Summary
이 프로토콜은 상승된 압력하에서 미생물 실험을 설명하여 기업 바이오 마이닝 공정에서 연구합니다. 실험 접근법은 산성, 철이 풍부한 배지에 미생물 배양을 포함하는 금 티타늄 반응 세포를 갖춘 흔들리는 고압 반응기를 채택한다.
Abstract
깊은 광석 퇴적물(biomining)에서 금속 침출과 같은 지하 미생물 공정을 조사하는 실험실 연구는 복제해야 하는 특수 한 환경 조건(예: 고압)을 포함하여 일반적이고 도전적인 장애물을 공유합니다. 그리고 어떤 경우에는 산성 솔루션. 전자는 최대 100bar의 가압에 적합한 실험 적 설정이 필요하며, 후자는 부식및 원치 않는 화학 반응에 대한 내화학성이 높은 유체 용기를 용기 벽으로 요구합니다. 현장 바이오 마이닝 분야에서 의 응용을 위한 이러한 조건을 충족시키기 위해, 흔들리는 고압 반응기 내부에 특수 한 유연한 금 티타늄 반응 세포가 이 연구에서 사용되었다. 설명된 시스템은 무산소, 압력 제어, 고도로 화학적으로 불활성 실험 환경에서 황 구동 미생물 철 감소를 통해 내부 생물 광의 시뮬레이션을 허용했습니다. 유연한 금 티타늄 반응 셀은 최대 100mL의 시료 용액을 수용할 수 있으며, 이는 시스템이 원하는 압력을 유지하면서 주어진 시점에서 샘플링할 수 있습니다. 실험은 시간에서 달에 이르는 시간대에 수행할 수 있습니다. 고압 반응기 시스템을 조립하는 것은 상당히 시간이 많이 걸립니다. 그럼에도 불구하고, 화학적으로 공격적인 유체에서 지구의 깊은 지하에서 발생하는 복잡하고 도전적인 (미생물) 공정이 실험실에서 조사되어야 할 때,이 시스템의 장점은 단점보다 큽니다. 결과는 고압에서조차 미생물 컨소시엄이 활성화된다는 것을 것을을 발견했습니다, 그러나 상당히 낮은 신진 대사 비율에서.
Introduction
지난 10년 동안 채굴이 환경에 미치는 영향을 최소화하기 위한 노력이 증가했습니다. 광석 (예 : 구리가 풍부한 황화물 광석)의 원료 추출을위한 오픈 피트 광산은 굴착 활동과 귀중한 추출 후 처리 된 광석의 많은 남은 양의 폐기물 암석및 잔류에 의해 주변 경관에 영향을 미칩니다. 구리와 같은 금속. 지하광석에서 직접 구리를 추출하면 이러한 영향을 크게 줄일 수 있습니다. 이 프로세스1의 유망한 후보지인 situ바이오마이닝의 기술입니다. 이 간행물은 광석에서 귀금속을 지하의 수성 용액으로 추출하기 위해 자극된 미생물 활성의 사용을 설명합니다. 따라서, 구리가 풍부한 용액은 예를 들어 금속을 더욱 농축하기 위해 표면으로 쉽게 펌핑될 수 있다.
광석 침출 acidophilic 미생물의 활성은 매개 변수2,3,4,5,6의다양한 배열에 대한 많은 실험실에서 연구되었다. 그러나, 주변 표면 실험실 조건 (근처 1 bar)과 1,000 m 깊이의 지하 조건 (~100 bar)의 차이로 인한 미생물 활동에 대한 압력 효과는 잘 문서화되지 않았습니다. 따라서 미생물 철분 감소에 대한 압력의 영향은 다른 실험 적 방법을 통해 조사되었다7. 여기서, 가장 적합한 기술은 상세히 설명한다.
