Summary
Este protocolo descreve experimentos microbianos pressões elevadas para estudar processos de biomineração in situ. A aproximação experimental emprega um reator de alta pressão de balanço equipado com uma pilha da reação do ouro-titânio que contem uma cultura microbiana em um meio ácido, ferro-rico.
Abstract
Estudos laboratoriais que investigam processos microbianos subsuperficiais, como a lixiviação de metais em depósitos de minério profundo (biomineração), compartilham obstáculos comuns e desafiadores, incluindo as condições ambientais especiais que precisam ser replicadas, por exemplo, alta pressão e, em alguns casos, soluções ácidas. O primeiro exige uma instalação experimental apropriada para a pressurização até a barra 100, quando o último exigir um recipiente fluido com resistência química elevada de encontro à corrosão e às reações químicas indesejadas com a parede do recipiente. Para atender a essas condições para uma aplicação no campo da biomineração in situ, uma célula de reação de ouro-titânio flexível especial dentro de um reator de alta pressão de balanço foi usada neste estudo. O sistema descrito permitiu a simulação da biomineração in situ através da redução do ferro microbiano impulsionado por enxofre em um ambiente experimental anóxico, controlado por pressão e altamente quimicamente inerte. A célula de reação de ouro-titânio flexível pode acomodar até 100 mL de solução de amostra, que pode ser amostrada em qualquer ponto de tempo determinado enquanto o sistema mantém a pressão desejada. Experimentos podem ser realizados em escalas temporais variando de horas a meses. A montagem do sistema de reator de alta pressão é bastante demorada. No entanto, quando processos complexos e desafiadores (microbiológicos) que ocorrem na subsuperfície profunda da terra em fluidos quimicamente agressivos têm de ser investigados em laboratório, as vantagens deste sistema superam as desvantagens. Os resultados encontrados que mesmo em alta pressão o consórcio microbiano é ativo, mas a taxas metabólicas significativamente mais baixas.
Introduction
Durante a última década, os esforços para minimizar o impacto da mineração no meio ambiente aumentaram. A mineração a céu aberto para a extração de matérias-primas de minérios (por exemplo, minérios de sulfeto ricos em cobre), impacta a paisagem circundante pelas atividades de escavação e pelos grandes volumes remanescentes de rochas residuais e restos de minério processado após a extração de preciosos metais como o cobre. Extrair o cobre diretamente do minério na subsuperfície reduziria significativamente estes impactos. A tecnologia da biomineração in situ é um candidato promissor para este processo1. Esta publicação descreve o uso de atividade microbiana estimulada para extrair os metais preciosos do minério em uma solução aquosa na subsuperfície. Assim, uma solução rica em cobre pode ser facilmente bombeada de volta para a superfície para concentrar ainda mais o metal, por exemplo.
A atividade de microrganismos acidofílicos de lixiviação de minério tem sido estudada em muitos laboratórios para uma variedade diversa de parâmetros2,3,4,5,6. No entanto, os efeitos de pressão sobre a atividade microbiana resultante da diferença entre as condições do laboratório de superfície ambiente (perto de 1 bar) e a subsuperfície a uma profundidade de 1.000 m com condições hidroestáticas (~ 100 bar), não são bem documentados. Portanto, os efeitos da pressão sobre a redução do ferro microbiano têm sido investigados por meio de diferentes avenidas experimentais7. Aqui, a técnica mais adequada é descrita detalhadamente.
Reatores de alta pressão têm sido amplamente utilizados para estudar reações em pressões e temperaturas que ocorrem na subsuperfície da terra. Tais reatores consistem em um vaso do reator na parte inferior que pode conter uma amostra fluida com uma cultura microbiana. Sentado em cima do vaso do reator, a cabeça do reator oferece uma variedade diversificada de conexões e interfaces para medidas de segurança e sensores de monitoramento (por exemplo, temperatura ou pressão). A maioria de reatores de alta pressão são feitos do aço inoxidável. Este material oferece alta resiliência e boas propriedades de usinagem, mas a resistência à corrosão da superfície de aço inoxidável não é adequada para cada aplicação. Por exemplo, se forem investigadas soluções aquosas altamente ácidas ou altamente redutoras, podem ocorrer reações significativas dos compostos de interesse com a parede do reator. Uma maneira de evitar isso é inserir um forro no vaso do reator, por exemplo, um forro feito de vidro de borosilicato7. It é fácil de limpar e pode ser esterilizado por autoclaving. Além disso, não é atacada por ácido ou reduzindo soluções aquosas. Mesmo que um forro possa ajudar a impedir reações artificiais da solução ou dos micróbios na solução com a parede do reator do aço inoxidável, diversos problemas permanecem. Para um, se um gás corrosivo é formado, como o sulfeto de hidrogênio produzido por bactérias redutores de sulfato, este gás pode reagir com a superfície descoberta da cabeça do reator sentada acima do forro. Outra desvantagem é que não é possível retirar uma amostra do reator, mantendo a pressão.
