שימוש גמיש זהב-טיטניום תגובת התאים כדי לדמות פעילות מיקרוביאלית תלויי לחץ בהקשר של ביוניג תת משטח

Summary

פרוטוקול זה מתאר ניסויים מיקרוביאלית תחת לחצים מוגבה ללמוד תהליכי ביוניג באתרו. הגישה הניסיונית מעסיקה כור בלחץ גבוה נדנדה מצויד תא התגובה זהב-טיטניום המכיל תרבות מיקרוביאלית של חומצי, ברזל עשיר בברזל.

Abstract

לימודי מעבדה בחקר תהליכי מיקרוביאלית של פני השטח, כגון מתכת המעכבות בפיקדונות עפרות עמוק (ביונינג), לחלוק מכשולים משותפים ומאתגרים, כולל תנאי הסביבה המיוחדים שצריך לשכפל, למשל, לחץ גבוה ובמקרים מסוימים פתרונות חומציים. הראשון מחייב התקנה ניסיונית המתאימה ללחץ של עד 100 bar, בעוד האחרון דורש מכולה נוזלית עם עמידות כימית גבוהה מפני תגובות כימיות ובלתי רצויות של קורוזיה עם קיר המיכל. כדי לעמוד בתנאים אלה עבור יישום בתחום של ביונינג באתרו, מיוחד גמיש זהב-טיטניום התגובה בתוך המחולל ללחץ גבוה נדנדה שימש במחקר זה. המערכת המתוארת מאפשרת סימולציה של ביוניג באתרו באמצעות הפחתת ברזל מונחה גופרית באמצעות בקרת שליטה, מבוקרת לחץ, כימית בסביבה ניסיוני מאוד. תא התגובה הגמיש זהב-טיטניום יכול להכיל עד 100 mL של פתרון לדוגמה, אשר ניתן לטעום בכל נקודת זמן נתון בעוד המערכת שומרת על הלחץ הרצוי. ניתן לבצע ניסויים בצירי זמן החל משעות עד חודשים. הרכבת מערכת המחולל לחץ גבוה די זמן רב. עם זאת, כאשר תהליכים מורכבים ומאתגרים (מיקרוביולוגית) המתרחשים במשטח התחתי העמוק של כדור הארץ, יש לחקור במעבדה את היתרונות של מערכת זו, הגוברים על החסרונות. התוצאות מצאו, כי גם בלחץ גבוה את החיידקים הוא פעיל, אך בקצב חילוף החומרים נמוך באופן משמעותי.

Introduction

במהלך העשור האחרון, המאמצים למזער את ההשפעה של הכרייה על הסביבה גדלו. כריית בור פתוח עבור הפקת חומרי גלם של עפרות (g., עשיר בנחושת הגופרתי), משפיע על הנוף שמסביב על ידי פעילויות החפירה ועל ידי כמויות גדולות של סלעי פסולת ושרידי עפרות מעובד לאחר החילוץ של יקר מתכות כמו נחושת. מיצוי הנחושת ישירות עפרות במשטח המשנה באופן משמעותי להפחית את ההשפעות האלה. הטכנולוגיה של ביוניג באתרו היא מועמד מבטיח לתהליך¹. פרסום זה מתאר את השימוש בפעילות גירוי מיקרוביאלית כדי לחלץ את המתכות יקרות מן עפרות לתוך פתרון מימית במשטח המשנה. לפיכך, פתרון עשיר בנחושת ניתן לשאוב בקלות בחזרה אל פני השטח כדי לרכז עוד יותר את המתכת, למשל.

הפעילות של מיקרואורגניזמים עפרת-leaching כבר נחקרו במעבדות רבות עבור מגוון מגוון של פרמטרים^2,3,4,5,6. עם זאת, השפעות הלחץ על הפעילות החיידקים כתוצאה ההבדל בין תנאי מעבדה משטח הסביבה (ליד 1 בר) ואת תת משטח בעומק של 1,000 m עם תנאים הידרוסטטיים (~ 100 בר), אינם מתועדים היטב. לכן, השפעות הלחץ על הפחתת ברזל מיקרוביאלית נחקרו באמצעות שדרות ניסיוני שונים⁷. כאן, הטכניקה המתאימה ביותר מתוארת בפרוטרוט.