고압 반응기는 지구 의 지하에서 발생하는 압력과 온도에서 반응을 연구하기 위해 광범위하게 사용되었습니다. 이러한 반응기는 미생물 배양액을 가진 유체 샘플을 함유할 수 있는 바닥의 반응기 용기로 구성된다. 반응기 용기 위에 앉은 반응기 헤드는 안전 측정 및 모니터링 센서(예: 온도 또는 압력)를 위한 다양한 연결 및 인터페이스를 제공합니다. 대부분의 고압 반응기는 스테인레스 스틸로 만들어집니다. 이 재료는 높은 탄력성과 좋은 가공 특성을 제공하지만 스테인레스 스틸 표면의 내식성은 모든 응용 분야에 적합하지 않습니다. 예를 들어, 높은 산성 또는 고도로 환원 용액을 조사하는 경우, 반응기 벽과 관심 있는 화합물의 중요한 반응이 발생할 수 있습니다. 이를 방지하는 한 가지 방법은 반응기 용기에 라이너를 삽입하는 것입니다, 예를 들어 보로실리케이트 유리7로만든 라이너. 그것은 청소하기 쉽고 오토 클레이브에 의해 살균 될 수있다. 또한, 산성 또는 수성 해액 감소에 의해 공격되지 않는다. 라이너가 스테인리스 스틸 반응기 벽으로 용액 내용액이나 미생물의 인공 반응을 방지하는 데 도움이 될 수 있지만 몇 가지 문제가 남아 있습니다. 하나는 황산염 환원 박테리아에 의해 생성되는 황화수소와 같은 부식성 가스가 형성되면, 이 가스는 라이너 위에 앉아있는 반응기 헤드의 드러난 표면과 반응할 수 있습니다. 또 다른 단점은 압력을 유지하면서 반응기에서 샘플을 인출할 수 없다는 것입니다.
이러한 한계를 극복하기 위해 고압 반응기 내부의 특수 한 유연한 반응 셀은 다양한 응용 분야에 대해 개발되었습니다. 유연한 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 세포8은 염분염의 용해도 연구를 위해 고안되었습니다. 그러나, 이 시스템의 한계는 일부 가스가 PTFE에 쉽게 침투할 수 있다는 것이다. 또한,이 물질은 여전히 상대적으로 낮은 온도 안정성을 갖는다. 따라서, 스테인리스 스틸 고압 반응기 내부에 배치되는 티타늄 헤드9와 플렉시블 골드 백을 설계함으로써 시스템이 개선되었다. 금 표면은 산성 또는 환원 용액 및 가스에 대한 내식성입니다. 티타늄 표면은 또한 연속이산화 티타늄 층을 형성하기 위해 철저하게 통과 할 때 매우 불활성이다. 연결된 티타늄 샘플링 튜브를 통해 이 반응 셀에서 샘플링하는 동안 골드 백은 부피가 줄어듭니다. 시스템의 내부 압력은 반응 셀을 수용하는 스테인레스 스틸 고압 반응기로 샘플링을 통해 철회되는 것과 동일한 양의 물을 펌핑하여 유지됩니다. 반응 셀 내부의 샘플은 실험 중에 고압 반응기를 90° 이상 흔들거나 기울임으로써 움직이게 됩니다.
반응 셀은 그림 1에묘사 된 부분으로 구성되어 있습니다 : 금 백, 티타늄 칼라, 티타늄 헤드, 스테인레스 스틸 와셔, 티타늄 압축 볼트 링, 스테인레스 선및 고압 콘용 칼라가있는 티타늄 샘플링 튜브 및 양쪽에 나사 연결, 티타늄 밸브. 골드 백은 벽 두께가 0.2mm, 외경 48mm, 길이 120mm의 원통형 금(Au 99.99) 셀입니다.
모든 티타늄 부품은 티타늄 등급 2 봉의 작업장에서 맞춤 제작됩니다. 칼라, 헤드, 와셔 및 압축 볼트 링의 치수는 그림 2에서볼 수 있습니다. 티타늄 샘플링 튜브는 외경 6.25mm, 벽 두께 1.8mm의 티타늄 모세관으로 내경 2.65mm를 생성합니다. 티타늄 헤드와 티타늄 밸브에 고압 콘 및 나사산 연결로 고정되어 티타늄 대 티타늄 표면의 밀봉을 보장합니다. 고압 티타늄 밸브에는 느린 개구부 스템이 장착되어 있어 고압에서도 매우 제어된 개구부 또는 샘플링이 가능합니다. 이 시스템은 수많은 연구에서 사용되었다10,11,12.
Protocol
1. 미생물 배양 배지 및 접종준비
- 출판된 기술13에따라 자가영양성 핵생물에 대한 기저염 배지를 준비한다. 증류수(mg/L)에 아래 화학물질을 용해및 혼합: Na2SO 4·10H2O(150) (NH4)2SO4 (450), KCl (50), MgSO4·7H2O (500),KH2PO4 (50), 및 Ca(NO) 3) 2·4H2O(7).
