Summary
Dit protocol beschrijft microbiële experimenten onder verhoogde druk om in situ biomining processen te bestuderen. De experimentele aanpak maakt gebruik van een schommelende hogedruk reactor uitgerust met een goud-Titanium reactiecel met een microbiële cultuur in een zuur, ijzerrijk medium.
Abstract
Laboratorium studies onderzoeken suboppervlakte microbiële processen, zoals metaal uitspoeling in diepe ertsafzettingen (biomining), delen gemeenschappelijke en uitdagende obstakels, met inbegrip van de bijzondere omgevingscondities die moeten worden gerepliceerd, bijvoorbeeld hoge druk en in sommige gevallen zure oplossingen. De eerste vereist een experimentele Setup geschikt voor druk tot 100 Bar, terwijl de laatste eist een vloeistof container met hoge chemische bestendigheid tegen corrosie en ongewenste chemische reacties met de container wand. Om aan deze voorwaarden te voldoen voor een toepassing op het gebied van in-situ-biomining, werd in deze studie een speciale flexibele goud-Titanium-reactie cel in een schommelende hogedruk reactor gebruikt. Het beschreven systeem liet simulatie van in-situ biomining door zwavelgedreven microbiële ijzer reductie in een anoxische, drukgecontroleerde, zeer chemisch inerte experimentele omgeving. De flexibele Gold-Titanium reaction Cell is geschikt voor maximaal 100 mL monsteroplossing, die op elk moment kan worden bemonsterd terwijl het systeem de gewenste druk behoudt. Experimenten kunnen worden uitgevoerd op tijdschema's variërend van uren tot maanden. Het monteren van het hogedruk reactor systeem is redelijk tijdrovend. Niettemin, wanneer complexe en uitdagende (microbiologische) processen die zich voordoen in de diepe ondergrond van de aarde in chemisch agressieve vloeistoffen moeten worden onderzocht in het laboratorium, de voordelen van dit systeem opwegen tegen de nadelen. De resultaten vonden dat zelfs bij hoge druk het microbiële consortium actief is, maar tegen aanzienlijk lagere metabolische tarieven.
Introduction
In de afgelopen tien jaar zijn de inspanningen om de impact van de mijnbouw op het milieu te minimaliseren toegenomen. Open pit mining voor de grondstofwinning van ertsen (bv. koper rijke sulfide ertsen), beïnvloedt het omringende landschap door de opgravings activiteiten en door de grote overblijvende volumes afval rotsen en resten van verwerkte erts na de winning van kostbare metalen zoals koper. Het extraheren van koper rechtstreeks uit het erts in de ondergrond zou deze effecten aanzienlijk verminderen. De technologie van in-situ biomining is een veelbelovende kandidaat voor dit proces1. Deze publicatie beschrijft het gebruik van gestimuleerde microbiële activiteit om de edele metalen uit het erts te halen in een waterige oplossing in de ondergrond. Zo kan een koper rijke oplossing gemakkelijk terug naar het oppervlak worden gepompt om bijvoorbeeld het metaal verder te concentreren.
De activiteit van erts-uitloog acidophilic micro-organismen is in veel laboratoria bestudeerd voor een divers scala aan parameters2,3,4,5,6. Echter, druk effecten op de microbiële activiteit als gevolg van het verschil tussen omgevings oppervlak laboratoriumomstandigheden (in de buurt van 1 bar) en de ondergrond op een diepte van 1.000 m met hydrostatische condities (~ 100 bar), zijn niet goed gedocumenteerd. Daarom zijn de effecten van druk op microbiële ijzer reductie onderzocht via verschillende experimentele wegen7. Hier wordt de meest geschikte techniek gedetailleerd beschreven.
Hogedruk reactoren zijn veelvuldig gebruikt voor het bestuderen van reacties bij druk en temperaturen die zich in de ondergrond van de aarde voordoen. Dergelijke reactoren bestaan uit een reactorvat aan de onderzijde dat een vloeistofmonster met een microbiële cultuur kan bevatten. De reactor hoofd zit bovenop het reactorvat en biedt een breed scala aan aansluitingen en interfaces voor veiligheidsmaatregelen en bewakings sensoren (bijv. temperatuur of druk). De meeste hogedruk reactoren zijn gemaakt van roestvrijstaal. Dit materiaal biedt een hoge veerkracht en goede bewerkingseigenschappen, maar de corrosiebestendigheid van het roestvrijstalen oppervlak is niet geschikt voor elke toepassing. Als bijvoorbeeld sterk zure of sterk reducerende waterige oplossingen worden onderzocht, kunnen significante reacties van de verbindingen die van belang zijn met de reactorwand optreden. Een manier om dit te voorkomen is om een liner in het reactorvat te plaatsen, bijvoorbeeld een Liner gemaakt van borosilicaatglas7. Het is gemakkelijk te reinigen en kan worden gesteriliseerd door Autoclaveren. Bovendien wordt het niet aangevallen door zure of minder waterige oplossingen. Hoewel een liner kan helpen om kunstmatige reacties van de oplossing of microben in de oplossing met de roestvrijstalen reactorwand te voorkomen, blijven er verschillende problemen bestaan. Voor één, als een corrosief gas wordt gevormd, zoals waterstofsulfide geproduceerd door sulfaat-reducerende bacteriën, kan dit gas reageren met het onbedekte oppervlak van de reactor kop die boven de liner zit. Een ander nadeel is dat het niet mogelijk is om een monster uit de reactor te trekken met behoud van de druk.
