Summary
Ce protocole décrit les expériences microbiennes sous des pressions élevées pour étudier les processus de biomines in situ. L'approche expérimentale utilise un réacteur à haute pression à bascule équipé d'une cellule de réaction or-titanium contenant une culture microbienne dans un milieu acide et riche en fer.
Abstract
Les études de laboratoire sur les processus microbiens souterrains, comme le lessivage des métaux dans les gisements de minerai profond (biomines), partagent des obstacles communs et difficiles, y compris les conditions environnementales particulières qui doivent être reproduites, par exemple, la haute pression et, dans certains cas, des solutions acides. Le premier nécessite une configuration expérimentale adaptée à la pressurisation jusqu'à 100 barres, tandis que le second exige un récipient fluide avec une forte résistance chimique contre la corrosion et les réactions chimiques indésirables avec la paroi du conteneur. Pour répondre à ces conditions pour une application dans le domaine de la biomines in situ, une cellule de réaction spéciale flexible or-titanium à l'intérieur d'un réacteur à haute pression à bascule a été utilisée dans cette étude. Le système décrit a permis la simulation de la biomining in situ par la réduction microbienne de fer sulfureuse dans un environnement expérimental anoxique, sous pression et hautement chimiquement inerte. La cellule de réaction flexible or-titanium peut accueillir jusqu'à 100 ml de solution d'échantillon, qui peut être échantillonnée à n'importe quel moment donné tandis que le système maintient la pression désirée. Les expériences peuvent être effectuées sur des échelles de temps allant de heures à plusieurs mois. L'assemblage du système de réacteur à haute pression prend assez de temps. Néanmoins, lorsque des processus complexes et difficiles (microbiologiques) se produisant dans le sous-sol profond de la terre dans des fluides chimiquement agressifs doivent être étudiés en laboratoire, les avantages de ce système l'emportent sur les inconvénients. Les résultats ont révélé que même à haute pression, le consortium microbien est actif, mais à des taux métaboliques significativement inférieurs.
Introduction
Au cours de la dernière décennie, les efforts visant à minimiser l'impact de l'exploitation minière sur l'environnement se sont intensifiés. L'exploitation à ciel ouvert pour l'extraction des matières premières des minerais (p. ex., les minerais de sulfure riches en cuivre) a un impact sur le paysage environnant par les activités d'excavation et par les grands volumes restants de roches résiduelles et de restes de minerai transformé après l'extraction de précieux métaux comme le cuivre. L'extraction du cuivre directement du minerai dans le sous-sol réduirait considérablement ces impacts. La technologie de la biomines in situ est un candidat prometteur pour ce processus1. Cette publication décrit l'utilisation de l'activité microbienne stimulée pour extraire les métaux précieux du minerai dans une solution aqueuse dans le sous-sol. Ainsi, une solution riche en cuivre peut être facilement pompée à la surface pour concentrer davantage le métal, par exemple.
L'activité des micro-organismes acidophiliques de minerai-lixiviation a été étudiée dans beaucoup de laboratoires pour un éventail divers de paramètres2,3,4,5,6. Cependant, les effets de pression sur l'activité microbienne résultant de la différence entre les conditions ambiantes de laboratoire de surface (près de 1 barre) et le sous-sol à une profondeur de 1 000 m avec des conditions hydrostatiques (100 barres) ne sont pas bien documentés. Par conséquent, les effets de la pression sur la réduction microbienne du fer ont été étudiés à travers différentes avenues expérimentales7. Ici, la technique la plus appropriée est décrite en détail.
