Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

النقل عاليه الكفاءة من الضامة الابتدائية مع في المختبر كتب mRNA

Published: November 9, 2019 doi: 10.3791/60143

Summary

الضامة ، وخاصه الضامة الاوليه ، هي تحديا لtransfect لأنها تتخصص في الكشف عن جزيئات من أصل غير الذات. ونحن نقدم وصفا للبروتوكول الذي يسمح بالنقل عاليه الكفاءة من الضامة الاوليه مع mRNA المتولدة من قوالب الحمض النووي مثل البلازميدات.

Abstract

الضامة هي خلايا الخلية المتخصصة في الكشف عن جزيئات من أصل غير الذات. ولهذه الغاية ، فهي مجهزه بمجموعه كبيره من مستقبلات التعرف علي النمط (PRRs). لسوء الحظ ، وهذا أيضا يجعل الضامة تحديا خاصا لtransfect كما الكاشف ترانسفيكشن والأحماض النووية المحولة غالبا ما يتم التعرف عليها من قبل PRRs كما غير الذاتي. ولذلك ، غالبا ما يؤدي التحويل في الضامة التنشيط وتدهور الأحماض النووية المقسمة أو حتى في الانتحار من الضامة. هنا ، ونحن وصف البروتوكول الذي يسمح النقل عاليه الكفاءة من الضامة murine الابتدائية مثل الضامة البريتوني (PM) والضامة نخاع العظم المشتقة (BMDM) مع mRNA في المختبر المنقولة من قوالب الحمض النووي مثل البلازميدات. مع هذا البروتوكول البسيط ، يتم تحقيق معدلات التحويل من حوالي 50-65 ٪ لل PM وحوالي 85 ٪ لشركه BMDM دون السمية الخلوية أو والاستمناع لاحظ. ونحن نوضح بالتفصيل جيل mRNA للتحويل من ثوابت الحمض النووي مثل البلازميدات واجراء التحويل.

Introduction

الضامة هي الخلايا البالعة التي تتخصص في الكشف ، وتناول والميكروبات المهينة ، والخلايا ابوتوتيك والحطام الخلوي. وعلاوة علي ذلك ، فانها تساعد علي تنسق الاستجابات المناعية عن طريق إفراز السايتوكينات والكيميائية وعن طريق تقديم المستضدات إلى خلايا T و B الخلايا. الضامة تلعب أيضا أدوارا هامه في العديد من العمليات الأخرى, مثل التئام الجروح, تصلب الشرايين, التورم والسمنة.

لتكون قادره علي الكشف عن جزيئات غير الذاتي مثل الأنماط الجزيئية المرتبطة بالممرض (PAMPs) والجزيئات خارج المكان مثل الأنماط الجزيئية المرتبطة الضرر (DAMPs) ، وقد تم تجهيز الضامة مع مجموعه كبيره من مستقبلات التعرف علي النمط (PRR)1. لسوء الحظ, هذا أيضا يجعل الضامة تحديا خاصا ل transfect2 كما الكاشف ترانسفيكشن3 والأحماض النووية المتحولة4,5,6,7 غالبا ما يتم التعرف عليها من قبل prrs كما غير الذاتي. لهذا السبب ، نقل الضامة باستخدام الأساليب الكيميائية أو الفيزيائية8 عاده ما يؤدي إلى تنشيط الضامة وتدهور الأحماض النووية المقسمة أو حتى في الانتحار الضام عن طريق الحمم البركانية ، وهو شكل من اشكال الموت المبرمجة الخلية التيتسببت بعد الاعتراف بالأمبير الخلوي النقل البيولوجي للبلاعم باستخدام الفيروسات مثل الفيروسات اللحمية أو لينتيفيروسيس كمتجات غالبا ما يكون أكثر كفاءه ، ولكن بناء هذه النواقل الفيروسيةيستغرق وقتا طويلا ويتطلب السلامة البيولوجية مستوي 2المعدات 10 ،11.

وهكذا ، علي الرغم من ان الضامة هي موضوع البحوث المكثفة ، ويعوق تحليل وظائفها علي المستوي الجزيئي لان واحده من أهم الاداات من البيولوجيا الجزيئية ، والتحول من الحمض النووي يبني للتعبير الخارجية لل البروتينات ، لا ينطبق بالبالكاد. وهذا غالبا ما يجبر الباحثين علي استخدام الضامة مثل خطوط الخلايا بدلا من الضامة حسن النية. وتشمل تطبيقات الحقن بالأحماض النووية التعبير عن الصيغ البروتينية المتحولة أو الموسومة ، والتعبير المفرط عن بروتين معين ، وأعاده التعبير عن البروتين في خلفيه الضربة القاضية والتعبير عن البروتينات من الأنواع الأخرى (مثل , [كري] للالطبيعيه أو مرشده [رنا] و كاس 9 ل يستهدف مورثه ضربه قاضيه).

هنا ، ونحن وصف البروتوكول الذي يسمح الانتقال كفاءه عاليه من (عاده من الصعب ترنسفكايشن) الضامة الاوليه ، وهذا هو murine الضامة البريتوني (PM) والضامة نخاع العظم المشتقة (bmdm) مع mrna المتولدة من قوالب الحمض النووي مثل البلازميدات. الأهم من ذلك ، في المختبر كتبت mrna التي تم إنشاؤها باستخدام هذا البروتوكول يحتوي علي النيونوسيدس المعدلة التي تحدث بشكل طبيعي 5-ميثيل-CTP والزائفة UTP التي تقلل من والاستمناع وتعزيز الاستقرار4،6،7،12،13. فضلا عن ذلك, ال 5 '-نهايات من ال في مختبره [مرنا] [دفوسفورلتد] بالفوسفاتيز قطبيه ان يمنع اعتراف ب ال [تلاعب-ي] مركبه14,15. هذا يقلل من الاعتراف المناعي الفطري لل في المختبر كتبت mRNA. مع شركائنا سهله لتنفيذ البروتوكول ، ومعدلات التحويل بين 50-65 ٪ (الضامة البريتوني (PM)) و 85 ٪ (BMDM) ويتم التوصل إلى حين ، الأهم من ذلك ، لا يوجد اي السمية الخلوية أو والاستمناع لاحظ. ونحن نوضح بالتفصيل ' 1 ' كيف يمكن ان تتولد من الحمض النووي الذي يسكت من الناحية المناعية لنقل العدوى من ثوابت الدنا مثل البلازميدات و (2) اجراء التحويل نفسه.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم تنفيذ عزل الضامة من الفئران وفقا لقانون حماية الماشية في ألمانيا وفقا للجنة الأخلاق في جامعه كولونيا.

ملاحظه: تنفيذ جميع الخطوات ارتداء القفازات. تنفيذ جميع الخطوات ترانسكشن تحت غطاء للتدفق الرقائقي لمنع تلوث الخلايا. قبل العمل مع mRNA ، تنظيف جميع الصكوك مثل الماصات وكل سطح مع 70 ٪ الايثانول و/أو السطحي RNAse المهينة (جدول المواد). تاكد من ان جميع أنابيب رد الفعل هي RNAse خاليه ومعقمه. استخدام المياه المعقمة فقط ، RNAase خاليه من أجل المخففات. استخدم بشكل حصري نصائح الماصة مع الفلاتر. تغيير نصائح الماصة بعد كل خطوه لضبط الماصات.

