Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Optimalisert Griess reaksjon for UV-Vis og Naked-Eye bestemmelse av anti-malarial Primaquine

doi: 10.3791/60136 Published: October 11, 2019
* These authors contributed equally

Summary

Denne protokollen beskriver en ny fargemetrisk metode for påvisning av antimalariamidler primaquine (PMQ) i syntetiske urinen og humant serum.

Abstract

Primaquine (PMQ), en viktig anti-malarial narkotika, har blitt anbefalt av verdenshelseorganisasjon (WHO) for behandling av livstruende infeksjoner forårsaket av P. vivax og ovale. Men, PMQ har uønskede bivirkninger som fører til akutt hemolyse hos pasienter med glukose-6-fosfat dehydrogenase (G6PD) mangel. Det er behov for å utvikle enkle og pålitelige metoder for PMQ besluttsomhet med det formål å dosering overvåking. I begynnelsen av 2019-tiden har vi rapportert en UV-Vis og en naken-øye-basert tilnærming for PMQ-metrisk kvantifisering. Oppdagelsen var basert på en Griess-lignende reaksjonen imellom PMQ og aniliner, hvilke kanne utvikle farget AZO produktene. Deteksjons grensen for direkte måling av PMQ i syntetisk urin er i nanomolar området. Videre har denne metoden vist stort potensiale for PMQ kvantifisering fra humane serumprøver ved klinisk relevante konsentrasjoner. I denne protokollen vil vi beskrive de tekniske detaljene om synteser og karakterisering av fargede AZO produkter, reagens forberedelsen og prosedyrene for PMQ bestemmelse.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

PMQ er en av de viktigste antimalariamidler narkotika, det fungerer ikke bare som en vev schizontocide for å hindre tilbakefall, men også som en gametocytocide å avbryte sykdom overføring1,2,3,4. Intravaskulær hemolyse er en av de om bivirkninger av PMQ, som blir svært alvorlig i de mangelfull i G6PD. Det er kjent at G6PD genetiske uorden er distribuert over hele verden med en gen frekvens mellom 3-30% i malaria endemiske områder. Alvorlighetsgraden av PMQ svakhet avhenger av graden av G6PD mangel samt dose og varigheten av PMQ eksponering5,6. For å redusere risikoen, WHO har anbefalt en enkelt lav dose (0,25 mg base/kg) av PMQ for malaria behandling. Men dette er fortsatt utfordret av variasjoner i pasientens medikament følsomhet5,7. Dose overvåkning er nødvendig for å vurdere farmakokinetikken etter PMQ-administrasjon, som kan påvirke Dosejustering for en vellykket behandling med begrenset toksisitet.

Høy ytelse flytende kromatografi (HPLC) er den mest brukte teknikken for PMQ klinisk bestemmelse. Endoh et al. rapporterte et HPLC-system med en UV-detektor for serum PMQ kvantifisering ved hjelp av en C-18 polymer gel kolonne8. I deres system ble serumproteiner først utløst med acetonitril, og deretter PMQ i supernatanten ble separert for HPLC. Kalibreringskurven var lineær over konsentrasjons området fra 0,01 til 1,0 μg/mL8. En annen metode basert på en omvendt fase HPLC med UV-deteksjon ved 254 NM er rapportert for kvantifisering av PMQ og dens viktigste metabolitter9. Kalibreringskurven for PMQ var lineær i området mellom 0.025-100 μg/mL. En ekstra væske-væske ekstraksjon med blandede Heksan og etanol acetate som organiske fase ble brukt for PMQ separasjon med prosentvis gjenvinning nådd 89%9. Mer nylig utviklet Miranda et al. en UPLC-metode med UV-deteksjon ved 260 NM for PMQ-analyse i tablett formuleringer med en deteksjonsgrense på 3 μg/mL10.