כורים בלחץ גבוה השתמשו בהרחבה כדי ללמוד תגובות ללחצים וטמפרטורות המתרחשות על פני השטח של כדור הארץ. כורים כאלה מורכבים מכלי המגיב בתחתית שיכול להכיל דגימת נוזל עם תרבות מיקרוביאלית. יושב על גבי כלי המגיב, ראש הכור מציע מגוון רחב של חיבורים וממשקים עבור אמצעי בטיחות וחיישנים ניטור (למשל, טמפרטורה או לחץ). כורים בלחץ גבוה עשויים נירוסטה. חומר זה מציע עמידות גבוהה ומאפיינים שבבי טוב, אבל עמידות קורוזיה של משטח נירוסטה אינו מספיק עבור כל יישום. לדוגמה, אם מדובר בחומרים חומציים ביותר או בעלי הפחתה גבוהה ביותר של פתרונות מימית, ייתכנו תגובות משמעותיות של תרכובות העניין עם קיר הכור. אחת הדרכים למנוע את זה היא להכניס אניה לתוך כלי המגיב, למשל אניה עשוי זכוכית בורוסיליקט⁷. זה קל לנקות והוא יכול להיות מעוקר על ידי אוטוקלינג. בנוסף, הוא אינו מותקף על ידי חומצי או הפחתת פתרונות מימית. למרות אניה יכול לעזור למנוע תגובות מלאכותיות של הפתרון או חיידקים בפתרון עם קיר הכור נירוסטה, מספר בעיות נותרו. עבור אחד, אם נוצר גז מאכל, כגון מימן גופרתי המיוצר על ידי חיידקים להפחתת סולפט, גז זה עשוי להגיב עם המשטח נחשף של ראש הכור יושב מעל אניה. חיסרון נוסף הוא שלא ניתן למשוך דגימה מהכור תוך שמירה על הלחץ.

כדי להתגבר על מגבלות אלה, תאים מיוחדים התגובה גמיש בתוך כורים בלחץ גבוה פותחו עבור מגוון רחב של יישומים. תא^שמונה גמיש פוליטפלואורואתילן תוכנן ללימודי מסיסות של מלחים בבררינות מלוחים מאוד. עם זאת, המגבלה של מערכת זו היא כי גזים מסוימים יכולים בקלות לחלחל החוצה. בנוסף, לחומר זה עדיין יש יציבות בטמפרטורה נמוכה יחסית. כך, המערכת שופרה על ידי עיצוב שקית זהב גמיש עם ראש טיטניום⁹ להיות ממוקם בתוך המחולל נירוסטה בלחץ גבוה. משטח הזהב עמיד בפני קורוזיה מפני מוצרים חומציים או מצמצמים של גזים. משטח טיטניום הוא גם מאוד אינרטי כאשר פסיב ביסודיות כדי ליצור שכבת טיטניום דו חמצני רציפה. במהלך הדגימה מתא התגובה הזה דרך שפופרת מחובר לדגימת טיטניום, שקית הזהב מתכווץ בווליום. הלחץ הפנימי של המערכת מתוחזק על ידי שאיבה באותו נפח של מים, כפי שהוא מסתגר על ידי דגימה, לתוך הכור פלדת אל-חלד בלחץ גבוה להתאים את התא התגובה. המדגם בתוך תא התגובה נשמרת בתנועה על ידי הנדנדה או הטיית הכור בלחץ גבוה על ידי יותר מ 90 ° במהלך הניסוי.

תא התגובה מורכב החלקים מתוארים באיור 1: שקית זהב, צווארון טיטניום, ראש טיטניום, נירוסטה מכונת כביסה, הנעל טיטניום טבעת, שפופרת דגימה טיטניום עם בלוטות הנירוסטה וקולרים עבור הלחץ הגבוה וה חיבורים משורשרות משני הצדדים ושסתום הטיטניום. שקית זהב הוא גליל זהב (Au 99.99) תא עם עובי קיר של 0.2 מ"מ, קוטר החיצוני של 48 מ"מ, ואורכו של 120 מ"מ.

כל חלקי טיטניום מותאמים אישית על ידי סדנת מתוך כיתה טיטניום 2 מוטות. הממדים של טבעת הצווארון, הראש, המכונת כביסה והדחיסה גלויים באיור 2. שפופרת דגימה טיטניום הוא נימי של טיטניום עם קוטר חיצוני של 6.25 מ"מ ועובי הקיר של 1.8 מ"מ, והתוצאה היא קוטר פנימי של 2.65 מ"מ. הוא קבוע לתוך הראש טיטניום שסתום טיטניום על ידי בלחץ גבוה התקשרויות והליכי משורשרות להבטיח גושפנקה של טיטניום נגד טיטניום משטחים. שסתום טיטניום בלחץ גבוה מצויד גזע פתיחה איטית כדי לאפשר פתיחה מבוקרת מאוד או דגימה אפילו בלחץ גבוה. מערכת זו שימש במחקרים רבים^10,11,12.

