक लाल बदलाव पैदा कर सकता है। सैद्धांतिक गणना समय निर्भर घनत्व कार्यात्मक सिद्धांत (टीडी-डीएफटी) के माध्यम से किया गया। चित्र 2Aमें प्रस्तुत के रूप में, गणना परिणाम 3.1% की औसत त्रुटि के साथ ऑप्टिकल माप के साथ अच्छा समझौते में था. 4-मेथॉक्सीलाइन का उपयोग प्रतिक्रिया दर, उत्पाद विलेयता और स्थिरता21में इसके अच्छे प्रदर्शन के कारण पीएमक्यू डिटेक्शन प्रतिक्रिया का संचालन करने के लिए किया गया था। इसके अलावा, से azo उत्पाद 4-methoxyaniline रंग में लाल है, जो नग्न आंखों के साथ भेद करने के लिए आसान है. अतः यह अभिक्रिया नग्न-नेत्रों की पहचान के लिए संभाव्यता प्रदान करती है (चित्र 3)।

चित्र 4क azo उत्पाद 3d के यूवी-विस अवशोषण स्पेक्ट्रम पर पीएच प्रभाव दिखाता है। मैं504 जब 1.0 से 6.0 करने के लिए पीएच बढ़ रही है बदल नहीं है. मैं504 पीएच 7.0 के तहत एक मामूली कमी दर्शाती है, जबकि एक बुनियादी पीएच (8.0 और 9.0) बहुत अवशोषण को प्रभावित करता है. चित्र 4ख Gries अभिक्रिया पर PMQ समाधानों के पीएच प्रभावको दर्शाता है। विभिन्न pHs (4.0, 5.0,6.0, 7.0, 8.0, 9.0) के साथ पीबीएस बफर में PMQ (50 डिग्री सेल्सियस) अलग-अलग खंड 3.1 में वर्णित के रूप में परीक्षण अभिकर्मक के साथ मिश्रित किया गया। मैं504 तो कमरे के तापमान पर 15 मिनट के बाद मापा गया था. जैसा कि संकेत दिया गया है, PMQ समाधानों के मूल pHs (8.0, 9.0) संभावित रूप से प्रतिक्रिया को प्रभावित करते हैं। चित्र 5 PMQ पता लगाने के लिए Gries प्रतिक्रिया करने के लिए सामान्य प्रक्रिया से पता चलता है। प्रोटोकॉल अनुभाग में वर्णित के रूप में, चार चरणों के लिए अवशोषण डेटा मैं504 विश्लेषण के लिए प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं. चित्रा 6A और 6B मूत्र और सीरम नमूनों से PMQ का प्रत्यक्ष पता लगाने के लिए अंशांकन घटता दिखाने के लिए, क्रमशः, नमूना pretreatments के बिना. एक उत्कृष्ट रैखिक संबंध (आर2 र् 0ण्998) तब पाया गया जब पीएमक्यू सिंथेटिक मूत्र में 0 से 200 डिग्री सेल्सियस के बीच होता है। सीरम नमूने के शब्द में, एक रैखिक संबंध 10 से 200 डिग्री सेल्सियस से लेकर सांद्रता में पाया गया.

चित्रा 7A सीरम से PMQ निकालने की प्रक्रिया से पता चलता है. अवशेषों निष्कर्षण और एकाग्रता के बाद आसुत पानी में redissolved थे, और फिर छान लिया. एक असली PMQ युक्त सीरम अनुकरण करने के लिए, PMQ पर अंतिम सांद्रता के साथ मानव सीरम में जोड़ा गया था 0, 0.2, 0.5, 1.0, 2.0 $M. 3ण्4 तथा 3.5 चरणों का उपयोग करते हुए सीरमों में पीएमक्यू की सांद्रता क्रमश0ण्02, 0ण्14, 0ण्44, 0ण्90 तथा 1ण्78 उ, क्रमश :7ब्. पाई गई । परिणाम के आधार पर, PMQ वसूली का प्रतिशत लगभग 90% पाया गया जब PMQ सीरम में 0.5 डिग्री सेल्सियस से अधिक था, जोपिछलीरिपोर्ट 9 के बराबर था.