Selv om HPLC metoder viser lovende følsomhet i narkotika bestemmelse og følsomheten kan forbedres ytterligere hvis HPLC er utstyrt med en masse spektrometer, er det fortsatt noen ulemper. Direkte narkotika målinger i biologiske væsker er vanligvis utilgjengelige for HPLC, ettersom mange biomolekyler i stor grad kan påvirke analysen. Ytterligere utdrag er nødvendig for å fjerne endogene molekyler før HPLC analyse11,12. Videre er PMQ deteksjon av en HPLC-UV-detektor vanligvis utført på sin maksimale absorpsjon bølgelengde (260 NM).; Det er imidlertid mange endogene molekyler i biologiske væsker med en sterk absorbansen på 260 NM (f. eks, aminosyrer, vitaminer, nukleinsyre syrer og urochrome pigmenter), og dermed forstyrrer PMQ UV-deteksjon. Det er behov for å utvikle enkle og kostnadseffektive metoder for PMQ bestemmelse med rimelig følsomhet og selektivitet.

Den Griess reaksjonen ble først presentert i 1879 som en metrisk test for nitritt deteksjon13,14,15,16. Nylig har denne reaksjonen blitt grundig utforsket for å oppdage ikke bare nitritt, men også andre biologisk relevante molekyler17,18,19,20. Vi har tidligere rapportert den første systematiske studien av en uventet Griess reaksjon med PMQ (figur 1). I dette systemet, PMQ er i stand til å danne fargede AZOS når kombinert med erstattet aniliner i nærvær av nitritt ioner under Sure forhold. Vi har videre funnet at fargen på AZOS varierte fra gult til blått når du øker elektron donerer effekten av substituent på aniliner21. En UV-Vis absorpsjon basert fargemetrisk metode for PMQ kvantifisering har blitt utviklet gjennom den optimaliserte reaksjonen mellom 4-methoxyaniline og PMQ. Denne metoden har vist stort potensiale for sensitiv og selektiv påvisning av PMQ i bio-relevante væsker. Her har vi som mål å beskrive de detaljerte prosedyrene for PMQ bestemmelse basert på denne farge metriske strategien.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. syntese av fargede AZOS

  1. I en 25 mL rund bunn kolbe (RBF), oppløse anilin (0,1 mmol) og primaquine bisphosphate (45,5 mg, 0,1 mmol) i 10 mL av H3PO4 Solution (5% v/v). Sett RBF på et is bad, legge til en røre bar med riktig størrelse i løsningen, og sette RBF på en røre plate.
    Merk: For syntese av AZO 3g (figur 2), bruk 0,2 mmol av primaquine bisphosphate.
  2. Løs opp NaNO2 (6,9 mg, 0,1 mmol) i 1 ml avkjølt vann og legg deretter inn i reaksjonsblandingen dråpevis. Fjern isen bad, og holde reaksjonsblandingen rørt ved romtemperatur.
  3. Overvåk reaksjonen med en silica gel belagt tynt lag kromatografi (TLC) plate. Bruk en diklormetan (DCM)/METHANOL (MeOH)-blanding (Vol/Vol = 5:1) som eluent for TLC. Den AZO produktet viser fargede flekker på TLC plate, som er lett å skille med nakne øyne. Stopp reaksjonen når PMQ flekker forsvinne på TLC.
  4. Juster reaksjonsblandingen til pH > 10 ved NaOH (2 M) på et is bad. Bruk en 50 mL separasjon trakt å trekke ut blandingen 3 ganger med 20 mL av etanol acetate for hver, kombinere og konsentrere den organiske fasen under vakuum ved hjelp av en roterende fordamper.
    Merk: Før ekstraksjon, Juster pH-verdien av reaksjons løsninger over 10. Dette kan opprettholde den primære amin som sin ikke-ionisert form, og dermed tilrettelegge utvinning.
  5. Rens rester av blits kromatografi med omvendt-fase silica gel under normalt trykk, ved hjelp av MeOH/H2O som eluent. Tørk produkt løsningen gjennom lyophilization for å gi ønskede AZO produkter.
    Merk: Den samme reaksjonen kan også utføres i fortynnede HCl-løsninger (0,2 M).

