Summary
Este protocolo describe experimentos microbianos bajo presiones elevadas para estudiar procesos de biominado in situ. El enfoque experimental emplea un reactor de alta presión mecedora equipado con una célula de reacción de oro y titanio que contiene un cultivo microbiano en un medio ácido y rico en hierro.
Abstract
Estudios de laboratorio que investigan procesos microbianos subsuperficiales, como la lixiviación de metales en depósitos de mineral profundo (biomining), comparten obstáculos comunes y desafiantes, incluidas las condiciones ambientales especiales que deben replicarse, por ejemplo, alta presión y en algunos casos soluciones ácidas. El primero requiere una configuración experimental adecuada para la presurización de hasta 100 bar, mientras que el segundo exige un contenedor de fluidos con alta resistencia química contra la corrosión y reacciones químicas no deseadas con la pared del contenedor. Para cumplir con estas condiciones para una aplicación en el campo de la biominería in situ, se utilizó una célula de reacción flexible especial de oro y titanio dentro de un reactor de alta presión mecedor utilizado en este estudio. El sistema descrito permitió la simulación de biomining in situ a través de la reducción de hierro microbiano impulsado por azufre en un entorno experimental anóxico, controlado por presión y altamente químicamente inerte. La célula de reacción flexible de oro y titanio puede acomodar hasta 100 ml de solución de muestra, que se puede muestrear en cualquier momento dado, mientras que el sistema mantiene la presión deseada. Los experimentos se pueden realizar en escalas de tiempo que van desde horas hasta meses. El montaje del sistema de reactores de alta presión consume bastante tiempo. Sin embargo, cuando los procesos complejos y desafiantes (microbiológicos) que ocurren en el subsuelo profundo de la tierra en fluidos químicamente agresivos tienen que ser investigados en el laboratorio, las ventajas de este sistema superan las desventajas. Los resultados encontraron que incluso a alta presión el consorcio microbiano está activo, pero a tasas metabólicas significativamente más bajas.
Introduction
Durante la última década, los esfuerzos para minimizar el impacto de la minería en el medio ambiente han aumentado. La minería a cielo abierto para la extracción de materias primas de minerales (por ejemplo, minerales de sulfuro ricos en cobre), afecta al paisaje circundante por las actividades de excavación y por los grandes volúmenes restantes de rocas de desecho y restos de mineral procesado después de la extracción de metales como el cobre. Extraer cobre directamente del mineral en el subsuelo reduciría significativamente estos impactos. La tecnología de biomining in situ es un candidato prometedor para este proceso1. Esta publicación describe el uso de la actividad microbiana estimulada para extraer los metales preciosos del mineral en una solución acuosa en el subsuelo. Por lo tanto, una solución rica en cobre se puede bombear fácilmente de nuevo a la superficie para concentrar aún más el metal, por ejemplo.
La actividad de los microorganismos acidofílicos de ore-lixiviación se ha estudiado en muchos laboratorios para una amplia gama de parámetros2,3,4,5,6. Sin embargo, los efectos de presión sobre la actividad microbiana resultantes de la diferencia entre las condiciones de laboratorio de superficie ambiente (cerca de 1 bar) y el subsuelo a una profundidad de 1.000 m con condiciones hidrostáticas (100 bar), no están bien documentados. Por lo tanto, los efectos de la presión sobre la reducción de hierro microbiano se han investigado a través de diferentes vías experimentales7. Aquí, la técnica más adecuada se describe en detalle.
Los reactores de alta presión se han utilizado ampliamente para estudiar las reacciones a presiones y temperaturas que ocurren en el subsuelo de la tierra. Estos reactores consisten en un recipiente de reactor en la parte inferior que puede contener una muestra de fluido con un cultivo microbiano. Sentado en la parte superior del recipiente del reactor, el cabezal del reactor ofrece una amplia gama de conexiones e interfaces para medidas de seguridad y sensores de monitoreo (por ejemplo, temperatura o presión). La mayoría de los reactores de alta presión están hechos de acero inoxidable. Este material ofrece alta resiliencia y buenas propiedades de mecanizado, pero la resistencia a la corrosión de la superficie de acero inoxidable no es adecuada para todas las aplicaciones. Por ejemplo, si se investigan soluciones acuosas altamente ácidas o altamente reductoras, pueden producirse reacciones significativas de los compuestos de interés con la pared del reactor. Una manera de evitar esto es insertar un revestimiento en el recipiente del reactor, por ejemplo un revestimiento hecho de vidrio borosilicato7. Es fácil de limpiar y se puede esterilizar mediante autoclave. Además, no es atacado por soluciones acuosas ácidas o reduciendo. A pesar de que un revestimiento puede ayudar a prevenir las reacciones artificiales de la solución o microbios en la solución con la pared del reactor de acero inoxidable, persisten varios problemas. Por un ejemplo, si se forma un gas corrosivo, como el sulfuro de hidrógeno producido por bacterias reductoras de sulfato, este gas podría reaccionar con la superficie descubierta de la cabeza del reactor sentada sobre el revestimiento. Otra desventaja es que no es posible retirar una muestra del reactor manteniendo la presión.