Figure 1
चित्र 1: पीएमक्यू पर ग्रिस प्रतिक्रिया का स्केमेटिक () नाइट्राइट विश्लेषण के लिए एक शास्त्रीय ग्रिस प्रतिक्रिया। (ख)प्रस्तावित पीएमक्यू डिटेक्शन विधि में ग्रिस अभिक्रिया। यह आंकड़ा पिछले काम21से अनुमति के साथ संशोधित किया गया है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: कृत्रिम अज़ोस के फोटोभौतिक गुण। (ए) यूवी-विस माप और विभिन्न anilines से उत्पन्न azos के अधिकतम अवशोषण के सैद्धांतिक गणना. कोष्ठक के बाहर की संख्याएं आसुत H2O में अधिकतम अवशोषण माप के लिए तटस्थ पीएच स्थितियों के निकट का प्रतिनिधित्व करती हैं; कोष्ठकों में संख्याओं में माप को 5% H3PO4 समाधान (चH $ 1ण्1) में संदर्भित किया जाता है। ]abs/ nm एक्सपर्ट. प्रयोग डेटा का प्रतिनिधित्व करता है और ]abs/calc. सैद्धांतिक गणना डेटा का प्रतिनिधित्व करता है. एक्स उत् तेजन ऊर्जा (ईवी) है, और च थ थथनी ताकत है। (ख) पीएमक्यू की फोटो छवियों और विभिन्न प्रतिस्थापन के साथ एजो उत्पादों, 5% फॉस्फोरिक एसिड समाधान में 50 डिग्री सेल्सियस। (सी) सिंथेटिक उत्पादों की यूवी-वीस स्पेक्ट्रम। मान 0 और 1 के बीच की श्रेणी में सामान्यीकृत किए गए थे. यह आंकड़ा पिछले काम21से अनुमति के साथ संशोधित किया गया है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: पीएमक्यू का रंगीन निर्धारण। (क)समय पर निर्भर तरीके से अधिकतम I504 पर अवशोषण परिवर्तनों की निगरानी करना. प्रतिक्रिया 4-मेथॉक्सीलाइन का उपयोग करके की गई थी, और पीएमक्यू का उपयोग 100 डिग्री सेल्सियस पर किया गया था; () पीएमक्यू की विभिन्न सांद्रता के साथ अभिक्रिया के रंग में परिवर्तन: 4-मेथॉक्सीलाइन विलयन का 400 डिग्री सेल्सियस (200 एम 0.2 एम एचसीएल में) और 200 डिग्री सेल्सियस सोडियम नाइट्राइट का जल में (5 एमएम), विभिन्न सांद्रताओं के पीएमक्यू विलयन के 200 डिग्री एल के साथ (0, 1, 2, 5 , 10, 20, 50, 100 डिग्री सेल्सियस)। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: PMQ का पता लगाने पर पीएच प्रभाव. (ए ) एज़ो उत्पाद 3 डी (50 डिग्री सेल्सियस) के यूवी-विस अवशोषण पर पीएच प्रभाव; (B) पीएमक्यू (50 डिग्री सेल्सियस) पीबीएस बफर में विभिन्न pHs (4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0) के साथ प्रतिक्रिया के रूप में चरण 3.1 में वर्णित प्रदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया गया. पंद्रह मिनट बाद, 504 एनएम पर अवशोषण मापा गया था. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: 96-वेल प्लेट आधारित प्रणाली पर एक ग्रिस प्रतिक्रियाके माध्यम से पीएमक्यू दृढ़ संकल्प । R1 0.2 M HCl में 200 m 4-methoxyaniline समाधान को संदर्भित करता है; R2 आसुत जल में 5 एमएम सोडियम नाइट्राइट को संदर्भित करता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्र ााालक 6ःअंशकः (क) संश्लित मूत्र तथा (ख) मानव सीरम नमूने से पी एम क्यू निर्धारणके लए वक्रों में से. पीएमक्यू की सांद्रता 0-200 डिग्री सेल्सियस से होती है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्र 7: सीरम नमूनों से PMQ दृढ़ संकल्प. (मात्रात्मकविश्लेषण के लिए सीरम नमूनों से PMQ निष्कर्षण का एक ) योजनाबद्ध चित्रण. () 0से 100 उ तक की सीमा के भीतर I504 तथा PMQ सांद्रता के बीच पाया जाने वाला रैखिक संबंध। () सीरम में पीएमक्यू को सीरम में जोड़ी गई यथार्थ राशि की तुलना में ग्रिस प्रतिक्रिया-आधारित विधि द्वारा परिमाणित किया गया था। यह आंकड़ा पिछले काम21से अनुमति के साथ संशोधित किया गया है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Table 1
तालिका 1. लॉग डी की सैद्धांतिक गणना और PMQ और CPMQ के जल वितरण का प्रतिशत.