2. UV-Vis målinger og teoretisk beregning

  1. Løs opp ren AZO (50 μM) i destillert vann eller i henholdsvis 5% H3PO4 Solution (pH 1,1). Ta opp UV-Vis absorpsjon Spectra (250-700 NM) på en spektrofotometer ved romtemperatur (25 ° c). Eksporter dataene som. xls/. xlsx-filer for videre analyse.
  2. Utfør alle teoretiske beregninger for PMQ selv og AZO produkter ved hjelp av Gaussian 16-programmet. Bruk tid avhengig tetthet funksjonell teori (TD-DFT) med en 6-31G basis sett. Inkluder løsningsmiddel effekter av polarizable (PCM) formalisme med vann.
    1. Bruk programvare (for eksempel Chemdraw Office) til å tegne strukturer og deretter lagre strukturen som en Gaussian input-fil (. gif).
    2. Åpne GIF-filen med Gauss-visning og klikk på knappen Beregn. Velg Gaussian beregning oppsett, opt + freqog Ground State-dft-B3LYP-6-31G; Klikk deretter Send. Geometri optimaliseringen vil generere en. log-fil.
    3. Følg fremgangsmåten ovenfor, bruk Gauss-visning for å åpne denne loggfilen. Klikk Beregn-Gaussian beregning oppsett og velg energi og TD-scf-dft-B3LYP-6-31G-singlet bare. Deretter sender. Energi beregningen vil generere en annen loggfil og en kubefil.
    4. Bruk Gauss-visning for å åpne loggfilen fra energi beregningen. Klikk resultater-UV/Vis å se spådd absorpsjon.
    5. Bruk Gauss-visning til å åpne kubefilen. Klikk på resultats og velg overflate og konturer-overflate handlinger og ny overflate for å se banene.
  3. Sammenlign resultatene fra både eksperimentell måling og Gaussian beregning. Beregn prosent feilen mellom de beregnede og målte verdiene, i henhold til følgende ligning.
                  Feil = | (WMax Cal.-wMaxExper.) /WMaxExper. | × 100%
    der WMax Cal. representerer den maksimale absorbansen bølgelengden fra teoretisk beregning og wMax Exper. representerer bølgelengden fra eksperimentell resultat.