Para superar essas limitações, as células de reação flexíveis especializadas dentro dos reatores de alta pressão foram desenvolvidas para uma variedade de aplicações. Uma pilha flexível do politetrafluoretileno (PTFE)8 foi projetada para estudos da solubilidade dos sais em salmouras altamente salinos. No entanto, a limitação deste sistema é que alguns gases podem facilmente permear o PTFE. Além disso, este material ainda tem uma estabilidade de temperatura relativamente baixa. Assim, o sistema foi melhorado projetando um saco flexível do ouro com uma cabeça Titanium9 a ser coloc dentro do reator de alta pressão do inoxidável-aço. A superfície do ouro é resistente à corrosão contra soluções e gases ácidos ou redutores. A superfície do titânio é igualmente altamente inerte quando passivated completamente para dar forma a uma camada contínua do dióxido Titanium. Durante a amostragem desta célula de reação através de um tubo de amostragem de titânio conectado, o saco de ouro encolhe em volume. A pressão interna do sistema é mantida bombeando o mesmo volume de água, como é retirado por amostragem, no reator de alta pressão de aço inoxidável que acomoda a célula de reação. A amostra dentro da célula de reação é mantida em movimento balançando ou inclinando o reator de alta pressão em mais de 90 ° durante o experimento.
A célula de reação consiste nas peças representadas na Figura 1: o saco de ouro, colar de titânio, cabeça de titânio, arruela de aço inoxidável, anel de parafuso de compressão de titânio, tubo de amostragem de titânio com glândulas e colares inoxidáveis para a alta pressão coned e conexões rosqueadas em ambos os lados, e a válvula Titanium. O saco do ouro é uma pilha cilíndrica do ouro (au 99,99) com uma espessura de parede de 0,2 milímetros, um diâmetro exterior de 48 milímetros, e um comprimento de 120 milímetros.
Todas as peças Titanium são feito-à-medida pela oficina das hastes Titanium da classe 2. As dimensões do anel de colarinho, cabeça, arruela e parafuso de compressão são visíveis na Figura 2. O tubo de amostragem de titânio é um capilar de titânio com um diâmetro externo de 6,25 mm e uma espessura de parede de 1,8 mm, resultando em um diâmetro interno de 2,65 mm. Ele é fixado na cabeça de titânio e a válvula de titânio por alta-pressão coned e rosca conexões garantindo um selo de titânio-contra-titânio superfícies. A válvula Titanium de alta pressão é equipada com uma haste de abertura lenta para permitir a abertura ou a amostragem muito controlada mesmo na alta pressão. Este sistema foi utilizado em inúmeros estudos10,11,12.
Protocol
1. preparação do meio e inoculação da cultura microbiana
- Preparar um meio de sal basal para procariontes autotróficos de acordo com as técnicas publicadas13. Dissolver e misturar os produtos químicos abaixo em água destilada (mg/L):na 2so4·10h 2o (150) (NH4)2so4 (450), KCl (50), MgSO4· 7h2o (500), KH2po4 (50), e CA (não 3) o 2· 4h2O (7).
- Adicionar 1 mL/L de uma solução de oligoelemento concentrado de 1.000 x contendo (g/L): ZnSO4· 7h2o (10), CuSO4· 5h2o (1), mnso4· H2o (0,76), CoSO4· 7h2o (1), CRK (so4)2· 12h2o (0,4), H3BO3 (0,6), namoo4· 2h2o (0,5), Niso4· 6h2o (1), na 2. º SeO4 (0,51), na2wo4· 2h2O (0,1), e Navo3 (0,1). Ajuste o pH para 1,8 adicionando 5 M de ácido sulfúrico.
- Esterilizar o meio em autoclave a 121 ° c e 1,2 bar por 20 min e esterilizar a solução de ferro férrico por filtração através de um filtro de seringa de tamanho de poros de 0,22 μm.
- Transfira 50 mL do meio de sal basal esterilizado para uma garrafa de soro e adicione a solução de ferro férrico e enxofre elementar a uma concentração final de 50 mM e 10 g/L, respectivamente.
- Inoculate o meio com uma cultura misturada compor de diversos procariotas ferro-oxidizing mesoacidophilic14.
- Tampe a garrafa de soro com rolhas de borracha butílica esterilizadas e vedação com friso de alumínio.
- Vigorosamente bolha do meio de cultura com N2 para tira de oxigênio dissolvido por 25 min. Use duas agulhas, coloque uma mais profunda na cabeça da garrafa, a outra perto da tampa.
