Summary
该协议描述了在高压下进行微生物实验，以研究原位生物采矿过程。该实验方法采用一种摇动的高压反应器，该反应器装有一个金钛反应细胞，在酸性、富含铁的介质中含有微生物培养基。
Abstract
研究地下微生物过程的实验室研究，如深矿床中的金属浸出（生物采矿），存在共同和具有挑战性的障碍，包括需要复制的特殊环境条件，例如高压在某些情况下，酸性溶液。前者需要一个适合加压至100bar的实验装置，而后者需要一个具有高耐腐蚀性和与容器壁发生不需要的化学反应的流体容器。为了满足这些在原位生物采矿领域的应用条件，本研究在摇动高压反应器内使用了一种特殊的柔性金钛反应单元。所述系统允许在缺氧、压力控制、高度化学惰性实验环境中通过硫驱动微生物铁还原来模拟原位生物采矿。柔性金钛反应单元可以容纳高达 100 mL 的样品溶液，可在系统保持所需压力的同时，在任何给定时间点进行采样。实验可以在从小时到几个月的时间尺度上进行。组装高压反应器系统相当耗时。然而，当在化学腐蚀性流体中发生在地球深层地下的复杂和具有挑战性的（微生物）过程时，这一系统的优点大于缺点。结果发现，即使在高压下，微生物联合体也是活跃的，但代谢率明显较低。
Introduction
在过去十年中，为尽量减少采矿对环境的影响而作出的努力有所增加。露天开采，用于开采矿石（例如，富含铜的硫化矿石），挖掘活动以及开采珍贵矿石后剩余的大量废石和加工矿石遗骸，对周围景观产生影响金属，如铜。直接从地下矿石中提取铜将大大减少这些影响。原位生物采矿技术是这一过程的一个有前途的候选技术。本出版物描述了利用刺激的微生物活性将贵金属从矿石中提取到地下的水溶液中。因此，例如，富含铜的溶液可以很容易地泵回表面，以进一步浓缩金属。
许多实验室对亲矿石浸酸微生物的活性进行了研究，研究参数为2、3、4、5、6等。然而，由于环境表面实验室条件（近1 bar）和静水条件（±100 bar）深度为1000米的地下环境实验室条件之间的差异，对微生物活动的压力影响没有很好的记录。因此，通过不同的实验途径，研究了压压对微生物铁还原的影响。在这里，详细介绍了最合适的技术。
高压反应器被广泛用于研究地球地下压力和温度的反应。这种反应器由底部的一个反应器容器组成，该容器可以包含具有微生物培养的流体样品。位于反应堆容器顶部，反应堆头为安全措施和监测传感器（如温度或压力）提供了多种连接和接口。大多数高压反应器由不锈钢制成。这种材料具有高弹性和良好的加工性能，但不锈钢表面的耐腐蚀性并不适合每种应用。例如，如果研究高酸性或高还原水溶液，则可能发生与反应器壁有关化合物的显著反应。避免这种情况的一个方法是将衬垫插入反应堆容器，例如由硼硅酸盐玻璃7制成的衬垫。它易于清洁，可以通过高压灭菌进行灭菌。此外，它不受酸性或减少水溶液的攻击。尽管衬垫可以帮助防止溶液或微生物在不锈钢反应器壁溶液中的人工反应，但仍然存在一些问题。其一，如果形成腐蚀性气体，如硫酸盐还原细菌产生的硫化氢，这种气体可能与位于衬套上方的反应器头的未覆盖表面发生反应。另一个缺点是，在保持压力的同时，不可能从反应器中取出样品。
为了克服这些限制，高压反应器内部专门开发了柔性反应单元，用于各种应用。柔性聚四氟乙烯（PTFE）细胞8设计用于高盐盐水盐的溶解度研究。然而，该系统的局限性是，一些气体很容易渗透到PTFE。此外，这种材料仍然具有相对较低的温度稳定性。因此，通过设计一个带有钛头9的柔性金包，将放置在不锈钢高压反应器内，从而改进了该系统。金表面耐酸性或减少溶液和气体的耐腐蚀。当彻底钝化以形成连续的二氧化钛层时，钛表面也高度惰性。在通过连接的钛取样管从该反应单元取样时，金袋体积缩小。系统的内部压力通过将相同体积的水（如取样）泵入容纳反应单元的不锈钢高压反应器来维持。在实验过程中，通过摇动或倾斜高压反应器超过90°，使反应单元内的样品保持运动。
反应单元由图1中描述的部件组成：金袋、钛领、钛头、不锈钢垫圈、钛压缩螺栓环、钛取样管（带不锈钢腺体和用于高压锥形和领圈）的钛取样管。螺纹连接两侧，和钛阀。金袋为圆柱形金质（Au 99.99），壁厚为0.2毫米，外径为48毫米，长度为120毫米。