3. PMQ bestemmelse

  1. PMQ måling ved hjelp av en 96-brønn plate (figur 5)
    1. Oppløsning 4-methoxyaniline i 0,2 M HCl for en 200 mM anilin løsning, R1. Oppløse natrium nitritt i destillert vann for å oppnå en 5 mM løsning, R2. Oppbevar alle løsningene i kjøleskapet ved 4 ° c før bruk.
    2. Tilsett 100 μL av R1 i en 96-brønn plate, og tilsett 50 μL av PMQ som inneholder prøve inn i platen for å blande med R1. Deretter legger du til 50 μL av R2 i platen. Bland løsningene ved gjentatt pipettering.
    3. Oppbevar platen i romtemperatur i 15 minutter, og ta deretter opp UV-Vis absorbansen ved 504 NM. Gjenta 3x for hver test.  Det AZO produktet er stabilt med lys eksponering på rommet; det ikke nødvendig å holde platen under mørkt.
    4. Eksporter dataene som. xls/. xlsx-filer for videre analyse.
  2. Kalibrerings kurve for direkte PMQ-måling i en urinprøve
    1. Klargjør PMQ-løsninger ved hjelp av syntetisk urin med PMQ-konsentrasjoner på henholdsvis 0, 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200 μM.
    2. Tilsett 100 μL av R1 i en 96 brønn plate, og tilsett 50 μL av PMQ urin løsning for å blande med R1. Deretter legger 50 μL av R2 til ovenstående blanding. Bland løsningene ved gjentatt pipettering. Oppbevar platen i romtemperatur i 15 minutter, og ta deretter opp UV-Vis absorbansen ved 504 NM.
    3. Generer en kalibrerings kurve basert på absorbansen i504 og PMQ konsentrasjoner. Bruk verdiene fra brønnene uten PMQ som en blank, og trekk fra de tomme verdiene fra alle testene før databehandling.
    4. Utfør en lineær tilpasning for å generere lineære ligninger som y = aX + b, der Y er absorbansen intensitet ved 504 NM, X er konsentrasjonen av PMQ, a er skråningen, og b er Y-skjæringspunktet til den lineære linjen.
  3. Kalibrerings kurve for direkte PMQ-måling i et humant serum prøve
    1. Klargjør PMQ-løsninger ved hjelp av humant serum med PMQ-konsentrasjoner på henholdsvis 0, 1, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200, μM.
    2. Tilsett 100 μL av R1 i en 96 brønn plate og tilsett 50 μL av PMQ serum løsning for å blande med R1. Tilsett 50 μL av R2 til ovenstående blanding og bland løsningene ved gjentatt pipettering. Oppbevar platen i romtemperatur i 15 minutter, og ta deretter opp UV-Vis absorbansen ved 504 NM. Eksporter dataene som. xls/. xlsx-fil for videre analyse.
    3. Generer en kalibrerings kurve basert på absorbansen i504 og PMQ konsentrasjoner. Bruk verdiene fra brønnene uten PMQ som en blank, og trekk fra de tomme verdiene fra alle testene før databehandling.
    4. Utfør en lineær tilpasning for å generere lineære ligninger som y = aX + b, der Y er absorbansen intensitet ved 504 NM, X er konsentrasjonen av PMQ, a er skråningen, og b er Y-skjæringspunktet til den lineære linjen.
  4. PMQ-ekstraksjon fra serum
    1. Legg til en viss mengde PMQ i humant serum for å simulere PMQ-inneholdende serum. For PMQ-ekstraksjon, tilsett 6 mL blanding av etanol/heksan (7:1 v/v) i 2 mL PMQ-inneholdende serum i et 15 mL sentrifugerør.
    2. Tilsett 100 μL av natriumhydroksid (2 M) løsning på avsugs systemet. Rist røret voldsomt med en Vortex-mikser i 30 s. samle det organiske laget og konsentrere det ved hjelp av en roterende fordamper under vakuum.
    3. Redissolve rester med 200 μL av destillert vann og fjerne uløselig lipid komponenter ved filtrering gjennom en disk-formet membran med 220 NM pore størrelse. Bruk den endelige løsningen for test.
  5. Bestem PMQ fra serum med ekstraksjon
    1. Følg trinn 3,2 eller 3,3 for å generere kalibreringskurven for PMQ i destillert vann. Pakk ut PMQ fra PMQ-inneholdende serum i henhold til trinn 3,4.
    2. Tilsett 100 μL av R1 og 50 μL av PMQ-løsning i en 96-brønn plate. Tilsett 50 μL av R2 til ovenstående blanding, og bland løsningene ved å gjenta pipettering.
    3. Oppbevar platen i romtemperatur i 15 minutter og ta opp UV-Vis absorbansen ved 504 NM. Bruk brønnene med R1 og R2, men uten PMQ som kontroller. Eksporter dataene som. xls/. xlsx-filer for videre analyse.
    4. Trekk kontrollverdiene fra de absorbansen verdiene i504 for hver test, og bruk deretter resultatet for konsentrasjon beregninger i henhold til liner ligningen fra kalibreringen kurven.
      Merk: Grensen for påvisning (LOD) for PMQ i alle tilfeller kan beregnes i henhold til en standard metode22. Beregningen var basert på kalibrerings funksjonen: LOD = 3,3 × SD/b, der SD er standardavviket for blank og b er stigningstallet for regression linjen

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

For å optimalisere reaksjons forholdene (figur 2) ble ulike aniliner brukt til å koble sammen med PMQ gjennom Griess-reaksjonen. Vi har oppnådd en rekke AZOS med forskjellige farger. Det har blitt funnet at aniliner med et elektron donerer substituent kan forårsake en rød-Shift i UV-Vis absorpsjon spekteret. Teoretiske beregninger ble gjennomført gjennom tid avhengig tetthet funksjonell teori (TD-DFT). Som presentert i figur 2a, var beregningsresultatet i god enighet med optiske målinger med gjennomsnittlig feil på 3,1%. 4-methoxyaniline ble deretter brukt til å gjennomføre PMQ oppdagelsen reaksjonen på grunn av sin gode ytelse i reaksjonshastighet, produkt løselighet, og stabilitet21. Videre er det AZO produktet fra 4-methoxyaniline rød i farge, noe som er lett å skille med nakne øyne. Denne reaksjonen gir derfor potensial for PMQ-deteksjon av nakne øyne (Figur 3).