- Injete CO2 para obter uma atmosfera de 90% N2 e 10% co2 no headspace do frasco de soro. Incubar a cultura sem mexer a 30 ° c no escuro.
2. preparação da célula de reacção ouro-titânio e do reator de alta pressão
- Limpe a célula de reacção ouro-titânio.
- Desmontar a célula de reação nas partes individuais para evitar o contato de ácido com as peças de aço inoxidável, ou a exposição das peças montadas com diferentes propriedades de expansão térmica para aquecer.
- Limpe as superfícies que estarão em contato com a amostra durante o experimento (ou seja, o saco de ouro, a cabeça de titânio, o tubo de amostragem de titânio e a válvula de titânio).
- Coloque o saco de ouro e a cabeça de titânio em uma taça de vidro.
- Adicione o suficiente HCl 10% para cobrir todas as peças.
- Aqueça o ácido em uma placa de aquecimento a 50 ° c por 3 h ao agitando-o.
- Retire as peças com pinças de PTFE da solução ácida e enxague-as com água desionizada.
- Enxágüe a superfície interna do saco do ouro e a cabeça Titanium completamente com 65% HNO3 e então com água deionizada.
- Enxágüe a superfície interna do tubo de amostragem de titânio e a válvula de titânio com 10% HCl, seguido por água deionizada, 65% HNO3e, em seguida, água deionizada novamente.
- Limpe todas as peças da contaminação orgânica enxaguando as com acetona.
- Seque todas as peças no forno a 105 ° c durante pelo menos 1 h.
- Aqueça as superfícies do saco de ouro, a cabeça de titânio, e o tubo de amostragem de titânio, expondo-os a uma temperatura de 450 ° c para 4 h em um forno de mufla em uma atmosfera de ar.
Nota: este procedimento esteriliza as superfícies e resulta na formação de uma camada de dióxido de titânio passivante em todas as superfícies de titânio. As peças de titânio devem ter uma cor amarela a azul após o tratamento térmico. - Anneal a célula de ouro para aumentar a flexibilidade do ouro, redefinindo pequenos domínios de cristalização aplicando calor com uma tocha de propano. Aqueça a superfície dourada ao redor para reduzir as dobras no ouro que pode ter se formado durante o último encolhimento do volume do saco de ouro em uma experiência. Certifique-se de não aquecer o ouro muito em um só lugar para evitar o seu derretimento.
Nota: um brilho vermelho da superfície do ouro mostra aquecimento suficiente. - Monte o saco do ouro no colar Titanium, e a tubulação de amostragem Titanium na cabeça Titanium usando um torque de 10 nanômetro para as glândulas.
- Inspecione o reator de alta pressão.
- Verifique visualmente o reator para possíveis danos, corrosão e peças soltas.
Nota: deve ser prestada especial atenção ao selo e ao kerf onde se realiza a vedação. Se uma gaxeta da grafita foi usada previamente para selar o reator, os restos dele podem ainda estar no kerf e devem ser removidos com um pino plástico antes da experimentação seguinte. - Aplique a pasta de sulfeto de cobre aos parafusos axiais na cabeça de alta pressão do reator. Assegure-se de que a graxa seja distribuída sobre toda a rosca.
- Verifique o selo de compressão do parafuso-encaixe para o comprimento da embalagem restante da grafite.
- Verifique visualmente o reator para possíveis danos, corrosão e peças soltas.
3. enchimento e montagem da célula de reação ouro-titânio condições anóxicas
- Coloque a caixa de luvas.
- Prepare o meio de cultura nas garrafas de soro de acordo com a seção 1.
- Enrole as partes da célula de reação goldtitanium que mais tarde estará em contato com a amostra em folha de alumínio para minimizar qualquer potencial contaminação.
- Abra e desbloqueie a antecâmara da caixa de luva, carregue todo o material de entrada na bandeja móvel e feche e bloqueie a tampa frontal.
- Evacuar a antecâmara 3x e enchê-lo com nitrogênio de alta pureza.
- Use um par de luvas e chegar o mais próximo possível da tampa interna. Desbloqueie e abra a tampa interna para remover o material de entrada da bandeja móvel.
- Feche e trave a tampa interna.
- Encha a célula de ouro.
- Desembrulhe o saco de ouro limpo e levante-o com uma taça de vidro, por exemplo. Abra a garrafa de soro contendo 100 mL de cultura bacteriana e enxofre elementar.
- Agitar suavemente a garrafa de soro e transferir a cultura bacteriana para o saco de ouro.
- Montar a célula de reacção.
- Insira a cabeça de titânio com o tubo de amostragem de titânio anexado no colar de titânio que encerra a borda superior do saco de ouro.
Nota: Certifique-se de que a superfície de vedação da parte inferior cônica da cabeça de titânio se encaixa suavemente girando-a 90 ° para frente e para trás. - Deslize a arruela e o anel do parafuso de compressão sobre o tubo de amostragem de titânio na cabeça de titânio.
Nota: gire o anel do parafuso de compressão no colar de titânio em 30 ° para alinhar as flanges do colar de titânio e o anel do parafuso de impulso. - Aperte os seis parafusos Allen na mesma medida para garantir uma distribuição de pressão uniforme da cabeça de titânio na borda superior do saco de ouro no colar de titânio (ou seja, a superfície de vedação da célula de reação).
Nota: aperte os parafusos Allen no anel do parafuso de compressão até à mão para que o torque para os parafusos opostos seja aumentado primeiro (cruzam) antes de continuar no sentido horário.
- Insira a cabeça de titânio com o tubo de amostragem de titânio anexado no colar de titânio que encerra a borda superior do saco de ouro.
- Reinstale a válvula de amostragem na parte superior do tubo de titânio. Aperte a conexão à mão e certifique-se de fechar a válvula.
- Retire todas as peças da caixa de luva.
4. montagem do reator de alta pressão com a célula de reação
- Monte a célula de reação na cabeça do reator.
Nota: a instalação do reator de alta pressão vem com uma exposição muito curta da extremidade aberta do tubo de amostragem para a atmosfera circundante, como a válvula de amostragem deve ser removida para guiar o tubo através da vedação do parafuso na cabeça do reator. Para a instalação, a cabeça do reator deve já ser coloc em um torno do banco. Um ângulo de 45 ° permite uma manipulação mais fácil. O encaixe de vedação de compressão (situado na posição central do conjunto do bloco de medição da cabeça do reator), que mantém o tubo de amostragem no lugar, precisa estar aberto.- Retire a válvula de amostragem de titânio, o parafuso e a gola em cima do tubo de amostragem.
- Guie o tubo com a célula de reação presa através do orifício central na cabeça do reator até cerca de 5 cm da passagem do tubo. Deslize o parafuso grande sobre o tubo e prenda o colar pequeno.
Nota: agora o conjunto de células de reação não pode deslizar para trás através da cabeça do reator e ambas as mãos estão livres para reinstalar a válvula de amostragem. - Volte a colocar a válvula de titânio.
- Aperte o encaixe de vedação de compressão.
- Retire a cabeça do reator do torno do banco para instalá-lo na embarcação do reator.
- Preparem-se para selar o reator.
- Coloque a vedação de grafite no kerf do vaso do reator.
- Coloque cuidadosamente a cabeça do reator com a célula de reação anexada na embarcação do reator.
Nota: a cabeça do reator, incluindo o termopar, deve ser cuidadosamente colocada no vaso do reator para não danificar o saco de ouro ou o termopar.
- Encha a embarcação do reator com uma mistura de água deionizada e da torneira (aproximadamente em uma relação 1:1).
- Sele o reator.
- Verifique o colarinho para garantir que as extremidades inferiores dos parafusos de compressão não estão saindo de seus fios. Caso contrário, a embarcação de pressão não será instalada corretamente.
- Levante o colar e coloc o em torno das bordas salientes da relação do headvessel do reator. Suavemente movendo o colarinho sobre ele resultará em um ajuste adequado. Feche as fechaduras de encaixe segurando o colarinho no lugar.
- Aperte os parafusos de compressão seguindo um padrão cruzado e aumente o torque em etapas moderadas até que o valor final recomendado pelo fabricante seja atingido.
Nota: diferentes sistemas de reatores de alta pressão podem ter valores de torque diferentes. - Finalmente, aperte os parafusos de compressão de forma no sentido horário.
- Instale o reator de alta pressão no dispositivo de balanço.
Nota: a instalação do reator de alta pressão no dispositivo de balanço é descrita para um modelo feito-à-medida manufacturado no Instituto Federal para Geosciences e recursos naturais em Hannover, Germany. Portanto, a instalação descrita é uma diretriz geral para dispositivos de design comparável.- Monte o reator cuidadosamente no dispositivo de balanço.
Nota: é melhor segurar o reator de alta pressão pelas peças de montagem do bloco do calibre (por exemplo, manómetro ou parafusos de amostragem do tubo) ao abaixá-la no dispositivo de balanço. - Fixate o reator com as duas braçadeiras sobre um par de parafusos longos.
- Coloque as arruelas em cada parafuso e aperte as braçadeiras com porcas de rosca.
- Conecte as unidades de controle para o termopar, o transdutor de pressão e o elemento de aquecimento.