所有钛部件均由车间由钛 2 级棒定制。图 2中可以看到衣领、头、垫圈和压缩螺栓环的尺寸。钛取样管是钛毛细管，外径6.25毫米，壁厚1.8毫米，内径2.65毫米。通过高压锥和螺纹连接将其固定在钛头和钛阀中，确保钛对钛表面的密封。高压钛阀配有缓慢开口杆，即使在高压下也能进行非常可控的打开或采样。这个系统被用于许多研究10，11，12。
Protocol
1. 微生物培养的培养和接种的准备
- 根据已公布的技术13，为自营养原核生物制备基底盐培养基。溶解和混合蒸馏水中以下的化学品 （mg/L）： Na2SO4+10H2O （150） （NH4）2SO4 （450）， KCl （50）， MgSO4+7H2O （500）， KH2PO4 （50） 和 Ca （NO3）2±4H2O （7）。
- 添加包含（g/L）的 1，000x 浓缩微量元素溶液的 1 mL/L：ZnSO4+7H2O （10）、CuSO4+5H2O （1）、MnSO4|H2O （0.76），CoSO4+7H2O （1）， CrK （SO4）2+12H2O （0.4）， H3BO3 （0.6）， 纳莫4+2H2O （0.5）， 尼索4+6H2O （1）， 纳2SeO4 （0.51），Na2WO4+2H2O （0.1） 和 NaVO3 （0.1）。加入5M硫酸，将pH态调节至1.8。
- 在 121°C 和 1.2 bar 的高压灭菌器中对介质进行消毒 20 分钟，并通过 0.22 μm 孔径注射器过滤器进行过滤，对铁铁溶液进行消毒。
- 将50 mL的消毒基底盐培养基转移到血清瓶中，并将铁铁溶液和元素硫分别加入50 mM和10 g/L的最终浓度。
- 接种介质与混合培养由几个嗜酸性铁氧化原核生物14组成。
- 用消毒的丁基橡胶塞盖住血清瓶，用铝压接密封。
- 用N2大力泡培养基，剥离溶解氧25分钟。使用两针，将一针深放在瓶头，另一针接近瓶盖。
- 注射CO2，在血清瓶的头部空间获得90%的N2和10%的CO2大气。在黑暗中，在不搅拌30°C的情况下孵育培养。
2. 金钛反应电池和高压反应器的制备
- 清洁金钛反应细胞。
- 将反应单元分解到各个部件中，以避免酸与不锈钢部件接触，或将具有不同热膨胀特性的组装部件暴露至热中。
- 清洁实验期间与样品接触的表面（即金袋、钛头、钛取样管和钛阀）。
- 将金袋和钛头放入玻璃烧杯中。
- 添加足够的 10% HCl 以覆盖所有部件。
- 将加热板上的酸加热至 50°C 3 小时，同时搅拌。
- 从酸溶液中取出带有 PTFE 钳子的部件，然后用去离子水冲洗。
- 用 65% HNO3彻底冲洗金袋和钛头的内表面，然后用去离子水冲洗。
- 用10%HCl冲洗钛取样管和钛阀的内表面，然后用去离子水，65%HNO3，然后再次去离子水。
- 用丙酮洗净所有零件，使其免受有机污染。
- 在 105°C 下干燥烤箱中的所有部件至少 1 小时。
- 将金袋、钛头和钛取样管的表面暴露在 450°C 的温度下加热 4 小时，在空气环境中的消声炉中加热。
注：此程序对表面进行消毒，导致在所有钛表面形成钝化二氧化钛层。热处理后，钛部件应呈黄色至蓝色。 - 通过用丙烷割炬加热来重置小结晶域，使金细胞受到破坏，从而增加黄金的灵活性。加热黄金表面，以减少在实验中最后一次收缩金袋体积时可能形成的金质结。确保不要在一个地方加热黄金太多，以避免其熔化。
注：金表面的红色发光显示足够的加热。 - 使用 10 Nm 的扭矩将金袋组装到钛领中，将钛取样管放入钛头。
- 检查高压反应器。
- 目视检查反应器的可能损坏、腐蚀和松动部件。
注意：应特别注意密封的密封件和进行密封的路缘。如果以前使用石墨垫片来密封反应器，则其残余物可能仍在路缘中，应在下一次实验前用塑料销将其拆下。 - 在高压反应器头的推力螺栓上涂上硫化铜膏。确保润滑脂分布在整个螺纹上。
- 检查螺钉安装压缩密封的长度，以寻找剩余的石墨包装长度。