1. جيل من قالب الحمض النووي

ملاحظه: قالب الحمض النووي لل في المختبر النسخ mRNA باستخدام هذا البروتوكول يجب ان تحتوي علي تسلسل T7 بروموتور للسماح التحام من البوليميريز RNA. إذا كان البلازما التي تحتوي علي تسلسل الحمض النووي للبروتين من الفائدة بالفعل يحتوي علي تسلسل T7 بروموتور الموجهة بشكل صحيح مباشره المنبع من تسلسل الفائدة ، والعتب من البلازميد (انظر الخطوة 1.1.) يحتاج إلى ان يؤديها. والا ، ارفق T7 بروموتور إلى تسلسل الفائدة بواسطة تفاعل البلمره المتسلسل (PCR ، انظر الخطوة 1.2.).

  1. الT7 التي تحتوي علي البلازميدات المضادة للبروموتور
    1. Linearize البلازميدات بالفعل تحتوي علي تسلسل الموجهة بشكل صحيح T7 بروموتور عن طريق الهضم مع تقييد انزيم قطع المصب من توقف كودون من تسلسل الفائدة. والا ، فان النسخ لن تنتهي بشكل صحيح بعد تسلسل الفائدة.
      ملاحظه: فمن الأفضل لاستخدام الانزيمات تقييد ترك نهايات حاده أو 5 ' يتدلى.
    2. تاكيد العملية الكاملة لل البلازميد بواسطة الكهربائي هلام اجنشا من الحمض النووي الهضم ضد البلازما المهضومة.
    3. تنقيه الحمض النووي البلازميد البلازما قبل استخدامها كقالب الحمض النووي لفي المختبر mrna النسخ باستخدام مجموعه تنقيه الحمض النووي (جدول المواد).
  2. المرفق من T7 بروموتور بواسطة PCR
    1. استخدام التمهيدي إلى الامام الذي يحتوي علي المكونات التالية (في الترتيب المشار اليه من 5 ' إلى 3 '): حوالي 5 bp عشوائية المنبع من بروموتور (علي سبيل المثال ، GAAAT) ؛ التسلسل T7 بروموتور (تاتاكجاكتكاكتاتاج); اثنين اضافيه Gs لزيادة كفاءه النسخ (GG); الجزء المستهدف الخاص بالتسلسل الذي هو متماثل للتسلسل البلازميد المحيطة codon البداية.
      ملاحظه: وينبغي ان تتالف من: 3-6 bp المنبع من تسلسل kozak وبدء كودون, تسلسل kozak وبدء كودون (عاده gccacc atg g), 12-18 bp المصب من البداية كودون. إذا كان تسلسل الفائدة لا يحتوي بالفعل علي تسلسل KOZAK أو بدء codon ، ويمكن إرفاق هذه في هذه الخطوة ببساطه بما في ذلك لهم في تسلسل التمهيدي.
    2. حساب tm من التمهيدي إلى الامام فقط من خلال الأخذ في الاعتبار الجزء المتماثلة إلى تسلسل الهدف.
    3. لتقييم الدمامل/تشكيل دبوس الشعر استخدام تسلسل التمهيدي كله ، والتي يمكن ان تتجاوز بسهوله 50 bp.
    4. استخدام التمهيدي العكسي الموجود في مكان ما في المصب من توقف codon.
      ملاحظه: إذا كان تسلسل الفائدة لا يحتوي بالفعل علي توقف codon ، فانه يمكن إرفاقها في هذه الخطوة ببساطه بما في ذلك في تسلسل التمهيدي.
    5. استخدام الإشعال إلى الامام والعكس لتنفيذ PCR باستخدام البوليميرات عاليه الدقة مع التدقيق اللغوي (جدول المواد).
    6. تاكيد الجيل من منتج واحد وحجم الاتساع بواسطة الكهربائي هلام اجنشا (علي سبيل المثال ، استخدام 1 ٪ هلام اجنشا والتيار المستمر V 100).
    7. تنقيه المنتج PCR قبل استخدامها كقالب الحمض النووي لل في المختبر mRNA النسخ باستخدام مجموعه تنقيه الحمض النووي.

2. جيلنا

  1. تذويب جميع مكونات مجموعه النسخ في المختبر mRNA (انظر جدول المواد). دوامه لمده 5 ليالي وتدور لأسفل لمده 2 s في 2,000 x g. يحفظ علي الثلج حتى الاستخدام.
  2. اعداد مزيج التفاعل لفي المختبر mRNA النسخ في أنبوب الطرد المركزي 0.5 mL في الترتيب التالي (الحجم الإجمالي لل 40 μL): 20 μL من 10x اركا/NTP مزيج (المدرجة في المختبر في عده النسخ mRNA) ؛ 0.25 ميكرولتر من 5-ميثيل-CTP (التركيز النهائي (نادي) هو 1.25 mM ؛ 50 ٪ من إجمالي CTP) ؛ 0.25 μL من الزائفة UTP (نادي هو 1.25 mM ؛ 50 ٪ من مجموع UTP) ؛ X μL من قالب الحمض النووي; 2 μL من T7 الحمض الريبي النيبالي البلمره مزيج (المدرجة في المختبر في عده النسخ mRNA) ؛ Y μL من RNAse خاليه H2O.
    ملاحظه: X هي وحده تخزين تحتوي علي 1 ميكروغرام علي الأقل من الحمض النووي. علي سبيل المثال ، 1.6 μL من 625 ng/μL الأسهم الحل. Y هو حجم الغيار إلى الحجم الإجمالي 40 μL.
  3. دوامه لمده 5 ليالي وتدور لأسفل لمده 2 s في 2,000 x g. احتضان في 37 درجه مئوية لمده 30 دقيقه في 400 دوره في الدقيقة علي خلاط حراري للنسخ في المختبر.
  4. ثم ، أضافه 2 μL من DNase انا مباشره في مزيج التفاعل لأزاله الحمض النووي القالب. دوامه لمده 5 ليالي وتدور لأسفل لمده 2 s في 2,000 x g.
  5. احتضان في 37 درجه مئوية لمده 15 دقيقه في 400 دوره في الدقيقة علي خلاط حراري. اتخاذ قسامه من 2 μl لهلام التحكم (الخطوة 3.3) وتخزين في-80 درجه مئوية.
  6. لبولي (A) المخلفات ، أضافه المكونات التالية مباشره في مزيج رد فعل السابقة (إلى حجم النهائي من 50 μL): 5 μL من بولي (A) العازلة تفاعل البلمره و 5 μL من بولي (A) البوليميريز (سواء المدرجة في المختبر في عده النسخ mRNA). دوامه لمده 5 ليالي وتدور لأسفل لمده 2 s في 2,000 x g.
  7. احتضان المزيج في 37 درجه مئوية لمده 30 دقيقه في 400 دوره في الدقيقة علي ثيرموميكسير. اتخاذ قسامه من 2 μl لهلام التحكم (الخطوة 3.3) وتخزين في-80 درجه مئوية.
  8. لأزاله الفوسفات من 5-نهايات من mRNA ، أضافه المكونات التالية مباشره في مزيج رد الفعل السابق (إلى حجم النهائي من 60 μL): 3 μL من RNAse خاليه H2O ؛ 6 μL من 10x القطب الجنوبي الفوسفاتيز رد فعل العازلة; 3 μL من الفوسفاتيز القطب الجنوبي (15 وحده ل 60 حجم التفاعل μL). دوامه لمده 5 ليالي وتدور لأسفل لمده 2 s في 2,000 x g.
  9. احتضان المزيج في 37 درجه مئوية لمده 30 دقيقه في 400 دوره في الدقيقة علي خلاط حراري.
  10. الحرارة-inactivate الفوسفاتيز القطب الجنوبي من قبل الحضانة في 80 درجه مئوية لمده 2 دقيقه.
    ملاحظه: من الناحية المثالية ، استخدم خلاط حراري منفصل ، لا تنتظر حتى يصل الخلاط الأول إلى درجه الحرارة المطلوبة.