Nota: é importante assegurar que todos os fios são de comprimento suficiente para o movimento de balanço e evitar o contacto com as superfícies aquecidas. - Deslize o elemento de aquecimento sobre o vaso do reator e aperte o bloqueio do parafuso.
Nota: a água para pressurizar o sistema é retirada de um reservatório com uma bomba de alta pressão. É transferido através dos capilares do aço inoxidável no reator de alta pressão.
Nota: o balanço do reator de alta pressão garante uma mistura completa do conteúdo da célula de reação (ou seja, o gás, fluido e todas as fases sólidas nele). Uma velocidade de balanço lenta é importante impedir dano ao saco do ouro por sólidos moventes rápidos ou pela deformação devido aos efeitos da gravidade no ouro flexível em temperaturas elevadas. O sistema de balanço pode girar perto a 180 °.
- Monte o reator cuidadosamente no dispositivo de balanço.
5. iniciando o experimento
- Verifique se os limites de temperatura e pressão no software de monitorização estão definidos para os valores desejados.
Nota: neste experimento foram definidos para 70 ° c e 25 MPa. - Realize uma verificação de vazamento.
- Ligue o tubo de pressão, um capilar de aço inoxidável, à cabeça do reator.
- Levante a pressão à pressão do alvo em intervalos distintos ao verific continuamente para ver se há o escapamento.
- Segure a pressão constante até que a vazão da bomba seja quase zero.
Nota: Beware que o ar compressível, dissolvido na água é visível por muito tempo em leituras sutis do fluxo.
- Inicie o aquecimento após uma verificação de vazamento bem-sucedida.
- Inicie o registro das bombas de pressurização.
- Ajuste o ponto de ajuste para o aquecimento para o valor desejado e iniciar o aquecimento com o software.
- Verifique regularmente todos os parâmetros e o estado do sistema.
- Desaperte o tubo de pressão depois de atingir a temperatura alvo.
- Inicie o dispositivo de balanço.
6. amostragem do reator de alta pressão no modo operacional
- Para tirar uma amostra, coloque uma seringa de 5 mL no conector Luer Lock da válvula de amostragem na parte superior do reator de alta pressão.
- Abra cuidadosamente a válvula e deixe a amostra de fluido empurrar para dentro da seringa pela pressão no interior do reator de alta pressão. Feche a válvula após o volume amostrado atingir 1 mL. Retire a seringa.
- Transfira as amostras na seringa imediatamente para um tubo de 2 mL numa capa de fumos para processamento.
7. Análise da amostra de fluido
Nota: somente as etapas para o ensaio fotométrico menos comum do ferrozine (isto é, seção 7,1) são descritas aqui em detalhe e mencionadas no vídeo, porque as outras etapas são procedimentos padrão da operação na microbiologia.
- Use um ensaio de ferrozine para determinar fotometricamente a concentração de ferro ferroso dissolvido (FE2 +(AQ)) e ferro total (FEtot)15.
- Prepare uma série de soluções padrão de ferro ferroso dissolvendo quantidades conhecidas de FeSO4· 7 H2O na água.
- Misture 50 μL destes níveis padrão com 1 mL de uma solução de ferrozine de 1 M.
Nota: a reacção do ferrozine com o ferro ferroso dissolvido forma um complexo púrpura. A intensidade da cor correlaciona-se com a concentração de ferro ferroso. - Estabelecer uma curva de calibração entre a concentração de ferro ferroso e a absorvência do complexo ferro-ferrozine.
- Calcule a concentração de ferro ferroso de uma amostra de duas medições paralelas de acordo com a curva padrão estabelecida.
- Analise o valor de pH e o potencial de oxidação/redução (ORP) com medidores de pH/redox digitais com eletrodos de pH e e um eletrodo de cloreto de prata, respectivamente.
- Contagem de células planctônicas diretamente usando um microscópio de luz com uma câmara de Thoma.
- Investigar a morfologia celular por microscopia eletrônica de varredura (MEV).
- Filtre as pilhas planctônicos crescidas circunstâncias diferentes com um filtro do tamanho do pore de 0.1 − 0.2 μm.
- Deshidratar amostras com acetona e armazená-las durante a noite a 4 ° c em 90% de acetona.
- Seque as amostras por ponto crítico de secagem e revestir-los com grafite ou ouro.
- Examine espécimes com um microscópio eletrônico de varredura da emissão do campo (FE-SEM) em 10 quilovolts.
Representative Results
Os resultados do experimento de reator de alta pressão com a célula de reação ouro-titânio especial mostram que a cultura mista microbiana de acidófilos oxidou o enxofre e reduziu o ferro férrico ao ferro ferroso (Figura 3).