Figur 4a viser pH-effekten på UV-Vis absorpsjon spekteret av AZO produktet 3D. Jeg504 endrer ikke når økende pH fra 1,0 til 6,0. Jeg504 under pH 7,0 utstillinger en svak nedgang, mens en grunnleggende pH (8,0 og 9,0) i stor grad påvirker absorpsjonen. Figur 4b viser pH-effekten av PMQ-løsninger på Griess-reaksjonen. PMQ (50 μM) i PBS buffer med ulike pHs (4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0) ble individuelt blandet med testing reagens som beskrevet i punkt 3,1. Jeg504 ble deretter målt etter 15 minutter ved romtemperatur. Som indikert, grunnleggende pHs (8,0, 9,0) av PMQ løsninger potensielt påvirke reaksjonen. Figur 5 viser den generelle prosedyren for å utføre Griess REAKSJONEN for PMQ deteksjon. Som beskrevet i protokoll seksjonen, er det nødvendig med fire trinn for å innhente absorpsjons dataene i504 for analyse. Figur 6a og 6b viser kalibrerings kurvene for direkte påvisning av PMQ fra urin-og serumprøver, uten prøve pretreatments. Et utmerket lineært forhold (R2 = 0,998) ble funnet når PMQ i syntetisk urin varierer fra 0 til 200 μM. På sikt av serum prøven ble det funnet et lineært forhold ved konsentrasjonen fra 10 til 200 μM.

Figur 7a viser prosedyren for å trekke ut PMQ fra serum. Restene ble gjenoppløses i destillert vann etter ekstraksjon og konsentrasjon, og deretter filtrert. For å simulere en ekte PMQ-inneholdende serum, PMQ ble lagt inn i humant serum med endelige konsentrasjoner på 0, 0,2, 0,5, 1,0, 2,0 μM. Ved hjelp av trinn 3,4 og 3,5 ble konsentrasjonen av PMQ i serum funnet å være 0,02, 0,14, 0,44, 0,90 og 1,78 μM, henholdsvis (figur 7C). Basert på resultatet ble prosentandelen av PMQ-utvinningen funnet å være rundt 90% når PMQ var over 0,5 μM i serum, noe som kunne sammenlignes med tidligere rapporter9.

Figure 1
Figur 1: skjematisk av GRIESS reaksjonen på PMQ. (A) en klassisk Griess reaksjon for nitritt analyse. (B) Griess reaksjonen i den foreslåtte PMQ gjenkjennings metoden. Dette tallet er endret med tillatelse fra tidligere arbeid21. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Photophysical egenskaper for syntetiske AZOS. (A) UV-Vis måling og teoretisk beregning av maksimal absorpsjon av AZOS generert fra ulike aniliner. Tallene utenfor parentes representerer for maksimal absorbansen måling i destillert H2O nær nøytral pH forhold; tallene i parentes refererer til målingen i 5% H3PO4 solution (pH ≈ 1,1). λABS/NM Exper. representerer eksperimentdataene og λABS/calc. representerer de teoretiske beregnings dataene. Eeks er eksitasjon energi (EV), og f er oscillator styrke. (B) Foto bilder av PMQ og AZO produkter med ulik substituentene, 50 μM i 5% fosfors syre løsning. (C) UV-Vis Spectra av syntetiske produkter. Verdiene ble normalisert til et område mellom 0 og 1. Dette tallet er endret med tillatelse fra tidligere arbeid21. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: fargemetrisk bestemmelse av PMQ. (A) overvåking av absorbansen endringer ved maksimal i504 i en tid avhengig måte. Reaksjonen ble utført med 4-methoxyaniline, og PMQ ble brukt ved 100 μM; (B) fargeendringer av reaksjonen med ulike KONSENTRASJONER av PMQ: 400 μL av 4-methoxyaniline oppløsning (200 mM i 0,2 M HCL) og 200 μL av natrium nitritt i vann (5 mm), med 200 ΜL av PMQ løsning av ulike konsentrasjoner (0, 1, 2, 5 , 10, 20, 50, 100 μM). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: pH effekt på PMQ deteksjon. (A) pH-effekter på UV-Vis-absorbansen av AZO produkt 3D (50 μM); (B) PMQ (50 μM) i PBS-bufferen med forskjellige pHs (4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0) ble brukt til å utføre reaksjonen som beskrevet i trinn 3,1. Femten minutter senere ble absorbansen ved 504 NM målt. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: PMQ bestemmelse gjennom en Griess reaksjon på en 96-brønn plate basert system. R1 refererer til 200 mM 4-methoxyaniline løsning i 0,2 M HCl; R2 refererer til 5 mM natrium nitritt i destillert vann. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: KALIBRERINGS kurver for PMQ-bestemmelse fra (A) syntetisk urin og (B) humane serumprøver. Konsentrasjonen av PMQ spenner fra 0-200 μM. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7: PMQ bestemmelse fra serumprøver. (A) skjematisk illustrasjon av PMQ-ekstraksjon fra serumprøver for den kvantitative analysen. (B) den lineære forholdet funnet mellom i504 og PMQ konsentrasjon innenfor området fra 0 til 100 μM. (C) PMQ i serum ble kvantifisere av Griess reaksjons BAS ert metode sammenlignet med det eksakte beløpet som ble lagt inn i serum. Dette tallet er endret med tillatelse fra tidligere arbeid21. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Table 1
Tabell 1. Teoretisk beregning av log D og prosentandelen av vannfordeling av PMQ og CPMQ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Vi beskrev et fargemetrisk metode for praktisk PMQ kvantifisering. Det er potensielt den mest enkle og kostnadseffektive gjeldende metoden. Enda viktigere, denne metoden tilbyr muliggjør nakne øyne basert PMQ måling uten å bruke noe utstyr.

Den optimaliserte Griess-reaksjonen for PMQ-deteksjon kan generere en rød farge AZO med maksimal absorpsjon ved 504 NM. Den potensielle påvirkningen fra UV-Vis absorpsjon av endogene biomolekyler er begrenset, og dermed gjør metoden lovende for direkte måling av PMQ i biologiske væsker. Som indikert av resultatet, ble det funnet et utmerket lineært forhold (R2 = 0,998) for urin PMQ deteksjon over konsentrasjons området på 0-200 ΜM (figur 6a). Grensen for påvisning (LOD) for PMQ ble funnet å være 0,63 μM. Denne metoden har også vist store potensialer for direkte måling av PMQ i humant serum. Et utmerket lineært forhold ble funnet i konsentrasjonen fra 10 til 200 μM for serum PMQ-deteksjon (figur 6b). Vi kan ytterligere forbedre følsomheten ved å pre-behandle serum prøven gjennom ekstraksjon og konsentrasjon. Som figur 7 viser med en enkel utvinningsprosess, kan denne metoden KVANTIFISERE serum PMQ på klinisk relevante områder. Basert på reaksjons mekanismen, kan den viktigste kar bok syl metabolitten av PMQ (CPMQ) potensielt danne et AZO produkt med lignende UV-Vis egenskaper. Men væske-væske-ekstraksjon under grunnleggende pH-forhold kan potensielt redusere forstyrrelsen fra CPMQ. Tabell 1 viser beregnet Logg D og vannfordeling for både PMQ og CPMQ. Som vist, ved pH > 10, mindre enn 6,33% av PMQ vil bli funnet i vannfasen, mens over 98,54% av CPMQ vil være i vannfasen. Derfor teoretisk sett, mer enn 93,7% av PMQ og mindre enn 1,56% av CPMQ kunne trekkes ut for test. Det kan bli konkludert med at forstyrrelsen fra de viktigste metabolitten CPMQ er begrenset.

Fremgangsmåten for PMQ deteksjon er veldig lett å håndtere. Ved å ta 96-plate-basert system som eksempel, består hele prosedyren av fire trinn: 1) og legger til 100 μL av 4-methoxyaniline oppløsning (200 mM i 0,2 M HCl) R1 inn i en 96-brønn plate; 2) legge 50 μL av PMQ konsentrasjon-ukjent prøve å blande med R1; 3) legge til 50 μL av R2 (5 mM natrium nitritt oppløsning) for å utføre reaksjonen ved romtemperatur; og 4) opptak av UV-Vis absorpsjon ved 504 NM ved hjelp av en spektrometer. Konsentrasjonen av PMQ fra en ukjent prøve kan beregnes basert på absorpsjons intensiteten i504 og den lineære ligningen fra kalibreringskurven. Hele prosedyren utføres ved romtemperatur uten behov for inkubasjons. Et mørkt miljø er ikke nødvendig for hele prosedyren, da det fargede produktet ikke er sensitivt til rom lys.

Det bør bemerkes at tiden for reaksjonen løsning for å nå sin mettet jeg504 er temperatur avhengig. Som vist i Figur 3, minst 12 min var nødvendig ved romtemperatur (25 ° c). Reaksjonstiden vil være lengre hvis du utfører reaksjonen ved temperaturer under 25 ° c. Den grunnleggende pH-tilstanden til PMQ-løsninger kan potensielt påvirke absorbansen i504. For å løse dette problemet må du justere pH-verdien i PMQ-løsningen til å være mindre enn 7,0. Ellers er det nødvendig med en ny kalibrerings kurve for løsningen med pH over 7,0. I tillegg kan indre nitritter i de testede prøvene påvirke gjenkjenningen. Dette kan imidlertid bare forekomme når konsentrasjonen av iboende nitritter er ekstremt høy siden en høy konsentrasjon av nitritt (5 mM) ble brukt i en standard test.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å erklære.