Para superar estas limitaciones, se han desarrollado células de reacción flexibles especializadas dentro de los reactores de alta presión para una variedad de aplicaciones. Una célula8 flexible de politetrafluoroetileno (PTFE) fue diseñada para estudios de solubilidad de sales en salmueras altamente salinas. Sin embargo, la limitación de este sistema es que algunos gases pueden impregnar fácilmente el PTFE. Además, este material todavía tiene una estabilidad de temperatura relativamente baja. Por lo tanto, el sistema se mejoró mediante el diseño de una bolsa de oro flexible con un cabezal de titanio9 para colocar dentro del reactor de alta presión de acero inoxidable. La superficie dorada es resistente a la corrosión contra soluciones y gases ácidos o reductores. La superficie de titanio también es altamente inerte cuando pasa a fondo para formar una capa continua de dióxido de titanio. Durante el muestreo de esta célula de reacción a través de un tubo de muestreo de titanio conectado, la bolsa de oro se encoge en volumen. La presión interna del sistema se mantiene bombeando el mismo volumen de agua, como se retira por muestreo, en el reactor de alta presión de acero inoxidable que acomoda la célula de reacción. La muestra dentro de la célula de reacción se mantiene en movimiento balanceándose o inclinando el reactor de alta presión en más de 90o durante el experimento.
La célula de reacción consta de las partes representadas en la Figura 1:la bolsa de oro, collar de titanio, cabeza de titanio, arandela de acero inoxidable, anillo de perno de compresión de titanio, tubo de muestreo de titanio con glándulas inoxidables y collares para la alta presión coned y conexiones roscadas en ambos lados, y la válvula de titanio. La bolsa de oro es una celda de oro cilíndrico (Au 99.99) con un espesor de pared de 0,2 mm, un diámetro exterior de 48 mm y una longitud de 120 mm.
Todas las piezas de titanio son hechas a medida por el taller a partir de varillas de titanio grado 2. Las dimensiones del collar, la cabeza, la arandela y el anillo del perno de compresión son visibles en la Figura 2. El tubo de muestreo de titanio es un capilar de titanio con un diámetro exterior de 6,25 mm y un espesor de pared de 1,8 mm, lo que resulta en un diámetro interior de 2,65 mm. Se fija en la cabeza de titanio y la válvula de titanio mediante conexiones de alta presión conadas y roscadas que garantizan un sello de superficies de titanio contra titanio. La válvula de titanio de alta presión está equipada con un vástago de apertura lenta para permitir una apertura o muestreo muy controlado incluso a alta presión. Este sistema fue utilizado en numerosos estudios10,11,12.
Protocol
1. Preparación del medio y la inoculación del cultivo microbiano
- Preparar un medio salina basal para prokaryotes autóficos según las técnicas publicadas13. Disolver y mezclar los siguientes productos químicos en agua destilada (mg/L): Na2SO410H2O (150) (NH4)2SO4 (450), KCl (50), MgSO4x 7H2O (500), KH2PO4 (50) y Ca(NO NO 3) 2x 4H2O (7).
- Añadir 1 ml/L de una solución de oligoelemento concentrado de 1.000x que contenga (g/L): ZnSO4x 7H2O (10), CuSO4x 5H2O (1), MnSO4 H2O (0,76), CoSO4x 7H2O (1), CrK(SO4)2x 12H2O (0,4), H3BO3 (0,6), NaMoO4x 2H2O (0,5), NiSO4x 6H2O (1), Na 2 SeO4 (0,51), Na2WO4x 2H2O (0,1) y NaVO3 (0,1). Ajuste el pH a 1,8 añadiendo ácido sulfúrico de 5 M.
- Esterilice el medio en un autoclave a 121 oC y 1,2 bar durante 20 minutos y esterilice la solución de hierro férrico mediante filtración a través de un filtro de jeringa de tamaño poro de 0,22 m.
- Transfiera 50 ml del medio de sal basal esterilizado a una botella de suero y añada solución de hierro férrico y azufre elemental a una concentración final de 50 mM y 10 g/L, respectivamente.
- Inocular el medio con un cultivo mixto compuesto por varios procariotas oxidantes de hierro mesoacidofílico14.
- Tapar el frasco de suero con tapones de goma de butilo esterilizados y sellar con engarces de aluminio.
- Burbuja vigorosamente el medio de cultivo con N2 para eliminar el oxígeno disuelto durante 25 min. Use dos agujas, coloque una más profunda en la cabeza del frasco y la otra cerca de la tapa.