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Discussion

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हम सुविधाजनक PMQ परिमाणीकरण के लिए एक colorimetric विधि का वर्णन किया. यह संभवतः सबसे सरल और लागत प्रभावी वर्तमान विधि है. इससे भी महत्वपूर्ण बात, इस विधि प्रदान करता है किसी भी उपकरण का उपयोग किए बिना नग्न आँख आधारित PMQ माप सक्षम बनाता है.

PMQ का पता लगाने के लिए अनुकूलित Gries प्रतिक्रिया 504 एनएम पर एक अधिकतम अवशोषण के साथ एक लाल रंग azo उत्पन्न कर सकते हैं. अंतर्जात जैव अणुओं के यूवी-विस अवशोषण से संभावित प्रभाव सीमित है, इस प्रकार जैविक तरल पदार्थ में पीएमक्यू के प्रत्यक्ष माप के लिए वादा करने वाली विधि को बना तेरी है। जैसा कि परिणाम द्वारा दर्शाया गया है, एक उत्कृष्ट रैखिक संबंध (त्2 र् 0ण्998) मूत्र के लिए पीएमक्यू का पता लगाने के लिए 0-200 उउ (चित्र 6क) की सांद्रता सीमा पर पाया गया। पता लगाना (LOD) PMQ के लिए सीमा 0.63 $M होना पाया गया. इस विधि भी मानव सीरम में PMQ के प्रत्यक्ष माप के लिए महान क्षमता दिखाया गया है. सीरम पीएमक्यू का पता लगाने के लिए 10 से 200 डिग्री सेल्सियस तक की सांद्रता में एक उत्कृष्ट रैखिक संबंध पाया गया (चित्र 6ख) । हम आगे निष्कर्षण और एकाग्रता के माध्यम से सीरम नमूना पूर्व इलाज द्वारा संवेदनशीलता में सुधार कर सकते हैं. चित्रा 7 एक सरल निष्कर्षण प्रक्रिया के साथ पता चलता है के रूप में, इस विधि चिकित्सकीय प्रासंगिक पर्वतमाला में सीरम PMQ मात्रा निर्धारित कर सकते हैं. प्रतिक्रिया तंत्र के आधार पर, मुख्य carboxyl metabolite PMQ (CPMQ) संभावित रूप से इसी तरह के यूवी-Vis गुणों के साथ एक azo उत्पाद बना सकते हैं। हालांकि, बुनियादी पीएच शर्तों के तहत तरल-तरल निष्कर्षण संभावित CPMQ से हस्तक्षेप को कम कर सकते हैं। तालिका 1 परिकलित लॉग D और PMQ और CPMQ दोनों का जल वितरण दिखाता है। जैसा कि दिखाया गया है, पीएच और 10 में, पीएमक्यू के 6.33% से कम पानी के चरण में पाया जाएगा, जबकि सीपीएमक्यू के 98.54% से अधिक पानी के चरण में होगा। इसलिए, सैद्धांतिक रूप से, पीएमक्यू के 93.7% से अधिक और सीपीएमक्यू के 1.56% से कम परीक्षण के लिए निकाला जा सकता है। यह निष्कर्ष निकाला जा सकता है कि मुख्य मेटाबोलाइट CPMQ से हस्तक्षेप सीमित है.