Em 1 barra ou em condições da pressão da barra 100, as culturas tiveram uma fase do lag quando crescidas na pilha da reação do ouro-titânio. Após esse período, um rápido aumento na concentração de ferro ferroso de aproximadamente 9 mM a 31 mM ocorreu na cultura cultivada em 1 bar. Ao longo do tempo de incubação de 22 dias, foram detectados ~ 31 mM e 13 mM de ferro ferroso nos ensaios em 1 bar e 100 bar, respectivamente. Isto demonstra claramente que as pilhas microbianas eram ativas na barra 100, mas sua atividade ferro-reduzindo férrico era significativamente mais baixa na pressão elevada. Os experimentos de controle abiótico conduzidos em tubos de Hungate e garrafas de soro não mostraram redução de ferro férrico em 1 bar e 100 bar.
As imagens de microscopia eletrônica de varredura (Figura 4) mostram células em forma de haste cultivadas em experimentos com baixa e alta pressão. Nenhuma mudança significativa na morfologia da pilha foi observada em 1 barra contra a barra 100. No entanto, o crescimento celular foi obviamente inibido pela pressão elevada, pois o número de células foi de 1,3 x 108 células/ml em 1 bar em comparação com 4,5 x 107 células/ml em 100 bar7. Estes dados são comparáveis com os testes feitos em tubos Hungate7. Assim, a célula de reação do ouro-titânio flexível própria não teve nenhum efeito no crescimento da pilha e era apropriada para testes de crescimento microbiano.
Os resultados mostram que os microrganismos biolixiviação são ativos mesmo em uma alta pressão de 100 bar, o que é altamente relevante para a biomineração in situ, pois tais condições ocorrem em depósitos de minério profundo a uma profundidade abaixo de 1.000 m7.
Figura 1: visão geral das partes da célula de reação. De baixo para cima: o saco do ouro, colar Titanium, cabeça Titanium, arruela, anel Titanium do parafuso da compressão, tubo de amostragem Titanium com as glândulas e os colares inoxidáveis para as conexões coned e rosqueadas de alta pressão em ambos os lados, e a válvula Titanium com um adaptador para ligar uma seringa Luer Lock. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: desenhos dimensionais das peças de titânio usinadas a partir de hastes de titânio grau 2. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: alterações das concentrações de ferro ferroso na célula de reação ouro-titânio com a cultura ferroso-oxidante. As células foram cultivadas anaerógicamente a 30 ° c. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: morfologia da cultura ferro-oxidante ferroso cultivada em 1 bar e 100 bar. As células foram cultivadas anaerógicamente a 30 ° c. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
O método apresentado para experimentos de alta pressão de reações microbianas em soluções ácidas foi uma ferramenta poderosa para simular processos geomicrobiológicos subsuperficiais profundos em um ambiente laboratorial.
Existem inúmeras etapas de trabalho manual envolvidas, algumas das quais exigem atenção especial. Como uma nota geral, nenhuma força excessiva deve ser usada ao montar as partes individuais da pilha ouro-titanium flexível e da cabeça do reator (seções 3 e 4). Se as especificações do fabricante (por exemplo, para a pressão máxima, temperatura, torque) são ignoradas, vazamento e/ou falha de material pode resultar.
A limpeza das peças de ouro e titânio (seção 2,2) é uma etapa de trabalho indispensável, não só para este experimento, mas especialmente para experimentos envolvendo (in-) reações orgânicas. Restos de experimentos anteriores na célula de ouro podem causar reações indesejadas e, portanto, a supressão dos resultados. Quando a célula de ouro-titânio montada é instalada na cabeça do reator, é melhor trabalhar de forma rápida e precisa, porque neste momento pequenas quantidades de oxigênio poderia entrar na célula de ouro. Fechar a válvula de amostragem antes de deixar o Glovebox é uma boa primeira medida para minimizar a troca entre a atmosfera ambiente com o interior da célula dourada.
Uma vez que o reator é coloc no dispositivo de balanço, é importante ajustar a velocidade de movimento de balanço a ~ 170 °/min. Se o reator de alta pressão se move muito rápido, a ruptura da célula de ouro pode acontecer devido a efeitos gravitacionais ou as bordas afiadas de sedimentos ou amostras de rocha quando usado.
Este método pode ser usado em campos de pesquisa adicionais. A célula de reação de ouro-titânio flexível tem o potencial para ser usado para um conjunto diversificado de investigações científicas9 estudando reações em pressão e temperatura elevadas e em fluidos ou gases altamente corrosivos.
Microrganismos na subsuperfície profunda em temperaturas acima de 70 ° c na presença de superfícies minerais podem estimular a produção de hidrogênio molecular ou ácidos orgânicos como o acetato mesmo pressão elevada16. Esses produtos, e outros compostos, podem induzir atividade microbiana elevada durante os processos de biolixiviação in situ, além dos compostos de enxofre investigados neste estudo.