- Inyectar CO2 para obtener una atmósfera de 90% N2 y 10% co2 en el espacio de la cabeza del frasco sérico. Incubar el cultivo sin agitar a 30oC en la oscuridad.
2. Preparación de la célula de reacción de oro y titanio y el reactor de alta presión
- Limpie la celda de reacción de oro y titanio.
- Desmontar la celda de reacción en las partes individuales para evitar el contacto del ácido con las piezas de acero inoxidable, o la exposición de las piezas ensambladas con diferentes propiedades de expansión térmica al calor.
- Limpie las superficies que estarán en contacto con la muestra durante el experimento (es decir, la bolsa de oro, la cabeza de titanio, el tubo de muestreo de titanio y la válvula de titanio).
- Coloque la bolsa de oro y la cabeza de titanio en un vaso de precipitados de vidrio.
- Agregue suficiente 10% HCl para cubrir todas las piezas.
- Calentar el ácido en una placa de calentamiento a 50 oC durante 3 h mientras se revuelve.
- Retire las piezas con pinzas de PTFE de la solución ácida y enjuáguelas con agua desionizada.
- Enjuague bien la superficie interior de la bolsa de oro y la cabeza de titanio con un 65% de HNO3 y luego con agua desionizada.
- Enjuague la superficie interna del tubo de muestreo de titanio y la válvula de titanio con 10% de HCl, seguido de agua desionizada, 65% HNO3y, a continuación, agua desionizada de nuevo.
- Limpie todas las piezas de la contaminación orgánica engsuándolas con acetona.
- Secar todas las piezas en el horno a 105 oC durante al menos 1 h.
- Calienta las superficies de la bolsa de oro, la cabeza de titanio y el tubo de muestreo de titanio exponiéndolas a una temperatura de 450oC durante 4 h en un horno de mufla en una atmósfera de aire.
NOTA: Este procedimiento esteriliza las superficies y da como resultado la formación de una capa de dióxido de titanio pasivante en todas las superficies de titanio. Las partes de titanio deben tener un color amarillo a azul después del tratamiento térmico. - Recocido la celda de oro para aumentar la flexibilidad del oro mediante el restablecimiento de pequeños dominios de cristalización mediante la aplicación de calor con una antorcha de propano. Calienta la superficie de oro alrededor para reducir las torceduras en el oro que podrían haberse formado durante la última contracción del volumen de la bolsa de oro en un experimento. Asegúrese de no calentar demasiado el oro en un solo lugar para evitar su derretimiento.
NOTA: Un resplandor rojo de la superficie dorada muestra suficiente calentamiento. - Ensamble la bolsa de oro en el collar de titanio y el tubo de muestreo de titanio en la cabeza de titanio utilizando un par de 10 Nm para las glándulas.
- Inspeccione el reactor de alta presión.
- Compruebe visualmente el reactor en busca de posibles daños, corrosión y piezas sueltas.
NOTA: Se debe prestar especial atención al sello y al kerf donde se lleva a cabo el sellado. Si una junta de grafito se utilizó anteriormente para sellar el reactor, los restos de ella todavía pueden estar en el kerf y deben ser retirados con un pasador de plástico antes del siguiente experimento. - Aplique pasta de sulfuro de cobre a los pernos de empuje en el cabezal del reactor de alta presión. Asegúrese de que la grasa se distribuye por toda la rosca.
- Compruebe el sello de compresión de ajuste de tornillo para la longitud del embalaje de grafito restante.
- Compruebe visualmente el reactor en busca de posibles daños, corrosión y piezas sueltas.
3. Llenar y ensamblar la célula de reacción de oro y titanio en condiciones anóxicos
- Cargue la guantera.
- Preparar el medio de cultivo en las botellas de suero de acuerdo con la sección 1.
- Envuelva las partes de la celda de reacción de goldtitanium que más tarde estarán en contacto con la muestra en papel de aluminio para minimizar cualquier posible contaminación.
- Abra y desbloquee la antesala de la guantera, cargue todo el material entrante en la bandeja movible y cierre y bloquee la cubierta frontal.
- Evacuar la antecámara 3x e inundarla con nitrógeno de alta pureza.
- Use un par de guantes y acerque lo más posible a la cubierta interior. Desbloquee y abra la cubierta interior para retirar el material de entrada de la bandeja móvil.
- Cierre y cierre la cubierta interior.
- Llena la celda de oro.
- Desenvuelva la bolsa de oro limpia y párela con un vaso de vidrio, por ejemplo. Abra el frasco sérico que contiene 100 ml de cultivo bacteriano y azufre elemental.
- Agitar suavemente el frasco de suero y transferir el cultivo bacteriano en la bolsa de oro.
- Montar la célula de reacción.