PMQ का पता लगाने के लिए प्रक्रिया को संभालने के लिए बहुत आसान है। एक उदाहरण के रूप में 96-अच्छी प्लेट आधारित प्रणाली ले रही है, पूरी प्रक्रिया के चार कदम होते हैं: 1) जोड़ने 100 $L 4-methoxyaniline समाधान के (200 m में 0.2 M HCl) R1 एक 96-अच्छी प्लेट में; 2) R1 के साथ मिश्रण करने के लिए PMQ एकाग्रता-अज्ञात नमूना के 50 डिग्री एल जोड़ने; 3) कमरे के तापमान पर प्रतिक्रिया करने के लिए R2 (5 m सोडियम नाइट्राइट समाधान) के 50 डिग्री एल जोड़ने; और 4) एक स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग कर 504 एनएम पर यूवी-विस अवशोषण रिकॉर्डिंग। एक अज्ञात नमूने से PMQ की एकाग्रता अवशोषण तीव्रता मैं504 और अंशांकन वक्र से रैखिक समीकरण के आधार पर गणना की जा सकती है. पूरी प्रक्रिया ऊष्मायन की आवश्यकता के बिना कमरे के तापमान पर किया जाता है। एक अंधेरे वातावरण पूरी प्रक्रिया के लिए आवश्यक नहीं है, के रूप में रंग का उत्पाद कमरे प्रकाश के प्रति संवेदनशील नहीं है.

यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि प्रतिक्रिया समाधान के लिए समय अपने संतृप्त मैं504 तक पहुँचने के लिए तापमान पर निर्भर है. जैसा कि चित्र 3 में दर्शायागया है, कमरे के तापमान (25 डिग्री सेल्सियस) पर कम से कम 12 मिनट की आवश्यकता थी। यदि 25 डिग्री सेल्सियस से कम तापमान पर अभिक्रिया का निष्पादन किया जाए तो अभिक्रिया का समय अधिक लंबा होगा। PMQ समाधान की बुनियादी पीएच हालत संभावित अवशोषण मैं504को प्रभावित कर सकते हैं. इस समस्या को हल करने के लिए, 7.0 से कम होने के लिए PMQ समाधान का pH समायोजित करें। अन्यथा, एक नया अंशांकन वक्र 7.0 से अधिक पीएच के साथ समाधान के लिए आवश्यक है। इसके अलावा, परीक्षण नमूनों में आंतरिक नाइट्राइट का पता लगाने को प्रभावित कर सकते हैं. हालांकि, यह केवल तब हो सकता है जब आंतरिक नाइट्राइट की एकाग्रता बहुत अधिक है क्योंकि नाइट्राइट (5 एमएम) की उच्च एकाग्रता एक मानक परीक्षण में इस्तेमाल किया गया था।

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Disclosures

लेखकों के पास घोषणा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

लेखकचीनी चिकित्सा के गुआंग्झू विश्वविद्यालय से स्टार्ट-अप ग्रांट और जीजेडयूसीएम (2019QNPY06) के युवा वैज्ञानिक अनुसंधान प्रशिक्षण परियोजना को स्वीकार करते हैं। हम भी सुविधाओं पर समर्थन के लिए चीनी चिकित्सा के गुआंग्झू विश्वविद्यालय के Lingnan चिकित्सा अनुसंधान केंद्र स्वीकार करते हैं.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-Methoxyaniline Aladdin K1709027
2,4-Dimethoxyaniline Heowns 10154207
3,4-Dimethoxyaniline Bidepharm BD21914
4-Methylaniline Adamas-beta P1414526
4-Nitroaniline Macklin C10191447
96-wells,Flat Botton Labserv 310109008
Gaussian@16 software Gaussian, Inc Version:x86-64 SSE4_2-enabled/Linux
Hydrochloric acid GCRF 20180902
Marvin sketch (software) CHEMAXON free edition: 15.6.29
Phosphoric acid Macklin C10112815
Primaquine bisiphosphate 3A Chemicals CEBK200054
Sodium nitrite Alfa Aesar 5006K18R
Sulfonamides TCI(shanghai) GCPLO-BP
Varioskan LUX Plate reader Thermo Fisher Supplied with SkanIt Software 4.1

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References

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यूवी-विस और एंटी-मलेरिया प्राइमाक्विन के नग्न-आंख निर्धारण के लिए अनुकूलित ग्रिस रिएक्शन
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Wu, Y., Wu, S., Huang, X. a., Zeng, Q., Deng, T., Liu, F. Optimized Griess Reaction for UV-Vis and Naked-eye Determination of Anti-malarial Primaquine. J. Vis. Exp. (152), e60136, doi:10.3791/60136 (2019).More

Wu, Y., Wu, S., Huang, X. a., Zeng, Q., Deng, T., Liu, F. Optimized Griess Reaction for UV-Vis and Naked-eye Determination of Anti-malarial Primaquine. J. Vis. Exp. (152), e60136, doi:10.3791/60136 (2019).

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