As aplicações incluem a determinação da solubilidade de gases e íons em fluidos aquosos, reações geoquímicas em condições de sistemas de ventilação hidrotermal17, a quantificação do fraccionamento de isótopos18, reações geoquímicas durante co 2 sequestro19, processos abióticos durante a formação de óleo e gás em rochas-fonte20, e reações microbianas em pressões elevadas na subsuperfície21 como no presente estudo.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a Robert Rosenbauer (USGS, Menlo Park) em compartilhar seus conhecimentos sobre as células de reação de ouro-titânio flexíveis, e Georg Scheeder (BGR) para sua entrada durante a fase inicial de criação do sistema modificado em Hannover. Gostaríamos de agradecer a muitos cientistas (incluindo Katja Heeschen, Andreas risse, Jens Gröger-Trampe, Theodor Alpermann) usando a configuração em Hannover em inúmeros projetos que contribuíram em pequenas melhorias ao longo do caminho e Christian Seeger para o desenvolvimento da dispositivo de balanço para os reatores de alta pressão. Agradecemos a Laura Castro (Universidade Complutense de Madri) por observações de SEM. E, finalmente, gostaríamos de expressar nossa gratidão a Nils Wölki por produzir este vídeo de alta qualidade para o artigo. Este trabalho foi apoiado pelo projeto Horizonte 2020 da União Europeia BIOMOre (acordo de subvenção # 642456).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | Merck | 100013 | |
| CaN2O6 | Fluka | 31218 | |
| Conax compression seal fittings | Conax Technologies | PG2-250-B-G | sealant could be selected according to temperatures in experiment |
| Copper paste | Caramba | 691301 | |
| Copper paste | CRC | 41520 | |
| CoSO4x7H2O | Sigma | 10026-24-1 | |
| CrKO8S2x12H2O | Roth | 3535.3 | |
| CuSO4x5H2O | Riedel de Haen | 31293 | |
| Disposable cuvettes | Sigma | z330388 | |
| Ethanol absolute | Roth | 9065.3 | |
| FE-SEM | JEOL | model no. JSM-6330F | |
| Ferrozine | Aldrich | 180017 | |
| Fe2(SO4)3x7H2O | Alfa Aesar | 33316 | |
| FeSO4x7H2O | Merck | 103965 | |
| Gold cell | Hereaus GmbH | manufactured according to dimensions supplied by customer | |
| High-pressure reactor | PARR Instruments | model no. 4650 Series | reactors from other vendors could be used, too |
| High-pressure syringe pump | Teledyne ISCO | DM-100 | |
| HCl | Roth | 6331.3 | |
| HNO3 | Fluka | 7006 | |
| H3BO3 | Sigma | B6768 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| KH2PO4 | Merck | 104873 | |
| L-(+)-Ascorbic acid/Vitamin C | Applichem | A1052 | |
| Light microscope | Leica DM3000 | ||
| MgSO4x7H2O | Merck | 105886 | |
| (NH4)2SO4 | Sigma | A4418 | |
| NaMoO4x2H2O | Sigma | 331058 | |
| NaO3Sex5H2O | Sigma | 00163 | |
| NaO3V | Sigma | 590088 | |
| Na2SO4 | Merck | 106649 | |
| Na2WO4x2H2O | Sigma | 72069 | |
| NiSO4x6H2O | Sigma | 31483 | |
| Omnifix Luer | BRAUN | 4616057V | |
| pH meter | Mettler Toledo | ||
| Redox potential meter | WTW | ORP portable meter | |
| Safe-Lock Tubes, 2 mL | Eppendorf | 0030120094 | |
| Serum bottle | Sigma | 33110-U | |
| Spectrophotometer | Thermo Scientific | model no. GENESYS 10S | |
| Sterican Hypodermic needle | BRAUN | 4657519 | |
| Stoppers | Sigma | 27234 | |
| Sulfur powder | Roth | 9304 | |
| Thoma Chamber | Hecht-Assistent | ||
| Titanium parts of reaction cell | Titan-Halbzeug GmbH | 121-238 | manufactured by workshop at BGR according to dimensions supplied from Titanium grade 2 rods from Titan-Halbzeug GmbH |
| Titanium valve | Nova Swiss Technologies | ND-5002 | |
| Whatman membrane filters nylon | Sigma | WHA7402004 | |
| ZnSO4x7H2O | Sigma | Z4750 |
References
- Johnson, D. B. Biomining goes underground. Nature Geoscience. 8 (3), 165-166 (2015).
- Bellenberg, S., et al. Manipulation of pyrite colonization and leaching by iron-oxidizing Acidithiobacillus species. Applied Microbiology and Biotechnology. 99 (3), 1435-1449 (2014).
- Christel, S., Fridlund, J., Watkin, E. L., Dopson, M. Acidithiobacillus ferrivorans SS3 presents little RNA transcript response related to cold stress during growth at 8 °C suggesting it is a eurypsychrophile. Extremophiles. 20 (6), 903-913 (2016).
- Dopson, M., Ossandon, F. J., Lovgren, L., Holmes, D. S. Metal resistance or tolerance? Acidophiles confront high metal loads via both abiotic and biotic mechanisms. Frontiers in Microbiology. 5, 157 (2014).
- Schippers, A., et al. Biomining: metal recovery from ores with microorganisms. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 141, 1-47 (2014).
- Shiers, D., Ralph, D., Bryan, C., Watling, H. Substrate utilisation by Acidianus brierleyi, Metallosphaera hakonensis and Sulfolobus metallicus in mixed ferrous ion and tetrathionate growth media. Minerals Engineering. 48, 86-93 (2013).
- Zhang, R., Hedrich, S., Ostertag-Henning, C., Schippers, A. Effect of elevated pressure on ferric iron reduction coupled to sulfur oxidation by biomining microorganisms. Hydrometallurgy. 178, 215-223 (2018).
- Dickson, F., Blount, C. W., Tunell, G. Use of hydrothermal solution equipment to determine the solubility of anhydrite in water from 100 degrees C to 275 degrees C and from 1 bar to 1000 bars pressure. American Journal of Science. 261 (1), 61-78 (1963).
- Seyfried, W., Gordon, P., Dickson, F. A new reaction cell for hydrothermal solution equipment. American Mineralogist. 64 (5-6), 646-649 (1979).
- Cross, M. M., Manning, D. A., Bottrell, S. H., Worden, R. H. Thermochemical sulphate reduction (TSR): experimental determination of reaction kinetics and implications of the observed reaction rates for petroleum reservoirs. Organic Geochemistry. 35 (4), 393-404 (2004).
- Frerichs, J., Rakoczy, J., Ostertag-Henning, C., Krüger, M. Viability and adaptation potential of indigenous microorganisms from natural gas field fluids in high pressure incubations with supercritical CO2. Environmental Science & Technology. 48 (2), 1306-1314 (2014).
- Heeschen, K., Risse, A., Ostertag-Henning, C., Stadler, S. Importance of co-captured gases in the underground storage of CO2: Quantification of mineral alterations in chemical experiments. Energy Procedia. 4, 4480-4486 (2011).
- Wakeman, K., Auvinen, H., Johnson, D. B. Microbiological and geochemical dynamics in simulated-heap leaching of a polymetallic sulfide ore. Biotechnology and Bioengineering. 101 (4), 739-750 (2008).
- Pakostova, E., Grail, B. M., Johnson, D. B. Indirect oxidative bioleaching of a polymetallic black schist sulfide ore. Minerals Engineering. 106, 102-107 (2017).
- Lovley, D. R., Phillips, E. J. Rapid assay for microbially reducible ferric iron in aquatic sediments. Applied and Environmental Microbiology. 53 (7), 1536-1540 (1987).
- Parkes, R. J., et al. Prokaryotes stimulate mineral H2 formation for the deep biosphere and subsequent thermogenic activity. Geology. 39 (3), 219-222 (2011).
- McCollom, T. M. Abiotic methane formation during experimental serpentinization of olivine. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 113 (49), 13965-13970 (2016).
- Pester, N. J., Conrad, M. E., Knauss, K. G., DePaolo, D. J. Kinetics of D/H isotope fractionation between molecular hydrogen and water. Geochimica et Cosmochimica Acta. 242, 191-212 (2018).
- Rosenbauer, R. J., Thomas, B., Bischoff, J. L., Palandri, J. Carbon sequestration via reaction with basaltic rocks: Geochemical modeling and experimental results. Geochimica et Cosmochimica Acta. 89, 116-133 (2012).
- Knauss, K. G., Copenhaver, S. A., Braun, R. L., Burnham, A. K. Hydrous pyrolysis of New Albany and Phosphoria Shales: production kinetics of carboxylic acids and light hydrocarbons and interactions between the inorganic and organic chemical systems. Organic Geochemistry. 27 (7-8), 477-496 (1997).
- Parkes, R. J., et al. Culturable prokaryotic diversity of deep, gas hydrate sediments: first use of a continuous high-pressure, anaerobic, enrichment and isolation system for subseafloor sediments (DeepIsoBUG). Environmental Microbiology. 11 (12), 3140-3153 (2009).