- Inserte la cabeza de titanio con el tubo de muestreo de titanio conectado en el collar de titanio que encierra el borde superior de la bolsa de oro.
NOTA: Asegúrese de que la superficie de sellado de la parte inferior cónica de la cabeza de titanio encaje suavemente girándola 90o hacia adelante y hacia atrás. - Deslice la arandela y el anillo del perno de compresión sobre el tubo de muestreo de titanio sobre la cabeza de titanio.
NOTA: Gire el anillo del perno de compresión en el collar de titanio 30o para alinear las bridas del collar de titanio y el anillo del perno de empuje. - Fije los seis tornillos Allen en la misma medida para garantizar una distribución uniforme de la presión de la cabeza de titanio en el borde superior de la bolsa de oro en el collar de titanio (es decir, la superficie de sellado de la célula de reacción).
NOTA: Fije los tornillos Allen en el anillo del perno de compresión hasta que a mano acojeado para que el par de torsión para los tornillos opuestos se incremente primero (cruce) antes de continuar en el sentido de las agujas del reloj.
- Inserte la cabeza de titanio con el tubo de muestreo de titanio conectado en el collar de titanio que encierra el borde superior de la bolsa de oro.
- Vuelva a instalar la válvula de muestreo en la parte superior del tubo de titanio. Fije la conexión a mano y asegúrese de cerrar la válvula.
- Retire todas las piezas de la guantera.
4. Montaje del reactor de alta presión con la célula de reacción
- Montar la celda de reacción en el cabezal del reactor.
NOTA: La instalación del reactor de alta presión viene con una exposición muy corta del extremo abierto del tubo de muestreo a la atmósfera circundante, ya que la válvula de muestreo debe retirarse para guiar el tubo a través del sello de tornillo en el cabezal del reactor. Para la instalación, el cabezal del reactor ya debe colocarse en una visera de banco. Un ángulo de 45o permite un manejo más fácil. El accesorio de sello de compresión (situado en la posición central del conjunto de bloque de gage del cabezal del reactor), que mantiene el tubo de muestreo en su lugar, debe estar abierto.- Retire la válvula de muestreo de titanio, el tornillo y el collar en la parte superior del tubo de muestreo.
- Guiar el tubo con la célula de reacción unida a través del orificio central en el cabezal del reactor hasta que pasen unos 5 cm del tubo. Deslice el tornillo grande sobre el tubo y fije el cuello pequeño.
NOTA: Ahora el conjunto de la célula de reacción no puede deslizarse hacia atrás a través del cabezal del reactor y ambas manos están libres de reinstalar la válvula de muestreo. - Vuelva a colocar la válvula de titanio.
- Apriete el accesorio del sello de compresión.
- Retire el cabezal del reactor de la visera del banco para instalarlo en el recipiente del reactor.
- Prepárense para sellar el reactor.
- Coloque el sellado de grafito en el kerf del recipiente del reactor.
- Coloque cuidadosamente el cabezal del reactor con la celda de reacción conectada en el recipiente del reactor.
NOTA: El cabezal del reactor, incluido el termopar, debe colocarse cuidadosamente en el recipiente del reactor para no dañar la bolsa de oro ni el termopar.
- Llene el recipiente del reactor con una mezcla de agua desionizada y del grifo (aproximadamente en una proporción de 1:1).
- Selle el reactor.
- Compruebe el collar para asegurarse de que los extremos inferiores de los pernos de compresión no sobresalen de sus roscas. De lo contrario, el recipiente a presión no se instalará correctamente.
- Levante el collar y colóquelo alrededor de los bordes salientes de la interfaz del cabezal del reactor. Mover suavemente el collar en él resultará en un ajuste adecuado. Cierre los cierres de presión que sujetan el collar en su lugar.
- Fije los pernos de compresión siguiendo un patrón entrecruzado y aumente el par en pasos moderados hasta alcanzar el valor final recomendado por el fabricante.
NOTA: Los diferentes sistemas de reactores de alta presión pueden tener diferentes valores de par. - Por último, fije los pernos de compresión en el sentido de las agujas del reloj.
- Instale el reactor de alta presión en el dispositivo de balanceo.
NOTA: La instalación del reactor de alta presión en el dispositivo de balanceo se describe para un modelo hecho a medida fabricado en el Instituto Federal de Geociencias y Recursos Naturales en Hannover, Alemania. Por lo tanto, la instalación descrita es una guía general para dispositivos de diseño comparable.- Monte el reactor cuidadosamente en el dispositivo de balanceo.
NOTA: Lo mejor es sujetar el reactor de alta presión por las piezas de montaje del bloque de medición (por ejemplo, manómetro o tornillos de tubo de muestreo) mientras se reduce en el dispositivo de balanceo. - Fije el reactor con dos abrazaderas sobre un par de tornillos largos.
- Coloque las arandelas en cada tornillo y apriete las abrazaderas con tuercas de tornillo.
- Conecte las unidades de control para el termopar, el transductor de presión y el elemento calefactor.
NOTA: Es importante asegurarse de que todos los cables tienen una longitud suficiente para el movimiento de balanceo y evitar el contacto con las superficies calentadas. - Deslice el elemento calefactor sobre el recipiente del reactor y apriete el bloqueo del tornillo.
NOTA: El agua para presurizar el sistema se extrae de un depósito con una bomba de alta presión. Se transfiere a través de capilares de acero inoxidable al reactor de alta presión.
NOTA: El balanceo del reactor de alta presión garantiza una mezcla completa del contenido de la célula de reacción (es decir, el gas, el fluido y todas las fases sólidas en él). Una velocidad de balanceo lenta es importante para evitar daños a la bolsa de oro por sólidos en movimiento rápido o por deformación debido a los efectos de gravedad sobre el oro flexible a temperaturas elevadas. El sistema de balanceo puede girar cerca de 180o.
- Monte el reactor cuidadosamente en el dispositivo de balanceo.
5. Inicio del experimento
- Compruebe si los límites de temperatura y presión del software de supervisión se establecen en los valores deseados.
NOTA: En este experimento se establecieron en 70 oC y 25 MPa. - Realice una comprobación de fugas.
- Conecte el tubo de presión, un capilar de acero inoxidable, al cabezal del reactor.
- Elevar la presión a la presión objetivo a intervalos distintos mientras se comprueba continuamente si hay fugas.
- Mantenga la presión constante hasta que el caudal de la bomba sea casi cero.
NOTA: Tenga en cuenta que el aire disuelto y compresible en el agua es visible durante mucho tiempo en lecturas de flujo sutiles.
- Inicie la calefacción después de una comprobación de fugas exitosa.
- Inicie el registro de las bombas de presurización.
- Ajuste el punto de ajuste de la calefacción al valor deseado e inicie la calefacción con el software.
- Compruebe regularmente todos los parámetros y el estado del sistema.
- Desapriete el tubo de presión después de alcanzar la temperatura objetivo.
- Inicie el dispositivo de balanceo.
6. Muestreo del reactor de alta presión en modo operativo
- Para tomar una muestra, conecte una jeringa de 5 ml al conector Luer Lock de la válvula de muestreo en la parte superior del reactor de alta presión.
- Abra cuidadosamente la válvula y deje que la muestra de fluido empuje en la jeringa por la presión dentro del reactor de alta presión. Cierre la válvula después de que el volumen muestreado alcance 1 ml. Extraiga la jeringa.
- Transfiera las muestras de la jeringa inmediatamente a un tubo de 2 ml en una campana extractora para su procesamiento.
7 . Análisis de la muestra de fluidos
NOTA: Sólo los pasos para el ensayo de ferrozina fotométrica menos común (es decir, la sección 7.1) se describen aquí en detalle y se mencionan en el video, porque los otros pasos son procedimientos de operación estándar en microbiología.
- Utilice un ensayo de ferrozina para determinar fotométricamente la concentración de hierro ferroso disuelto (Fe2+(aq))y hierro total (Fetot)15.
- Preparar una serie de soluciones estándar de hierro ferroso mediante la disolución de cantidades conocidas de FeSO4x 7 H2O en agua.
- Mezclar 50 ml de estos niveles estándar con 1 ml de una solución de ferrozine de 1 M.
NOTA: La reacción de ferrozina con el hierro ferroso disuelto forma un complejo púrpura. La intensidad del color se correlaciona con la concentración de hierro ferroso. - Establezca una curva de calibración entre la concentración de hierro ferroso y la absorbancia del complejo hierro-ferrozina.
- Calcular la concentración de hierro ferroso de una muestra a partir de dos mediciones paralelas de acuerdo con la curva estándar establecida.
- Analizar el valor de pH y el potencial de oxidación/reducción (ORP) con medidores digitales de pH/redox con electrodos de pH semimicro, y un electrodo de cloruro de plata, respectivamente.
- Cuente las células planctónicas directamente mediante el uso de un microscopio de luz con una cámara Thoma.
- Investigar la morfología celular mediante el escaneo de microscopía electrónica (SEM).
- Filtrar las células planctónicas cultivadas en diferentes condiciones a través de un filtro de tamaño de poro de 0,1 x 0,2 m.
- Deshidratar las muestras con acetona y almacenarlas durante la noche a 4oC en acetona al 90%.
- Seque las muestras por punto crítico de secado y recubrirlas con grafito u oro.
- Examine las muestras con un microscopio electrónico de barrido de emisión de campo (FE-SEM) a 10 kV.
Representative Results
Los resultados del experimento del reactor de alta presión con la célula especial de reacción oro-titanio muestran que el cultivo mixto microbiano de acidophiles oxidado el azufre y redujo el hierro férrico al hierro ferroso(Figura 3).
En condiciones de presión de 1 bar o 100 bar, los cultivos tuvieron un retraso cuando se cultivaban en la célula de reacción de oro y titanio. Después de ese período, se produjo un rápido aumento en la concentración de hierro ferroso de aproximadamente 9 mM a 31 mM en el cultivo cultivado a 1 bar. Durante el tiempo de incubación de 22 días, se detectaron 31 mM y 13 mM de hierro ferroso en los ensayos a 1 bar y 100 bar, respectivamente. Esto demuestra claramente que las células microbianas estaban activas a 100 bar, pero su actividad de reducción de hierro férrico fue significativamente menor a presión elevada. Los experimentos de control abiótico realizados en tubos Hungate y botellas de suero no mostraron reducción de hierro férrico a 1 bar y 100 bar.
Las imágenes de microscopía electrónica de barrido(Figura 4)muestran células en forma de varilla cultivadas en experimentos a baja y alta presión. No se observó ningún cambio significativo en la morfología celular en 1 bar frente a 100 bar. Sin embargo, el crecimiento celular fue obviamente inhibido por la presión elevada, ya que el número de células era 1.3 x 108 células/mL a 1 bar en comparación con 4.5 x 107 células/mL a 100 bar7. Estos datos son comparables con las pruebas realizadas en los tubos Hungate7. Por lo tanto, la célula de reacción flexible de oro y titanio en sí no tuvo ningún efecto en el crecimiento celular y era adecuada para pruebas de crecimiento microbiano.
Los resultados muestran que los microorganismos biolixiviantes están activos incluso a una alta presión de 100 bar, lo cual es muy relevante para la biominainación in situ porque tales condiciones se producen en depósitos profundos de mineral a una profundidad inferior a 1.000 m7.
Figura 1: Descripción general de las partes de la célula de reacción. De abajo a arriba: la bolsa de oro, collar de titanio, cabeza de titanio, arandela, anillo de perno de compresión de titanio, tubo de muestreo de titanio con glándulas y collares inoxidables para las conexiones de alta presión conadas y roscadas en ambos lados, y la válvula de titanio con una adaptador para conectar una jeringa Luer Lock. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Dibujos dimensionales de las piezas de titanio mecanizadas a partir de varillas de titanio grado 2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Cambios de las concentraciones de hierro ferroso en la célula de reacción de oro y titanio con el cultivo de óxido de hierro ferroso. Las células se cultivaron anaeróbicamente a 30 oC. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Morfología del cultivo ferroso-oxidizante de hierro cultivado a 1 bar y 100 bar. Las células se cultivaron anaeróbicamente a 30 oC. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
El método presentado para experimentos de alta presión de reacciones microbianas dentro de soluciones ácidas fue una poderosa herramienta para simular procesos geomicrobiológicos de subsuelo profundo en un entorno de laboratorio.
Hay numerosos pasos de trabajo manual involucrados, algunos de los cuales requieren una atención especial. Como nota general, no se debe utilizar fuerza excesiva al ensamblar las partes individuales de la célula flexible de oro y titanio y el cabezal del reactor (secciones 3 y 4). Si se ignoran las especificaciones del fabricante (por ejemplo, para presión máxima, temperatura, par) , pueden producirse fugas y/o fallos de material.
La limpieza de las piezas de oro y titanio (sección 2.2) es un paso de trabajo indispensable, no sólo para este experimento, sino especialmente para experimentos que implican reacciones (in)orgánicas. Los restos de experimentos anteriores en la célula de oro pueden causar reacciones no deseadas y, por lo tanto, sesgo de resultados. Cuando la célula de oro-titanio montada se instala en el cabezal del reactor, es mejor trabajar de forma rápida y precisa, porque en este momento pequeñas cantidades de oxígeno podrían entrar en la celda de oro. Cerrar la válvula de muestreo antes de salir de la guantera es una buena primera medida para minimizar el intercambio entre la atmósfera ambiente con el interior de la celda de oro.
Una vez que el reactor se coloca en el dispositivo de balanceo, es importante ajustar la velocidad de movimiento de balanceo a 170o/min. Si el reactor de alta presión se mueve demasiado rápido, la ruptura de la célula de oro puede ocurrir debido a efectos gravitacionales o los bordes afilados de las muestras de sedimentos o rocas cuando se utiliza.
Este método se puede utilizar en campos de investigación adicionales. La célula flexible de reacción de oro y titanio tiene el potencial de ser utilizada para un conjunto diverso de investigaciones científicas9 estudiando reacciones a presión y temperatura elevadas y en fluidos o gases altamente corrosivos.
Los microorganismos en el subsuelo profundo a temperaturas superiores a 70 oC en presencia de superficies minerales pueden estimular la producción de hidrógeno molecular o ácidos orgánicos como el acetato incluso bajo presión elevada16. Estos productos, y otros compuestos, podrían inducir una actividad microbiana elevada durante los procesos de biolixiviación in situ, además de los compuestos de azufre investigados en este estudio.
Las aplicaciones incluyen la determinación de la solubilidad de gases e iones en fluidos acuosos, reacciones geoquímicas en condiciones de los sistemas de ventilación hidrotérmica17,la cuantificación del fraccionamiento de isótopos18, reacciones geoquímicas durante el CO 2 secuestros 19,procesos abióticos durante la formación de petróleo y gas en rocas de origen20,y reacciones microbianas a presiones elevadas en el subsuelo21 como en el presente estudio.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a Robert Rosenbauer (USGS, Menlo Park) en compartir su experiencia en las células flexibles de reacción de oro y titanio, y a Georg Scheeder (BGR) por su contribución durante la fase inicial de configuración del sistema modificado en Hannover. Nos gustaría dar las gracias a muchos científicos (incluyendo Katja Heeschen, Andreas Risse, Jens Gracia-Trampe, Theodor Alpermann) utilizando la configuración en Hannover en numerosos proyectos que contribuyeron en pequeñas mejoras en el camino y Christian Seeger para el desarrollo de la dispositivo de balanceo para los reactores de alta presión. Agradecemos a Laura Castro (Universidad Complutense de Madrid) por las observaciones sede. Y, por último, nos gustaría expresar nuestra gratitud a Nils W'lki por producir este video de alta calidad para el artículo. Este trabajo fue apoyado por el proyecto BIOMOre de la Unión Europea Horizonte 2020 (Acuerdo de subvención n.o 642456).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | Merck | 100013 | |
| CaN2O6 | Fluka | 31218 | |
| Conax compression seal fittings | Conax Technologies | PG2-250-B-G | sealant could be selected according to temperatures in experiment |
| Copper paste | Caramba | 691301 | |
| Copper paste | CRC | 41520 | |
| CoSO4x7H2O | Sigma | 10026-24-1 | |
| CrKO8S2x12H2O | Roth | 3535.3 | |
| CuSO4x5H2O | Riedel de Haen | 31293 | |
| Disposable cuvettes | Sigma | z330388 | |
| Ethanol absolute | Roth | 9065.3 | |
| FE-SEM | JEOL | model no. JSM-6330F | |
| Ferrozine | Aldrich | 180017 | |
| Fe2(SO4)3x7H2O | Alfa Aesar | 33316 | |
| FeSO4x7H2O | Merck | 103965 | |
| Gold cell | Hereaus GmbH | manufactured according to dimensions supplied by customer | |
| High-pressure reactor | PARR Instruments | model no. 4650 Series | reactors from other vendors could be used, too |
| High-pressure syringe pump | Teledyne ISCO | DM-100 | |
| HCl | Roth | 6331.3 | |
| HNO3 | Fluka | 7006 | |
| H3BO3 | Sigma | B6768 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| KH2PO4 | Merck | 104873 | |
| L-(+)-Ascorbic acid/Vitamin C | Applichem | A1052 | |
| Light microscope | Leica DM3000 | ||
| MgSO4x7H2O | Merck | 105886 | |
| (NH4)2SO4 | Sigma | A4418 | |
| NaMoO4x2H2O | Sigma | 331058 | |
| NaO3Sex5H2O | Sigma | 00163 | |
| NaO3V | Sigma | 590088 | |
| Na2SO4 | Merck | 106649 | |
| Na2WO4x2H2O | Sigma | 72069 | |
| NiSO4x6H2O | Sigma | 31483 | |
| Omnifix Luer | BRAUN | 4616057V | |
| pH meter | Mettler Toledo | ||
| Redox potential meter | WTW | ORP portable meter | |
| Safe-Lock Tubes, 2 mL | Eppendorf | 0030120094 | |
| Serum bottle | Sigma | 33110-U | |
| Spectrophotometer | Thermo Scientific | model no. GENESYS 10S | |
| Sterican Hypodermic needle | BRAUN | 4657519 | |
| Stoppers | Sigma | 27234 | |
| Sulfur powder | Roth | 9304 | |
| Thoma Chamber | Hecht-Assistent | ||
| Titanium parts of reaction cell | Titan-Halbzeug GmbH | 121-238 | manufactured by workshop at BGR according to dimensions supplied from Titanium grade 2 rods from Titan-Halbzeug GmbH |
| Titanium valve | Nova Swiss Technologies | ND-5002 | |
| Whatman membrane filters nylon | Sigma | WHA7402004 | |
| ZnSO4x7H2O | Sigma | Z4750 |
References
- Johnson, D. B. Biomining goes underground. Nature Geoscience. 8 (3), 165-166 (2015).