Om deze beperkingen te overwinnen, zijn gespecialiseerde flexibele reactie cellen in de hogedruk reactoren ontwikkeld voor een verscheidenheid aan toepassingen. Een flexibele polytetrafluorethyleen (PTFE) cel8 is ontworpen voor oplosbaarheid studies van zouten in zeer zoute brines. De beperking van dit systeem is echter dat sommige gassen gemakkelijk de PTFE kunnen doordringen. Daarnaast heeft dit materiaal nog steeds een relatief lage temperatuur stabiliteit. Zo werd het systeem verbeterd door het ontwerpen van een flexibele gouden tas met een titanium kop9 om in de roestvrijstalen hogedruk reactor te worden geplaatst. Het goud oppervlak is corrosiebestendig tegen zure of reducerende oplossingen en gassen. Het Titanium oppervlak is ook zeer inert wanneer het grondig wordt gepassiveerde om een continue titaandioxide laag te vormen. Tijdens het bemonsteren van deze reactiecel door een aangesloten Titanium bemonsteringsbuis krimpt de gouden zak in volume. De interne druk van het systeem wordt gehandhaafd door het pompen van dezelfde hoeveelheid water, zoals wordt teruggetrokken door bemonstering, in de roestvrijstalen hogedruk reactor opvang van de reactie-cel. Het monster in de reactiecel wordt in beweging gehouden door tijdens het experiment de hogedruk reactor met meer dan 90 ° te rocken of te kantelen.
De reactiecel bestaat uit de delen afgebeeld in Figuur 1: de gouden zak, Titanium kraag, Titanium kop, roestvrijstalen ring, Titanium compressie bout ring, Titanium bemonsteringsbuis met roestvrij klieren en halsbanden voor de hoge druk kegelvormige en schroefverbindingen aan beide zijden en de Titanium klep. De Gold Bag is een cilindrische gouden (au 99,99) cel met een wanddikte van 0,2 mm, een buitendiameter van 48 mm en een lengte van 120 mm.
Alle titanium onderdelen worden op maat gemaakt door de workshop van titanium Grade 2 hengels. De afmetingen van de kraag, het hoofd, de ring en de ring van de compressie bout zijn zichtbaar in Figuur 2. De Titanium bemonsteringsbuis is een capillair van titanium met een buitendiameter van 6,25 mm en een wanddikte van 1,8 mm, resulterend in een inwendige diameter van 2,65 mm. Het is bevestigd in de Titanium kop en de Titanium klep door hoge druk kegelvormige en schroefdraad verbindingen zorgen voor een zegel van titanium-tegen-Titanium oppervlakken. De hogedruk Titanium klep is uitgerust met een langzame opening stuurpen om zeer gecontroleerde opening of bemonstering zelfs bij hoge druk mogelijk te maken. Dit systeem werd gebruikt in tal van studies10,11,12.
Protocol
1. bereiding van het medium en de inoculatie van de microbiële cultuur
- Bereid een basaal zout medium voor autotrofische prokaryoten volgens gepubliceerde technieken13. Los en meng de chemicaliën hieronder in gedistilleerd water (mg/L):na 2dus4· 10h2o (150) (NH4)2so4 (450), KCl (50), MGSO4· 7h2o (500), KH2po4 (50) en ca (no 3) 2· 4h2O (7).
- Voeg 1 mL/L van een 1, 000x geconcentreerde spoorelement oplossing met (g/L): ZnSO4· 7h2o (10), CuSO4· 5H2o (1), mnso4· H2o (0,76), Coso4· 7h2o (1), CRK (zo4)2· 12h2O (0,4), H3BO3 (0,6), namoo4· 2H2o (0,5), NISO4· 6h2o (1), na 2 SeO4 (0,51), na2wo4· 2H2O (0,1), en NaVO3 (0,1). Pas de pH op 1,8 door 5 M zwavelzuur toe te voegen.
- Steriliseren het medium in een autoclaaf bij 121 °C en 1,2 bar gedurende 20 minuten en steriliseren de ijzer oplossing door filtratie door een 0,22 μm poriegrootte spuit filter.
- Breng 50 ml van het gesteriliseerde basale zout medium over in een serum fles en voeg ijzer-ijzer oplossing en elementair zwavel toe aan een eindconcentratie van respectievelijk 50 mm en 10 g/L.
- Beënt het medium met een gemengde cultuur bestaande uit verschillende mesoacidophilische ijzer-oxiderende prokaryoten14.
- Dop de serum fles met gesteriliseerde butylrubberen stoppers en afdichting met aluminium krimp.
- Bel het kweekmedium krachtig met N2 om de opgeloste zuurstof gedurende 25 minuten te strippen. gebruik twee naalden, plaats een dieper in de fles kop, de andere dicht bij de dop.
- Injecteer CO2 om een atmosfeer van 90% N2 en 10% Co2 te verkrijgen in de hoofdruimte van de serum fles. Inbroed de cultuur zonder te roeren op 30 ° c in het donker.
2. voorbereiding van de Gold-Titanium reaction Cell en de hogedruk reactor
- Reinig de Gold-Titanium reactiecel.
- Demonteer de reactie cel in de afzonderlijke delen om te voorkomen dat het contact van zuur met de roestvrijstalen delen, of de blootstelling van de geassembleerde onderdelen met verschillende thermische expansie-eigenschappen om te verwarmen.
- Reinig de oppervlakken die tijdens het experiment in contact komen met het monster (d.w.z. de gouden zak, de Titanium kop, Titanium bemonsteringsbuis en Titanium klep).
- Plaats de gouden tas en de Titanium kop in een glazen bekerglas.
- Voeg voldoende 10% HCl toe om alle onderdelen te bedekken.
- Verwarm het zuur op een verwarmingsplaat tot 50 °C gedurende 3 uur tijdens het roeren.
- Verwijder de onderdelen met PTFE pincet uit de zure oplossing en spoel ze af met gedeïoniseerd water.
- Spoel het binnenoppervlak van de gouden zak en de Titanium kop grondig met 65% HNO3 en vervolgens met gedeïoniseerd water.
- Spoel het binnenste oppervlak van de Titanium bemonsteringsbuis en de Titanium klep met 10% HCl, gevolgd door gedeïoniseerd water, 65% HNO3, en vervolgens gedeïoniseerd water weer.
- Reinig alle onderdelen van organische verontreiniging door ze met aceton te spoelen.
- Droog alle delen in de oven bij 105 °C gedurende ten minste 1 uur.
- Verwarm de oppervlakken van de gouden zak, de Titanium kop en de Titanium bemonsteringsbuis door ze bloot te stellen aan een temperatuur van 450 °C gedurende 4 uur in een moffeloven in een lucht atmosfeer.
Let op: deze procedure Steriliseert de oppervlakken en resulteert in de vorming van een passiverende titaniumdioxide laag op alle Titanium oppervlakken. De Titanium delen moeten een gele tot blauwe kleur hebben na de hittebehandeling. - Anneal de gouden cel om de flexibiliteit van het goud te verhogen door het resetten van kleine kristallisatie domeinen door warmte toe te passen met een propaan toorts. Verwarm het gouden oppervlak rondom om knikken in het goud te verminderen die mogelijk gevormd zijn tijdens het laatste krimpen van het goud zakje volume in een experiment. Zorg ervoor dat u het goud niet te veel op één plek verhit om te voorkomen dat het smelt.
Opmerking: een rode gloed van het gouden oppervlak toont voldoende Verwarming. - Monteer de gouden zak in de Titanium kraag, en de Titanium bemonsterings slang in de Titanium kop met een koppel van 10 nm voor de klieren.
- Inspecteer de hogedruk reactor.
- Controleer de reactor visueel op mogelijke beschadigingen, corrosie en losse onderdelen.
Opmerking: er moet speciale aandacht worden besteed aan de afdichting en de kerf waar de verzegeling plaatsvindt. Als een grafiet pakking eerder werd gebruikt om de reactor te verzegelen, kan het nog steeds in de kerf zijn en moet het met een plastic PIN worden verwijderd voor het volgende experiment. - Breng koper sulfide pasta aan op de stuw bouten in de hogedrukreactor kop. Zorg ervoor dat het vet over de hele draad wordt verdeeld.
- Controleer de schroef-fitting compressie afdichting voor de lengte van de resterende grafiet verpakking.
- Controleer de reactor visueel op mogelijke beschadigingen, corrosie en losse onderdelen.
3. vullen en monteren van de Gold-Titanium reactiecel onder anoxische condities
- Laad het handschoenenkastje.
- Bereid het kweekmedium in de serumflessen volgens punt 1.
- Wikkel de delen van de goldtitanium-reactie cellen die later in aanraking zullen komen met het monster in aluminiumfolie om mogelijke verontreiniging te minimaliseren.
- Open en Ontgrendel de antichambre van het handschoenenkastje, laad al het inkomende materiaal op de verplaatsbare lade en sluit en vergrendel de voorklep.
- Evacueren de Antichambre 3x en overspoelen met hoge zuiverheid stikstof.
- Draag een paar handschoenen en ga zo dicht mogelijk bij de binnenbekleding zitten. Ontgrendel en open de binnenklep om het inkomende materiaal uit de beweegbare lade te verwijderen.
- Sluit de binnenklep en vergrendel deze.
- Vul de gouden cel.
- Pak de schone gouden tas uit en zet hem bijvoorbeeld op met een glazen beker. Open de serum fles met 100 mL bacteriële cultuur en elementair zwavel.
- Schud de serum fles voorzichtig en breng de bacteriecultuur over in de gouden zak.
- Monteer de reactiecel.
- Steek de Titanium kop met de bijgevoegde Titanium bemonsteringsbuis in de Titanium kraag die de bovenste rand van de gouden zak omsluit.
Let op: Zorg ervoor dat het afdichtingsoppervlak van het conische onderste deel van de Titanium kop soepel past door het 90 ° heen en weer te draaien. - Schuif de ring en de compressie bout over de Titanium bemonsteringsbuis op de Titanium kop.
Opmerking: Draai de ring van de compressie bout met 30 ° in de Titanium kraag om de flenzen van de Titanium kraag en de ring van de taats bout uit te lijnen. - Bevestig de zes allen schroeven in dezelfde mate om een gelijkmatige drukverdeling van de Titanium kop op de bovenste rand van de gouden zak in de Titanium kraag te garanderen (d.w.z. het afdichtingsoppervlak van de reactiecel).
Opmerking: Bevestig de inbussleutels in de ring van de compressie bout tot de hand dicht, zodat het koppel voor de tegenovergestelde schroeven eerst wordt verhoogd (crisscrossing) voordat u met de klok mee doorgaat.
- Steek de Titanium kop met de bijgevoegde Titanium bemonsteringsbuis in de Titanium kraag die de bovenste rand van de gouden zak omsluit.
- Installeer de bemonsteringsklep aan de bovenkant van de Titanium buis opnieuw. Bevestig de verbinding hand dicht en zorg ervoor dat u de klep sluit.
- Verwijder alle onderdelen uit het handschoenenkastje.
4. montage van de hogedruk reactor met de reactiecel
- Monteer de reactiecel in de reactor kop.
Opmerking: de installatie van de hogedruk reactor wordt geleverd met een zeer korte blootstelling van het open uiteinde van de bemonsteringsbuis naar de omringende atmosfeer, aangezien de bemonsteringsklep moet worden verwijderd om de buis door de schroef afdichting in de reactor kop te leiden. Voor de installatie moet de reactor hoofd al in een bank VISE worden geplaatst. Een hoek van 45 ° zorgt voor eenvoudigere handling. De fitting van de compressie afdichting (gelegen in de centrale positie van de Gage Block-assemblage van de reactor hoofd), die de bemonsteringsbuis op zijn plaats houdt, moet open zijn.- Verwijder de Titanium bemonsteringsklep, de schroef en de halsband bovenop de bemonsteringsbuis.
- Leid de buis met de reactie cel bevestigd door het centrale gat in de reactor hoofd tot ongeveer 5 cm van de buis passeren. Schuif de grote schroef over de buis en bevestig de kleine kraag.
Opmerking: nu kan de reactie celverzameling niet door de reactor kop glijden en beide handen zijn vrij om de bemonsteringsklep opnieuw te installeren. - Bevestig de Titanium klep opnieuw.
- Draai de fitting van de compressie afdichting vast.
- Verwijder de reactor kop van de Bank VISE om deze op het reactorvat te installeren.
- Voorbereiden om de reactor te verzegelen.
- Zet de grafiet afdichting op de kerf van het reactorvat.
- Plaats de reactor hoofd voorzichtig met de bijgevoegde reactie cel op het reactorvat.
Opmerking: de reactor kop, inclusief het thermokoppel, moet zorgvuldig op het reactorvat worden geplaatst om de gouden zak of het thermokoppel niet te beschadigen.
- Vul het reactorvat met een mengsel van gedeïoniseerd en kraanwater (ongeveer in een verhouding van 1:1).
- De reactor verzegelen.
- Controleer de halsband om er zeker van te zijn dat de onderste uiteinden van de compressie bouten niet uit hun draden steken. Anders wordt het drukvat niet correct geïnstalleerd.
- Til de halsband op en plaats deze rond de uitstekende randen van de interface van het hoofd vaartuig van de reactor. Zachtjes bewegen van de kraag op het zal resulteren in een goede pasvorm. Sluit de knipsloten die de halsband op zijn plaats houden.
- Bevestig de compressie bouten na een doorkruisen-patroon en verhoog het koppel in gematigde stappen tot de door de fabrikant aanbevolen eindwaarde wordt bereikt.
Opmerking: verschillende hogedrukreactor systemen kunnen verschillende koppelwaarden hebben. - Bevestig de compressie bouten tot slot met de klok mee.
- Installeer de hogedruk reactor in het schommel apparaat.
Opmerking: de installatie van de hogedruk reactor in het schommel apparaat wordt beschreven voor een op maat gemaakt model vervaardigd in het Federaal Instituut voor Geowetenschappen en natuurlijke hulpbronnen in Hannover, Duitsland. Daarom is de beschreven installatie een algemene richtlijn voor apparaten met een vergelijkbaar ontwerp.- Monteer de reactor voorzichtig in het schommel apparaat.
Opmerking: het is het beste om de hogedrukreactor te houden door de montagedelen van de Gage Block (bijv. manometer of monsternemings buis schroeven) terwijl u deze in het schommel apparaat verlaagt. - Fixeren de reactor met twee klemmen over een paar lange schroeven.
- Plaats de ringen op elke schroef en draai de klemmen vast met schroef moeren.
- Sluit de bedieningseenheden voor het thermokoppel, de druk transducer en het verwarmingselement aan.
Opmerking: het is belangrijk om ervoor te zorgen dat alle draden voldoende lang zijn voor de schommelende beweging en contact met de verwarmde oppervlakken voorkomen. - Schuif het verwarmingselement over het reactorvat en draai het schroef slot vast.
Opmerking: het water om het systeem onder druk te zetten is afkomstig van een reservoir met een hogedrukpomp. Het wordt overgebracht via roestvrijstalen capillairen in de hogedruk reactor.
Opmerking: het schommelen van de hogedruk reactor garandeert een grondige menging van de reactie celinhoud (d.w.z. het gas, de vloeistof en alle vaste fasen erin). Een langzame schommelende snelheid is belangrijk om schade aan de gouden zak te voorkomen door snel bewegende vaste stoffen of door vervorming als gevolg van zwaartekracht effecten op het flexibele goud bij verhoogde temperaturen. Het schommelsysteem kan draaien door bijna 180 °.
- Monteer de reactor voorzichtig in het schommel apparaat.
5. het experiment starten
- Controleer of de temperatuur-en druk limieten in de Bewakingssoftware zijn ingesteld op de gewenste waarden.
Opmerking: in dit experiment waren ze ingesteld op 70 °C en 25 MPa. - Voer een lekcontrole uit.
- Sluit de druk pijp, een roestvrijstalen capillaire, aan op de reactor kop.
- Verhoog de druk met verschillende intervallen tot de doel druk en controleer voortdurend op lekkage.
- Houd de druk constante vast tot de stroomsnelheid van de pomp bijna nul is.
Opmerking: pas op dat comprimeerbare, opgeloste lucht in water voor een lange tijd zichtbaar is in subtiele stromings metingen.
- Start de verwarming na een geslaagde lekcontrole.
- Start de houtkap van de druk pompen.
- Stel het ingestelde punt voor de verwarming in op de gewenste waarde en start de verwarming met de software.
- Controleer regelmatig alle parameters en de systeemstatus.
- Draai de druk pijp vast na het bereiken van de beoogde temperatuur.
- Start het schommel apparaat.
6. bemonstering van de hogedruk reactor in de bedrijfsmodus
- Om een monster te nemen, bevestig een 5 mL spuit aan de Luer lock connector van de bemonsteringsklep aan de bovenkant van de hogedrukreactor.
- Open de klep voorzichtig en laat het vloeistofmonster door de druk in de hogedrukreactor in de spuit duwen. Sluit de klep nadat het bemonsterde volume 1 mL heeft bereikt. Maak de spuit los.
- Breng de monsters in de spuit onmiddellijk over in een buis van 2 mL in een rook afzuigkap voor verwerking.
7. Analyse van vloeistofmonster
Opmerking: alleen de stappen voor de minder gebruikelijke fotometrische ferrozine assay (d.w.z. sectie 7,1) worden hier gedetailleerd beschreven en worden vermeld in de video, omdat de andere stappen standaard operatieprocedures zijn in microbiologie.
- Gebruik een ferrozine test voor de fotometrisch bepaling van de concentratie van opgelost ferro ijzer (FE2 +(AQ)) en totaal ijzer (FEtot)15.
- Maak een reeks ferro-ijzer standaard oplossingen door bekende hoeveelheden FeSO4· 7 H2O in water op te lossen.
- Meng 50 μL van deze standaard spiegels met 1 mL ferrozine oplossing van 1 M.
Opmerking: de reactie van ferrozine met het opgeloste ferro ijzer vormt een paars complex. De intensiteit van de kleur correleert met de ijzerhoudende ijzer concentratie. - Stel een ijkcurve in tussen de ijzer-en ijzer concentratie en de extinctie van het Iron-ferrozine complex.
- Bereken de concentratie van ferro-ijzer van een monster uit twee parallelle metingen volgens de vastgestelde standaard curve.
- Analyseer de pH-waarde en de oxidatie/reductie potentiaal (ORP) met digitale pH/redox-meters met respectievelijk semimicro pH-elektroden en een Zilverchloride-elektrode.
- Graaf plankton cellen rechtstreeks met behulp van een lichte Microscoop met een Thoma kamer.
- Onderzoek celmorfologie door het scannen van elektronenmicroscopie (SEM).
- Filter plankton cellen geteeld onder verschillende omstandigheden door een 0,1 − 0,2 μm poriegrootte filter.
- Dehydraat monsters met aceton en bewaar ze 's nachts bij 4 °C in 90% aceton.
- Droog de monsters door kritisch punt drogen en vacht ze met grafiet of goud.
- Onderzoek specimens met een veld emissie scanning elektronen microscoop (FE-SEM) bij 10 kV.
Representative Results
Resultaten van de hogedruk reactor experiment met de speciale Gold-Titanium reactie cel tonen aan dat de microbiële gemengde cultuur van acidophiles geoxideerde zwavel en verminderde ijzer ijzer tot ferro ijzer (Figuur 3).
Bij zowel 1 bar of 100 bar druk omstandigheden, de culturen hadden een lag fase wanneer geteeld in de Gold-Titanium reactie cel. Na die periode trad een snelle toename van de ijzerhoudende ijzer concentratie van ongeveer 9 mM tot 31 mM op in de cultuur die in 1 bar werd geteeld. Over de incubatietijd van 22 dagen werden ~ 31 mM en 13 mM ferro ijzer gedetecteerd in de assays bij 1 bar en 100 Bar, respectievelijk. Dit toont duidelijk aan dat de microbiële cellen actief waren op 100 Bar, maar hun ijzer-reducerende activiteit was significant lager bij verhoogde druk. Abiotische controle experimenten uitgevoerd in hungate buizen en serumflessen niet tonen ijzer ijzer reductie bij 1 bar en 100 bar.
De scan-elektronenmicroscopie beelden (Figuur 4) tonen staafvormige cellen die zijn gekweekt in experimenten met lage en hoge druk. Er werd geen significante verandering in de celmorfologie waargenomen bij 1 bar versus 100 bar. Celgroei was echter duidelijk geremd door de verhoogde druk, omdat het celnummer 1,3 x 108 cellen/ml bij 1 bar was in vergelijking met 4,5 x 107 cellen/ml bij 100 Bar7. Deze gegevens zijn vergelijkbaar met de tests gedaan in Hungate tubes7. Zo had de flexibele Gold-Titanium reaction Cell zelf geen effect op celgroei en was het geschikt voor microbiële groei tests.
De resultaten tonen aan dat bioloog-micro-organismen actief zijn, zelfs bij een hoge druk van 100 Bar, wat zeer relevant is voor in-situ biomining, omdat dergelijke omstandigheden zich voordoen in diepe ertsafzettingen op een diepte onder 1.000 m7.
Figuur 1: overzicht van de reactie celdelen. Van onder naar boven: de gouden tas, Titanium kraag, Titanium kop, ring, Titanium compressie bout ring, Titanium bemonsteringsbuis met roestvrij klieren en halsbanden voor de hoge druk kegelvormige en threaded verbindingen aan beide zijden, en de Titanium klep met een adapter voor het aansluiten van een Luer Lock spuit. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: dimensionale tekeningen van de titanium onderdelen vervaardigd uit staven van titanium Grade 2. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: veranderingen van de ferro-ijzer concentraties in de goud-Titanium reactie cel met de ijzerhoudende ijzer-oxiderende cultuur. Cellen werden anaërooge geteeld op 30 ° c. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: morfologie van de ijzerhoudende ijzer-oxiderende cultuur geteeld in 1 bar en 100 bar. Cellen werden anaërooge geteeld op 30 ° c. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Discussion
De gepresenteerde methode voor hogedruk experimenten met microbiële reacties binnen zure oplossingen was een krachtig hulpmiddel om diepe ondergrond geomicrobiologische processen in een laboratoriumomgeving te simuleren.
Er zijn tal van handmatige werkstappen betrokken, waarvan sommige speciale aandacht vereisen. In het algemeen moet er geen overmatige kracht worden gebruikt bij het assembleren van de afzonderlijke delen van de flexibele goud-Titanium cel en de reactor kop (secties 3 en 4). Als de specificaties van de fabrikant (bv. voor maximale druk, temperatuur, koppel) worden genegeerd, kan lekkage en/of materiaal storing tot gevolg hebben.
Het schoonmaken van de goud-en titanium onderdelen (paragraaf 2,2) is een onmisbare werk stap, niet alleen voor dit experiment, maar vooral voor experimenten met (in-) organische reacties. Overblijfselen van eerdere experimenten in de gouden cel kunnen ongewenste reacties veroorzaken en daarom het vertekenende van resultaten. Wanneer de geassembleerde goud-Titanium cel in de reactor hoofd is geïnstalleerd, is het het beste om snel en nauwkeurig te werken, omdat op dit moment kleine hoeveelheden zuurstof de gouden cel kunnen binnenkomen. Het sluiten van de bemonsteringsklep voor het verlaten van de dashboardkastje is een goede eerste maatregel om de uitwisseling tussen de omgevingsatmosfeer met het interieur van de gouden cel te minimaliseren.
Zodra de reactor in het schommel apparaat is geplaatst, is het belangrijk om de schommelende bewegingssnelheid in te stellen op ~ 170 °/min. Als de hogedruk reactor te snel beweegt, kan het breken van de gouden cel optreden als gevolg van zwaartekracht effecten of de scherpe randen van sediment of rotsmonsters bij gebruik.
Deze methode kan worden gebruikt in extra onderzoeksvelden. De flexibele Gold-Titanium reaction Cell heeft het potentieel om te worden gebruikt voor een gevarieerde reeks wetenschappelijke onderzoeken9 het bestuderen van reacties bij verhoogde druk en temperatuur en in zeer corrosieve vloeistoffen of gassen.
Micro-organismen in de diepe ondergrond bij temperaturen boven 70 °C in aanwezigheid van minerale oppervlakken kunnen de productie van moleculair waterstof of organische zuren zoals acetaat, zelfs onder verhoogde druk16stimuleren. Deze producten, en andere verbindingen, kunnen induceren verhoogde microbiële activiteit tijdens in situ bioloog processen, naast de zwavelverbindingen onderzocht in deze studie.
Toepassingen omvatten de bepaling van de oplosbaarheid van gassen en ionen in waterige vloeistoffen, geochemische reacties onder omstandigheden van hydrothermische vent-systemen17, de kwantificering van isotoop fractionering18, GEOCHEMISCHE reacties tijdens co 2 vastlegging19, abiotische processen tijdens de vorming van olie en gas in bron rotsen20, en microbiële reacties bij verhoogde druk in de ondergrond21 zoals in de huidige studie.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We danken Robert Rosenbauer (USGS, Menlo Park) met het delen van zijn expertise over de flexibele goud-Titanium reactie cellen en Georg Scheeder (BGR) voor zijn inbreng tijdens de eerste fase van het opzetten van het gemodificeerde systeem in Hannover. We willen graag veel wetenschappers bedanken (waaronder Katja Heeschen, Andreas Risse, Jens Gröger-Trampe, Theodor Alpermann) met behulp van de Setup in Hannover in tal van projecten die hebben bijgedragen aan kleine verbeteringen langs de weg en Christian Seeger voor de ontwikkeling van de schommel apparaat voor de hogedruk reactoren. We bedanken Laura Castro (Complutense Universiteit van Madrid) voor SEM observaties. En ten slotte willen we onze dankbaarheid uitspreken aan Nils Wölki voor het produceren van deze video van hoge kwaliteit voor het artikel. Dit werk werd gesteund door de Europese Unie Horizon 2020 project BIOMOre (subsidieovereenkomst # 642456).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | Merck | 100013 | |
| CaN2O6 | Fluka | 31218 | |
| Conax compression seal fittings | Conax Technologies | PG2-250-B-G | sealant could be selected according to temperatures in experiment |
| Copper paste | Caramba | 691301 | |
| Copper paste | CRC | 41520 | |
| CoSO4x7H2O | Sigma | 10026-24-1 | |
| CrKO8S2x12H2O | Roth | 3535.3 | |
| CuSO4x5H2O | Riedel de Haen | 31293 | |
| Disposable cuvettes | Sigma | z330388 | |
| Ethanol absolute | Roth | 9065.3 | |
| FE-SEM | JEOL | model no. JSM-6330F | |
| Ferrozine | Aldrich | 180017 | |
| Fe2(SO4)3x7H2O | Alfa Aesar | 33316 | |
| FeSO4x7H2O | Merck | 103965 | |
| Gold cell | Hereaus GmbH | manufactured according to dimensions supplied by customer | |
| High-pressure reactor | PARR Instruments | model no. 4650 Series | reactors from other vendors could be used, too |
| High-pressure syringe pump | Teledyne ISCO | DM-100 | |
| HCl | Roth | 6331.3 | |
| HNO3 | Fluka | 7006 | |
| H3BO3 | Sigma | B6768 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| KH2PO4 | Merck | 104873 | |
| L-(+)-Ascorbic acid/Vitamin C | Applichem | A1052 | |
| Light microscope | Leica DM3000 | ||
| MgSO4x7H2O | Merck | 105886 | |
| (NH4)2SO4 | Sigma | A4418 | |
| NaMoO4x2H2O | Sigma | 331058 | |
| NaO3Sex5H2O | Sigma | 00163 | |
| NaO3V | Sigma | 590088 | |
| Na2SO4 | Merck | 106649 | |
| Na2WO4x2H2O | Sigma | 72069 | |
| NiSO4x6H2O | Sigma | 31483 | |
| Omnifix Luer | BRAUN | 4616057V | |
| pH meter | Mettler Toledo | ||
| Redox potential meter | WTW | ORP portable meter | |
| Safe-Lock Tubes, 2 mL | Eppendorf | 0030120094 | |
| Serum bottle | Sigma | 33110-U | |
| Spectrophotometer | Thermo Scientific | model no. GENESYS 10S | |
| Sterican Hypodermic needle | BRAUN | 4657519 | |
| Stoppers | Sigma | 27234 | |
| Sulfur powder | Roth | 9304 | |
| Thoma Chamber | Hecht-Assistent | ||
| Titanium parts of reaction cell | Titan-Halbzeug GmbH | 121-238 | manufactured by workshop at BGR according to dimensions supplied from Titanium grade 2 rods from Titan-Halbzeug GmbH |
| Titanium valve | Nova Swiss Technologies | ND-5002 | |
| Whatman membrane filters nylon | Sigma | WHA7402004 | |
| ZnSO4x7H2O | Sigma | Z4750 |
References
- Johnson, D. B. Biomining goes underground. Nature Geoscience. 8 (3), 165-166 (2015).
- Bellenberg, S., et al. Manipulation of pyrite colonization and leaching by iron-oxidizing Acidithiobacillus species. Applied Microbiology and Biotechnology. 99 (3), 1435-1449 (2014).
- Christel, S., Fridlund, J., Watkin, E. L., Dopson, M. Acidithiobacillus ferrivorans SS3 presents little RNA transcript response related to cold stress during growth at 8 °C suggesting it is a eurypsychrophile. Extremophiles. 20 (6), 903-913 (2016).
- Dopson, M., Ossandon, F. J., Lovgren, L., Holmes, D. S. Metal resistance or tolerance? Acidophiles confront high metal loads via both abiotic and biotic mechanisms. Frontiers in Microbiology. 5, 157 (2014).
- Schippers, A., et al. Biomining: metal recovery from ores with microorganisms. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 141, 1-47 (2014).
- Shiers, D., Ralph, D., Bryan, C., Watling, H. Substrate utilisation by Acidianus brierleyi, Metallosphaera hakonensis and Sulfolobus metallicus in mixed ferrous ion and tetrathionate growth media. Minerals Engineering. 48, 86-93 (2013).
- Zhang, R., Hedrich, S., Ostertag-Henning, C., Schippers, A. Effect of elevated pressure on ferric iron reduction coupled to sulfur oxidation by biomining microorganisms. Hydrometallurgy. 178, 215-223 (2018).
- Dickson, F., Blount, C. W., Tunell, G. Use of hydrothermal solution equipment to determine the solubility of anhydrite in water from 100 degrees C to 275 degrees C and from 1 bar to 1000 bars pressure. American Journal of Science. 261 (1), 61-78 (1963).
- Seyfried, W., Gordon, P., Dickson, F. A new reaction cell for hydrothermal solution equipment. American Mineralogist. 64 (5-6), 646-649 (1979).
- Cross, M. M., Manning, D. A., Bottrell, S. H., Worden, R. H. Thermochemical sulphate reduction (TSR): experimental determination of reaction kinetics and implications of the observed reaction rates for petroleum reservoirs. Organic Geochemistry. 35 (4), 393-404 (2004).
- Frerichs, J., Rakoczy, J., Ostertag-Henning, C., Krüger, M. Viability and adaptation potential of indigenous microorganisms from natural gas field fluids in high pressure incubations with supercritical CO2. Environmental Science & Technology. 48 (2), 1306-1314 (2014).
- Heeschen, K., Risse, A., Ostertag-Henning, C., Stadler, S. Importance of co-captured gases in the underground storage of CO2: Quantification of mineral alterations in chemical experiments. Energy Procedia. 4, 4480-4486 (2011).
- Wakeman, K., Auvinen, H., Johnson, D. B. Microbiological and geochemical dynamics in simulated-heap leaching of a polymetallic sulfide ore. Biotechnology and Bioengineering. 101 (4), 739-750 (2008).
- Pakostova, E., Grail, B. M., Johnson, D. B. Indirect oxidative bioleaching of a polymetallic black schist sulfide ore. Minerals Engineering. 106, 102-107 (2017).
- Lovley, D. R., Phillips, E. J. Rapid assay for microbially reducible ferric iron in aquatic sediments. Applied and Environmental Microbiology. 53 (7), 1536-1540 (1987).
- Parkes, R. J., et al. Prokaryotes stimulate mineral H2 formation for the deep biosphere and subsequent thermogenic activity. Geology. 39 (3), 219-222 (2011).
- McCollom, T. M. Abiotic methane formation during experimental serpentinization of olivine. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 113 (49), 13965-13970 (2016).
- Pester, N. J., Conrad, M. E., Knauss, K. G., DePaolo, D. J. Kinetics of D/H isotope fractionation between molecular hydrogen and water. Geochimica et Cosmochimica Acta. 242, 191-212 (2018).
- Rosenbauer, R. J., Thomas, B., Bischoff, J. L., Palandri, J. Carbon sequestration via reaction with basaltic rocks: Geochemical modeling and experimental results. Geochimica et Cosmochimica Acta. 89, 116-133 (2012).
- Knauss, K. G., Copenhaver, S. A., Braun, R. L., Burnham, A. K. Hydrous pyrolysis of New Albany and Phosphoria Shales: production kinetics of carboxylic acids and light hydrocarbons and interactions between the inorganic and organic chemical systems. Organic Geochemistry. 27 (7-8), 477-496 (1997).
- Parkes, R. J., et al. Culturable prokaryotic diversity of deep, gas hydrate sediments: first use of a continuous high-pressure, anaerobic, enrichment and isolation system for subseafloor sediments (DeepIsoBUG). Environmental Microbiology. 11 (12), 3140-3153 (2009).