3. mRNA تنقيه

  1. تنقيه في المختبر كتبت mRNA باستخدام مجموعه مخصصه لتنقيه الحمض الريبي النيبالي (جدول المواد).
    1. أضافه X μL من حل التملص إلى مزيج رد فعل mRNA من الخطوة 2.10. مزيج من خلال عكس 5 مرات. أضافه 300 μL من التركيز حل الربط. اخلطه بواسطة الماصات اللطيفة 5 مرات.
      ملاحظه: X هو حجم الغيار إلى حجم إجمالي 100 μL. علي سبيل المثال ، أضافه 40 μl الحل الشطف إلى 60 مزيج رد فعل mrna.
    2. أضافه 100 μL من الايثانول خاليه من RNAase. اخلطه بواسطة الماصات اللطيفة 5 مرات.
    3. ضع عمود عامل تصفيه في أحد أنابيب التجميع التي تم توفيرها. انقل مزيج تفاعل mRNA برفق إلى مركز الفلتر دون لمس الفلتر. أجهزه الطرد المركزي في 15,000 x g ل 1 دقيقه في درجه حرارة الغرفة (RT).
    4. ارفع عمود الفلتر بعناية وتخلص من التدفق في أنبوب التجميع. ضع عمود الفلتر مره أخرى في نفس أنبوب التجميع.
    5. أضافه 500 μL من محلول الغسيل (لا ننسي لأضافه 20 مل من الايثانول خاليه من RNAase قبل استخدام محلول الغسيل للمرة الاولي).
    6. جهاز الطرد المركزي في 15,000 x g لمده دقيقه واحده في RT. كرر الخطوات 3-1-4-3.1.6 لغسل مره أخرى.
    7. الطرد المركزي باقصي سرعه (17,900 x g) لمده دقيقه واحده في RT لأزاله اي السوائل المتبقية من عمود الفلتر. خذ بعناية عمود الفلتر من أنبوب التجميع. ضع عمود الفلتر في أنبوب تجميع جديد.
    8. أضافه 50 μl من المخزن المؤقت الشطف إلى مركز التصفية دون لمس عامل التصفية. احتضان في 65 درجه مئوية لمده 10 دقيقه علي خلاط حراري.
    9. الطرد المركزي في 15,000 x ز لمده دقيقه واحده في RT. قم بازاله عمود عامل التصفية وتجاهله.
  2. قياس تركيز ونقاء mRNA التي لا يمكن التملص منها ، علي سبيل المثال ، باستخدام مقياس الطيف الطيفي لقياس الامتصاص في 260 و 280 نانومتر.
    ملاحظه: A260/A280 نسبه 1.8-2.1 يدل علي mRNA عاليه النقاء.
  3. التحقق من وجود منتج واحد ، وتصحيح طول النص وبولي (ا) المخلفات عن طريق تحليل قسامات من الخطوات 2.5 و 2.7 بواسطة اجبرز هلام الكهربائي تحت ظروف التعتيم (علي سبيل المثال ، استخدام 1.2 الهلام الذي يحتوي علي 20 مم التي تحتوي علي 10 ملم 3-(ن-مورتولينو) حمض بروبانيسولفونيك [MOPS] ، خلات الصوديوم 5 ملم ، 1 مم أدتا و 20 ٪ الفورمالديهايد وتشغيل في 20 مم MOPS ، 5 مم خلات الصوديوم ، 1 مم أدتا و 0.74 ٪ الفورمالديهايد في 100 V ثابت الحالي).
  4. تخزين mRNA تنقيه في أنبوب الشطف في-80 درجه مئوية حتى الانتقال. إذا كان استخدام كميات منخفضه فقط من mrna للتحويل ثم قسامه علي mrna لتجنب دورات التجميد المتكررة الذوبان.
    ملاحظه: يمكن تخزين mrna في-80 درجه مئوية لمده 1 سنه.