- 目视检查反应器的可能损坏、腐蚀和松动部件。
3. 在缺氧条件下填充和组装金钛反应细胞
- 装入手套箱。
- 根据第1节，在血清瓶中制备培养基。
- 包裹金钛反应细胞的部件，这些部件稍后将与铝箔中的样品接触，以尽量减少任何潜在的污染。
- 打开并解锁手套箱的前室，将所有入站材料装载到可移动托盘上，然后关闭并锁定前盖。
- 疏散前室3x，并淹没它与高纯度氮。
- 戴上一副手套，尽可能靠近内盖。解锁并打开内盖，从可移动托盘中取出入站材料。
- 关闭并锁定内盖。
- 填充金单元格。
- 例如，打开干净的金袋，用玻璃烧杯站立起来。打开含有100 mL细菌培养物和元素硫的血清瓶。
- 轻轻摇动血清瓶，将细菌培养物转移到金袋中。
- 组装反应细胞。
- 将钛头与随附的钛取样管插入连接金袋上部边缘的钛领中。
注：确保钛头的圆锥下部密封表面平稳地适合，前后转动90°。 - 将垫圈和压缩螺栓环滑到钛取样管上。
注：将钛环中的压缩螺栓环转动 30°，以对齐钛领和推力螺栓环的法兰。 - 将六个 Allen 螺钉固定到相同的程度，以确保钛头在钛领（即反应单元的密封表面）金袋最上部边缘上均匀分配压力。
注：将压缩螺栓环中的 Allen 螺钉固定，直到手紧，以便先增加相反螺钉的扭矩（交叉），然后再顺时针继续。
- 将钛头与随附的钛取样管插入连接金袋上部边缘的钛领中。
- 重新安装钛管顶部的取样阀。用手固定连接并确保关闭阀门。
- 从手套箱中取出所有零件。
4. 将高压反应器与反应单元组装在一起
- 将反应单元组装到反应器头。
注：高压反应器的安装使取样管的开端与周围大气接触的时间很短，因为必须拆下取样阀以引导该管穿过反应器头的螺钉密封。对于安装，应将反应器头放入工作台。45° 角度允许更容易处理。压缩密封接头（位于反应器头的量盖块组件的中心位置），将取样管固定到位，需要打开。- 拆下取样管顶部的钛取样阀、螺钉和衣领。
- 引导管，将反应细胞附着在反应器头的中央孔中，直到约5厘米的管穿过。将大螺钉滑到管子上并固定小衣领。
注：现在反应单元组件不能滑回反应器头，双手可以自由重新安装取样阀。 - 重新连接钛气门。
- 拧紧压缩密封接头。
- 将反应堆头从工作台上拆下，将其安装在反应堆容器上。
- 准备密封反应器。
- 将石墨密封在反应堆容器的轮缘上。
- 小心地将带有附加反应单元的反应堆头放在反应器容器上。
注：反应器头（包括热电偶）必须小心地放置在反应器容器上，不得损坏金袋或热电偶。
- 向反应器容器中填充去离子和自来水的混合物（大约以 1：1 的比例）。
- 密封反应器。
- 检查衣领，确保压缩螺栓的下端没有伸出螺纹。否则，压力容器将不能正确安装。
- 提起衣领并将其放在反应器头容器界面的突出边缘周围。轻轻移动衣领，将产生适当的配合。合上卡扣锁，将衣领固定到位。
- 按照纵横交错的图案固定压缩螺栓，以中等步骤增加扭矩，直到达到制造商建议的最终值。
注：不同的高压反应器系统可能具有不同的扭矩值。 - 最后，以顺时针方式固定压缩螺栓。
- 在摇动装置中安装高压反应器。
注：德国汉诺威联邦地球科学和自然资源研究所生产的定制模型描述了在摇动装置中安装高压反应器。因此，描述的安装是同类设计的设备的一般准则。- 小心地将反应堆安装在摇动装置中。
注：最好用量具组件部件（例如，电力计或取样管螺钉）握住高压反应器，同时将其放入摇动装置中。 - 用两个夹子固定在一对长螺钉上。
- 将夹板放在每个螺钉上，用螺钉螺母拧紧夹具。
- 连接热电偶、压力传感器和加热元件的控制单元。
注：请务必确保所有导线长度足以进行摇动运动，并防止接触加热表面。 - 将加热元件滑过反应器容器并拧紧其螺钉锁。
注：向系统加压的水取自带高压泵的储液罐。它通过不锈钢毛细管输送到高压反应器中。
注：高压反应器的摇动保证了反应细胞含量（即气体、流体及其所有固体相）的彻底混合。缓慢的摇动速度对于防止快速移动的固体或因重力作用在高温下对柔性金体而变形而损坏金袋非常重要。摇动系统可旋转近 180°。
- 小心地将反应堆安装在摇动装置中。
5. 开始实验
- 检查监控软件中的温度和压力限制是否设置为所需值。
注：在本实验中，它们被设置为 70°C 和 25 MPa。 - 执行泄漏检查。
- 将压力管（不锈钢毛细管）连接到反应器头。
- 以不同的间隔将压力升高到目标压力，同时持续检查泄漏情况。
- 保持压力常数，直到泵的流量接近于零。
注意：请注意，在水中的可压缩溶解空气在细微的流动读数中长时间可见。
- 成功进行泄漏检查后，启动加热。
- 启动加压泵的测井。
- 将加热的设定点调整到所需的值，然后使用软件开始加热。
- 定期检查所有参数和系统状态。
- 达到目标温度后，拧紧压力管。
- 启动摇动设备。
6. 在运行模式下对高压反应堆进行取样
- 要取样，请将 5 mL 注射器连接到高压反应器顶部取样阀的 Luer Lock 连接器上。
- 小心地打开阀门，让液体样品通过高压反应器内的压力推入注射器。采样体积达到 1 mL 后关闭阀门。分离注射器。
- 立即将注射器中的样品转移到烟机罩中的 2 mL 管中进行处理。
7 .流体样品分析
注： 此处仅详细介绍了不太常见的光度法铁氧测法测定步骤（即第 7.1 节），并在视频中提到，因为其他步骤是微生物学中的标准操作程序。
- 使用铁氧体测定法对溶解铁（Fe2+（aq）和总铁 （Fetot）15的浓度进行光度测定。
- 通过在水中溶解已知数量的 FeSO4+7 H2O，制备一系列铁质标准溶液。
- 将 50 μL 的标准电平与 1 m 铁津溶液的 1 mL 混合。
注：铁氧体与溶解铁的反应形成紫色复合物。颜色的强度与铁铁浓度相关。 - 在铁铁浓度和铁铁-铁氧合物的吸收率之间建立校准曲线。
- 根据既定的标准曲线，通过两个平行测量值计算样品铁铁的浓度。
- 分别使用带半微pH电极的数字pH/氧化/还原计和氯化银电极分析pH值和氧化/还原电位（ORP）。
- 使用带Thoma腔室的光学显微镜直接对浮游细胞进行计数。
- 通过扫描电子显微镜（SEM）研究细胞形态。
- 通过 0.1±0.2 μm 孔径过滤器过滤在不同条件下生长的木板细胞。
- 用丙酮脱水样品，在4°C的90%丙酮中储存过夜。
- 通过临界点干燥样品，并涂有石墨或金。
- 在 10 kV 下使用场发射扫描电子显微镜 （FE-SEM） 检查试样。
Representative Results
高压反应器实验用特殊金钛反应细胞的实验结果表明，亲酸的微生物混合培养物氧化硫，将铁铁还原铁铁（图3）。
在1巴或100bar压力条件下，培养物在金钛反应细胞中生长时有滞后阶段。之后，铁铁浓度从约9 mM迅速上升至31 mM， 生长在 1 bar 的培养中。在22天的孵育时间内，分别在1巴和100bar的测定中检测到±31 mM和13 mM铁。这清楚地表明，微生物细胞在100bar处是活跃的，但它们的铁氧还原活性在高压下明显降低。在Hungate管和血清瓶中进行的非生物对照实验没有显示铁铁在1巴和100巴的减少。
扫描电子显微镜图像（图4）显示了在低高压实验中生长的棒状细胞。在1柱对100柱时，细胞形态没有显著变化。然而，细胞生长明显受到压力升高的抑制，因为细胞数为1.3 x 108细胞/mL，在1bar时与100 bar7的4.5 x 107细胞/mL相比。这些数据与Hungate管7中的测试相当。因此，柔性金钛反应细胞本身对细胞生长没有影响，适合微生物生长试验。
结果表明，生物浸出微生物即使在100bar的高压下也是活性的，这与原位生物开采高度相关，因为这种条件发生在1000m7以下的深矿床中。
图1：反应细胞部分概述。从下到上：金袋、钛领、钛头、垫圈、钛压缩螺栓环、钛取样管，带不锈钢腺体和衣领，用于两侧的高压锥形和螺纹连接，以及带用于连接 Luer 锁注射器的适配器。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：用钛2级棒加工的钛零件的尺寸图。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：含铁氧化培养基的金钛反应单元中铁浓度的变化。细胞在30°C下厌氧培养。请点击此处查看此图的较大版本。
图4：铁氧化培养在1条和100bar生长的形态。细胞在30°C下厌氧培养。请点击此处查看此图的较大版本。
Discussion
提出在酸性溶液中进行微生物反应的高压实验方法是在实验室环境中模拟深层地下生物过程的有力工具。
涉及许多手动工作步骤，其中一些需要特别注意。一般说来，在组装柔性金钛电池和反应器头的各个部件时，不得使用过度力（第3节和第4节）。如果忽略制造商的规格（例如，最大压力、温度、扭矩），则可能导致泄漏和/或材料故障。
清洗黄金和钛部件（第2.2节）是一个不可或缺的工作步骤，不仅对这个实验，特别是对于涉及（在）有机反应的实验。以前在金细胞中实验的残留物可能会导致不必要的反应，从而对结果产生偏差。当组装的金钛电池安装在反应器头时，最好快速准确地工作，因为此时少量的氧气可以进入金细胞。在离开手套箱之前关闭取样阀是减少环境气氛与金电池内部交换的良好第一措施。
一旦反应器被放置在摇动装置中，将摇动运动速度设置为±170°/分钟非常重要。如果高压反应器移动过快，则使用时，由于重力效应或沉积物或岩石样品的锋利边缘，可能会发生金细胞破裂。
此方法可用于其他研究领域。柔性金钛反应单元具有可用于各种科学研究的潜力，9研究在高压和高温下以及高腐蚀性流体或气体中的反应。
在地下70°C以上的深层微生物在矿物表面存在的情况下，即使在高压下，也能刺激分子氢或有机酸（如醋酸）的产生。除了本研究中研究的硫化合物外，这些产品和其他化合物在原位生物浸出过程中可能诱发微生物活性升高。
应用包括测定水流体中气体和离子的溶解度、热液喷口系统17条件下的地球化学反应、同位素分馏18的定量、CO期间地球化学反应2固存19，在源岩石20形成的油气形成过程中的非生物过程，以及本研究中21号地下高压处的微生物反应。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢罗伯特·罗森鲍尔（USGS，Menlo Park）分享了他在柔性金钛反应细胞方面的专业知识，并感谢乔治·谢德（BGR）在汉诺威建立改进系统的初始阶段提供的意见。我们要感谢许多科学家（包括卡佳·海申、安德烈亚斯·里塞、詹斯·格鲁格-特拉普、西奥多·阿尔珀曼）在汉诺威的设置，这些项目在前进的道路上做出了一些小小的改进，克里斯蒂安·西格为高压反应堆的摇动装置。我们感谢劳拉·卡斯特罗（马德里康普卢坦塞大学）对SEM的观察。最后，我们要感谢尼尔斯·沃尔基为本文制作了这个高质量的视频。这项工作得到了欧盟Horizon 2020项目BIOMOre（赠款协议#642456）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | Merck | 100013 | |
| CaN2O6 | Fluka | 31218 | |
| Conax compression seal fittings | Conax Technologies | PG2-250-B-G | sealant could be selected according to temperatures in experiment |
| Copper paste | Caramba | 691301 | |
| Copper paste | CRC | 41520 | |
| CoSO4x7H2O | Sigma | 10026-24-1 | |
| CrKO8S2x12H2O | Roth | 3535.3 | |
| CuSO4x5H2O | Riedel de Haen | 31293 | |
| Disposable cuvettes | Sigma | z330388 | |
| Ethanol absolute | Roth | 9065.3 | |
| FE-SEM | JEOL | model no. JSM-6330F | |