- 1,000x 농축 미량 요소 용액 (g/L) 포함 1 mL/L 추가: ZnSO4·7H2O(10), CuSO4·5H2O(1), MnSO4· H2O (0.76), CoSO4·7H2O(1), CrK (SO4)2·12H2O(0.4), H3BO3 (0.6), 나무4·2H2O(0.5), 니소4·6H2O(1), 나 2개 SeO4 (0.51), Na2WO4·2H 2O(0.1), 나보3(0.1). 5M 황산을 첨가하여 pH를 1.8로 조절합니다.
- 121°C및 1.2bar에서 오토클레이브에서 배지를 20분 동안 살균하고 0.22 μm 의 기공 크기 주사기 필터를 통해 여과하여 철분 용액을 살균합니다.
- 멸균된 기저 염 배지의 50 mL를 혈청 병에 옮기고 철분 용액과 원소 황을 각각 50 mM및 10 g/L의 최종 농도에 첨가합니다.
- 배지를 여러 개의 메소산성 철산화원생생물(14)으로구성된 혼합 배양물로 접종한다.
- 세럼 병을 멸균된 부틸 고무 스토퍼로 캡하고 알루미늄 크림프로 밀봉합니다.
- 25 분 동안 용존 산소를 제거하기 위해N2로 배양 배지를 활발하게 거품을 낸다. 두 개의 바늘을 사용하고, 병 머리에 한 개를 더 깊게 놓고, 다른 하나는 캡에 가깝게 놓는다.
- CO2를 주입하여 혈청 병의 헤드스페이스에서 90%N2 및 10%CO2 분위기를 얻었다. 어둠 속에서 30°C에서 교반하지 않고 배양을 배양한다.
2. 금 티타늄 반응 전지 및 고압 반응기의 제조
- 금 티타늄 반응 세포를 청소합니다.
- 반응 셀을 개별 부품으로 분해하여 스테인리스 스틸 부품과 산의 접촉을 피하거나 열에 다른 열 팽창 특성을 가진 조립된 부품의 노출을 방지합니다.
- 실험 중에 시료와 접촉할 표면(예: 골드 백, 티타늄 헤드, 티타늄 샘플링 튜브 및 티타늄 밸브)을 청소합니다.
- 골드 백과 티타늄 헤드를 유리 비커에 넣습니다.
- 모든 부품을 커버하기에 충분한 10% HCl을 추가합니다.
- 가열 플레이트에 산을 50 °C로 가열하면서 3 시간 동안 저어줍니다.
- PTFE 핀셋으로 부품을 산용액에서 제거하고 탈이온수로 헹굽습니다.
- 골드 백과 티타늄 헤드의 내부 표면을 65% HNO3로 철저히 헹구고 탈이온수로 헹구십시오.
- 티타늄 샘플링 튜브와 티타늄 밸브의 내부 표면을 10% HCl로 헹구고 탈이온수, 65% HNO3,그리고 다시 탈이온수를 헹구십시오.
- 아세톤으로 헹각하여 유기 오염으로부터 모든 부품을 청소하십시오.
- 오븐의 모든 부품을 105°C에서 1시간 이상 건조시십시오.
- 금백, 티타늄 헤드 및 티타늄 샘플링 튜브의 표면을 공기 분위기에서 머플 로에서 4시간 동안 450°C의 온도에 노출시킴으로써 가열합니다.
참고: 이 절차는 표면을 살균하고 모든 티타늄 표면에 이산화 티타늄 층을 형성합니다. 티타늄 부품은 열처리 후 노란색에서 파란색으로 변해야 합니다. - 안닐은 프로판 토치로 열을 가하여 작은 결정화 도메인을 재설정함으로써 금의 유연성을 증가시다. 실험에서 금 백 부피의 마지막 수축 중에 형성되었을 수 있는 금의 꼬임을 줄이기 위해 금 표면을 온전히 가열합니다. 금이 녹지 않도록 한 곳에서 너무 많이 가열하지 않도록 하십시오.
참고: 금 표면의 빨간색 광선은 충분한 가열을 보여줍니다. - 티타늄 칼라에 골드 백을 조립하고, 티타늄 샘플링 튜브를 땀샘에 대해 10 Nm의 토크를 사용하여 티타늄 헤드에 튜브를 샘플링합니다.
- 고압 반응기를 검사합니다.
- 반응기의 손상, 부식 및 느슨한 부품이 있는지 시각적으로 확인합니다.