4. اعداد الضامة

  1. موت ببطء C57/BL6 الفئران (استخدام الفئران من نفس الجنس ومن 6-24 أسابيع من العمر) عن طريق خلع عنق الرحم.
    ملاحظه: يمكن استخدام نفس الفئران لعزل PM (الخطوة 4.2) وتوليد BMDM (الخطوات 4.3 و 4.4). لعزله من PM استخدام اثنين علي الأقل من الفئران. ان فقط [بMDM] ان يكون خلقت واحده فاره عاده كافيه.
  2. الإثراء المناعي للبلضام الصفاقي.
    1. ملء حقنه 10 مل مع 0.9 x 40 مم قني مع 8 مل من الجليد الباردة الفوسفات-مخزنه المالحة (تلفزيوني) و 2 مل من الهواء. مسح التجويف البريتوني مع تلفزيوني. سيشكل الهواء فقاعه ان يقلل تسرب من ال [ببس].
    2. جمع بسرعة غسل البريتوني مع نفس الحقنه ونقل إلى أنبوب طرد المخروطية مل 50. الجمع بين الخلايا الصفاقي من الفئران متعددة إذا لزم الأمر. إبقاء تعليق الخلية علي الجليد.
    3. تعليق خليه الطرد المركزي في 650 x g لمده 5 دقائق في 4 °c. تجاهل ماده طافي وأعاده تعليق بيليه الخلية في 5 مل من 0.2 ٪ nacl ل 30 ثانيه لخلايا الدم الحمراء lyse.
    4. أضافه 5 مل من 1.6 ٪ كلوريد الصوديوم إلى حجم إجمالي من 10 مل لأعاده تكوين الظروف متساوي الحركة. جهاز الطرد المركزي في 650 x g لمده 5 دقائق في 4 °c.
    5. 292.5 97.5 ).
    6. أضافه 2.5 μL من الخرز المغناطيسية مترافق إلى الأجسام المضادة CD11b محدده لكل 97.5 μL من تعليق الخلية (علي سبيل المثال ، أضافه 7.5 μL إلى 292.5 μL).
    7. احتضان علي الجليد لمده 15 دقيقه في 150 لفه في الدقيقة علي شاكر المدارية.
    8. تعليق خليه الطرد المركزي في 650 x g ل 5 دقيقه في 4 °c ، وتجاهل ماده طافي وأعاده تعليق بيليه الخلية في 1 مل من المخزن المؤقت للرصد والاشراف.
    9. أضافه 4 مل من المخزن المؤقت للرصد والاشراف إلى حجم إجمالي من 5 مل وغسل الخلايا عن طريق الأنابيب بلطف صعودا وهبوطا ثلاث مرات.
    10. كرر الخطوات 4.2.8 و4.2.9 مرتين إضافيتين لما مجموعه ثلاث خطوات للغسيل.
    11. خلال خطوات الغسيل وضع عمود LS في فاصل الخلايا المغناطيسية (انظر جدول المواد). شطف العمود مع 3 مل من المخزن المؤقت للرصد والاشراف.
      ملاحظه: تجنب اي فقاعات لان هذه قد تسد العمود.
    12. أعاده تعليق بيليه الخلية في 1 مل من المخزن المؤقت للرصد والاشراف. أضافه 3 مل من المخزن المؤقت للرصد والاشراف إلى حجم إجمالي من 4 مل ، ومزيج من الأنابيب صعودا وهبوطا ثلاث مرات.
    13. انقل 4 مل من تعليق الخلية إلى عمود LS المغسول.
      ملاحظه: مره أخرى ، تجنب اي فقاعات لان هذه قد تسد العمود.
    14. انتظر حتى يصبح خزان العمود فارغا تماما. لا تقم باضافه سوائل اضافيه حتى يتوقف العمود عن التنقيط.
    15. أضافه 3 مل من المخزن المؤقت للرصد والاشراف علي العمود. ثم ، انتظر حتى خزان العمود فارغ تماما. كرر الخطوة 4.2.15 مرتين إضافيتين.
    16. وضع العمود LS في أنبوب طرد المخروطية 15 مل. تطبيق 5 مل من المخزن المؤقت للرصد والاشراف علي العمود. الانتظار حتى 2 مل من السوائل قد مرت من خلال العمود ، ثم استخدام المكبس لدفع بلطف الجزء المتبقي في الأنبوب.
    17. تعليق خليه الطرد المركزي في 650 x g ل 5 دقيقه في 4 °c وتجاهل supernatant.
    18. أعاده التعليق بيليه الخلية في 1 مل من DMEM تستكمل مع 10% الحرارة--الجنين الساق المنشط المصل (FCS) (DMEM + FCS).
    19. تحديد عدد الخلايا القابلة للحياة عن طريق العد في الحل التريبين الأزرق في غرفه العد نيوبوير وخلايا البذور في DMEM + FCS في لوحات الثقافة.
      ملاحظه: بذره [م] في كثافة من 100,000 خلايا/بئر في مسطحه [ميكروتر] قعر لوحه. لا تستخدم الانسجه المعالجة الثقافة ألواح كما لا يمكن فصل PM من هذه. استخدام لوحات غير معالجه بدلا من ذلك.
  3. جيل من BMDM
    1. أزاله الجلد والعضلات من الساقين الخلفيتين باستخدام زوج من المقص. اغسل كل ساق بالغمر القصير في 70% الايثانول.
    2. فصل الساقين وفتح كلا طرفي عظم الفخذ والساق عن طريق قطع مع مقص.
    3. ملء حقنه 5 مل مليئه 0.6 مم × 30 ملم قني مع 5 مل من اندوتوكسين منخفض جدا (vle) rpmi 1640 ومسح نخاع العظم من العظام المفتوحة في طبق الثقافة.
    4. الجمع بين نخاع العظم من الفئران متعددة إذا لزم الأمر عن طريق تكرار الخطوات 4.3.3. نقل نخاع العظم إلى أنبوب طرد المخروطية 50 mL.
    5. الطرد المركزي النخاع العظمي تعليق في 650 x g ل 5 دقيقه في 4 °c وتجاهل supernatant.
    6. أعاده تعليق بيليه الخلية في 5 مل من خليه الدم الحمراء تحلل العازلة (8.3 ٪ NH4Cl ، 0.1 M تريس) واحتضان لمده 5 دقائق في RT لlyse خلايا الدم الحمراء.
    7. الطرد المركزي تعليق الخلية في 650 x g في 4 درجه مئوية لمده 5 دقيقه وتجاهل supernatant.
    8. أعاده تعليق الخلية بيليه في 1 مل من vle rpmi 1640 المتوسطة المضافة مع 10 ٪ FCS ، 1 ٪ البنسلين/ستربتوميسين ، 1 ٪ hepes ، 1 ٪ بيروفات الصوديوم و 10 نانوغرام/مل المؤتلف الضامة مستعمره عامل تحفيز (M-السائل الدماغي الشوكي) (rpmi + + + +).
    9. أضافه 4 مل منrpmi + + + + + إلى حجم إجمالي من 5 مل.
    10. اعداد 5 92 مم × 16 مم غير المعالجة اطباق بيتري مع الحدب (انظر جدول المواد) لكل الماوس عن طريق التنضيد 7 مل من rpmi + + + + + المتوسطة في كل طبق.
    11. نقل 1 مل من محلول الخلية إلى 5 اطباق الثقافة المعدة واحتضان في 37 درجه مئوية و 5 ٪ CO2.
    12. بعد 4 أيام ، تغذيه الخلايا عن طريق أضافه 4 مل من RPMI + + + + +. بعد 6-7 أيام ، يتم تمييز خلايا نخاع العظم تماما في BMDM.
  4. حصاد BMDM
    1. أزاله المتوسطة تماما من الاطباق الثقافية. أضافه 5 مل من الحارة 0.2 mM أدتا في الاذاعه التلفزيونية لكل طبق.
    2. كشط برفق لوحه كامله مع مكشطه خليه لفصل BMDM. الجمع بين تعليق الخلية في أنبوب طرد المخروطية 50 mL.
    3. اغسل جميع الاطباق الخمسة مره أخرى. استخدام نفس الحجم من 5 مل من الحارة 0.2 mM أدتا في الاذاعه التلفزيونية لجميع الاطباق 5. الجمع بين هذا التعليق الخلية مع واحد من الخطوة السابقة.
    4. الطرد المركزي تعليق الخلية في 650 x g ل 5 دقيقه في 4 درجه مئوية وتجاهل supernatant.
    5. أعاده تعليق بيليه الخلية في 1 مل من vle rpmi 1640 المتوسطة المضافة مع 10 ٪ FCS ، 1 ٪ hepes ، 1 ٪ بيروفات الصوديوم و 10 نانوغرام/مل المؤتلف M-السائل الدماغي الشوكي ولكن لا المضادات الحيوية (rpmi + + + +).
    6. تحديد عدد الخلايا القابلة للحياة عن طريق العد في الحل التريبين الأزرق في غرفه العد نيوبوير وخلايا البذور في rpmi + + + + في لوحات الثقافة.
      ملاحظه: البذور bmdm في كثافة من الخلايا 50,000/الحد الأقصى بشكل جيد في لوحه عيار مكروي أسفل مسطح. لا تستخدم لوحات الانسجه المعالجة الثقافة كما BMDM بالبالكاد يمكن فصلها عن هذه. استخدام لوحات غير معالجه بدلا من ذلك.