Les réacteurs à haute pression ont été largement utilisés pour étudier les réactions aux pressions et aux températures qui se produisent dans le sous-sol de la terre. Ces réacteurs sont constitués d'une cuve de réacteur au fond qui peut contenir un échantillon de liquide avec une culture microbienne. Assis au-dessus de la cuve du réacteur, la tête du réacteur offre un large éventail de connexions et d'interfaces pour les mesures de sécurité et les capteurs de surveillance (p. ex., température ou pression). La plupart des réacteurs à haute pression sont en acier inoxydable. Ce matériau offre une grande résilience et de bonnes propriétés d'usinage, mais la résistance à la corrosion de la surface en acier inoxydable n'est pas suffisante pour chaque application. Par exemple, si des solutions aqueuses très acides ou fortement réducteurs sont étudiées, des réactions significatives des composés d'intérêt avec la paroi du réacteur peuvent se produire. Une façon d'éviter cela est d'insérer une doublure dans la cuve du réacteur, par exemple une doublure en verre borosilicate7. Il est facile à nettoyer et peut être stérilisé par autoclaclacage. En outre, il n'est pas attaqué par des solutions acides ou aqueuses. Même si une doublure peut aider à prévenir les réactions artificielles de la solution ou des microbes dans la solution avec la paroi du réacteur en acier inoxydable, plusieurs problèmes subsistent. D'une part, si un gaz corrosif se forme, comme le sulfure d'hydrogène produit par des bactéries qui réduisent le sulfate, ce gaz pourrait réagir avec la surface découverte de la tête du réacteur située au-dessus de la doublure. Un autre inconvénient est qu'il n'est pas possible de retirer un échantillon du réacteur tout en maintenant la pression.
Pour surmonter ces limites, des cellules de réaction flexibles spécialisées à l'intérieur des réacteurs à haute pression ont été développées pour une variété d'applications. Unecellule 8 flexible de polytétrafluoroethylene (PTFE) a été conçue pour des études de solubilité des sels dans les saumures fortement salines. Cependant, la limitation de ce système est que certains gaz peuvent facilement imprégner le PTFE. En outre, ce matériau a encore une stabilité de température relativement faible. Ainsi, le système a été amélioré en concevant un sac en or flexible avec une tête de titane9 à placer à l'intérieur du réacteur à haute pression en acier inoxydable. La surface dorée est résistante à la corrosion contre les solutions acides ou réducteurs. La surface de titane est également très inerte lorsqu'elle est passivated à fond pour former une couche continue de dioxyde de titane. Lors de l'échantillonnage de cette cellule de réaction à travers un tube d'échantillonnage de titane connecté, le sac d'or rétrécit en volume. La pression interne du système est maintenue en pompant le même volume d'eau, comme le retire l'échantillonnage, dans le réacteur à haute pression en acier inoxydable qui peut accueillir la cellule de réaction. L'échantillon à l'intérieur de la cellule de réaction est maintenu en mouvement en faisant basculer ou incliner le réacteur à haute pression de plus de 90 degrés au cours de l'expérience.
La cellule de réaction se compose des pièces représentées dans la figure 1: le sac en or, le collier en titane, la tête en titane, la rondelle en acier inoxydable, l'anneau de boulon de compression de titane, le tube d'échantillonnage de titane avec glandes et colliers inoxydables pour le coned à haute pression et connexions filetées des deux côtés, et la valve en titane. Le sac en or est une cellule en or cylindrique (Au 99,99) d'une épaisseur de mur de 0,2 mm, d'un diamètre extérieur de 48 mm et d'une longueur de 120 mm.
Toutes les pièces en titane sont fabriquées sur mesure par l'atelier à partir de tiges de titane de grade 2. Les dimensions du collier, de la tête, de la rondelle et de l'anneau de boulon de compression sont visibles dans la figure 2. Le tube d'échantillonnage en titane est un capillaire de titane d'un diamètre extérieur de 6,25 mm et d'une épaisseur de 1,8 mm, ce qui donne un diamètre intérieur de 2,65 mm. Il est fixé dans la tête de titane et la valve de titane par des connexions à coned et filetées à haute pression assurant un sceau de titane contre les surfaces de titane. La soupape de titane à haute pression est équipée d'une tige d'ouverture lente pour permettre une ouverture ou un échantillonnage très contrôlé, même à haute pression. Ce système a été utilisé dans de nombreuses études10,11,12.
Protocol
1. Préparation du milieu et inoculation de la culture microbienne
- Préparer un milieu salé basal pour les procaryotes autotrophes selon les techniques publiées13. Dissoudre et mélanger les produits chimiques ci-dessous dans l'eau distillée (mg/L): Na2SO4'10H2O (150) (NH4)2SO4 (450), KCl (50), MgSO4'7H2O (500), KH2PO4 (50), et Ca(NO) 3) 2h 4H2O (7).
- Ajouter 1 mL/L d'une solution d'oligo-élément concentré de 1 000 x contenant (g/L) : ZnSO4x 7H2O (10), CuSO45H2O (1), MnSO4 H2O (0,76), CoSO4'7H2O (1), CrK (SO4)2'12H2O (0.4), H3BO3 (0.6), NaMoO4'2H2O (0.5), NiSO4'6H2O (1), Na 2 (en) SeO4 (0,51), Na2WO42H2O (0,1), et NaVO3 (0,1). Ajuster le pH à 1,8 en ajoutant 5 M d'acide sulfurique.
- Stériliser le milieu dans un autoclave à 121 oC et 1,2 barre pendant 20 min et stériliser la solution de fer ferrique par filtration à l'intérieur d'un filtre à seringues de taille pore de 0,22 m.
- Transférer 50 ml du milieu de sel basal stérilisé dans une bouteille de sérum et ajouter la solution ferrique en fer et le soufre élémentaire à une concentration finale de 50 mm et 10 g/L, respectivement.
- Inoculer le milieu avec une culture mixte composée de plusieurs procaryotes oxydants de fer mésoacidophiques14.
- Garnir la bouteille de sérum d'arrêts en caoutchouc butyl stérilisé et sceller avec des sertissages en aluminium.
- Faites une bulle vigoureuse du milieu de culture avec n2 pour dépouiller l'oxygène dissous pendant 25 min. Utilisez deux aiguilles, placez l'une plus profondément dans la tête de la bouteille, l'autre près du bouchon.
- Injecter du CO2 pour obtenir une atmosphère de 90 % n2 et 10 % de CO2 dans l'espace de tête de la bouteille de sérum. Incuber la culture sans remuer à 30 oC dans l'obscurité.
2. Préparation de la cellule de réaction or-titanium et du réacteur à haute pression
- Nettoyez la cellule de réaction or-titanium.
- Démontez la cellule de réaction dans les différentes parties pour éviter le contact de l'acide avec les pièces en acier inoxydable, ou l'exposition des pièces assemblées avec différentes propriétés d'expansion thermique à la chaleur.
- Nettoyez les surfaces qui seront en contact avec l'échantillon pendant l'expérience (c.-à-d. le sac d'or, la tête de titane, le tube d'échantillonnage de titane et la valve en titane).
- Mettez le sac en or et la tête en titane dans un bécher en verre.
- Ajouter assez de 10% HCl pour couvrir toutes les pièces.
- Chauffer l'acide sur une plaque chauffante à 50 oC pendant 3 h tout en le remuant.
- Retirer les pièces avec une pince PTFE de la solution acide et les rincer à l'eau déionisée.
- Rincer la surface intérieure du sac d'or et la tête de titane à fond avec 65% HNO3, puis avec de l'eau déionisée.
- Rincer la surface intérieure du tube d'échantillonnage de titane et la valve de titane avec 10% HCl, suivie de l'eau déionisée, 65% HNO3, puis deionized eau à nouveau.
- Nettoyez toutes les pièces de la contamination organique en les rinçant à l'acétone.
- Sécher toutes les parties du four à 105 oC pendant au moins 1 h.
- Chauffez les surfaces du sac d'or, de la tête de titane et du tube d'échantillonnage en titane en les exposant à une température de 450 oC pendant 4 h dans un four à silencieux dans une atmosphère d'air.
REMARQUE : Cette procédure stérilise les surfaces et entraîne la formation d'une couche de dioxyde de titane passivating sur toutes les surfaces de titane. Les pièces de titane doivent avoir une couleur jaune à bleue après le traitement thermique. - Anneal la cellule d'or pour augmenter la flexibilité de l'or en réinitialisant les petits domaines de cristallisation en appliquant la chaleur avec une torche au propane. Chauffer la surface d'or tout autour pour réduire les plis dans l'or qui aurait pu se former au cours de la dernière diminution du volume du sac d'or dans une expérience. Assurez-vous de ne pas trop chauffer l'or en un seul endroit pour éviter sa fonte.
REMARQUE : Une lueur rouge de la surface d'or montre le chauffage suffisant. - Assembler le sac d'or dans le collier de titane, et le tube d'échantillonnage de titane dans la tête de titane en utilisant un couple de 10 Nm pour les glandes.
- Inspecter le réacteur à haute pression.
- Vérifiez visuellement le réacteur pour décevoir d'éventuels dommages, corrosion et pièces détachées.
REMARQUE : Une attention particulière doit être accordée au sceau et au bord du noyau où l'étanchéité a lieu. Si un joint de graphite a déjà été utilisé pour sceller le réacteur, les restes de celui-ci peuvent encore être dans le kerf et doivent être enlevés avec une goupille en plastique avant la prochaine expérience. - Appliquer de la pâte de sulfure de cuivre sur les boulons de poussée dans la tête du réacteur à haute pression. Assurez-vous que la graisse est répartie sur l'ensemble du fil.
- Vérifiez le joint de compression vissé pour la longueur de l'emballage de graphite restant.
- Vérifiez visuellement le réacteur pour décevoir d'éventuels dommages, corrosion et pièces détachées.
3. Remplissage et assemblage de la cellule de réaction or-titanium dans des conditions anoxiques
- Chargez la boîte à gants.
- Préparer le milieu de culture dans les bouteilles de sérum selon la section 1.
- Enveloppez les parties de la cellule de réaction de titane d'or qui seront plus tard en contact avec l'échantillon dans le papier d'aluminium pour réduire au minimum toute contamination potentielle.
- Ouvrez et déverrouillez l'antichambre de la boîte à gants, chargez tout le matériel entrant sur le plateau immable, et fermez et verrouillez le couvercle avant.
- Évacuez l'antichambre 3x et inondez-la d'azote de haute pureté.
- Portez une paire de gants et approchez-vous le plus possible de la couverture intérieure. Déverrouillez et ouvrez le couvercle intérieur pour enlever le matériau entrant du plateau mobile.
- Fermez et verrouillez le couvercle intérieur.
- Remplissez la cellule d'or.
- Déballez le sac en or propre et tenez-le avec un bécher en verre, par exemple. Ouvrez la bouteille de sérum contenant 100 ml de culture bactérienne et de soufre élémentaire.
- Secouez doucement la bouteille de sérum et transférez la culture bactérienne dans le sac en or.
- Assembler la cellule de réaction.
- Insérez la tête de titane avec le tube d'échantillonnage de titane attaché dans le collier en titane enveloppant le bord supérieur du sac d'or.
REMARQUE : Assurez-vous que la surface d'étanchéité de la partie inférieure conique de la tête de titane s'intègre en douceur en la tournant à 90 degrés d'avant en arrière. - Faites glisser la laveuse et l'anneau de boulon de compression sur le tube d'échantillonnage de titane sur la tête de titane.
REMARQUE : Tournez l'anneau de boulon de compression dans le collier de titane par 30 degrés pour aligner les brides du collier de titane et l'anneau de boulon de poussée. - Attachez les six vis Allen dans la même mesure afin d'assurer une répartition uniforme de la tête de titane sur le bord le plus haut du sac d'or dans le collier en titane (c.-à-d., la surface d'étanchéité de la cellule de réaction).
REMARQUE : Attachez les vis Allen dans l'anneau de boulon de compression jusqu'à ce que le couple pour les vis opposées soit augmenté d'abord (croisement) avant de continuer dans le sens des aiguilles d'une montre.
- Insérez la tête de titane avec le tube d'échantillonnage de titane attaché dans le collier en titane enveloppant le bord supérieur du sac d'or.
- Réinstaller la soupape d'échantillonnage au sommet du tube de titane. Attachez la connexion à la main et assurez-vous de fermer la vanne.
- Retirer toutes les pièces de la boîte à gants.
4. Assemblage du réacteur à haute pression avec la cellule de réaction
- Assembler la cellule de réaction dans la tête du réacteur.
REMARQUE : L'installation du réacteur à haute pression est accompagnée d'une très courte exposition de l'extrémité ouverte du tube d'échantillonnage à l'atmosphère environnante, car la soupape d'échantillonnage doit être enlevée pour guider le tube à travers le joint de vis dans la tête du réacteur. Pour l'installation, la tête du réacteur doit déjà être placée dans un étau de banc. Un angle de 45 degrés permet une manipulation plus facile. Le raccord de joint de compression (situé dans la position centrale de l'assemblage du bloc de jadis de la tête du réacteur), qui maintient le tube d'échantillonnage en place, doit être ouvert.- Retirez la soupape d'échantillonnage en titane, la vis et le collier sur le tube d'échantillonnage.
- Guidez le tube avec la cellule de réaction attachée par le trou central dans la tête du réacteur jusqu'à environ 5 cm du tube passer à travers. Faites glisser la grosse vis sur le tube et attachez le petit collier.