Acknowledgments

Forfatterne erkjenner oppstart Grant fra Guangzhou University of Chinese Medicine og ungdom vitenskapelig forskning trening prosjektet GZUCM (2019QNPY06). Vi erkjenner også Lingnan Medical Research Center ved Guangzhou University of Chinese Medicine for støtte på fasiliteter.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-Methoxyaniline Aladdin K1709027
2,4-Dimethoxyaniline Heowns 10154207
3,4-Dimethoxyaniline Bidepharm BD21914
4-Methylaniline Adamas-beta P1414526
4-Nitroaniline Macklin C10191447
96-wells,Flat Botton Labserv 310109008
Gaussian@16 software Gaussian, Inc Version:x86-64 SSE4_2-enabled/Linux
Hydrochloric acid GCRF 20180902
Marvin sketch (software) CHEMAXON free edition: 15.6.29
Phosphoric acid Macklin C10112815
Primaquine bisiphosphate 3A Chemicals CEBK200054
Sodium nitrite Alfa Aesar 5006K18R
Sulfonamides TCI(shanghai) GCPLO-BP
Varioskan LUX Plate reader Thermo Fisher Supplied with SkanIt Software 4.1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fernando, D., Rodrigo, C., Rajapakse, S. Primaquine in vivax malaria: an update and review on management issues. Malar Journal. 10, 351 (2011).
  2. Deng, C., et al. Large-scale Artemisinin-Piperaquine Mass Drug Administration With or Without Primaquine Dramatically Reduces Malaria in a Highly Endemic Region of Africa. Clinical Infectious Diseases. 67, (11), 1670-1676 (2018).
  3. Pavic, K., et al. Primaquine hybrids as promising antimycobacterial and antimalarial agents. European Journal of Medical Chemistry. 143, 769-779 (2018).
  4. McQueen, A., et al. Synthesis, characterization, and cellular localization of a fluorescent probe of the antimalarial 8-aminoquinoline primaquine. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 27, (20), 4597-4600 (2017).
  5. Ashley, E. A., Recht, J., White, N. J. Primaquine: the risks and the benefits. Malaria Journal. 13, (1), 418 (2014).
  6. Watson, J., Taylor, W. R., Menard, D., Kheng, S., White, N. J. Modelling primaquine-induced haemolysis in G6PD deficiency. Elife. 6, (2017).
  7. Beutler, E. Glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency: a historical perspective. Blood. 111, (1), 16-24 (2008).
  8. Endoh, Y. S., et al. High-performance liquid chromatographic determination of pamaquine, primaquine and carboxy primaquine in calf plasma using electrochemical detection. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications. 579, (1), 123-129 (1992).
  9. Dua, V. K., Kar, P. K., Sarin, R., Sharma, V. P. High-performance liquid chromatographic determination of primaquine and carboxyprimaquine concentrations in plasma and blood cells in Plasmodium vivax malaria cases following chronic dosage with primaquine. Journal of Chromatography B: Biomedical Applications. 675, (1), 93-98 (1996).
  10. Miranda, T. A., Silva, P. H. R., Pianetti, G. A., César, I. C. Simultaneous quantitation of chloroquine and primaquine by UPLC-DAD and comparison with a HPLC-DAD method. Malaria Journal. 14, 29 (2015).
  11. Tatsuno, M., Nishikawa, M., Katagi, M., Tsuchihashi, H. Simultaneous determination of illicit drugs in human urine by liquid chromatography-mass spectrometry. Journal of Analytical Toxicology. 20, (5), 281-286 (1996).
  12. Erni, F. Use of high-performance liquid chromatography in the pharmaceutical industry. Journal of Chromatography A. 507, 141-149 (1990).
  13. Tsikas, D. Analysis of nitrite and nitrate in biological fluids by assays based on the Griess reaction: Appraisal of the Griess reaction in the l-arginine/nitric oxide area of research. Journal of Chromatography B. 851, (1), 51-70 (2007).
  14. Zurcher, D. M., Adhia, Y. J., Romero, J. D., McNeil, A. J. Modifying a known gelator scaffold for nitrite detection. Chemical Communications. 50, (58), 7813-7816 (2014).
  15. Kunduru, K. R., Basu, A., Tsah, T., Domb, A. J. Polymer with pendant diazo-coupling functionality for colorimetric detection of nitrates. Sensors and Actuators B: Chemical. 251, 21-26 (2017).
  16. Li, D., Ma, Y., Duan, H., Deng, W., Li, D. Griess reaction-based paper strip for colorimetric/fluorescent/SERS triple sensing of nitrite. Biosensors and Bioelectronics. 99, 389-398 (2018).
  17. Deng, T., et al. A novel strategy for colorimetric detection of hydroxyl radicals based on a modified Griess test. Talanta. 195, 152-157 (2019).
  18. Pang, H., et al. A photo-responsive macroscopic switch constructed using a chiral azo-calix[4]arene functionalized silicon surface. Chemical Communications (Camb). 54, (24), 2978-2981 (2018).
  19. Kaur, N., Dhaka, G., Singh, J. Simple naked-eye ratiometric and colorimetric receptor for anions based on azo dye featuring with benzimidazole unit. Tetrahedron Letters. 56, (9), 1162-1165 (2015).
  20. Liu, F., Lou, J., Hristov, D. X-Ray responsive nanoparticles with triggered release of nitrite, a precursor of reactive nitrogen species, for enhanced cancer radiosensitization. Nanoscale. 9, (38), 14627-14634 (2017).
  21. Deng, T., et al. An unexpected Griess reaction on the important anti-malarial drug primaquine and its application for drug determination. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 171, 8-14 (2019).
  22. Shrivastava, A., Gupta, V. Methods for the determination of limit of detection and limit of quantitation of the analytical methods. Chronicles of Young Scientists. 2, (1), 21-25 (2011).
Optimalisert Griess reaksjon for UV-Vis og Naked-Eye bestemmelse av anti-malarial Primaquine
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wu, Y., Wu, S., Huang, X. a., Zeng, Q., Deng, T., Liu, F. Optimized Griess Reaction for UV-Vis and Naked-eye Determination of Anti-malarial Primaquine. J. Vis. Exp. (152), e60136, doi:10.3791/60136 (2019).More

Wu, Y., Wu, S., Huang, X. a., Zeng, Q., Deng, T., Liu, F. Optimized Griess Reaction for UV-Vis and Naked-eye Determination of Anti-malarial Primaquine. J. Vis. Exp. (152), e60136, doi:10.3791/60136 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter