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Engineering

Utilizzo di celle di reazione oro-titanio flessibili per simulare l'attività microbica dipendente dalla pressione nel contesto del biomining del sottosuolo

doi: 10.3791/60140 Published: October 5, 2019

Summary

Questo protocollo descrive gli esperimenti microbici sotto pressioni elevate per studiare i processi di biomining in situ. L'approccio sperimentale impiega un reattore ad alta pressione a dondolo dotato di una cellula di reazione oro-titanio contenente una coltura microbica in un mezzo acido ricco di ferro.

Abstract

Studi di laboratorio che studiano i processi microbici del sottosuolo, come la lisciviazione dei metalli in depositi di minerali profondi (biomining), condividono ostacoli comuni e impegnativi, comprese le particolari condizioni ambientali che devono essere replicate, ad esempio l'alta pressione e in alcuni casi soluzioni acide. Il primo richiede una configurazione sperimentale adatta per la pressurizzazione fino a 100 bar, mentre il secondo richiede un contenitore di liquidi con elevata resistenza chimica contro la corrosione e reazioni chimiche indesiderate con la parete del contenitore. Per soddisfare queste condizioni per un'applicazione nel campo della biomining in situ, in questo studio è stata utilizzata una speciale cella di reazione oro-titanio flessibile all'interno di un reattore ad alta pressione a dondolo. Il sistema descritto ha permesso la simulazione della biomining in situ attraverso la riduzione del ferro microbico basato sul zolfo in un ambiente sperimentale anossia, controllato dalla pressione e altamente inerte chimicamente. La cella di reazione flessibile oro-titanio può ospitare fino a 100 mL di soluzione campione, che può essere campionata in qualsiasi punto temporale mentre il sistema mantiene la pressione desiderata. Gli esperimenti possono essere eseguiti su scale temporali che vanno da ore a mesi. L'assemblaggio del sistema di reattori ad alta pressione richiede molto tempo. Tuttavia, quando in laboratorio devono essere studiati processi complessi e impegnativi (microbiologici) che si verificano nel sottosuolo profondo della terra in fluidi chimicamente aggressivi, i vantaggi di questo sistema superano gli svantaggi. I risultati hanno trovato che anche ad alta pressione il consorzio microbico è attivo, ma a tassi metabolici significativamente più bassi.

Introduction

Nel corso dell'ultimo decennio, gli sforzi per ridurre al minimo l'impatto dell'attività mineraria sull'ambiente sono aumentati. L'estrazione a cielo aperto per l'estrazione di materie prime di minerali (ad esempio, minerali di solfuro ricchi di rame), colpisce il paesaggio circostante dalle attività di scavo e dai grandi volumi rimanenti di rocce di scarto e resti di minerali trasformati dopo l'estrazione di preziosi metalli come il rame. L'estrazione di rame direttamente dal minerale nel sottosuolo ridurrebbe significativamente questi impatti. La tecnologia del biomining in situ è un candidato promettente per questo processo1. Questa pubblicazione descrive l'uso dell'attività microbica stimolata per estrarre i metalli preziosi dal minerale in una soluzione acquosa nel sottosuolo. Così, una soluzione ricca di rame può essere facilmente pompata di nuovo in superficie per concentrare ulteriormente il metallo, per esempio.

L'attività dei microrganismi acidofili di lisciviazione del minerale è stata studiata in molti laboratori per una vasta gamma di parametri2,3,4,5,6. Tuttavia, gli effetti di pressione sull'attività microbica derivanti dalla differenza tra le condizioni di laboratorio della superficie ambiente (vicino a 1 battuta) e il sottosuolo ad una profondità di 1.000 m con condizioni idrostatiche (100 bar) non sono ben documentati. Pertanto, gli effetti della pressione sulla riduzione del ferro microbico sono stati studiati attraverso diverse vie sperimentali7. Qui, la tecnica più adatta è descritta in dettaglio.

I reattori ad alta pressione sono stati ampiamente utilizzati per studiare le reazioni alle pressioni e alle temperature che si verificano nel sottosuolo della terra. Tali reattori sono costituiti da un recipiente di reattori sul fondo che può contenere un campione di liquido con una coltura microbica. Seduto sulla parte superiore del recipiente del reattore, la testa del reattore offre una vasta gamma di connessioni e interfacce per misure di sicurezza e sensori di monitoraggio (ad esempio, temperatura o pressione). La maggior parte dei reattori ad alta pressione sono realizzati in acciaio inossidabile. Questo materiale offre elevata resilienza e buone proprietà di lavorazione, ma la resistenza alla corrosione della superficie in acciaio inossidabile non è adeguata per ogni applicazione. Ad esempio, se si studiano soluzioni acquose altamente acide o altamente riducenti, possono verificarsi reazioni significative dei composti di interesse con la parete del reattore. Un modo per evitare questo è quello di inserire un rivestimento nel recipiente del reattore, ad esempio un rivestimento in vetro borosilicate7. È facile da pulire e può essere sterilizzato da autoclaving. Inoltre, non è attaccato da soluzioni acide o riducendo acquose. Anche se un rivestimento può aiutare a prevenire le reazioni artificiali della soluzione o dei microbi nella soluzione con la parete del reattore in acciaio inossidabile, permangono diversi problemi. Per uno, se si forma un gas corrosivo, come il solfuro di idrogeno prodotto dai batteri che riducono il solfato, questo gas potrebbe reagire con la superficie scoperta della testa del reattore seduta sopra la fodera. Un altro svantaggio è che non è possibile ritirare un campione dal reattore mantenendo la pressione.

Per superare questi limiti, sono state sviluppate cellule di reazione flessibili specializzate all'interno dei reattori ad alta pressione per una varietà di applicazioni. Una cella di politetrafluoroetilene flessibile (PTFE)8 è stata progettata per studi di solubilità dei sali nelle salamoie altamente saline. Tuttavia, la limitazione di questo sistema è che alcuni gas possono facilmente permeare il PTFE. Inoltre, questo materiale ha ancora una stabilità della temperatura relativamente bassa. Così, il sistema è stato migliorato progettando una borsa d'oro flessibile con una testa in titanio9 da posizionare all'interno del reattore ad alta pressione in acciaio inossidabile. La superficie dorata è resistente alla corrosione contro soluzioni e gas acidi o di riduzione. La superficie in titanio è anche molto inerte quando passiva accuratamente per formare uno strato di biossido di titanio continuo. Durante il campionamento da questa cella di reazione attraverso un tubo di campionamento in titanio collegato, il sacchetto d'oro si riduce in volume. La pressione interna del sistema viene mantenuta pompando lo stesso volume d'acqua, così come viene prelevato mediante campionamento, nel reattore ad alta pressione in acciaio inossidabile che ospita la cella di reazione. Il campione all'interno della cellula di reazione viene mantenuto in movimento dondolando o inclinando il reattore ad alta pressione di oltre 90 gradi durante l'esperimento.

La cella di reazione è costituita dalle parti raffigurate nella Figura 1:il sacchetto d'oro, il collare in titanio, la testa in titanio, la rondella in acciaio inossidabile, l'anello del bullone di compressione del titanio, il tubo di campionamento in titanio con ghiandole inossidabili e i collari per il cono ad alta pressione e connessioni filettate su entrambi i lati e la valvola in titanio. La borsa d'oro è una cella in oro cilindrico (Au 99,99) con uno spessore della parete di 0,2 mm, un diametro esterno di 48 mm e una lunghezza di 120 mm.

Tutte le parti in titanio sono fatte su misura dall'officina da aste di titanio di grado 2. Le dimensioni del collare, della testa, della rondella e dell'anello del bullone di compressione sono visibili nella Figura 2. Il tubo di campionamento del titanio è un capillare di titanio con un diametro esterno di 6,25 mm e uno spessore della parete di 1,8 mm, con un diametro interno di 2,65 mm. È fissato nella testa in titanio e nella valvola in titanio mediante connessioni conhoed e filettata ad alta pressione, garantendo una sigillata di superfici in titanio contro titanio. La valvola in titanio ad alta pressione è dotata di un gambo ad apertura lenta per consentire un'apertura o un campionamento molto controllato anche ad alta pressione. Questo sistema è stato utilizzato in numerosi studi10,11,12.

Protocol

1. Preparazione del mezzo e inoculazione della coltura microbica

  1. Preparare un mezzo di sale basale per i procarioti autotrofi secondo le tecniche pubblicate13. Sciogliere e mescolare le sostanze chimiche riportate di seguito in acqua distillata (mg/L): Na2SO4, 10H2O (150) (NH4)2SO4 (450), KCl (50), MgSO47H2O (500), KH2PO4 (50) e Ca(NO 3) 2x 4H2O (7).
  2. Aggiungere 1 mL/L di una soluzione di elemento di traccia concentrato 1.000x contenente (g/L): nSO4s7H2O (10), CuSO4 H2O (0,76), CoSO47H2O (1), CrK(SO4)2-12H2O (0,4), H3BO3 (0,6), NaMoO4x 2H2O (0,5), NiSO4x 6H2O (1), 2 Il nome del sistema SeO4 (0,51), Na2WO4x 2H2O (0,1) e NaVO3 (0,1). Regolare il pH a 1,8 aggiungendo 5 M di acido solforico.
  3. Sterilizzare il mezzo in un'autoclave a 121 e 1,2 bar per 20 min e sterilizzare la soluzione di ferro ferrico filtrando attraverso un filtro di siringa delle dimensioni dei pori da 0,22 m.
  4. Trasferire 50 mL del mezzo di sale basale sterilizzato in una bottiglia di siero e aggiungere la soluzione di ferro ferrico e lo zolfo elementare ad una concentrazione finale di 50 mM e 10 g/L, rispettivamente.
  5. Inoculare il mezzo con una cultura mista composta da diversi prokaryotes di ferro mesoacidofilo14.
  6. Bloccare la bottiglia del siero con i tappi di gomma butili sterilizzati e sigillare con crimpature in alluminio.
  7. Bolle vigorosamente il mezzo di coltura con N2 per strisciare ossigeno disciolto per 25 min.
  8. Iniettare CO2 per ottenere un'atmosfera di CO 2e 10% 90%cod nella vela della bottiglia del siero. Incubare la coltura senza mescolare a 30 gradi centigradi al buio.

2. Preparazione della cellula di reazione oro-titanio e del reattore ad alta pressione

  1. Pulire la cella di reazione oro-titanio.
    1. Smontare la cella di reazione nelle singole parti per evitare il contatto dell'acido con le parti in acciaio inossidabile o l'esposizione delle parti assemblate con diverse proprietà di espansione termica al calore.
    2. Pulire le superfici che saranno a contatto con il campione durante l'esperimento (ad esempio, il sacchetto d'oro, la testa in titanio, il tubo di campionamento del titanio e la valvola in titanio).
      1. Metti il sacchetto d'oro e la testa in titanio in un bicchiere di vetro.
      2. Aggiungere abbastanza 10% HCl per coprire tutte le parti.
      3. Riscaldare l'acido su una piastra di riscaldamento a 50 gradi centigradi per 3 h mescolandolo.
      4. Rimuovere le parti con pinzette PTFE dalla soluzione acida e sciacquarle con acqua deionizzata.
      5. Sciacquare accuratamente la superficie interna del sacchetto d'oro e la testa in titanio con il 65% HNO3 e poi con acqua deionizzata.
      6. Sciacquare la superficie interna del tubo di campionamento del titanio e la valvola in titanio con il 10% di HCl, seguita da acqua deionizzata, il 65% HNO3, quindi dicuizzare nuovamente l'acqua.
      7. Pulire tutte le parti dalla contaminazione organica sciacquandole con acetone.
      8. Asciugare tutte le parti del forno a 105 gradi centigradi per almeno 1 h.
    3. Riscaldare le superfici del sacchetto d'oro, la testa in titanio e il tubo di campionamento del titanio esponendoli a una temperatura di 450 s per 4 h in un forno di muffola in un'atmosfera d'aria.
      NOTA: Questa procedura sterilizza le superfici e determina la formazione di uno strato passivo di biossido di titanio su tutte le superfici in titanio. Le parti in titanio devono avere un colore giallo-blu dopo il trattamento termico.
    4. Anneal la cella d'oro per aumentare la flessibilità dell'oro reimpostando piccoli domini di cristallizzazione applicando calore con una torcia di propano. Riscaldare la superficie d'oro tutto intorno per ridurre i nodi nell'oro che potrebbe essersi formato durante l'ultimo restringimento del volume della borsa d'oro in un esperimento. Assicurarsi di non riscaldare l'oro troppo in un posto per evitare la sua fusione.
      NOTA: Un bagliore rosso della superficie dorata mostra un riscaldamento sufficiente.
    5. Assemblare il sacchetto d'oro nel collare in titanio e il tubo di campionamento in titanio nella testa di titanio utilizzando una coppia di 10 Nm per le ghiandole.
  2. Ispezionare il reattore ad alta pressione.
    1. Controllare visivamente il reattore per eventuali danni, corrosione e parti sciolte.
      NOTA: Particolare attenzione deve essere prestata al sigillo e al taglio dove avviene la guarnatura. Se una guarnizione di grafite è stata precedentemente utilizzata per sigillare il reattore, i resti di esso possono essere ancora nel taglio e devono essere rimossi con un perno di plastica prima dell'esperimento successivo.
    2. Applicare la pasta di solfuro di rame sui bulloni di spinta nella testa del reattore ad alta pressione. Assicurarsi che il grasso sia distribuito su tutto il filo.
    3. Controllare il sigillo di compressione a vite per la lunghezza del restante imballaggio in grafite.

3. Riempimento e assemblaggio della cella di reazione oro-titanio in condizioni anossiche

  1. Caricare il vano portaoggetti.
    1. Preparare il mezzo di coltura nelle bottiglie del siero secondo la sezione 1.
    2. Avvolgere le parti della cellula di reazione goldtitanium che saranno successivamente a contatto con il campione in un foglio di alluminio per ridurre al minimo qualsiasi potenziale contaminazione.
    3. Aprire e sbloccare l'anticamera del vano portaoggetti, caricare tutto il materiale in entrata sul vassoio mobili e chiudere e bloccare il coperchio anteriore.
    4. Evacuare l'anticamera 3x e inondarla di azoto ad alta purezza.
    5. Indossare un paio di guanti e avvicinarsi il più possibile alla copertura interna. Sbloccare e aprire il coperchio interno per rimuovere il materiale di ingresso dal vassoio mobile.
    6. Chiudere e bloccare il coperchio interno.
  2. Riempi la cella d'oro.
    1. Srotolare la borsa d'oro pulito e alzarla con un bicchiere di vetro, per esempio. Aprire la bottiglia di siero contenente 100 mL di coltura batterica e zolfo elementare.
    2. Scuotere delicatamente la bottiglia del siero e trasferire la coltura batterica nel sacchetto d'oro.
  3. Assemblare la cella di reazione.
    1. Inserire la testa di titanio con il tubo di campionamento in titanio attaccato nel collare in titanio che racchiude il bordo superiore della borsa d'oro.
      NOTA: Assicurarsi che la superficie di sigillatura della parte inferiore conica della testa di titanio si adatti agevolmente girandola di 90 gradi avanti e indietro.
    2. Far scorrere la rondella e l'anello del bullone di compressione sopra il tubo di campionamento in titanio sulla testa di titanio.
      NOTA: Ruotare di 30 gradi l'anello del bullone di compressione nel collare in titanio per allineare le flangie del collare in titanio e dell'anello del bullone di spinta.
    3. Fissare le sei viti Allen allo stesso modo per garantire una distribuzione uniforme della pressione della testa di titanio sul bordo superiore della borsa d'oro nel collare in titanio (cioè la superficie di sigillatura della cella di reazione).
      NOTA: Fissare le viti Allen nell'anello del bullone di compressione fino a quando la coppia a mano in modo che la coppia per le viti opposte venga aumentata prima (attraversamento) prima di continuare in senso orario.
  4. Reinstallare la valvola di campionamento nella parte superiore del tubo di titanio. Fissare la connessione a tenuta per le mani e assicurarsi di chiudere la valvola.
  5. Rimuovere tutte le parti dal vano portaoggetti.

4. Assemblare il reattore ad alta pressione con la cellula di reazione

  1. Assemblare la cellula di reazione nella testa del reattore.
    NOTA: l'installazione del reattore ad alta pressione comporta un'esposizione molto breve dell'estremità aperta del tubo di campionamento all'atmosfera circostante, poiché la valvola di campionamento deve essere rimossa per guidare il tubo attraverso la guarnatura della vite nella testa del reattore. Per l'installazione, la testa del reattore dovrebbe già essere collocata in una morsa da panca. Un angolo di 45 gradi consente una maneggevolezza più semplice. Il raccordo della guarnizione a compressione (situato nella posizione centrale dell'assieme del blocco bavaglio della testa del reattore), che tiene il tubo di campionamento in posizione, deve essere aperto.
    1. Rimuovere la valvola di campionamento in titanio, la vite e il collare sulla parte superiore del tubo di campionamento.
    2. Guidare il tubo con la cella di reazione attaccata attraverso il foro centrale nella testa del reattore fino a circa 5 cm del tubo passare attraverso. Far scorrere la grande vite sopra il tubo e fissare il piccolo collare.
      NOTA: Ora l'assemblaggio della cella di reazione non può scivolare indietro attraverso la testa del reattore ed entrambe le mani sono libere di reinstallare la valvola di campionamento.
    3. Riattaccare la valvola in titanio.
    4. Stringere il raccordo della guaritore a compressione.
    5. Rimuovere la testa del reattore dalla morsa della panca per installarla sul recipiente del reattore.
  2. Preparatevi a sigillare il reattore.
    1. Posizionare la guarne in grafite sul taglio del recipiente del reattore.
    2. Posizionare con attenzione la testa del reattore con la cella di reazione attaccata sul recipiente del reattore.
      NOTA: La testa del reattore, compresa la termocoppia, deve essere posizionata con cura sulla nave del reattore per non danneggiare il sacchetto d'oro o la termocoppia.
  3. Riempire il recipiente del reattore con una miscela di deionizzata e acqua del rubinetto (circa in un rapporto 1:1).
  4. Sigillare il reattore.
    1. Controllare il collare per assicurarsi che le estremità inferiori dei bulloni di compressione non sporgesiano dai loro fili. In caso contrario, il recipiente a pressione non verrà installato correttamente.
    2. Sollevare il collare e posizionarlo intorno ai bordi sporgenti dell'interfaccia del recipiente del reattore. Spostando delicatamente il colletto su di esso si tradurrà in una misura adeguata. Chiudere le serrature a scatto tenendo il collare in posizione.
    3. Fissare i bulloni di compressione seguendo un modello incrociato e aumentare la coppia in passi moderati fino a raggiungere il valore finale raccomandato dal produttore.
      NOTA: diversi sistemi di reattori ad alta pressione possono avere valori di coppia diversi.
    4. Infine, fissare i bulloni di compressione in senso orario.
  5. Installare il reattore ad alta pressione nel dispositivo di dondolo.
    NOTA: L'installazione del reattore ad alta pressione nel dispositivo a dondolo è descritta per un modello su misura prodotto presso l'Istituto federale per le geoscienze e le risorse naturali di Hannover, in Germania. Pertanto, l'installazione descritta è una linea guida generale per i dispositivi di progettazione comparabile.
    1. Montare il reattore con attenzione nel dispositivo di dondolo.
      NOTA: È meglio tenere il reattore ad alta pressione dalle parti di assemblaggio del blocco gage (ad esempio, manometro o viti del tubo di campionamento) mentre lo si abbassa nel dispositivo di dondolo.
    2. Fissare il reattore con due morsetti su un paio di viti lunghe.
    3. Posizionare le lavatrici su ogni vite e stringere i morsetti con i dadi a vite.
    4. Collegare le unità di controllo per la termocoppia, il trasduttore di pressione e l'elemento riscaldante.
      NOTA: È importante assicurarsi che tutti i fili siano di lunghezza sufficiente per il movimento a dondolo ed evitare il contatto con le superfici riscaldate.
    5. Far scorrere l'elemento riscaldante sopra il recipiente del reattore e stringere il lucchetto a vite.
      NOTA: L'acqua per pressurizzare il sistema viene prelevata da un serbatoio con una pompa ad alta pressione. Viene trasferito attraverso capillari in acciaio inox nel reattore ad alta pressione.
      NOTA: il dondolo del reattore ad alta pressione garantisce una miscelazione accurata del contenuto della cella di reazione (ad esempio, il gas, il fluido e tutte le fasi solide in esso). Una velocità di dondolo lenta è importante per evitare danni alla borsa d'oro da solidi in rapido movimento o da deformazioni a causa degli effetti di gravità sull'oro flessibile a temperature elevate. Il sistema a dondolo può ruotare di circa 180 gradi.

5. Avvio dell'esperimento

  1. Verificare se i limiti di temperatura e pressione nel software di monitoraggio sono impostati sui valori desiderati.
    NOTA: In questo esperimento sono stati impostati su 70 e 25 MPa.
  2. Eseguire un controllo delle perdite.
    1. Collegare il tubo di pressione, un capillare in acciaio inossidabile, alla testa del reattore.
    2. Aumentare la pressione alla pressione del bersaglio a intervalli distinti, controllando continuamente la perdita.
    3. Tenere costante la pressione fino a quando la portata della pompa è quasi pari a zero.
      NOTA: Attenzione che l'aria comprimibile e disciolta in acqua sia visibile per lungo tempo nelle letture di flusso sottili.
  3. Avviare il riscaldamento dopo un controllo delle perdite riuscito.
    1. Avviare la registrazione delle pompe di pressurizzazione.
    2. Regolare il set point per il riscaldamento al valore desiderato e avviare il riscaldamento con il software.
    3. Controllare regolarmente tutti i parametri e lo stato del sistema.
    4. Annullare l'inserire il tubo di pressione dopo aver raggiunto la temperatura di destinazione.
    5. Avviare il dispositivo di dondolo.

6. Campionamento del reattore ad alta pressione in modalità operativa

  1. Per prendere un campione, attaccare una siringa da 5 mL al connettore Luer Lock della valvola di campionamento nella parte superiore del reattore ad alta pressione.
  2. Aprire con attenzione la valvola e lasciare che il campione di liquido spinga nella siringa dalla pressione all'interno del reattore ad alta pressione. Chiudere la valvola dopo che il volume campionato raggiunge 1 mL. Staccare la siringa.
  3. Trasferire immediatamente i campioni nella siringa in un tubo da 2 mL in una cappa di fumi per la lavorazione.

7 . Analisi del campione di fluido

NOTA: Solo i passaggi per l'analisi della ferrozina fotometrica meno comune (ad esempio, sezione 7.1) sono descritti in dettaglio e sono menzionati nel video, perché gli altri passaggi sono procedure operative standard in microbiologia.

  1. Utilizzare un saggio ferrozina per determinare fotometricamente la concentrazione di ferroso disciolto (Fe2o(aq)) e ferro totale (Fetot)15.
    1. Preparare una serie di soluzioni standard ferrose sciogliendo quantità note di FeSO4,7 H2O in acqua.
    2. Mescolare 50 l di questi livelli standard con 1 mL di una soluzione ferrozina da 1 m.
      NOTA: La reazione della ferrozina con il ferro ferroso disciolto forma un complesso viola. L'intensità del colore è correlata alla concentrazione ferrosa di ferro.
    3. Stabilire una curva di calibrazione tra la concentrazione ferrosa di ferro e l'assorbimento del complesso ferro-ferrosa.
    4. Calcolare la concentrazione di ferro ferroso di un campione da due misurazioni parallele secondo la curva standard stabilita.
  2. Analizzare il valore del pH e il potenziale di ossidazione/riduzione (ORP) con misuratori digitali di pH/redox con elettrodi semimicropH e un elettrodo di cloruro d'argento, rispettivamente.
  3. Contare direttamente le cellule planctoniche utilizzando un microscopio luminoso con una camera Thoma.
  4. Studiare la morfologia cellulare mediante la microscopia elettronica a scansione (SEM).
    1. Filtrare le cellule planctoniche coltivate in condizioni diverse attraverso un filtro dimensione porosa 0,1,2 m.
    2. Disidratare i campioni con acetone e conservarli durante la notte a 4 gradi centigradi nel 90% di acetone.
    3. Asciugare i campioni asciugandoli e ricoprirli con grafite o oro.
    4. Esaminare i campioni con un microscopio elettronico a scansione delle emissioni di campo (FE-SEM) a 10 kV.

Representative Results

I risultati dell'esperimento del reattore ad alta pressione con la speciale cellula di reazione oro-titanio mostrano che la coltura mista microbica degli acidofili ossida vazolo e ridotto ferroso ferrosa(Figura 3).

In entrambe le condizioni di pressione di 1 bar o 100 bar, le colture hanno avuto una fase di ritardo quando sono cresciute nella cellula di reazione oro-titanio. Dopo tale periodo, si è verificato un rapido aumento della concentrazione di ferro ferroso da circa 9 mM a 31 mM nella coltura coltivata a 1 bar. Nel corso del tempo di incubazione di 22 giorni, 31 mM e 13 mM di ferroferro sono stati rilevati nei saggi a 1 bar e 100 bar, rispettivamente. Questo dimostra chiaramente che le cellule microbiche erano attive a 100 bar, ma la loro attività ferrica di riduzione del ferro era significativamente più bassa a una pressione elevata. Gli esperimenti di controllo abiotico condotti in tubi Hungate e bottiglie di siero non mostravano una riduzione ferrica del ferro a 1 bar e 100 bar.

Le immagini di microscopia elettronica a scansione (Figura 4) mostrano cellule a forma di asta coltivate in esperimenti a bassa e alta pressione. Nessun cambiamento significativo nella morfologia cellulare è stato osservato a 1 bar contro 100 bar. Tuttavia, la crescita cellulare è stata ovviamente inibita dalla pressione elevata, poiché il numero di cellule era 1,3 x 108 cellule / mL a 1 barra rispetto a 4,5 x 107 cellule / mL a 100 bar7. Questi dati sono comparabili con i test effettuati nei tubi Hungate7. Pertanto, la cellula di reazione flessibile oro-titanio stessa non ha avuto alcun effetto sulla crescita cellulare ed era adatta per i test di crescita microbica.

I risultati mostrano che i microrganismi di bioleaching sono attivi anche ad alta pressione di 100 bar, che è altamente rilevante per il biomining in situ perché tali condizioni si verificano in depositi di minerali profondi ad una profondità inferiore a 1.000 m7.

Figure 1
Figura 1: Panoramica delle parti della cellula di reazione. Dal basso verso l'alto: il sacchetto d'oro, il collare in titanio, la testa in titanio, la rondella, l'anello di compressione del titanio, il tubo di campionamento in titanio con ghiandole e collari inossidabili per le connessioni cono e filettate ad alta pressione su entrambi i lati, e la valvola in titanio con adattatore per il collegamento di una siringa Luer Lock. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Disegni dimensionali delle parti in titanio lavorate da aste di titanio di grado 2. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Cambiamenti delle concentrazioni di ferro ferroso nella cella di reazione oro-titanio con la coltura ferrosa ferrosa ferrosa ferrosa ferrosa ferrosa ferrosa ferrosa ferrosa ferrosa ferrosa ferrosa ferro-ossidante. Le cellule sono state coltivate anaerobicamente a 30 gradi centigradi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Morfologia della coltura ferrosa ferro-ossidante coltivata a 1 bar e 100 bar. Le cellule sono state coltivate anaerobicamente a 30 gradi centigradi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

Il metodo presentato per esperimenti ad alta pressione di reazioni microbiche all'interno di soluzioni acide era un potente strumento per simulare processi geomicrobiologici del sottosuolo profondo in un ambiente di laboratorio.

Ci sono numerose fasi di lavoro manuale coinvolti, alcuni dei quali richiedono particolare attenzione. Come nota generale, non deve essere utilizzata alcuna forza eccessiva per assemblare le singole parti della cella flessibile oro-titanio e la testa del reattore (sezioni 3 e 4). Se le specifiche del produttore (ad esempio, per la massima pressione, temperatura, coppia) vengono ignorate, può verificarsi perdite e/o guasti del materiale.

La pulizia delle parti in oro e titanio (sezione 2.2) è una fase di lavoro indispensabile, non solo per questo esperimento, ma soprattutto per esperimenti che coinvolgono reazioni (in-)organiche. I resti di precedenti esperimenti nella cellula d'oro possono causare reazioni indesiderate e quindi distorsioni dei risultati. Quando la cella oro-titanio assemblata è installata nella testa del reattore, è meglio lavorare in modo rapido e preciso, perché in questo momento piccole quantità di ossigeno potrebbero entrare nella cella d'oro. Chiudere la valvola di campionamento prima di lasciare il glovebox è una buona prima misura per ridurre al minimo lo scambio tra l'atmosfera ambientale con l'interno della cella d'oro.

Una volta che il reattore è posizionato nel dispositivo di dondolo, è importante impostare la velocità del movimento a dondolo a . Se il reattore ad alta pressione si muove troppo velocemente, la rottura della cellula d'oro può verificarsi a causa di effetti gravitazionali o dei bordi taglienti di sedimenti o campioni di roccia quando viene utilizzato.

Questo metodo può essere utilizzato in campi di ricerca aggiuntivi. La cella di reazione flessibile oro-titanio ha il potenziale per essere utilizzata per una serie diversificata di ricerche scientifiche9 studiando le reazioni a pressione e temperatura elevate e in fluidi o gas altamente corrosivi.

I microrganismi nel sottosuolo profondo a temperature superiori ai 70 gradi centigradi in presenza di superfici minerali possono stimolare la produzione di idrogeno molecolare o acidi organici come l'acetato anche sotto pressione elevata16. Questi prodotti, e altri composti, potrebbero indurre elevata attività microbica durante i processi di bioleaching in situ, oltre ai composti di zolfo studiati in questo studio.

Le applicazioni includono la determinazione della solubilità di gas e ioni nei fluidi acquosi, le reazioni geochimiche a condizioni dei sistemi di sfiato idrotermale17, la quantificazione della frazione isotopica18, reazioni geochimiche durante il CO 2 sequestro19, processi abiotici durante la formazione di petrolio e gas nelle rocce di origine20e reazioni microbiche a pressioni elevate nel sottosuolo21 come nel presente studio.

Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Ringraziamo Robert Rosenbauer (USGS, Menlo Park) nel condividere la sua esperienza sulle celle di reazione flessibili oro-titanio, e Georg Scheeder (BGR) per il suo contributo durante la fase iniziale di creazione del sistema modificato ad Hannover. Ringraziamo molti scienziati (tra cui Katja Heeschen, Andreas Risse, Jens Gràger-Trampe, Theodor Alpermann) utilizzando l'allestimenti di Hannover in numerosi progetti che hanno contribuito a piccoli miglioramenti lungo la strada e Christian Seeger per lo sviluppo del per i reattori ad alta pressione. Ringraziamo Laura Castro (Complutense University of Madrid) per le osservazioni SEM. E infine, vorremmo esprimere la nostra gratitudine a Nils W'lki per la produzione di questo video di alta qualità per l'articolo. Questo lavoro è stato sostenuto dal progetto BIOMOre (accordo di sovvenzione 642456) dell'Unione europea.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone Merck 100013
CaN2O6 Fluka 31218
Conax compression seal fittings Conax Technologies PG2-250-B-G sealant could be selected according to temperatures in experiment
Copper paste Caramba 691301
Copper paste CRC 41520
CoSO4x7H2O Sigma 10026-24-1
CrKO8S2x12H2O Roth 3535.3
CuSO4x5H2O Riedel de Haen 31293
Disposable cuvettes Sigma z330388
Ethanol absolute Roth 9065.3
FE-SEM JEOL model no. JSM-6330F
Ferrozine Aldrich 180017
Fe2(SO4)3x7H2O Alfa Aesar 33316
FeSO4x7H2O Merck 103965
Gold cell Hereaus GmbH manufactured according to dimensions supplied by customer
High-pressure reactor PARR Instruments model no. 4650 Series reactors from other vendors could be used, too
High-pressure syringe pump Teledyne ISCO DM-100
HCl Roth 6331.3
HNO3 Fluka 7006
H3BO3 Sigma B6768
KCl Sigma P9541
KH2PO4 Merck 104873
L-(+)-Ascorbic acid/Vitamin C Applichem A1052
Light microscope Leica DM3000
MgSO4x7H2O Merck 105886
(NH4)2SO4 Sigma A4418
NaMoO4x2H2O Sigma 331058
NaO3Sex5H2O Sigma 00163
NaO3V Sigma 590088
Na2SO4 Merck 106649
Na2WO4x2H2O Sigma 72069
NiSO4x6H2O Sigma 31483
Omnifix Luer BRAUN 4616057V
pH meter Mettler Toledo
Redox potential meter WTW ORP portable meter
Safe-Lock Tubes, 2 mL Eppendorf 0030120094
Serum bottle Sigma 33110-U
Spectrophotometer Thermo Scientific model no. GENESYS 10S
Sterican Hypodermic needle BRAUN 4657519
Stoppers Sigma 27234
Sulfur powder Roth 9304
Thoma Chamber Hecht-Assistent
Titanium parts of reaction cell Titan-Halbzeug GmbH 121-238 manufactured by workshop at BGR according to dimensions supplied from Titanium grade 2 rods from Titan-Halbzeug GmbH
Titanium valve Nova Swiss Technologies ND-5002
Whatman membrane filters nylon Sigma WHA7402004
ZnSO4x7H2O Sigma Z4750

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References

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Utilizzo di celle di reazione oro-titanio flessibili per simulare l'attività microbica dipendente dalla pressione nel contesto del biomining del sottosuolo
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Ostertag-Henning, C., Zhang, R., Helten, O., Weger, T., Schippers, A. Using Flexible Gold-Titanium Reaction Cells to Simulate Pressure-Dependent Microbial Activity in the Context of Subsurface Biomining. J. Vis. Exp. (152), e60140, doi:10.3791/60140 (2019).More

Ostertag-Henning, C., Zhang, R., Helten, O., Weger, T., Schippers, A. Using Flexible Gold-Titanium Reaction Cells to Simulate Pressure-Dependent Microbial Activity in the Context of Subsurface Biomining. J. Vis. Exp. (152), e60140, doi:10.3791/60140 (2019).

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