Protocol

1. הכנת המדיום והחיסון לתרבות החיידקים

1. הכינו מדיום מלח בסיס לautotrophic prokaryotes על פי טכניקות שפורסמו¹³. להמיס ולערבב את הכימיקלים מתחת מים מזוקקים (mg/L): Na₂כך₄· 10h₂O (150) (NH₄)₂כך₄ (450), kcl (50), MGSO₄· 7h₂O (500), KH₂פו₄ (50), ו-Ca (לא ₃מ, 1 ₂· 4h₂O (7).
2. להוסיף 1 מ ל/ליטר של 1, 000x הפתרון אלמנט מעקב מרוכז המכיל (g/L): לקואז₄· 7h₂o (10), cuso₄· 5h₂o (1), mnso_{4 ·} H₂o (0.76), CoSO₄· 7h₂o (1), crk (SO₄)₂· 12h₂o (0.4), H₃בו₃ (0.6), namoo₄· 2h₂o (0.5), niso₄· 6h₂o (1), Na מיכל _השני SeO₄ (0.51), Na₂WO₄· 2h₂O (0.1), ו navo₃ (0.1). להתאים את ה-pH ל 1.8 על ידי הוספת 5 M חומצה גופרתית.
3. לחטא את המדיום ב-החיטוי ב 121 ° צ' ו 1.2 בר עבור 20 דקות ולעקר את הפתרון ברזל ferric על ידי סינון באמצעות 0.22 יקרומטר הנקבוביות גודל מסנן מזרק.
4. העברת 50 mL של המדיום מעוקר מלח בסיס לתוך בקבוק סרום ולהוסיף פתרון ברזל ferric וגופרית היסודות לריכוז הסופי של 50 mM ו 10 g/L, בהתאמה.
5. החזר המדיום עם תרבות מעורבת המורכבת מכמה מתכת ברזל מאסיזופילית¹⁴.
6. קאפ בקבוק הסרום עם עוצרי גומי מעוקר בוטיל וחותם עם כדורי אלומיניום.
7. בועה נמרצות מדיום התרבות עם N₂ כדי להסיר חמצן מומס 25 דקות. השתמש בשתי מחטים, הניחו אחד עמוק יותר בראש הבקבוק, השני קרוב לכובע.
8. הכנס CO₂ כדי לקבל 90% N₂ ו 10% CO₂ אווירה בחלל הקדמי של בקבוק הנסיוב. מודאת התרבות ללא ערבוב ב 30 ° c בחושך.

2. הכנת תא התגובה זהב-טיטניום והכור ללחץ גבוה

1. . תנקה את תא התגובה של טיטניום הזהב
   1. לפרק את התא התגובה לתוך החלקים הבודדים כדי למנוע את המגע של חומצה עם חלקי נירוסטה, או חשיפת החלקים התאספו עם תכונות הרחבה תרמית שונים כדי חום.
   2. נקו את המשטחים שיהיו במגע עם המדגם במהלך הניסוי (כלומר, שקית זהב, ראש טיטניום, שפופרת דגימה טיטניום, שסתום טיטניום).
      1. שים את שקית הזהב ואת הראש טיטניום בגביע זכוכית.
      2. להוסיף מספיק 10% HCl כדי לכסות את כל החלקים.
      3. מחממים את החומצה על צלחת חימום עד 50 ° c במשך 3 שעות תוך כדי ערבוב.
      4. הסירו את החלקים בעזרת מלקחיים מתמיסה החומצה ושטפו אותם במים מפוהים.
      5. לשטוף את המשטח הפנימי של שקית זהב ואת ראש טיטניום ביסודיות עם 65% HNO₃ ולאחר מכן עם מים מקודשים.
      6. לשטוף את המשטח הפנימי של שפופרת דגימה טיטניום שסתום טיטניום עם 10% HCl, ואחריו מים מיוהים, 65% HNO₃, ולאחר מכן מים מיוהים שוב.
      7. לנקות את כל החלקים מזיהום אורגני על ידי שטיפה אותם עם אצטון.
      8. יבש את כל החלקים בתנור ב 105 ° c לפחות 1 h.
   3. מחממים את המשטחים של שקית הזהב, את ראש הטיטניום ואת שפופרת דגימת הטיטניום על ידי חשיפת אותם לטמפרטורה של 450 ° c ב-4 שעות בתנור מעמעם באווירת אוויר.
      הערה: הליך זה מחטא את משטחי המשטחים ומביא להיווצרות שכבת טיטניום בעלת תחמוצת הפסיפת על כל משטחי הטיטניום. חלקי טיטניום צריך צבע צהוב לכחול לאחר הטיפול בחום.
   4. אנאל תא הזהב כדי להגדיל את הגמישות של הזהב על ידי איפוס קבוצות התגבשות קטנות על ידי החלת חום עם לפיד פרופן. מחממים את משטח הזהב מסביב כדי להקטין את הסטיות בזהב שייתכן שנוצרו במהלך התכווצות האחרונה של נפח שק הזהב בניסוי. הקפידו לא לחמם את הזהב יותר מדי במקום אחד כדי למנוע את ההיתוך שלו.
      הערה: הזוהר האדום של משטח הזהב מראה חימום מספיק.
   5. להרכיב את שקית הזהב לתוך הצווארון טיטניום, ואת צינורות הדגימה טיטניום לתוך הראש טיטניום באמצעות מומנט של 10 ננומטר על בלוטות.
2. . בדוק את המחולל של הלחץ הגבוה
   1. בדוק באופן חזותי את הכור לנזק אפשרי, קורוזיה וחלקים רופפים.
      הערה: יש לשלם תשומת לב מיוחדת לחותם ולכרך בו מתרחש האיטום. אם אטם גרפיט השתמשו בעבר כדי לאטום את הכור, שרידים של אותו עדיין יכול להיות בתוך kerf ויש להסיר עם סיכת פלסטיק לפני הניסוי הבא.
   2. החלת נחושת גופרתי להדביק את המנעולים בראש המחולל לחץ גבוה. ודא כי הגריז מופץ על כל פתיל.
   3. בדוק את חותם הדחיסה של הברגים לאורך האריזה של הגרפיט הנותר.

3. מילוי והרכבת תא התגובה זהב-טיטניום בתנאים אנקסימית

1. . העמיסו את תא הכפפות
   1. הכן את מדיום התרבות בבקבוקי הנסיוב לפי סעיף 1.
   2. לעטוף את חלקי התא התגובה goldtitanium שמאוחר יותר יהיה במגע עם המדגם רדיד אלומיניום כדי למזער את כל הזיהום הפוטנציאלי.
   3. פתח ושחרר את האנטקאמבר של תיבת הכפפות, טען את כל החומר הנכנס על המגש הקדמי, וסגור ונעל את מכסה החזית.
   4. . ומציפים אותו בחנקן עם טוהר גבוה
   5. לבש זוג כפפות והתקרב ככל האפשר לכיסוי הפנימי. בטל את נעילת ופתח את המכסה הפנימי כדי להסיר את החומר הנכנס מהמגש הנייד.
   6. סגור ונעל את המכסה הפנימי.
2. . תמלא את תא הזהב
   1. השאר את שקית הזהב הנקיה והעמד אותו בגביע זכוכית, למשל. פתח את בקבוק הנסיוב המכיל 100 mL של תרבות חיידקית וגופרית היסודות.
   2. טלטל בעדינות את בקבוק הנסיוב והעבר את התרבות החיידקית לשקית הזהב.
3. . תאסוף את תא התגובות
   1. הכנס את ראש טיטניום עם שפופרת הדגימה המצורפת טיטניום לתוך צווארון טיטניום מתוחם את השפה העליונה של השקית זהב.
      הערה: ודא כי משטח האיטום של החלק התחתון של החרוט של ראש טיטניום מתאים בצורה חלקה על ידי הפיכתו 90 ° הלוך ושוב.
   2. החלק את מכונת הכביסה ואת טבעת בריח הדחיסה מעל צינור טיטניום דגימה על הראש טיטניום.
      הערה: להפוך את הטבעת בריח הדחיסה בצווארון טיטניום על ידי 30 ° כדי ליישר את האוגן של צווארון טיטניום ואת טבעת הבריח דחף.
   3. להדק את ששת ברגים אלן באותה מידה כדי להבטיח הפצת לחץ אפילו של ראש טיטניום על השפה העליונה של שקית זהב בצווארון טיטניום (כלומר, משטח איטום של תא התגובה).
      הערה: יש להדק את הברגים בטבעת הדחיסה עד לחיזוק הידני, כך שהפיתול של הברגים הנגדיים מוגבר תחילה (החוצה) לפני שתמשיך בכיוון השעון.
4. התקן מחדש את שסתום הדגימה בחלק העליון של צינור הטיטניום. הדק את החיבור צמוד והקפד לסגור את השסתום.
5. להסיר את כל החלקים מתיבת הכפפות.

4. הרכבת המחולל בלחץ גבוה עם תא התגובה

1. הכנס את תא התגובה. לראש הכור
   הערה: ההתקנה של הכור ללחץ גבוה מגיע עם חשיפה קצרה מאוד של הקצה הפתוח של שפופרת הדגימה אל האווירה הסובבת, כמו שסתום הדגימה יש להסיר כדי להנחות את הצינור דרך חותם הבורג בראש הכור. עבור ההתקנה, ראש הכור כבר צריך להיות מוצב מלחציים ספסל. זווית 45 ° מאפשרת טיפול קל יותר. התאמת חותם הדחיסה (ממוקם במיקום המרכזי של ההרכבה בלוק המדידה של ראש הכור), אשר מחזיקה את צינור הדגימה במקום, צריך להיות פתוח.
   1. הסר את שסתום דגימת טיטניום, בורג, ואת הצווארון על גבי צינור הדגימה.
   2. מדריך את הצינור עם תא התגובה המצורפת דרך החור המרכזי בראש הכור עד כ 5 ס מ של צינור לעבור דרך. החלק את הבורג הגדול מעל הצינורית והדקי את הקולר הקטן.
      הערה: כעת ההרכבה תא התגובה אינה יכולה להחליק חזרה דרך ראש הכור ושני הידיים חופשיות להתקין מחדש את שסתום הדגימה.
   3. . חברו מחדש את שסתום הטיטניום
   4. הדק את התאמת חותמת הדחיסה.
   5. הסר את ראש הכור ממלחציים הספסל כדי להתקין אותו על כלי המגיב.
2. . היכונו לאטום את הכור
   1. שים את הגרפיט איטום על הכרך של כלי המגיב.
   2. מניחים בזהירות את ראש הכור עם תא התגובה המצורפת אל כלי המגיב.
      הערה: ראש הכור, כולל הזוג התרמי, חייב להיות ממוקם בזהירות על כלי המגיב כדי לא לפגוע בשקית הזהב או בזוג התרמותרמיים.
3. ממלאים את כלי המגיב עם תערובת של מים מאוהים וברז (בקירוב 1:1).
4. . אטמו את הכור
   1. בדוק את הקולר כדי לוודא כי הקצוות התחתונים של בריחים הדחיסה אינם מבצבץ מתוך האשכולות שלהם. אחרת, כלי הלחץ לא יהיה מותקן כראוי.
   2. הרם את הקולר והניחו אותו סביב הקצוות הבולטות של ממשק headvessel של הכור. הזזת הצווארון בעדינות תגרום להתאמה נאותה. סגרו את המנעולים. שמחזיקים את הקולר במקום
   3. הדקו את בריחים הדחיסה בעקבות התבנית והגדילו את הפיתול בשלבים מתונים עד לקבלת הערך הסופי המומלץ על ידי היצרן.
      הערה: מערכות שונות של הכור ללחץ גבוה עשוי להיות ערכי מומנט שונים.
   4. לבסוף, הדק את בריחים הדחיסה בכיוון כיוון השעון.
5. התקן את הכור ללחץ גבוה במכשיר הנדנדה.
   הערה: התקנת הכור ללחץ גבוה במכשיר הנדנדה מתוארת עבור מודל מותאם אישית המיוצר במכון הפדרלי למדעי הגיאוטכנולוגיה ומשאבי טבע בהנובר, גרמניה. לכן, ההתקנה המתוארת היא מנחה כללי עבור התקנים של עיצוב דומה.
   1. הר את הכור בזהירות במכשיר נדנדה.
      הערה: מומלץ להחזיק את הכור ללחץ גבוה על ידי חלקי ההרכבה בלוק המדידה (למשל, מאנמטר או ברגים דגימה) תוך הנמכת אותו לתוך המכשיר נדנדה.
   2. תיקונים בכור עם שני מלחציים. מעל זוג ברגים ארוכים
   3. מניחים שיבות על כל בורג ולהדק את התפסים עם אגוזים בורג.
   4. חברו את יחידות הבקרה של הזוג התרמי, את מתמר הלחץ ואת אלמנט החימום.
      הערה: חשוב לוודא שכל החוטים בעלי אורך מספיק לתנועה הנדנדה ולמניעת מגע עם המשטחים המחוממים.
   5. החלק את אלמנט החימום מעל כלי המגיב והדק את נעילת הברגים.
      הערה: המים ללחץ המערכת נלקח מתוך מאגר עם משאבה בלחץ גבוה. הוא מועבר דרך נימים נירוסטה לתוך המחולל לחץ גבוה.
      הערה: מטלטל הכור הגבוה מבטיח ערבוב יסודי של תוכן תא התגובה (כלומר, הגז, הנוזלים וכל השלבים המוצקים בו). מהירות נדנדה איטית חשוב למנוע נזק שקית זהב על ידי מוצקים נעים נע או על ידי דפורמציה עקב השפעות הכבידה על הזהב גמיש בטמפרטורות גבוהות. מערכת הנדנדה יכולה להסתובב בקרוב ל 180 °.

5. התחלת הניסוי

1. בדוק אם הטמפרטורה ומגבלות הלחץ בתוכנת הניטור מוגדרים לערכים הרצויים.
   הערה: בניסוי זה הוגדרו כ-70 ° c ו -25 MPa.
2. . בצעו בדיקת דליפות
   1. חברו את צינור הלחץ, נימי נירוסטה, לראש הכור.
   2. להעלות את הלחץ על לחץ היעד במרווחי זמן ברורים תוך בדיקה רציפה של דליפה.
   3. החזק את הלחץ קבוע עד שקצב הזרימה של המשאבה כמעט אפס.
      הערה: היזהרו מהאוויר המומס, האויר הנמס במים נראה לאורך זמן רב בקריאות זרימה עדינות.
3. הפעל את החימום לאחר בדיקת דליפה מוצלחת.
   1. התחל את הרישום של משאבות הלחץ.
   2. התאימו את נקודת ההגדרה של החימום לערך הרצוי והתחילו את החימום עם התוכנה.
   3. בדוק בקביעות את כל הפרמטרים ואת מצב המערכת.
   4. Untighten את צינור הלחץ לאחר שהגיע טמפרטורת היעד.
   5. . הפעל את מכשיר הנדנדה

6. דגימת המחולל בלחץ גבוה במצב מבצעי

1. כדי לקחת דגימה, לצרף מזרק 5 מ ל מחבר Luer Lock של שסתום הדגימה בחלק העליון של הכור ללחץ גבוה.
2. בזהירות לפתוח את השסתום ולתת לדגימת נוזל לדחוף לתוך המזרק על ידי הלחץ בתוך המחולל לחץ גבוה. סגור את השסתום לאחר שנפח הדגימה מגיע ל-1 mL. . נתק את המזרק
3. העבר את הדגימות במזרק מיד לתוך שפופרת 2 מ ל בתוך מכסה לעיבוד.

7. ניתוח דגימת נוזלים

הערה: רק השלבים עבור שיטת הפעולה הנפוצה ביותר (כלומר, סעיף 7.1) מתוארים כאן בפרוטרוט ומוזכרים בסרטון, משום שהשלבים האחרים הם הליכי תפעול סטנדרטיים במיקרוביולוגיה.

1. השתמש בקביעת שיטת הפרו כדי לקבוע את הריכוז של ברזל ברזלי מומס (Fe^{2 +}_(aq)) ואת הברזל הכולל (fe_עד)¹⁵.
   1. הכן סדרה של פתרונות סטנדרטיים ברזל ברזלי על ידי המסת כמויות ידועות של FeSO₄· 7 H₂O במים.
   2. מערבבים 50 μL של רמות סטנדרטיות אלה עם 1 mL של פתרון מגנטי 1 M.
      הערה: תגובת הפרואזין עם ברזל ברזלי מומס צורות מורכב סגול. העוצמה של הצבע התואם את הריכוז ברזל ברזלי.
   3. הקמת עקומת כיול בין ריכוז ברזל ברזלי וספיגת מתחם ברזל-פראזין.
   4. חישוב הריכוז של ברזל ברזלי של מדגם משתי מדידות מקבילות לפי העקומה הסטנדרטית הוקמה.
2. לנתח את ערך ה-pH ואת הפוטנציאל חמצון/הפחתת (ORP) עם מטרים pH/redox דיגיטלית עם אלקטרודות חצי מיקרו pH, אלקטרודה כלוריד כסף, בהתאמה.
3. הרוזן תאים פלנקטון ישירות באמצעות מיקרוסקופ אור עם תא thoma.
4. חקירת מורפולוגיה של התאים באמצעות סריקת מיקרוסקופ אלקטרוני (SEM).
   1. מסנן תאים פלנקטון גדל בתנאים שונים באמצעות מסנן גודל 0.1-0.2 יקרומטר של הנקבוביות.
   2. מייבשים דגימות עם אצטון ולאחסן אותם לילה ב 4 ° צ' ב 90% אצטון.
   3. נגב את דגימות לפי נקודה קריטית ייבוש ומעילים אותם עם גרפיט או זהב.
   4. בחן דגימות עם פליטת שדה סריקה מיקרוסקופ אלקטרונים (FE-SEM) ב 10 kV.

Representative Results

תוצאות של ניסוי המחולל בלחץ גבוה עם תא התגובה מיוחד זהב-טיטניום להראות כי התרבות מעורבת מיקרוביאלית של מאסינים תחמוצת גופרית מופחתת ברזל ferric כדי ברזל ברזלי (איור 3).

בשניהם 1 בר או 100 בתנאי לחץ בר, התרבויות היה שלב השהיה כאשר גדלו בתוך תא התגובה זהב טיטניום. לאחר תקופה זו, עלייה מהירה בריכוז ברזל ברזלי מתוך כ 9 מ"מ עד 31 מ"מ התרחשה בתרבות גדל 1 בר. במהלך הדגירה של 22 ימים, ~ 31 מ"מ ו -13 מ"מ של ברזל ברזלי אותרו בבית הספר 1 bar ו-100 bar, בהתאמה. זה מוכיח בבירור כי התאים החיידקים היו פעילים ב 100 bar, אבל הפעילות שלהם להפחתת ברזל היתה נמוכה באופן משמעותי בלחץ גבוה. בדיקות abiotic שנערכו בצינורות Hungate ובקבוקי סרום לא הראו הפחתת ברזל ferric ב 1 בר ו-100 בר.

התמונות מיקרוסקופ האלקטרונים סריקה (איור 4) להראות תאים בצורת מוט גדל ניסויים בלחץ נמוך וגבוה. אין שינוי משמעותי במבנה התא נצפתה ב 1 בר לעומת 100 bar. עם זאת, צמיחת התא היה מעוכב ללא ספק על ידי הלחץ הגבוה, כמו מספר הטלפון היה 1.3 x 10⁸ תאים/ml ב 1 בר בהשוואה ל 4.5 x 10⁷ תאים/ml ב 100 בר⁷. נתונים אלה הם המקבילה עם הבדיקות שנעשו צינורות Hungate⁷. לפיכך, תא התגובה הגמיש של טיטניום הזהב עצמו לא השפיע על צמיחת התאים והיה מתאים לבדיקות גידול חיידקים.

התוצאות מראות כי מיקרואורגניזמים bioleaching פעילים גם בלחץ גבוה של 100 בר, אשר רלוונטי מאוד עבור ביונינג באתרו, כי תנאים כאלה מתרחשים הפקדות עפרות עמוק בעומק מתחת 1,000 m⁷.

איור 1: סקירה של חלקי התא התגובה. מלמטה למעלה: שקית זהב, צווארון טיטניום, ראש טיטניום, מכונת כביסה, טיטניום בריח לדחיסת הטבעת, שפופרת דגימה טיטניום עם בלוטות וקולרים עבור הלחץ הגבוה התחברות הליכי משני הצדדים, ואת שסתום טיטניום עם מתאם לחיבור מזרק מנעול Luer. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: ציורים ממדיים של חלקי טיטניום מאצ מוטות של כיתה טיטניום 2. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: שינויים של ריכוזי ברזל ברזלי בתא התגובה זהב-טיטניום עם תרבות ברזל-אוקסיגון הברזל. התאים טיפחו anaerobically ב -30 ° c. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: מורפולוגיה של תרבות הברזל ברזלי ברזל גדל ב 1 בר 100 בר. התאים טיפחו anaerobically ב -30 ° c. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

השיטה המוצגת לניסויים בלחץ גבוה של תגובות חיידקים בתוך פתרונות חומצי היה כלי רב עוצמה כדי לדמות תהליכים תת-מgeomicrobiological עמוקים בסביבת מעבדה.

ישנם מספר צעדי עבודה ידניים מעורבים, שחלקם דורשים תשומת לב מיוחדת. בתור הערה כללית, אין להשתמש בכוח מופרז בעת הרכבת החלקים הבודדים של תא הזהב-טיטניום הגמיש וראש הכור (סעיפים 3 ו-4). אם המפרט של היצרן (לדוגמה, עבור לחץ מרבי, טמפרטורה, מומנט כוח), המערכת תתעלם ממנה, דליפת דליפה ו/או חומר עלול להיגרם.

ניקוי חלקי זהב וטיטניום (סעיף 2.2) הוא צעד הכרחי לעבודה, לא רק עבור ניסוי זה, אלא במיוחד עבור ניסויים הכרוכים (ב-) תגובות אורגניות. שרידים מניסויים קודמים בתא הזהב עלולים לגרום לתגובות בלתי רצויות ולכן ממתח תוצאות. כאשר התאספו תא זהב טיטניום מותקן בראש הכור, עדיף לעבוד במהירות ובדיוק, כי בזמן זה כמויות קטנות של חמצן יכול להיכנס לתא זהב. סגירת שסתום הדגימה לפני היציאה כפפות הוא מידה הראשון טוב כדי למזער את החליפין בין אווירת הסביבה עם הפנים של תא זהב.

לאחר הכור ממוקם במכשיר נדנדה, חשוב להגדיר את מהירות התנועה נדנדה ~ 170 °/min. אם המחולל לחץ גבוה נע מהר מדי, קרע של תא הזהב עלול לקרות עקב השפעות הכבידה או הקצוות חדים של משקעים או דגימות סלע בעת שימוש.

ניתן להשתמש בשיטה זו בשדות מחקר נוספים. תא התגובה הגמיש של טיטניום הזהב מכיל את הפוטנציאל לשמש לקבוצה מגוונת של חקירות מדעיות⁹ ללמוד תגובות בלחץ ובטמפרטורה גבוהות ובנוזלים מאוד מאכל או גזים.

מיקרואורגניזמים במשטח התת עמוק בטמפרטורות מעל 70 ° c בנוכחות של משטחים מינרליים עשוי לעורר את הייצור של מימן מולקולרי או חומצות אורגניות כמו אצטט גם תחת לחץ גבוה¹⁶. מוצרים אלה, ותרכובות אחרות, עשוי לגרום לפעילות מיקרוביאלית מוגבר במהלך התהליכים bioleaching באתרו, בנוסף תרכובות גופרית נחקר במחקר זה.

היישומים כוללים קביעת מסיסות של גזים ויונים בנוזלים מימיים, תגובות גיאוכימיות בתנאים של מערכות אוורור הידרותרמיות¹⁷, הקוונפיקציה של שבירה איזוטופ¹⁸, תגובות GEOCHEMICAL במהלך CO ₂ קיבוע על¹⁹, תהליכים אביוטיים במהלך היווצרות של נפט וגז בתוך סלעי מקור²⁰, ותגובות חיידקים בלחצים מוגבה במשטח המשנה²¹ כמו במחקר הנוכחי.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetone	Merck	100013
CaN2O6	Fluka	31218
Conax compression seal fittings	Conax Technologies	PG2-250-B-G	sealant could be selected according to temperatures in experiment
Copper paste	Caramba	691301
Copper paste	CRC	41520
CoSO4x7H2O	Sigma	10026-24-1
CrKO8S2x12H2O	Roth	3535.3
CuSO4x5H2O	Riedel de Haen	31293
Disposable cuvettes	Sigma	z330388
Ethanol absolute	Roth	9065.3
FE-SEM	JEOL	model no. JSM-6330F
Ferrozine	Aldrich	180017
Fe2(SO4)3x7H2O	Alfa Aesar	33316
FeSO4x7H2O	Merck	103965
Gold cell	Hereaus GmbH		manufactured according to dimensions supplied by customer
High-pressure reactor	PARR Instruments	model no. 4650 Series	reactors from other vendors could be used, too
High-pressure syringe pump	Teledyne ISCO	DM-100
HCl	Roth	6331.3
HNO3	Fluka	7006
H3BO3	Sigma	B6768
KCl	Sigma	P9541
KH2PO4	Merck	104873
L-(+)-Ascorbic acid/Vitamin C	Applichem	A1052
Light microscope	Leica DM3000
MgSO4x7H2O	Merck	105886
(NH4)2SO4	Sigma	A4418
NaMoO4x2H2O	Sigma	331058
NaO3Sex5H2O	Sigma	00163
NaO3V	Sigma	590088
Na2SO4	Merck	106649
Na2WO4x2H2O	Sigma	72069
NiSO4x6H2O	Sigma	31483
Omnifix Luer	BRAUN	4616057V
pH meter	Mettler Toledo
Redox potential meter	WTW	ORP portable meter
Safe-Lock Tubes, 2 mL	Eppendorf	0030120094
Serum bottle	Sigma	33110-U
Spectrophotometer	Thermo Scientific	model no. GENESYS 10S
Sterican Hypodermic needle	BRAUN	4657519
Stoppers	Sigma	27234
Sulfur powder	Roth	9304
Thoma Chamber	Hecht-Assistent
Titanium parts of reaction cell	Titan-Halbzeug GmbH	121-238	manufactured by workshop at BGR according to dimensions supplied from Titanium grade 2 rods from Titan-Halbzeug GmbH
Titanium valve	Nova Swiss Technologies	ND-5002
Whatman membrane filters nylon	Sigma	WHA7402004
ZnSO4x7H2O	Sigma	Z4750