참고: 밀봉이 이루어지는 씰과 커프에 특별한 주의를 기울여야 합니다. 흑연 개스킷이 이전에 반응기를 밀봉하는 데 사용된 경우, 그 잔해는 여전히 커프에 있을 수 있으며 다음 실험 전에 플라스틱 핀으로 제거해야 합니다. - 고압 반응기 헤드의 추력 볼트에 구리 황화물 페이스트를 적용합니다. 그리스가 전체 스레드에 분산되어 있는지 확인합니다.
- 스크류 피팅 압축 씰에서 남은 흑연 포장 길이를 확인합니다.
- 반응기의 손상, 부식 및 느슨한 부품이 있는지 시각적으로 확인합니다.
3. 결산 조건하에서 금 티타늄 반응 세포를 채우고 조립
- 글러브 박스를 로드합니다.
- 섹션 1에 따라 세럼 병에 배양 배지를 준비한다.
- 나중에 알루미늄 호일의 샘플과 접촉할 금티타늄 반응 셀의 부품을 감싸서 잠재적인 오염을 최소화합니다.
- 글러브 박스의 대기실을 열고 잠금을 해제하고 모든 인바운드 재료를 이동 식 트레이에 적재하고 앞면 덮개를 닫고 잠급니다.
- 대기실을 3배 대피시키고 고순도 질소로 범람시.
- 장갑을 착용하고 내부 커버에 가능한 한 가깝게 하십시오. 내부 커버를 열고 이동식 트레이에서 인바운드 재질을 제거합니다.
- 내부 덮개를 닫고 잠급전합니다.
- 골드 셀을 채웁니다.
- 깨끗한 골드 백을 풀고 유리 비커로 일어서십시오. 세균 배양 및 원소 황 100 mL를 포함하는 혈청 병을 엽니다.
- 세럼 병을 부드럽게 흔들어 세균 문화를 골드 백으로 옮김을 옮김.
- 반응 셀을 조립합니다.
- 티타늄 헤드를 부착된 티타늄 샘플링 튜브로 골드 백의 상부 테두리를 둘러싸는 티타늄 칼라에 삽입합니다.
참고: 티타늄 헤드의 원추형 하부의 밀봉 표면이 90°앞뒤로 돌려 부드럽게 맞도록 하십시오. - 와셔와 압축 볼트 링을 티타늄 샘플링 튜브 위에 밀어 티타늄 헤드 위로 밀어 냅니다.
참고: 티타늄 칼라의 압축 볼트 링을 30°로 돌려 티타늄 칼라의 플랜지와 스러스트 볼트 링을 정렬합니다. - 6개의 알렌 나사를 동일한 정도로 고정하여 티타늄 칼라의 금백의 가장 위쪽 림에 티타늄 헤드의 균일한 압력 분포를 보장한다(즉, 반응 셀의 밀봉 표면).
참고: 반대 쪽 나사의 토크가 먼저 증가되도록 압축 볼트 링에 Allen 나사를 손으로 고정한 후 시계 방향으로 계속합니다.
- 티타늄 헤드를 부착된 티타늄 샘플링 튜브로 골드 백의 상부 테두리를 둘러싸는 티타늄 칼라에 삽입합니다.
- 티타늄 튜브 상단에 샘플링 밸브를 다시 설치합니다. 연결을 손으로 단단히 조이고 밸브를 닫아야합니다.
- 글러브 박스에서 모든 부품을 제거합니다.
4. 반응 셀로 고압 반응기 조립
- 반응 셀을 반응기 헤드에 조립합니다.
참고 : 고압 반응기의 설치는 샘플링 밸브가 반응기 헤드의 나사 씰을 통해 튜브를 안내하기 위해 제거되어야하기 때문에 샘플링 튜브의 개방 된 끝을 주변 대기에 매우 짧은 노출과 함께 제공됩니다. 설치를 위해, 반응기 헤드는 이미 벤치 바이스에 배치되어야한다. 45° 각도로 취급이 용이합니다. 샘플링 튜브를 제자리에 배치하는 압축 씰 피팅(반응기 헤드게이지 블록 어셈블리의 중앙 위치에 위치)을 열어야 합니다.- 샘플링 튜브 상단의 티타늄 샘플링 밸브, 나사 및 칼라를 제거합니다.
- 반응기 헤드의 중앙 구멍을 통해 부착된 반응 셀로 튜브를 약 5cm 통과할 때까지 튜브를 안내합니다. 큰 나사를 튜브 위로 밀어 작은 옷깃을 고정합니다.
참고: 이제 반응 셀 어셈블리가 반응기 헤드를 통해 다시 미끄러지며 양손은 샘플링 밸브를 자유롭게 다시 설치할 수 있습니다. - 티타늄 밸브를 다시 부착하십시오.
- 압축 씰 피팅을 조입니다.
- 벤치 바이스에서 반응기 헤드를 제거하여 반응기 용기에 설치합니다.
- 반응기를 밀봉 할 준비.
- 반응기 용기의 커프에 흑연 밀봉을 넣습니다.
- 반응기 헤드를 부착된 반응 셀과 함께 반응기 용기에 조심스럽게 놓습니다.
참고: 열전대를 포함한 반응기 헤드는 금백이나 열전대를 손상시키지 않도록 반응기 용기에 신중하게 배치해야 합니다.
- 탈이온화 및 수돗물(약 1:1 비율)으로 반응기 용기를 채웁니다.
- 반응기를 밀봉합니다.
- 칼라를 확인하여 압축 볼트의 아래쪽 끝이 스레드에서 튀어나오지 않는지 확인합니다. 그렇지 않으면 압력 용기가 올바르게 설치되지 않습니다.
- 칼라를 들어 올리고 반응기 헤드혈관 인터페이스의 돌출 된 가장자리 주위에 놓습니다. 옷깃을 부드럽게 움직이면 적절한 핏이 됩니다. 칼라를 제자리에 고정한 스냅 잠금 장치를 닫습니다.
- 십자 패턴에 따라 압축 볼트를 고정하고 제조업체가 권장하는 최종 값이 달성될 때까지 적당한 단계로 토크를 늘립니다.
참고: 다른 고압 반응기 시스템은 다른 토크 값을 가질 수 있습니다. - 마지막으로, 압축 볼트를 시계 방향으로 고정합니다.
- 흔들기 장치에 고압 반응기를 설치합니다.
참고: 흔들기 장치에 고압 반응기의 설치는 독일 하노버의 연방 지질 과학 및 천연 자원 연구소에서 제조 된 맞춤형 모델에 대해 설명됩니다. 따라서, 설명된 설치는 유사한 설계의 장치에 대한 일반적인 지침이다.- 반응기를 흔들 장치에 조심스럽게 장착합니다.
참고 : 게이지 블록 조립 부품 (예 : 기동계 또는 샘플링 튜브 나사)에 의해 고압 반응기를 고정하면서 흔들 장치로 낮추는 것이 가장 좋습니다. - 긴 나사 한 쌍위에 두 개의 클램프로 반응기를 고정시.
- 각 나사에 와셔를 놓고 나사 너트로 클램프를 조입니다.
- 열전대, 압력 변환기 및 발열체의 제어 장치를 연결합니다.
참고: 모든 전선이 흔들기 모션에 충분한 길이를 유지하고 가열된 표면에 접촉하지 않도록 하는 것이 중요합니다. - 반응기 용기 위에 발열체를 밀어 내고 나사 잠금 장치를 조입니다.
참고: 시스템을 가압하는 물은 고압 펌프가 있는 저수지에서 채취됩니다. 그것은 고압 반응기로 스테인레스 스틸 모세 혈관을 통해 전송됩니다.
참고 : 고압 반응기의 흔들림은 반응 세포 내용물 (즉, 가스, 유체 및 그 안에있는 모든 고체 상)의 철저한 혼합을 보장합니다. 느린 흔들림 속도는 고체를 빠르게 이동하거나 고온에서 유연한 금에 중력 영향으로 인한 변형으로 인해 금 백의 손상을 방지하는 것이 중요합니다. 흔들 시스템은 180 °에 가깝게 회전 할 수 있습니다.
- 반응기를 흔들 장치에 조심스럽게 장착합니다.
5. 실험 시작
- 모니터링 소프트웨어의 온도 및 압력 한계가 원하는 값으로 설정되어 있는지 확인합니다.
참고: 본 실험에서 그들은 70°C 및 25 MPa로 설정하였다. - 누출 검사를 수행합니다.
- 스테인리스 스틸 모세관인 압력 파이프를 반응기 헤드에 연결합니다.
- 누출을 지속적으로 확인하면서 뚜렷한 간격으로 목표 압력에 대한 압력을 높입니다.
- 펌프의 유량이 거의 0이 될 때까지 압력을 일정하게 유지합니다.
참고: 물에 압축되고 용존된 공기가 미묘한 흐름 판독값에서 장시간 볼 수 있다는 점에 유의하십시오.
- 누출 확인을 성공적으로 마친 후 가열을 시작합니다.
- 가압 펌프의 로깅을 시작합니다.
- 가열에 대한 설정점을 원하는 값으로 조정하고 소프트웨어로 가열을 시작합니다.
- 정기적으로 모든 매개 변수와 시스템 상태를 확인합니다.
- 목표 온도에 도달한 후 압력 파이프를 조이십시오.
- 흔들 장치를 시작합니다.
6. 작동 모드에서 고압 반응기 샘플링
- 샘플을 채취하려면 고압 반응기 상단의 샘플링 밸브의 Luer Lock 커넥터에 5mL 주사기를 부착합니다.
- 조심스럽게 밸브를 열고 유체 샘플이 고압 반응기 내부의 압력에 의해 주사기로 밀어 넣습니다. 샘플링된 부피가 1mL에 도달하면 밸브를 닫습니다. 주사기를 분리합니다.
- 주사기의 샘플을 즉시 2 mL 튜브로 처리하기 위해 연기 후드에 넣습니다.
7 . 유체 샘플 분석
참고 : 덜 일반적인 광측정 페로진 분석 (즉, 섹션 7.1)에 대한 단계만 자세히 설명되며 다른 단계는 미생물학의 표준 작동 절차이기 때문에 비디오에서 언급됩니다.
- 페로진 검법을 사용하여 용존 철(Fe2+(aq))과총 철(Fetot)의농도를 광도측정하여 결정한다15.
- 알려진 양의 FeSO4·7H2O를물에 용해시켜 일련의 철본용액을 준비한다.
- 이 표준 레벨의 50 μL을 1 M 페로진 용액의 1 mL과 혼합합니다.
참고 : 용해 된 철과 페로진의 반응은 보라색 복합체를 형성합니다. 색상의 강도는 철철 농도와 상관관계가 있습니다. - 철 분 농도와 철 페로진 복합체의 흡광도 사이에 교정 곡선을 설정합니다.
- 확립된 표준 곡선에 따라 두 개의 병렬 측정에서 샘플의 철 농도를 계산합니다.
- 반도체 pH 전극과 은 염화물 전극이 있는 디지털 pH/레독스 미터로 pH 값과 산화/환원 전위(ORP)를 각각 분석합니다.
- Thoma 챔버가있는 가벼운 현미경을 사용하여 플랑크토닉 세포를 직접 계산하십시오.
- 전자 현미경 검사법 (SEM)을 스캔하여 세포 형태를 조사합니다.
- 0.1-0.2 μm 기공 크기 필터를 통해 다양한 조건하에서 성장한 플랑크토닉 세포를 필터합니다.
- 아세톤으로 시료를 탈수하고 90% 아세톤에서 4°C에서 하룻밤 동안 보관합니다.
- 임계 점 건조에 의해 샘플을 건조하고 흑연 또는 금으로 코팅.
- 10 kV에서 필드 방출 주사 전자 현미경 (FE-SEM)를 가진 견본을 검토하십시오.
Representative Results
특수금-티타늄 반응 세포를 이겨낸 고압 반응기 실험의 결과는 산성애의 미생물 혼합 배양이 황을 산화시키고 철철을 철로 환원시켰다는 것을보여준다(도 3).
1 bar 또는 100 bar 압력 조건에서, 배양액은 금-티타늄 반응 세포에서 성장했을 때 지연 상을 가졌다. 그 기간 이후에, 철철 농도가 약 9 mM에서 31 mM으로 급격히 증가하여 1 bar에서 재배된 배양물에서 발생하였다. 22일의 배양 시간 동안, ~31 mM 및 13 mM의 철철이 각각 1 bar 및 100 bar에서 검정되었다. 이것은 미생물 세포가 100 bar에서 활성화되었다는 것을 명확하게 보여줍니다, 그러나 그들의 철 분 감소 활동은 높은 압력에서 현저하게 더 낮았습니다. Hungate 튜브 및 혈청 병에서 수행된 생체 대조군 실험은 1 bar 및 100 bar에서 철분 감소를 나타내지 않았다.
스캐닝 전자 현미경 이미지(그림 4)낮은 및 고압에서 실험에서 성장 막대 모양의 세포를 보여줍니다. 세포 형태에 유의한 변화는 1 bar 대 100 bar에서 관찰되지 않았다. 그러나, 세포 성장은 100 bar7에서4.5 x 107 세포/mL에 비해 1bar에서 1.3 x 108 세포/mL이었기 때문에 상승된 압력에 의해 명백하게 억제되었다. 이러한 데이터는 Hungate 튜브7에서수행 된 테스트와 비교됩니다. 따라서, 유연한 금-티타늄 반응 세포 자체는 세포 성장에 영향을 미치지 않았으며 미생물 성장 시험에 적합했다.
결과는 생물분해 미생물이 100 bar의 고압에서도 활성화되어 있으며, 이러한 조건은 1,000m7이하의 깊이에서 깊은 광석 퇴적물에서 발생하기 때문에 현장에서 생체 채굴에 매우 관련이 있음을 보여줍니다.
그림 1: 반응 세포 부분의 개요. 아래에서 위로: 골드 백, 티타늄 칼라, 티타늄 헤드, 와셔, 티타늄 압축 볼트 링, 스테인리스 땀샘이있는 티타늄 샘플링 튜브, 양쪽에 고압 콘 및 스레드 연결을위한 칼라, 그리고 티타늄 밸브와 티타늄 밸브 루어 잠금 주사기를 연결하기위한 어댑터. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 티타늄 등급 2의 막대에서 가공된 티타늄 부품의 치수 도면. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 철-산화 배양액을 가진 금-티타늄 반응 세포내의 철철 농도의 변화. 세포를 30°C에서 혐기성으로 배양하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 1 bar 및 100 bar에서 재배된 철철 산화 문화의 형태. 세포를 30°C에서 혐기성으로 배양하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
산성 용액 내의 미생물 반응의 고압 실험을 위한 제시된 방법은 실험실 환경에서 깊은 지하 지구미생물 공정을 시뮬레이션하는 강력한 도구였습니다.
관련된 수많은 수동 작업 단계가 있으며, 그 중 일부는 특별한주의가 필요합니다. 일반적으로 유연한 금 티타늄 셀과 반응기 헤드(섹션 3 및 4)의 개별 부품을 조립할 때 과도한 힘을 사용해서는 안 됩니다. 제조업체의 사양(예: 최대 압력, 온도, 토크)을 무시하면 누출 및/또는 재료 고장이 발생할 수 있습니다.
금과 티타늄 부품(섹션 2.2)의 세척은 이 실험뿐만 아니라 특히 유기 반응과 관련된 실험에 필수적인 작업 단계입니다. 금 세포에서 이전 실험에서 잔재 원치 않는 반응을 일으킬 수 있습니다 따라서 결과의 편견. 조립된 금티타늄 셀이 반응기 헤드에 설치되면, 이 때 소량의 산소가 금 세포에 들어갈 수 있기 때문에 신속하고 정확하게 작동하는 것이 가장 좋습니다. 글로브 박스를 떠나기 전에 샘플링 밸브를 닫는 것은 금 전지의 내부와 주변 분위기 사이의 교환을 최소화하기위한 좋은 첫 번째 조치입니다.
반응기가 흔들기 장치에 배치되면 흔들기 동작 속도를 ~170°/min로 설정하는 것이 중요합니다. 고압 반응기가 너무 빨리 움직이면 중력 효과 나 퇴적물 또는 암석 샘플의 날카로운 가장자리로 인해 금 전지의 파열이 발생할 수 있습니다.
이 방법은 추가 연구 분야에서 사용할 수 있습니다. 유연한 금 티타늄 반응 셀은 높은 압력 과 온도에서 고부부식성 유체 또는 가스에서 반응을 연구하는 다양한 과학적 조사9 세트에 사용될 가능성이 있습니다.
미네랄 표면의 존재 하에서 70°C 이상의 온도에서 깊은 지하 표면의 미생물은 상승된 압력 하에서도 아세테이트와 같은 분자 수소 또는 유기산의 생산을 자극할 수 있다16. 이러한 제품, 및 다른 화합물, 이 연구에서 조사 된 황 화합물 이외에, 시제 생물 질화 과정에서 높은 미생물 활동을 유도 할 수있다.
응용 분야에는 수성 유체의 가스 및 이온의 용해도 측정, 수열 환구 시스템(17)의조건에서의 지구 화학 반응, 동위원소 분획의 정량화18,CO 중 지구 화학 반응 포함 2 격리19,소스 암석(20)에서 오일 및가스의 형성 동안 의 생체 학적 과정, 및 본 연구에서와 같이지하(21)에서 상승된 압력에서 미생물 반응.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
우리는 로버트 로젠바우어(USGS, 멘로 파크)가 하노버에서 수정된 시스템을 설정하는 초기 단계에서 유연한 금 티타늄 반응 세포에 대한 전문 지식을 공유하고, 게오르그 셰더(BGR)에게 감사를 표합니다. 우리는 많은 과학자 (카차 Heeschen 포함, 안드레아스 리세, 젠스 Gröger-트램페, 테오도르 알페르만) 길을 따라 작은 개선에 기여 수많은 프로젝트에서 하노버의 설정을 사용하여 감사하고 크리스티안 시거 개발을위한 고압 반응기용 흔들 기재. 우리는 SEM 관찰에 대한 로라 카스트로 (마드리드 콤플루텐세 대학)에게 감사드립니다. 마지막으로, 이 기사에 대한 고품질 비디오를 제작한 닐스 뵈르키에게 감사를 표하고 싶습니다. 이 작품은 유럽 연합 호라이즌에 의해 지원되었다 2020 프로젝트 BIOMOre (보조금 계약 # 642456).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | Merck | 100013 | |
| CaN2O6 | Fluka | 31218 | |
| Conax compression seal fittings | Conax Technologies | PG2-250-B-G | sealant could be selected according to temperatures in experiment |
| Copper paste | Caramba | 691301 | |
| Copper paste | CRC | 41520 | |
| CoSO4x7H2O | Sigma | 10026-24-1 | |
| CrKO8S2x12H2O | Roth | 3535.3 | |
| CuSO4x5H2O | Riedel de Haen | 31293 | |
| Disposable cuvettes | Sigma | z330388 | |
| Ethanol absolute | Roth | 9065.3 | |
| FE-SEM | JEOL | model no. JSM-6330F | |
| Ferrozine | Aldrich | 180017 | |
| Fe2(SO4)3x7H2O | Alfa Aesar | 33316 | |
| FeSO4x7H2O | Merck | 103965 | |
| Gold cell | Hereaus GmbH | manufactured according to dimensions supplied by customer | |
| High-pressure reactor | PARR Instruments | model no. 4650 Series | reactors from other vendors could be used, too |
| High-pressure syringe pump | Teledyne ISCO | DM-100 | |
| HCl | Roth | 6331.3 | |
| HNO3 | Fluka | 7006 | |
| H3BO3 | Sigma | B6768 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| KH2PO4 | Merck | 104873 | |
| L-(+)-Ascorbic acid/Vitamin C | Applichem | A1052 | |
| Light microscope | Leica DM3000 | ||
| MgSO4x7H2O | Merck | 105886 | |
| (NH4)2SO4 | Sigma | A4418 | |
| NaMoO4x2H2O | Sigma | 331058 | |
| NaO3Sex5H2O | Sigma | 00163 | |
| NaO3V | Sigma | 590088 | |
| Na2SO4 | Merck | 106649 | |
| Na2WO4x2H2O | Sigma | 72069 | |
| NiSO4x6H2O | Sigma | 31483 | |
| Omnifix Luer | BRAUN | 4616057V | |
| pH meter | Mettler Toledo | ||
| Redox potential meter | WTW | ORP portable meter | |
| Safe-Lock Tubes, 2 mL | Eppendorf | 0030120094 | |
| Serum bottle | Sigma | 33110-U | |
| Spectrophotometer | Thermo Scientific | model no. GENESYS 10S | |
| Sterican Hypodermic needle | BRAUN | 4657519 | |
| Stoppers | Sigma | 27234 | |
| Sulfur powder | Roth | 9304 | |
| Thoma Chamber | Hecht-Assistent | ||
| Titanium parts of reaction cell | Titan-Halbzeug GmbH | 121-238 | manufactured by workshop at BGR according to dimensions supplied from Titanium grade 2 rods from Titan-Halbzeug GmbH |
| Titanium valve | Nova Swiss Technologies | ND-5002 | |
| Whatman membrane filters nylon | Sigma | WHA7402004 | |
| ZnSO4x7H2O | Sigma | Z4750 |
References
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