REMARQUE : Maintenant, l'assemblage de la cellule de réaction ne peut pas glisser à travers la tête du réacteur et les deux mains sont libres de réinstaller la valve d'échantillonnage. - Re-attachez la valve en titane.
- Resserrer le raccord de joint de compression.
- Retirez la tête du réacteur de l'étau de la banquette pour l'installer sur la cuve du réacteur.
- Préparez-vous à sceller le réacteur.
- Placez l'étanchéité au graphite sur le bord du réacteur.
- Placez soigneusement la tête du réacteur avec la cellule de réaction attachée sur la cuve du réacteur.
REMARQUE : La tête du réacteur, y compris le thermocouple, doit être soigneusement placée sur la cuve du réacteur pour ne pas endommager le sac d'or ou le thermocouple.
- Remplissez la cuve du réacteur d'un mélange d'eau déionisée et d'eau du robinet (environ dans un rapport de 1:1).
- Scellez le réacteur.
- Vérifiez le collier pour vous assurer que les extrémités inférieures des boulons de compression ne sortent pas de leurs fils. Dans le cas contraire, le récipient de pression ne sera pas correctement installé.
- Soulevez le collier et placez-le autour des bords saillants de l'interface du vaisseau de tête du réacteur. Déplacer doucement le collier sur elle se traduira par un ajustement approprié. Fermez les serrures enclenchement tenant le collier en place.
- Attachez les boulons de compression suivant un motif sillonné et augmentez le couple à des étapes modérées jusqu'à ce que la valeur finale recommandée par le fabricant soit atteinte.
REMARQUE : Différents systèmes de réacteurs à haute pression peuvent avoir des valeurs de couple différentes. - Enfin, attachez les boulons de compression dans le sens des aiguilles d'une montre.
- Installez le réacteur à haute pression dans le dispositif de bascule.
REMARQUE : L'installation du réacteur à haute pression dans le dispositif de bascule est décrite pour un modèle fait sur mesure fabriqué à l'Institut fédéral des géosciences et des ressources naturelles à Hanovre, en Allemagne. Par conséquent, l'installation décrite est une ligne directrice générale pour les dispositifs de conception comparable.- Montez soigneusement le réacteur dans le dispositif de bascule.
REMARQUE : Il est préférable de tenir le réacteur à haute pression par les pièces d'assemblage du bloc de gage (p. ex., manomètre ou vis de tube d'échantillonnage) tout en l'abaissant dans le dispositif de bascule. - Fixer le réacteur avec deux pinces sur une paire de longues vis.
- Placer les rondelles sur chaque vis et serrer les pinces avec des écrous à vis.
- Connectez les unités de commande du thermocouple, du transducteur de pression et de l'élément chauffant.
REMARQUE : Il est important de s'assurer que tous les fils sont d'une longueur suffisante pour le mouvement de bascule et d'empêcher le contact avec les surfaces chauffées. - Faites glisser l'élément de chauffage sur la cuve du réacteur et serrez sa serrure à vis.
REMARQUE : L'eau pour pressuriser le système est prélevée dans un réservoir à l'air d'une pompe à haute pression. Il est transféré par des capillaires en acier inoxydable dans le réacteur à haute pression.
REMARQUE : Le basculement du réacteur à haute pression garantit un mélange complet du contenu de la cellule de réaction (c.-à-d. le gaz, le fluide et toutes les phases solides qu'il y a). Une vitesse de bascule lente est importante pour éviter les dommages au sac d'or par des solides en mouvement rapide ou par déformation due aux effets de gravité sur l'or flexible à des températures élevées. Le système de bascule peut tourner de près de 180 degrés.
- Montez soigneusement le réacteur dans le dispositif de bascule.
5. Démarrage de l'expérience
- Vérifiez si les limites de température et de pression du logiciel de surveillance sont fixées aux valeurs souhaitées.
REMARQUE : Dans cette expérience, ils ont été réglés à 70 oC et 25 MPa. - Effectuez une vérification des fuites.
- Connectez le tuyau de pression, un capillaire en acier inoxydable, à la tête du réacteur.
- Augmentez la pression à la pression cible à des intervalles distincts tout en vérifiant continuellement les fuites.
- Maintenez la pression constante jusqu'à ce que le débit de la pompe soit presque nul.
REMARQUE : Méfiez-vous que l'air compressible et dissous dans l'eau est visible pendant une longue période dans des lectures subtiles de débit.
- Démarrer le chauffage après une vérification réussie des fuites.
- Démarrer l'enregistrement des pompes de pressurisation.
- Ajustez le point d'ensemble pour le chauffage à la valeur désirée et démarrez le chauffage avec le logiciel.
- Vérifiez régulièrement tous les paramètres et l'état du système.
- Déserrer le tuyau de pression après avoir atteint la température cible.
- Démarrez le dispositif de bascule.
6. Échantillonnage du réacteur à haute pression en mode opérationnel
- Pour prélever un échantillon, attachez une seringue de 5 ml au connecteur luer lock de la soupape d'échantillonnage au sommet du réacteur à haute pression.
- Ouvrez soigneusement la soupape et laissez l'échantillon de liquide pousser dans la seringue par la pression à l'intérieur du réacteur à haute pression. Fermer la vanne après que le volume échantillonné atteigne 1 ml. Détachez la seringue.
- Transférer immédiatement les échantillons dans la seringue dans un tube de 2 ml dans une hotte à fumée pour traitement.
7 . Analyse de l'échantillon de liquide
REMARQUE : Seules les étapes de l'analyse de ferrozine photométrique moins courante (c.-à-d. la section 7.1) sont décrites ici en détail et sont mentionnées dans la vidéo, parce que les autres étapes sont des procédures d'opération standard en microbiologie.
- Utiliser un essai de ferrozine pour déterminer photométriquement la concentration de fer ferreux dissous (Fe2)(aq)) et de fer total (Fetot)15.
- Préparer une série de solutions standard de fer ferreux en dissolvant des quantités connues de FeSO4x 7 H2O dans l'eau.
- Mélanger 50 'L de ces niveaux standard avec 1 ml d'une solution de ferrozine de 1 M.
REMARQUE : La réaction de ferrozine avec le fer ferreux dissous forme un complexe pourpre. L'intensité de la couleur est corrélée à la concentration de fer ferreux. - Établir une courbe d'étalonnage entre la concentration ferreuse de fer et l'absorption du complexe fer-ferrozine.
- Calculer la concentration de fer ferreux d'un échantillon à partir de deux mesures parallèles selon la courbe standard établie.
- Analyser la valeur du pH et le potentiel d'oxydation/réduction (ORP) à l'égard des compteurs numériques de pH/redox avec des électrodes semi-micro pH, et une électrode de chlorure d'argent, respectivement.
- Comptez directement les cellules planctoniques à l'aide d'un microscope léger avec une chambre Thoma.
- Étudier la morphologie cellulaire en scannant la microscopie électronique (SEM).
- Filtrer les cellules planctoniques cultivées dans des conditions différentes grâce à un filtre de taille de pores de 0,1 à 0,2 m.
- Déshydrater les échantillons d'acétone et les conserver toute la nuit à 4 oC dans 90 % d'acétone.
- Séchez les échantillons par point critique de séchage et enrobez-les de graphite ou d'or.
- Examiner les spécimens à l'école avec un microscope électronique à balayage des émissions sur le terrain (FE-SEM) à 10 kV.
Representative Results
Les résultats de l'expérience du réacteur à haute pression avec la cellule de réaction spéciale or-titanium montrent que la culture microbienne mixte d'acidophiles oxydé le soufre et réduit le fer ferrique au fer ferreux (Figure 3).
À la fois 1 bar ou 100 conditions de pression de barre, les cultures ont eu une phase de décalage une fois cultivées dans la cellule de réaction d'or-titanium. Après cette période, une augmentation rapide de la concentration de fer ferreux d'environ 9 mm à 31 mM s'est produite dans la culture cultivée à 1 barre. Au cours de la période d'incubation de 22 jours, 31 mm et 13 mm de fer ferreux ont été détectés dans les essais à 1 barre et 100 bar, respectivement. Ceci démontre clairement que les cellules microbiennes étaient actives à 100 barre, mais leur activité ferrique de fer-réduction était sensiblement plus basse à la pression élevée. Les expériences de lutte abiotique menées dans les tubes Hungate et les bouteilles de sérum n'ont pas montré de réduction ferrique du fer à 1 barre et 100 bar.
Les images de microscopie électronique à balayage (Figure 4) montrent des cellules en forme de tige cultivées dans des expériences à basse et haute pression. Aucun changement significatif dans la morphologie cellulaire n'a été observé à 1 barre contre 100 bar. Cependant, la croissance cellulaire a été évidemment inhibée par la pression élevée, car le nombre de cellules était 1.3 x 108 cellules/mL à 1 barre par rapport à 4.5 x 107 cellules/mL à 100 barre7. Ces données sont comparables aux tests effectués dans les tubes Hungate7. Ainsi, la cellule flexible de réaction d'or-titanium elle-même n'a eu aucun effet sur la croissance de cellules et était appropriée pour des essais de croissance microbienne.
Les résultats montrent que les micro-organismes bioleaching sont actifs même à une pression élevée de 100 barres, ce qui est très pertinent pour la biomines in situ parce que de telles conditions se produisent dans les dépôts de minerai profond à une profondeur inférieure à 1000 m7.
Figure 1 : Aperçu des parties de la cellule de réaction. De bas en haut : le sac en or, le col en titane, la tête de titane, la rondelle, l'anneau de boulon de compression de titane, le tube d'échantillonnage de titane avec les glandes et les colliers inoxydables pour les connexions coned et filetées à haute pression des deux côtés, et la valve de titane avec un adaptateur pour connecter une seringue Luer Lock. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Dessins dimensionnels des pièces en titane usinées à partir de tiges de titane de grade 2. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Changements des concentrations de fer ferreux dans la cellule de réaction or-titane avec la culture ferreux oxydant le fer. Les cellules ont été cultivées anaérobieà à 30 oC. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Morphologie de la culture ferreux oxydante du fer cultivée à 1 bar et 100 bar. Les cellules ont été cultivées anaérobieà à 30 oC. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Discussion
La méthode présentée pour les expériences à haute pression des réactions microbiennes dans les solutions acides était un outil puissant pour simuler les processus géomicrobiologiques souterrains profonds dans un environnement de laboratoire.
Il y a de nombreuses étapes de travail manuelles impliquées, dont certaines nécessitent une attention particulière. En général, aucune force excessive ne doit être utilisée lors de l'assemblage des différentes parties de la cellule flexible or-titanium et de la tête du réacteur (sections 3 et 4). Si les spécifications du fabricant (p. ex., pour la pression maximale, la température, le couple) sont ignorées, des fuites et/ou une défaillance matérielle peuvent en résulter.
Le nettoyage des pièces d'or et de titane (section 2.2) est une étape de travail indispensable, non seulement pour cette expérience, mais surtout pour les expériences impliquant des réactions organiques (in-). Les restes d'expériences antérieures dans la cellule d'or peuvent provoquer des réactions indésirables et donc biaiser les résultats. Lorsque la cellule d'or-titanium assemblée est installée dans la tête du réacteur, il est préférable de travailler rapidement et précisément, car à ce moment-là de petites quantités d'oxygène pourraient entrer dans la cellule d'or. Fermer la soupape d'échantillonnage avant de quitter la boîte à gants est une bonne première mesure pour minimiser l'échange entre l'atmosphère ambiante et l'intérieur de la cellule dorée.
Une fois que le réacteur est placé dans le dispositif de bascule, il est important de placer la vitesse de mouvement de bascule à 170 '/min. Si le réacteur à haute pression se déplace trop vite, la rupture de la cellule d'or peut se produire en raison d'effets gravitationnels ou des bords tranchants des sédiments ou des échantillons de roche lorsqu'il est utilisé.
Cette méthode peut être utilisée dans d'autres domaines de recherche. La cellule de réaction flexible or-titanium a le potentiel d'être utilisée pour un ensemble diversifié d'études scientifiques9 étudiant des réactions à haute pression et température et dans des fluides ou des gaz fortement corrosifs.
Les micro-organismes dans le sous-sol profond à des températures supérieures à 70 oC en présence de surfaces minérales peuvent stimuler la production d'hydrogène moléculaire ou d'acides organiques comme l'acétate, même sous une pression élevée16. Ces produits, et d'autres composés, pourraient induire une activité microbienne élevée au cours des processus de biolixiviation in situ, en plus des composés sulfureux étudiés dans cette étude.
Les applications comprennent la détermination de la solubilité des gaz et des ions dans les fluides aqueux, les réactions géochimiques aux conditions des systèmes d'évent hydrothermaux17, la quantification de la fractionnement des isotopes18, les réactions géochimiques pendant le CO 2 séquestration19, processus abiotiques lors de la formation du pétrole et du gaz dans les roches sources20, et réactions microbiennes à des pressions élevées dans le sous-sol21 comme dans la présente étude.
Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Nous remercions Robert Rosenbauer (USGS, Menlo Park) en partageant son expertise sur les cellules flexibles de réaction or-titanium, et Georg Scheeder (BGR) pour son apport au cours de la phase initiale de la mise en place du système modifié à Hanovre. Nous tenons à remercier de nombreux scientifiques (dont Katja Heeschen, Andreas Risse, Jens Groger-Trampe, Theodor Alpermann) qui ont utilisé la configuration à Hanovre dans de nombreux projets qui ont contribué à de petites améliorations en cours de route et Christian Seeger pour le développement de la pour les réacteurs à haute pression. Nous remercions Laura Castro (Université Complutense de Madrid) pour les observations SEM. Enfin, nous tenons à exprimer notre gratitude à Nils Wilki pour la production de cette vidéo de haute qualité pour l'article. Ces travaux ont été soutenus par le projet BIOMOre de l'Union européenne Horizon 2020 (accord de subvention no 642456).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | Merck | 100013 | |
| CaN2O6 | Fluka | 31218 | |
| Conax compression seal fittings | Conax Technologies | PG2-250-B-G | sealant could be selected according to temperatures in experiment |
| Copper paste | Caramba | 691301 | |
| Copper paste | CRC | 41520 | |
| CoSO4x7H2O | Sigma | 10026-24-1 | |
| CrKO8S2x12H2O | Roth | 3535.3 | |
| CuSO4x5H2O | Riedel de Haen | 31293 | |
| Disposable cuvettes | Sigma | z330388 | |
| Ethanol absolute | Roth | 9065.3 | |
| FE-SEM | JEOL | model no. JSM-6330F | |
| Ferrozine | Aldrich | 180017 | |
| Fe2(SO4)3x7H2O | Alfa Aesar | 33316 | |
| FeSO4x7H2O | Merck | 103965 | |
| Gold cell | Hereaus GmbH | manufactured according to dimensions supplied by customer | |
| High-pressure reactor | PARR Instruments | model no. 4650 Series | reactors from other vendors could be used, too |
| High-pressure syringe pump | Teledyne ISCO | DM-100 | |
| HCl | Roth | 6331.3 | |
| HNO3 | Fluka | 7006 | |
| H3BO3 | Sigma | B6768 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| KH2PO4 | Merck | 104873 | |
| L-(+)-Ascorbic acid/Vitamin C | Applichem | A1052 | |
| Light microscope | Leica DM3000 | ||
| MgSO4x7H2O | Merck | 105886 | |
| (NH4)2SO4 | Sigma | A4418 | |
| NaMoO4x2H2O | Sigma | 331058 | |
| NaO3Sex5H2O | Sigma | 00163 | |
| NaO3V | Sigma | 590088 | |
| Na2SO4 | Merck | 106649 | |
| Na2WO4x2H2O | Sigma | 72069 | |
| NiSO4x6H2O | Sigma | 31483 | |
| Omnifix Luer | BRAUN | 4616057V | |
| pH meter | Mettler Toledo | ||
| Redox potential meter | WTW | ORP portable meter | |
| Safe-Lock Tubes, 2 mL | Eppendorf | 0030120094 | |
| Serum bottle | Sigma | 33110-U | |
| Spectrophotometer | Thermo Scientific | model no. GENESYS 10S | |
| Sterican Hypodermic needle | BRAUN | 4657519 | |
| Stoppers | Sigma | 27234 | |
| Sulfur powder | Roth | 9304 | |
| Thoma Chamber | Hecht-Assistent | ||
| Titanium parts of reaction cell | Titan-Halbzeug GmbH | 121-238 | manufactured by workshop at BGR according to dimensions supplied from Titanium grade 2 rods from Titan-Halbzeug GmbH |
| Titanium valve | Nova Swiss Technologies | ND-5002 | |
| Whatman membrane filters nylon | Sigma | WHA7402004 | |
| ZnSO4x7H2O | Sigma | Z4750 |
References
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