| Ferrozine | Aldrich | 180017 | |
| Fe2(SO4)3x7H2O | Alfa Aesar | 33316 | |
| FeSO4x7H2O | Merck | 103965 | |
| Gold cell | Hereaus GmbH | manufactured according to dimensions supplied by customer | |
| High-pressure reactor | PARR Instruments | model no. 4650 Series | reactors from other vendors could be used, too |
| High-pressure syringe pump | Teledyne ISCO | DM-100 | |
| HCl | Roth | 6331.3 | |
| HNO3 | Fluka | 7006 | |
| H3BO3 | Sigma | B6768 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| KH2PO4 | Merck | 104873 | |
| L-(+)-Ascorbic acid/Vitamin C | Applichem | A1052 | |
| Light microscope | Leica DM3000 | ||
| MgSO4x7H2O | Merck | 105886 | |
| (NH4)2SO4 | Sigma | A4418 | |
| NaMoO4x2H2O | Sigma | 331058 | |
| NaO3Sex5H2O | Sigma | 00163 | |
| NaO3V | Sigma | 590088 | |
| Na2SO4 | Merck | 106649 | |
| Na2WO4x2H2O | Sigma | 72069 | |
| NiSO4x6H2O | Sigma | 31483 | |
| Omnifix Luer | BRAUN | 4616057V | |
| pH meter | Mettler Toledo | ||
| Redox potential meter | WTW | ORP portable meter | |
| Safe-Lock Tubes, 2 mL | Eppendorf | 0030120094 | |
| Serum bottle | Sigma | 33110-U | |
| Spectrophotometer | Thermo Scientific | model no. GENESYS 10S | |
| Sterican Hypodermic needle | BRAUN | 4657519 | |
| Stoppers | Sigma | 27234 | |
| Sulfur powder | Roth | 9304 | |
| Thoma Chamber | Hecht-Assistent | ||
| Titanium parts of reaction cell | Titan-Halbzeug GmbH | 121-238 | manufactured by workshop at BGR according to dimensions supplied from Titanium grade 2 rods from Titan-Halbzeug GmbH |
| Titanium valve | Nova Swiss Technologies | ND-5002 | |
| Whatman membrane filters nylon | Sigma | WHA7402004 | |
| ZnSO4x7H2O | Sigma | Z4750 |
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