- Bellenberg, S., et al. Manipulation of pyrite colonization and leaching by iron-oxidizing Acidithiobacillus species. Applied Microbiology and Biotechnology. 99 (3), 1435-1449 (2014).
- Christel, S., Fridlund, J., Watkin, E. L., Dopson, M. Acidithiobacillus ferrivorans SS3 presents little RNA transcript response related to cold stress during growth at 8 °C suggesting it is a eurypsychrophile. Extremophiles. 20 (6), 903-913 (2016).
- Dopson, M., Ossandon, F. J., Lovgren, L., Holmes, D. S. Metal resistance or tolerance? Acidophiles confront high metal loads via both abiotic and biotic mechanisms. Frontiers in Microbiology. 5, 157 (2014).
- Schippers, A., et al. Biomining: metal recovery from ores with microorganisms. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 141, 1-47 (2014).
- Shiers, D., Ralph, D., Bryan, C., Watling, H. Substrate utilisation by Acidianus brierleyi, Metallosphaera hakonensis and Sulfolobus metallicus in mixed ferrous ion and tetrathionate growth media. Minerals Engineering. 48, 86-93 (2013).
- Zhang, R., Hedrich, S., Ostertag-Henning, C., Schippers, A. Effect of elevated pressure on ferric iron reduction coupled to sulfur oxidation by biomining microorganisms. Hydrometallurgy. 178, 215-223 (2018).
- Dickson, F., Blount, C. W., Tunell, G. Use of hydrothermal solution equipment to determine the solubility of anhydrite in water from 100 degrees C to 275 degrees C and from 1 bar to 1000 bars pressure. American Journal of Science. 261 (1), 61-78 (1963).
- Seyfried, W., Gordon, P., Dickson, F. A new reaction cell for hydrothermal solution equipment. American Mineralogist. 64 (5-6), 646-649 (1979).
- Cross, M. M., Manning, D. A., Bottrell, S. H., Worden, R. H. Thermochemical sulphate reduction (TSR): experimental determination of reaction kinetics and implications of the observed reaction rates for petroleum reservoirs. Organic Geochemistry. 35 (4), 393-404 (2004).
- Frerichs, J., Rakoczy, J., Ostertag-Henning, C., Krüger, M. Viability and adaptation potential of indigenous microorganisms from natural gas field fluids in high pressure incubations with supercritical CO2. Environmental Science & Technology. 48 (2), 1306-1314 (2014).
- Heeschen, K., Risse, A., Ostertag-Henning, C., Stadler, S. Importance of co-captured gases in the underground storage of CO2: Quantification of mineral alterations in chemical experiments. Energy Procedia. 4, 4480-4486 (2011).
- Wakeman, K., Auvinen, H., Johnson, D. B. Microbiological and geochemical dynamics in simulated-heap leaching of a polymetallic sulfide ore. Biotechnology and Bioengineering. 101 (4), 739-750 (2008).
- Pakostova, E., Grail, B. M., Johnson, D. B. Indirect oxidative bioleaching of a polymetallic black schist sulfide ore. Minerals Engineering. 106, 102-107 (2017).
- Lovley, D. R., Phillips, E. J. Rapid assay for microbially reducible ferric iron in aquatic sediments. Applied and Environmental Microbiology. 53 (7), 1536-1540 (1987).
- Parkes, R. J., et al. Prokaryotes stimulate mineral H2 formation for the deep biosphere and subsequent thermogenic activity. Geology. 39 (3), 219-222 (2011).
- McCollom, T. M. Abiotic methane formation during experimental serpentinization of olivine. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 113 (49), 13965-13970 (2016).
- Pester, N. J., Conrad, M. E., Knauss, K. G., DePaolo, D. J. Kinetics of D/H isotope fractionation between molecular hydrogen and water. Geochimica et Cosmochimica Acta. 242, 191-212 (2018).
- Rosenbauer, R. J., Thomas, B., Bischoff, J. L., Palandri, J. Carbon sequestration via reaction with basaltic rocks: Geochemical modeling and experimental results. Geochimica et Cosmochimica Acta. 89, 116-133 (2012).
- Knauss, K. G., Copenhaver, S. A., Braun, R. L., Burnham, A. K. Hydrous pyrolysis of New Albany and Phosphoria Shales: production kinetics of carboxylic acids and light hydrocarbons and interactions between the inorganic and organic chemical systems. Organic Geochemistry. 27 (7-8), 477-496 (1997).
- Parkes, R. J., et al. Culturable prokaryotic diversity of deep, gas hydrate sediments: first use of a continuous high-pressure, anaerobic, enrichment and isolation system for subseafloor sediments (DeepIsoBUG). Environmental Microbiology. 11 (12), 3140-3153 (2009).