5. انتقال الضامة مع mRNA

  1. حساب الحجم المطلوب من المخزن المؤقت للتحويل mRNA.
    ملاحظه: حجم المخزن المؤقت النقل mRNA المطلوبة يعتمد علي حجم جيد: استخدام 200 μL للتحويل في لوحه 6-حسنا ، 100 μL في لوحه 12 بئر وهلم جرا. دائما أضافه حجم الغيار قليلا بسبب فقدان الأنابيب (ولكن ليس كثيرا ، لمنع التخفيف لا لزوم لها من mRNA). علي سبيل المثال ، استخدم 450 μL بدلا من 4 × 100 μL = 400 μL إلى transfect في 4 ابار من لوحه 12 بئر.
  2. حساب الحجم المطلوب من الكاشف العابر mRNA. يتم أضافه كاشف النقل mRNA بنسبه 1:50. علي سبيل المثال ، مطلوب 9 μL من الكاشف النقل mRNA لحجم النهائي من 450 μL.
  3. حساب المبلغ الإجمالي لل mRNA المطلوبة. لا يقل عن 100 ng لكل 100,000 الضامة مطلوبه لنقل كفاءه ، 200 ng يعمل بشكل أفضل (علي سبيل المثال ، 800 ng mRNA إلى transfection 400,000 الضامة).
    1. مضاعفه الكمية المحسوبة من mRNA المطلوبة مع العدد الإجمالي لآبار التي يجب ان يتم نقلها (علي سبيل المثال ، 4 الآبار مع 400,000 الضامة كل: 4 × 800 ng = 3,200 ng mRNA مطلوب في المجموع لجميع الآبار). علي سبيل المثال ، إذا كان سهم mRNA الخاص بك هو 426.8 ng/μL ، فانه من الضروري 7.49 μL للحصول علي التحويل الأمثل ل 4 ابار مع 400,000 الضامة لكل منهما.
  4. أضافه الحجم المحسوب من المخزن المؤقت نقل mRNA (الخطوة 5.1.) ناقص وحدات التخزين لكاشف النقل mRNA (الخطوة 5.2) و mRNA (الخطوة 5.3) إلى أنبوب رد فعل. علي سبيل المثال ، 450 μl-9 μl-7.49 μL = 433.51 μL.
  5. ذوبان الأسهم mRNA ومزجها بالتقليب لطيف من أنبوب التملص. أضافه الحجم المحسوب من mRNA (الخطوة 5.3) إلى أنبوب رد الفعل مع العازلة رد فعل mRNA (في المثال المعروض أعلاه: 7.49 μL في 433.51 μL).
  6. دوامه لمده 5 ليالي وتدور لأسفل لمده 2 s في 2,000 x g.
  7. دوامه كاشف النقل mRNA ل 5 ليالي وتدور لمده 2 ليالي في 2,000 x ز.
  8. أضف الحجم المحسوب لكاشف النقل mRNA (الخطوة 5.2) إلى أنبوب التفاعل الذي يحتوي علي المخزن المؤقت لناقل الحركة mRNA و mRNA (في المثال المعروض أعلاه: 9 μL من كاشف النقل mRNA).
  9. دوامه مزيج التحويل لمده 5 ليالي وتدور لمده 2 ليالي في 2,000 x g.
  10. احتضان لمده 15 دقيقه في RT.
  11. في الوقت نفسه, استبدلت الثقافة وسط من الضامة مع طازجه, دافئه ثقافة وسط (رايت خطوات 4.2.18. و 4.4.5).
  12. بعد الخطوة حضانة 5.10 ، أضافه مزيج التحويل إلى الآبار التي تحتوي علي الضامة في حجم مناسب لحجم البئر (انظر الخطوة 5.1). أضف مزيج القطرات في دائره من الخارج إلى وسط البئر.
  13. صخره بلطف لوحه ، أولا في العمودي ومن ثم في اتجاه أفقي لضمان توزيع موحد لمزيج ترانسكشن في البئر. ثم ، احتضان في 37 درجه مئوية و 5 ٪ CO2. سيبدا توليف البروتين المرمز بواسطة mRNA المقطع بعد فتره وجيزة من الانتقال. للحصول علي أفضل النتائج ، احتضان لمده 6 ساعات علي الأقل.
  14. بعد الحضانة ، وتحليل كفاءه النقل عن طريق (المناعي) المجهر الفلوري ، تدفق الخلوية أو المناعة16، أو استخدام الضامة المقسمة للتجربة الاختيار.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

لقد استخدمنا بنجاح هذا البروتوكول لتوليد mRNA الترميز للعلم الموسومة نيمو والمتغيرات IKKβ لتحويل الضامة الاساسيه16. الترميز البلازميدات للعلم--الموسومة من نوع البرية (نيموWT) و C54/347a متحولة نيمو (نيموC54/374a) (انظر جدول المواد) تحتوي بالفعل علي T7 بروموتور في الاتجاه الصحيح (الشكل 1ا). التالي ، كان علينا فقط ان جعل البلازميدات لتوليد قوالب الحمض النووي للنسخ في المختبر. لهذه الغاية ، تم هضم 10 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد مع 5 μl xbal مما ادي إلى الحد من البلازميد بسبب قطع واحده 3 ' من codon توقف. تم التحقق من الانتهاء الكامل للحمض النووي البلازميد من قبل الكهربائي هلام اجبرز (الشكل 1ب).

الترميز البلازميدات للعلم--الموسومة من نوع البرية (IKKβWT) و S177/181e متحولة ikkβ (IkkβS177/181e) لا تحتوي علي T7 بروموتور. ولذلك ، قمنا بإرفاق T7 بروموتور من قبل PCR لتوليد قوالب الحمض النووي للنسخ في المختبر (الشكل 2ا). تم التحقق من توليد منتج PCR محدده ، اي منتج واحد من الحجم الصحيح ، من قبل الكهربائي هلام اجبرز (الشكل 2ب).

بعد النسخ في المختبر باستخدام قوالب الحمض النووي الخاصة بها ، ونحن التحقق من جيل واحد mrna المنتج من الحجم الصحيح وبولي (a) المخلفات من قبل الكهربائي هلام الاغاروز تحت ظروف النحت (الشكل 3).

للتحقق من ان mRNA التي تم إنشاؤها باستخدام هذا البروتوكول لا تمكن من نقل الضامة الاساسيه (انظر الشكل 4ا ، ب لتحليلات التدفق الخلوي للتخصيب المناعي المغناطيسي لل PM وحاله التمايز من bmdm) ، قمنا بإنشاء ترميز Mrna ل egfp (الشكل 5ا) 100,000 PM أو 50,000 bmdm لكل بئر من لوحه عيار مكروي غير المعالجة تم نقلها مع 50 ، 100 أو 200 ng من الجبهة الاشتراكية السريلانكية لمده 6 أو 9 أو 24 ساعة. في كل من PM و BMDM ، يمكن الكشف عن مستويات عاليه من التعبير eGFP في 6 ساعة بعد التحويل. وزاد معدل النقل بمقدار الكمية المحولة من mRNA وكان اعلي بالنسبة ل200 ng mRNA (الشكل 6ب ، ج). بالنسبة لل PM ، بلغ معدل التحويل حوالي 50-65 ٪ في 6 إلى 9 ساعة بعد التحويل (الشكل 6ب). عند 24 ساعة بعد التحويل ، كان معدل التحويل اقل بكثير مما يشير إلى انتهاء التعبير eGFP. التالي ، لا ينبغي تحويل الساعة بين عشيه وضحيها. بالنسبة لشركه BMDM ، بلغ معدل التحويل حوالي 80-85% (الشكل 6ج). وكان انخفاض معدل التحويل بعد 24 ساعة اقل وضوحا في BMDM. التالي ، يمكن تحويل BMDM بين عشيه وضحيها. في كل من PM (الشكل 6D ، E) و bmdm (الشكل 6F ، G) ، زاد مستوي التعبير من egfp في الخلايا المقسمة بطريقه تعتمد علي الوقت والجرعة. الأهم من ذلك ، فان اجراء التحويل لم يكن للحث علي موت الخلايا الليتيك أو ابوتوتيك كما لم يكن هناك زيادة في بروبيديوم يوديد-إيجابي (PI) أو الملحق في الضامة V-الايجابيه بعد العدوى (الشكل 7ا ، ب).

تم تحليل كفاءه التحويل من الترميز mRNAs لعلم-الموسومة نيمو أو IKKβ المتغيرات عن طريق المجهر المناعي. 300,000 م في بئر من 12 بئر لوحه تم نقلها مع 300 ng من mRNA ذات الصلة ل 6 ح. وكان معدل التحويل حوالي 60 ٪ لنيمو Mrna وحوالي 55 ٪ ل IKKβ Mrna (الشكل 8ا ، ب). التالي ، كانت معدلات التحويل الخاصة بهم مماثله للمعدلات الخاصة بالتحويل العابر للحدود التي تشير إلى معدل تحويل عام يبلغ حوالي 55% لفتره المساء.

وقد استخدمنا أيضا هذا البروتوكول لتوليد الترميز mRNA ل Cre للالطبيعيه. الانتقال من 400,000 BMDM من نيموflox/flox الفئران17 في بئر من 12-بئر لوحه مع 400 ng من Cre للالطبيعيه mrna أسفرت عن استنفاد كامله تقريبا للبروتين نيمو بعد 48 h (الشكل 9) تشير إلى النقل كفاءه عاليه من bmdm.

ولم تقم الشركة بإفراز اي كميات قابله للكشف من IL-1β و IL-6 و TNF بعد التحويل (الشكل 10ا ، ب). وعلاوة علي ذلك ، لم يتم تنشيط NF-kB و MAPK مسارات الإشارات بعد التحويل16 مشيرا إلى ان اجراء ترانسكشن لا ينشط الإشارات التهابيه. كما اننا لم نلاحظ اي تعديلات وظيفية من الضامة المقسمة بالمقارنة مع الضامة غير المحولة16.

Figure 1
الشكل 1: البلازميدات الترميز نيمو الذي يحتوي بالفعل علي T7 بروموتور في الاتجاه الصحيح. (ا) مقتطف تسلسل من الترميز البلازميد للعلم-الموسومة نيموWT أو نيموC54/347A. A T7 مروج في الاتجاه الصحيح وقريبه من تسلسل kozak وبدء كودون موجود بالفعل. المنطقة T7 بروموتور ، وتسلسل الترميز (الاقراص المدمجة) للعلامة العلم و نيمو ، والبداية ووقف المخطوطات وموقع التقييد للحصول علي الاذن مع XbaI هي مرمزه بألوان. (ب) الممثل 1 ٪ هلام اجنشا تظهر البلازميدات قبل وبعد الاذن مع اكسبال ؛ تم تحميل 1 μl من غير المعالجة ، خطي أو تنقيه الحمض النووي البلازميد الحمضية لكل حاره. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: T7 الملحق الحركي إلى البلازميدات ترميز IKKß بواسطة PCR. (ا) مقتطف تسلسل من الترميز البلازميد للعلم-الموسومة ikkβWT أو ikkβS177/181e. البلازميدات لا تحتوي علي T7 بروموتور مناسبه ، والتي يتم إرفاقها بالتالي من قبل PCR. الموقع والتوجه وتسلسل التمهيدي إلى الامام (التي تحتوي علي تسلسل T7 بروموتور ليتم اضافتها) ويشار إلى التمهيدي العكسي من قبل الأسهم. المنطقة T7 بروموتور ، والأقراص المدمجة للعلامة العلم و IKKβ وبداية ووقف المخطوطات هي مرمزه بألوان. (ب) التمثيلية 1 ٪ هلام التحقق من جيل من منتج PCR واحد من الحجم الصحيح باستخدام الإشعال المشار اليها أعلاه. تم تحميل 1 μL من المنتج PCR المنقي لكل حاره. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: تركيب mRNA من نيمو-و IKKβ-ترميز قوالب الحمض النووي. (ا) التمثيل التمثيلي 1.2 ٪ هلام اجنشا تحتوي علي 0.7 ٪ الفورمالديهايد تظهر mrna تنقيه من نيمو و IKKβ يبني قبل وبعد بولي (ا) المخلفات. تم تحميل 2 μL من نيموwt، نيموC54/347a، ikkβWt و IkkβS177/181e mrna لكل حاره. وقد تم تحميل 32 μL لأسانا سلم لتحديد طول الحمض الريبي النيبالي. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: تحليلات التدفق الخلوي للتخصيب المناعي المغناطيسي لل PM وحاله تمايز BMDM. (ا) تم تحليل النسبة المئوية من F4/80 +/cd11b + PM في الغسيل الصفاقي قبل وبعد الإثراء المناعي بواسطة قياس التدفق الخلوي. (ب) التعبير عن F4/80 و CD11b من قبل bmdm بعد 6 أيام من التمايز تم التحقق منها من قبل الخلوي التدفق. 10,000 أو 5,000 تم حساب الخلايا لكل عينه ، علي التوالي. وتظهر البيانات كما يعني ± SEM من ن = 3 تجارب مستقله ، لكل منهما. * P < 0.05 ، * * p < 0.01 ، * * * p < 0.001 و * * * * p < 0.0001 بواسطة t-اختبار الطالب. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: mRNA التوليف مع بولي (ا) المخلفات من eGFP. (ا) مقتطفات التسلسل من الترميز البلازميد ل egfp. لا يحتوي البلازميد علي T7 بروموتور مناسبه ، والتي تعلق بالتالي من قبل PCR. الموقع والتوجه وتسلسل التمهيدي إلى الامام (التي تحتوي علي تسلسل T7 بروموتور ليتم اضافتها) ويشار إلى التمهيدي العكسي من قبل الأسهم. المنطقة T7 بروموتور ، والأقراص المدمجة ل eGFP والبداية ووقف المخطوطات هي مرمزه بألوان. (ب) الممثل 1 ٪ هلام اجنشا تظهر السعه المنقية بعد PCR باستخدام الإشعال المشار اليها أعلاه. تم تحميل 1 μL من المنتج PCR المنقي لكل حاره. (ج) التمثيل التمثيلي 1.2 ٪ هلام اجنشا تحتوي علي 0.7 ٪ الفورمالديهايد تبين mrna تنقيه من egfp قبل وبعد بولي (ا) المخلفات. تم تحميل 2 μL من الجبهة الاشتراكية السريلانكية لكل حاره. وقد تم تحميل 32 μL لأسانا سلم لتحديد طول الحمض الريبي النيبالي. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: الانتقال عالي الكفاءة لكل من الضامة الصفاقيه و BMDM مع mRNA eGFP. وقد حضنت الضامة ل 6, 9 أو 24 ح مع 50, 100 أو 200 ng من المعقدة المركب إلى jetMESSENGER أو مع jetMESSENGER وحدها (وهميه) ومن ثم تحليلها عن طريق تدفق الخلوي. (ا) استراتيجية الصب المستخدمة لتعريف السكان من الضامة قابله للحياة ، egfp القابلةللاستمرار + الضامة وPI + (اي ، ميت) الضامة. وتظهر البيانات التمثيلية للتحويل مع 200 ng mRNA ل 6 ح. (ب ، ج) تم تحديد معدلات التحويل من (ب) PM و (C) bmdm عن طريق تحليل النسبة المئوية للخلايا الايجابيه القابلة للاستمرار من قبل التدفق الخلوي (n = 5-7 و n = 4-5 التجارب المستقلة ، علي التوالي). (مد-زاي) وقد تم تحديد مستويات التعبير من eGFP من خلال تحليل الكثافة المتوسطة (المؤسسة) من القابلة للاستمرار (D) pm و (F) bmdm والسكان الفرعيين الايجابيه والايجابيه لل (ه) م و (ز) bmdm (n = 5-7 و n = 4-5 التجارب المستقلة ، علي التوالي). 10,000 تم حساب الخلايا لكل عينه. وتظهر البيانات علي انها تعني ± نوفاسكوتيا = لا يستهان بها ؛ * P < 0.05 ، * * p < 0.01 ، * * * p < 0.001 و * * * * p < 0.0001 بواسطة t-اختبار الطالب. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 7
الشكل 7: لا يؤدي النقل العابر إلى التسبب في موت الخلايا الخلوية أو الميتة. تم تحديد وفاه الخلايا الناجمة عن التحويل من (ا) PM و (B) bmdm بتحليل النسبة المئوية للخلايا الموجبة والملحقة V-ايجابيه (n = 5-7 و n = 4-5 التجارب المستقلة ، علي التوالي). وطرحت النسبة المئوية من الضامة الميتة الموجودة في عينات غير المتحولة (بعض درجه من موت الخلايا بسبب مفرزه المادية من الضامة من الآبار علي الرغم من استخدام لوحات غير معالجه) من انه في العينات المحولة كل منها لتاخذ في الاعتبار فقط وفاه الخلية التي يسببها اجراء التحويل يتم عرض استراتيجية النابض المستخدمة لتحديد السكان منPI +، الضمv + وpi +/الضم فيv + الضامة لمجموعه بيانات تمثيليه من بعد الظهر مع 200 ng mrna لمده 6 ساعات. تم استخدام ستوروبورنين (50 μM لمده 1 ساعة) كعنصر تحكم إيجابي. 10,000 تم حساب الخلايا لكل عينه. وتظهر البيانات علي انها تعني ± بلا تاريخ = لا يمكن كشفها. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 8
الشكل 8: معدلات التحويل باستخدام ترميز mRNA لتركيبات نيمو و IKK. معدلات التحويل باستخدام الترميز mRNA ل (ا) نيمو يبني و (ب) تم قياسها بواسطة المجهر المناعي (ن = 4 تجارب مستقله). شريط المقياس = 4 ميكرومتر. وتظهر البيانات علي انها تعني ± n.t. = غير مقسمه ، نوفاسكوتيا = ليست كبيره ؛ * P < 0.05 ، * * p < 0.01 ، * * * p < 0.001 و * * * * p < 0.0001 بواسطة t-اختبار الطالب. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 9
الشكل 9: الانتقال من نيموfl/fl Bmdm مع mrna الترميز ل cre للالطبيعيه النتائج في نقص كامل تقريبا ل نيمو. BMDM من نيموfl/fl تم نقل الفئران مع mrna ترميز cre للالطبيعيه ل 48 ح. نقص للبروتين نيمو نتيجة لضربه قاضيه تم تقييمها بواسطة لطخه الغربية باستخدام الأجسام المضادة المحددة الاعتراف نيمو أو β-actin وكميا عن طريق قياس الكثافة (ن = 5 تجارب مستقله). يتم عرض البيانات كما يعني ± SEM. * p < 0.05 ، * * p < 0.01 ، * * * p < 0.001 و * * * * p < 0.0001 من قبل الطالب t-اختبار. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 10
الشكل 10: التحويل لا يحفز علي الاستجابة التهابيه. (ا) PM و (B) bmdm تم نقلها مع الترميز Mrna ل نيموWT أو نيموC54/347A. كما السيطرة الايجابيه ، وكانت الضامة المصابة مع الجينات الليستيريا في تعدد العدوى من 1 أو حفز مع 5 ميكروغرام/مل lps أو بولي (I:C) لمده 5 ساعات (PM) أو 24 ساعة (bmdm). تم كميا إفراز il-1 β ، آيل-6 ، و tnf إلى ماده طافي من قبل اليسا (ن = 3 تجارب مستقله). وتظهر البيانات علي انها تعني ± n.t. = لا يتم تحويلها ، بلا تاريخ = لا يمكن كشفها. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هنا نقدم بروتوكول لنقل كفاءه عاليه من الضامة الاساسيه عاده من الصعب إلى ترنسفكايشن مع في المختبر كتبت mrna. والاهم من ذلك ، فان انتقال الضامة باستخدام هذا البروتوكول لا يحفز موت الخلايا أو ينشط الإشارات التهابيه التي تشير إلى انه لا يتم التعرف علي الكاشف العابر ولا علي مركبات mRNA غير الذاتية.

جوده mRNA هي ذات اهميه رئيسيه لنجاح عمليه التحويل من الضامة باستخدام هذا البروتوكول. التالي ، ينبغي توخي الحذر الشديد من ان mRNA لا تلامس مع RNAses (علي سبيل المثال ، من خلال المخازن المؤقتة الملوثة أو قوارير). إذا كان في شك ، والتحقق من تدهور mRNA (علي سبيل المثال ، من قبل الكهربائي هلام اجبرز). وكان معدل التحويل ومستوي التعبير القصوى بالفعل في 6 ساعات بعد التحويل. ولذلك ، فمن الممكن ان يتم التعبير عن البروتين من الفائدة في مستويات كافيه للتحليل في النقاط الزمنيه السابقة بعد الحقن. ولكننا لم نختبر هذا الأمر. وعلاوة علي ذلك ، فان نقل كميات أكبر من mRNA قد يزيد من معدل النقل العابر و/أو مستوي التعبير. ومع ذلك ، فان نقل كميات أكبر من mRNA قد يؤدي أيضا إلى درجه معينه من الوالاستمناع أو حتى السمية الخلوية. والافتقار الكامل اليها هو أحد المزايا الرئيسية لهذا البروتوكول. التالي ، إذا كانت كميات أكبر من mRNA ليتم نقلها ، والاستمناع والسمية الخلوية يجب ان يتم تقييمها بعناية.

ويرتبط مستوي التعبير ارتباطا واضحا بكميه النقل العابر للحدود. ومع ذلك ، أدت أعاده التعبير عن نيمو في BMDM نقص نيمو في التعبير عن البروتين نيمو مماثله كما هو الحال في النوع البري BMDM16 مشيرا إلى ان mrna النقل باستخدام هذا البروتوكول لا يؤدي إلى الإفراط كبيره من البروتين من الفائدة. التالي ، قد لا يكون هذا البروتوكول مناسبا لدراسة عواقب الإفراط في التعبير عن البروتين المثير للاهتمام. نحن بالأحرى نعتبر هذا ميزه, ومع ذلك, كما الإفراط في التعبير عن البروتين في كثير من الأحيان يغير سلوكها.

القيد الرئيسي لنقل mRNA ، بشكل عام ، هو انه يؤدي فقط في التعبير عابره من البروتين من الفائدة (لان mRNA التي تم إنشاؤها وتحويلها باستخدام هذا البروتوكول سوف تكون عرضه للدوران العادي). PM يبدو ان التعبير عن البروتين من الفائدة لفتره أقصر من الزمن بالمقارنة مع BMDM. التالي ، وعلي النقيض من BMDM ، لا ينبغي ان يتم تحويلها مساء بين عشيه وضحيها. كم من الوقت سيتم التعبير عن بروتين معين من الفائدة سوف تختلف (كما كل من استقرار mRNA وان من البروتين سوف تختلف). ومع ذلك نوصي بأداء تجربه الاختيار في نفس يوم الانتقال. إذا كان التعبير عن البروتين من الفائدة مطلوب لفترات أطول من الوقت ، والخلايا ربما يمكن نقلها عده مرات (علي سبيل المثال ، كل يوم كما هو موضح في18).

لقد استخدمنا بنجاح البروتوكول الموصوف هنا ل transfect murine PM و BMDM والخلايا الليفية الفئران الجنينية (MEFs)16. من الناحية النظرية ، يمكن استخدام mRNA التي تم إنشاؤها باستخدام هذا البروتوكول لنقل اي نوع خليه معينه من اي أنواع الثدييات. قد يختلف الكاشف الأمثل لنقل الحركة mRNA ومحتوي النيونوسيدس المعدلة بالنسبة لأنواع الخلايا الأخرى ، علي الرغم من ذلك.

وتشمل التعديلات المستقبلية الواعدة ادراج ال 5 '-و 3 '-UTRs. معظم البلازميدات الموجودة مسبقا لا تحتوي الا علي CCDS من البروتين من الفائدة ولكن ليس 5 '-و 3 '-UTRs. وقد يزيد ادراجها (كما هو موصوف في19) من تعزيز الاستقرار والتعبير لدي الحركة. أيضا, إرفاق العلامات الفوقية إلى البروتين من الفائدة من خلال ببساطه بما في ذلك تسلسل العلامة المربه في التمهيدي إلى الامام أو العكسي (لل N-و C-العلامات الطرفية الفوقية, علي التوالي), وينبغي ان يكون ممكنا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

Acknowledgments

ساندت هذا عمل كان ب ال [دوتش] [فورسسكهنغجيميندسكهفت] ([سالفيس] 670).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5-methyl-CTP (100 mM) Jena Biosience NU-1138S stored at -20 °C
Antarctic phosphatase New England BioLabs M0289 stored at -20 °C
Antarctic phosphatase reaction buffer (10x) New England BioLabs B0289 stored at -20 °C
anti-NEMO/IKKγ antibody Invitrogen MA1-41046 stored at -20 °C
anti-β-actin antibody Sigma-Aldrich A2228 stored at -20 °C
Petri dishes 92,16 mm with cams Sarstedt 821,473 stored at RT
CD11b Microbeads mouse and human Miltenyi Biotec 130-049-601 stored at 4 °C
Cre recombinase + T7-Promotor forward primer Sigma-Aldrich 5′-GAAATTAATACGACTCACTATA
GGGGCAGCCGCCACCATGTCC
AATTTACTGACCGTAC-3´, stored at -20 °C
Cre recombinase + T7-Promotor reverse primer Sigma-Aldrich 5′-CTAATCGCCATCTTCCAGCAGG
C-3′, stored at -20 °C
DNA purification kit: QIAquick PCR purification Kit Qiagen 28104 stored at RT
eGFP + T7-Promotor forward primer Sigma-Aldrich 5´-GAAATTAATACGACTCACTATA
GGGATCCATCGCCACCATGGTG
AGCAAGG-3´, stored at -20 °C
eGFP + T7-Promotor reverse primer Sigma-Aldrich 5´-TGGTATGGCTGATTA
TGATCTAGAGTCG-3´, stored at -20 °C
Fast Digest buffer (10x) Thermo Scientific B64 stored at -20 °C
FastDigest XbaI Thermo Scientific FD0684 stored at -20 °C
High-fidelity polymerase with proofreading: Q5 High-Fidelity DNA-Polymerase New England Biolabs Inc M0491S stored at -20 °C
IKKβ + T7-Promotor forward primer Sigma-Aldrich 5′-GAAATTAATACGACTCACTATA
GGGTTGATCTACCATGGACTACA
AAGACG-3′, stored at -20 °C
IKKβ + T7-Promotor reverse primer Sigma-Aldrich 5′-GAGGAAGCGAGAGCT-CCATCTG-3′, stored at -20 °C
In vitro mRNA transcription kit: HiScribe T7 ARCA mRNA kit (with polyA tailing) New England BioLabs E2060 stored at -20 °C
LS Columns Miltenyi Biotec 130-042-401 stored at RT
MACS MultiStand Miltenyi Biotec 130-042-303 stored at RT
mRNA transfection buffer and reagent: jetMESSENGER Polyplus transfection 409-0001DE stored at 4 °C
Mutant IKKβ IKK-2S177/181E plasmid Addgene 11105 stored at -20 °C
Mutant NEMOC54/347A plasmid Addgene 27268 stored at -20 °C
pEGFP-N3 plasmid Addgene 62043 stored at -20 °C
poly(I:C) Calbiochem 528906 stored at -20 °C
pPGK-Cre plasmid F.T. Wunderlich, H. Wildner, K. Rajewsky, F. Edenhofer, New variants of inducible Cre recombinase: A novel mutant of Cre-PR fusion protein exhibits enhanced sensitivity and an expanded range of inducibility. Nucleic Acids Res. 29, 47e (2001). stored at -20 °C
pseudo-UTP (100 mM) Jena Biosience NU-1139S stored at -20 °C
QuadroMACS Separator Miltenyi Biotec 130-090-976 stored at RT
Rat-anti-mouse CD11b antibody, APC-conjugated BioLegend 101212 stored at 4 °C
Rat-anti-mouse F4/80 antibody, PE-conjugated eBioscience 12-4801-82 stored at 4 °C
Recombinant M-CSF Peprotech 315-02 stored at -20 °C
RNA purification kit: MEGAclear transcription clean-up kit ThermoFisher Scientific AM1908 stored at 4 °C
RNAse-degrading surfactant: RnaseZAP Sigma-Aldrich R2020 stored at RT
Ultrapure LPS from E.coli O111:B4 Invivogen stored at -20 °C
Wild type IKKβ plasmid Addgene 11103 stored at -20 °C
Wild type NEMO plasmid Addgene 27268 stored at -20 °C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ley, K., Pramod, A. B., Croft, M., Ravichandran, K. S., Ting, J. P. How Mouse Macrophages Sense What Is Going On. Frontiers in Immunology. 7 (204), (2016).
  2. Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. The expression of exogenous genes in macrophages: obstacles and opportunities. Methods in Molecular Biolology. 531, 123-143 (2009).
  3. Guo, X., et al. Transfection reagent Lipofectamine triggers type I interferon signaling activation in macrophages. Immunology and cell biology. 97 (1), 92-96 (2019).
  4. Kariko, K., Weissman, D. Naturally occurring nucleoside modifications suppress the immunostimulatory activity of RNA: implication for therapeutic RNA development. Current Opinion in Drug Discovery and Development. 10 (5), 523-532 (2007).
  5. Van De Parre, T. J., Martinet, W., Schrijvers, D. M., Herman, A. G., De Meyer, G. R. mRNA but not plasmid DNA is efficiently transfected in murine J774A.1 macrophages. Biochemical and biophysical research communications. 327 (1), 356-360 (2005).
  6. Uchida, S., Kataoka, K., Itaka, K. Screening of mRNA Chemical Modification to Maximize Protein Expression with Reduced Immunogenicity. Pharmaceutics. 7 (3), 137-151 (2015).
  7. Kariko, K., et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability. Molecular Therapy. 16 (11), 1833-1840 (2008).
  8. Khantakova, J. N., et al. Transfection of bone marrow derived cells with immunoregulatory proteins. Cytokine. 108, 82-88 (2018).
  9. Franz, K. M., Kagan, J. C. Innate Immune Receptors as Competitive Determinants of Cell Fate. Molecular Cell. 66 (6), 750-760 (2017).
  10. Kaestner, L., Scholz, A., Lipp, P. Conceptual and technical aspects of transfection and gene delivery. Bioorganic & medicinal chemistry letters. 25 (6), 1171-1176 (2015).
  11. Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).
  12. Kormann, M. S., et al. Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice. Nature Biotechnology. 29 (2), 154-157 (2011).
  13. Kariko, K., Buckstein, M., Ni, H., Weissman, D. Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors: the impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA. Immunity. 23 (2), 165-175 (2005).
  14. Hornung, V., et al. 5'-Triphosphate RNA is the ligand for RIG-I. Science. 314 (5801), 994-997 (2006).
  15. Pichlmair, A., et al. RIG-I-mediated antiviral responses to single-stranded RNA bearing 5'-phosphates. Science. 314 (5801), 997-1001 (2006).
  16. Herb, M., et al. Mitochondrial reactive oxygen species enable proinflammatory signaling through disulfide linkage of NEMO. Science Signaling. 12 (568), (2019).
  17. Schmidt-Supprian, M., et al. NEMO/IKK gamma-deficient mice model incontinentia pigmenti. Molecular Cell. 5 (6), 981-992 (2000).
  18. Mandal, P. K., Rossi, D. J. Reprogramming human fibroblasts to pluripotency using modified mRNA. Nature Protocols. 8 (3), 568-582 (2013).
  19. Oh, S., Kessler, J. A. Design, Assembly, Production, and Transfection of Synthetic Modified mRNA. Methods. 133, San Diego, CA. 29-43 (2018).

Tags

المناعة والعدوى ، العدد 153 ، الضامة الاساسيه ، الضامة البريتوني ، الضامة نخاع العظم المشتقة ، الخلايا المناعية ، في النسخ الأنبوبي ، mRNA ، التحويل
النقل عاليه الكفاءة من الضامة الابتدائية مع في المختبر كتب mRNA
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Herb, M., Farid, A., Gluschko, A.,More

Herb, M., Farid, A., Gluschko, A., Krönke, M., Schramm, M. Highly Efficient Transfection of Primary Macrophages with In Vitro Transcribed mRNA. J. Vis. Exp. (153), e60143, doi:10.3791/60143 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter