Summary
巨噬细胞，特别是原发性巨噬细胞，由于它们专门检测非自源分子，因此很难转染。我们描述了一种协议，它允许使用从DNA模板（如质粒）生成的mRNA对原性巨噬细胞进行高效的转染。
Abstract
巨噬细胞是专门检测非自源分子的噬菌体。为此，他们配备了大量模式识别受体（PRRs）。不幸的是，这也使得巨噬细胞特别难以转染，因为转染试剂和转染的核酸经常被PR识别为非自体。因此，转染通常会导致巨噬细胞活化和转染核酸的降解，甚至导致巨噬细胞的自杀。在这里，我们描述了一个协议，它允许高效转染鼠原性巨噬细胞，如围肠巨噬细胞（PM）和骨髓衍生巨噬细胞（BMDM），在体外转录从DNA模板（如质粒）的mRNA。通过这种简单的方案，在未观察到细胞毒性或免疫原性的情况下，PM和BMDM的转染率约为50-65%，BMDM约为85%。我们详细描述了从DNA结构（如质粒和转染过程）转染的mRNA的生成。
Introduction
巨噬细胞是噬菌体，专门检测、摄取和降解微生物、凋亡细胞和细胞碎片。此外，它们通过分泌细胞因子和化学因子，以及向T细胞和B细胞提供抗原，帮助协调免疫反应。巨噬细胞在许多其他过程中也起着重要作用，如伤口愈合、动脉粥样硬化、肿瘤发生和肥胖。
为了能够检测非自分子，如病原体相关的分子模式（PAMPs）和不合时宜的分子，如损伤相关分子模式（DAMPs），巨噬细胞配备了大量模式识别受体（PRR）1。不幸的是，这也使得巨噬细胞特别难以转染2作为转染试剂3和转染核酸4，5，6，7经常被PR识别为非自体。因此，使用化学或物理方法的巨噬细胞转染通常会导致大噬细胞活化和转染核酸的降解，甚至导致巨噬细胞通过热膜病自杀，这是一种在识别细胞环管PAMPs/DAMPs（如DNA或外来RNA9）后触发的细胞细胞死亡。使用腺病毒或扁病毒等病毒作为载体的巨噬细胞的生物转染通常效率更高，但构建这种病毒载体却非常耗时，需要生物安全2级设备10、11。
因此，虽然巨噬细胞是深入研究的主题，但由于分子生物学最重要的工具之一，核酸构造的转染，用于外源性表达，因此在分子水平上对其功能的分析受到了阻碍。蛋白质，是很难适用的。这经常迫使研究人员使用类似巨噬细胞的细胞系，而不是真正的巨噬细胞。核酸构造转染的应用包括突变或标记蛋白的表达、特定蛋白质的过度表达、在各自敲除背景中的蛋白质重新表达以及来自其他物种的蛋白质的表达（例如。，Cre 重组酶或指导 RNA 和 Cas9 用于靶向基因敲除）。
在这里，我们描述了一个协议，允许高效转染（通常难以转染）原体噬菌体，即鼠围管巨噬细胞（PM）和骨髓衍生巨噬细胞（BMDM）与MRNA产生的DNA模板，如质粒。重要的是，使用该协议产生的体外转录mRNA含有自然产生的修饰核苷5-甲基-CTP和伪UTP，降低免疫原性，增强稳定性4，6，7，12，13。此外，在体外转录的mRNA的5'端被南极磷酸酶去磷化，以防止RIG-I复合体14、15的识别。这最大限度地减少了体外转录mRNA的先天免疫识别。通过我们易于执行的协议，转染率在50-65%（围脑巨噬细胞（PM））和85%（BMDM）之间，而重要的是，没有观察到细胞毒性或免疫原性。我们详细描述 （i） 如何从DNA结构（如质粒）和 （ii） 转染程序本身生成用于转染的免疫沉默的 mRNA。
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Protocol
根据德国《动物保护法》，根据科隆大学伦理委员会对小鼠进行巨噬菌体分离。
注：戴上手套执行所有步骤。在层流罩下执行所有转染步骤，以防止细胞受到污染。在使用 mRNA 之前，使用 70% 乙醇和/或 RNAe 降解表面活性剂（材料表）清洁所有仪器，如移液器和每个表面。确保所有反应管无RNA酶和无菌。只使用无菌的无RNA酶水进行稀释。专门使用带过滤器的移液器吸头。在每个移液步骤后更换移液器提示。
1. DNA模板的生成
注：使用该协议的体外mRNA转录的DNA模板必须包含T7前运动序列，以允许RNA聚合酶的对接。如果含有感兴趣的蛋白质的DNA序列的质粒已经包含一个正确定向的T7运动序列，则需要对质粒进行线性化（参见步骤1.1.）。否则，通过聚合酶链反应将 T7 前马达连接到兴趣序列（PCR，参见步骤 1.2.）。
-
T7预运动质粒的线性化
- 通过消化，通过限制酶将兴趣序列的停止科顿下游切割，使已经包含正确定向的T7运动序列的质粒线性化。否则，转录在兴趣序列后将无法正常结束。
注：最好使用限制性酶，留下钝端或5'悬垂。 - 通过未消化的胶质DNA与消化质粒DNA的藻酸凝胶电泳，确认质粒的完全线性化。
- 使用DNA纯化试剂盒（材料表）在用作体外mRNA转录的DNA模板之前，先纯化线性质粒DNA。
- 通过消化，通过限制酶将兴趣序列的停止科顿下游切割，使已经包含正确定向的T7运动序列的质粒线性化。否则，转录在兴趣序列后将无法正常结束。
-
PCR 附件 T7 前马达
- 使用包含以下组件的正向引基（按指示顺序从 5' 到 3'）：promotor 上游约 5 个随机 bp（例如，GAAAT）;T7前运动序列（TAATACGACTACTATATAT;两个额外的G，提高转录效率（GG）;与起始科顿周围的质粒序列相同的目标序列特定部分。
注：它应该由：3-6 bp上游的KOZAK序列和启动科顿，KOZAK序列和启动科顿（通常GCCACC ATG G），12-18 bp下游的起始科顿。如果兴趣序列尚未包含 KOZAK 序列或起始科顿，则可以在此步骤中附加这些序列，只需将它们包含在引物序列中即可。 - 仅通过考虑零件与目标序列的均值来计算正向引漆的 tm。
- 要评估二聚体/发夹形成，请使用整个引色序列，这很容易超过50 bp。
- 使用位于停止科顿下游某处的反向底漆。
注：如果兴趣序列尚未包含停止号子，则可以在此步骤中附加该兴趣序列，只需将其包含在引物序列中即可。 - 使用正向和反向引物使用具有校对的高保真聚合酶执行 PCR（材料表）。
- 通过阿加生凝胶电泳（例如，使用1%的胶质凝胶和100 V恒定电流）确认单一产品及放大剂尺寸的生成。
- 使用DNA纯化试剂盒作为体外mRNA转录的DNA模板之前，先纯化PCR产物。
- 使用包含以下组件的正向引基（按指示顺序从 5' 到 3'）：promotor 上游约 5 个随机 bp（例如，GAAAT）;T7前运动序列（TAATACGACTACTATATAT;两个额外的G，提高转录效率（GG）;与起始科顿周围的质粒序列相同的目标序列特定部分。
2. mRNA 生成
- 解冻体外mRNA转录试剂盒的所有成分（见材料表）。涡旋5s，在2000 x g下旋转2s。保持冰上，直到使用。
- 以以下顺序在0.5 mL微离心管中制备体外mRNA转录反应混合物（总体积为40μL）：20μL的10xARCA/NTP混合物（包含在体外mRNA转录试剂盒中）;0.25 μL的5甲基CTP（最终浓度（f.c.）为1.25 mM;占CTP总量的50%;0.25 μL 的伪 UTP（f.c. 为 1.25 mM;占 UTP 总量的 50%;X=L的DNA模板;2 μL T7 RNA聚合酶混合物（包含在体外mRNA转录试剂盒中）;无RNAE H2O的 Y μL。
注：X 是包含至少 1 μg DNA 的体积。例如，625 纳克/μL 库存溶液中为 1.6 μL。Y 是总体积为 40 μL 的备用体积。 - 涡旋5s，在2000 x g下旋转2s。在37°C下在400rpm的转速下在热混合器上孵育30分钟，进行体外转录。
- 然后，将2μL的DNase I直接加入反应混合物中，以去除模板DNA。涡旋5s，在2000 x g下旋转2s。
- 在 37°C 下在 400 rpm 转速下在热混合器上孵育 15 分钟。对照凝胶（步骤 3.3）取2μL的等分，并储存在-80°C。
- 对于聚（A）尾料，将以下成分直接添加到前一反应混合物中（最终体积为50μL）：5μL的10x聚酯（A）聚合酶反应缓冲液和5μL聚酯（A）聚合酶（均包含在体外mRNA转录试剂盒中）。涡旋5s，在2000 x g下旋转2s。
- 在 37°C 下在 400 rpm 的转速下在热混合器上孵育混合物 30 分钟。对照凝胶（步骤 3.3）取2μL的等分，并储存在-80°C。
- 对于 mRNA 5 μ 端的脱磷酸化，将以下组分直接添加到前一个反应混合物中（最终体积为 60 μL）：3 μL 无RNA H2O;6 μL 10x南极磷酸酶反应缓冲液;3 μL 南极磷酸酶（15 个单位，用于 60 μL 反应体积）。涡旋5s，在2000 x g下旋转2s。
- 在 37°C 下在 400 rpm 转速下在热混合器上孵育混合物 30 分钟。
- 在80°C孵育2分钟，使南极磷酸酶失去热活性。
注：理想情况下，使用单独的热混合器，不要等到第一个混合器达到所需温度。
3. mRNA 纯化
- 使用专用的RNA纯化试剂盒（材料表）纯化体外转录的mRNA。
- 从步骤2.10向mRNA反应混合物中加入X μL洗脱溶液。通过反转 5 次进行混合。加入300μL的装订溶液浓缩物。通过温和的移液5次混合。
注：X 是总体积为 100 μL 的备用卷。例如，将40μL洗脱溶液加入60μL mRNA反应混合物中。 - 加入100μL无RNA酶乙醇。通过温和的移液5次混合。
- 在提供的收集管之一中放置一个过滤器列。将 mRNA 反应混合物轻轻转移到过滤器的中心，而不接触过滤器。在室温 （RT） 下，在 15，000 x g下离心 1 分钟。
- 小心地抬起滤芯柱，并丢弃收集管中的流过。将过滤器柱放回同一收集管中。
- 加入500μL的洗涤溶液（不要忘记在首次使用洗涤溶液之前加入20mL无RNA酶乙醇）。
- 在 RT. 重复步骤 3.1.4-3.1.6 时，在 15，000 x g下离心 1 分钟，再清洗一次。
- 全速（17，900 x g）在RT下离心1分钟，以清除滤芯柱上的任何残留液体。小心地从收集管中取取滤芯柱。将过滤器列放在新的收集管中。
- 在不接触过滤器的情况下，将 50 μL 的洗脱缓冲液添加到过滤器的中心。在65°C下在热混合器上孵育10分钟。
- 在 RT 下以 15，000 x g 离心 1 分钟，拆下滤芯并丢弃。
- 从步骤2.10向mRNA反应混合物中加入X μL洗脱溶液。通过反转 5 次进行混合。加入300μL的装订溶液浓缩物。通过温和的移液5次混合。
- 例如，使用微体积分光光度计测量 260 和 280 nm 的吸光度，测量洗脱的 mRNA 的浓度和纯度。
注：A260/A280 比率为 1.8-2.1 表示高度纯化 mRNA。 - 通过在变性条件下分析步骤 2.5 和 2.7 步骤中的异位，验证单个产品、正确的转录长度和聚（A） 尾液的存在（例如，使用含有 20 mM 3-（N-形态诺） 的 1.2% agarose 凝胶丙苯丙酸 [MOPS]，5 mM 醋酸钠，1 mM EDTA 和 20% 甲醛，在 20 mM MOPS、5 mM 醋酸钠、1 mM EDTA 和 0.74% 甲醛中运行，电流为 100 V 恒流。
- 将纯化的mRNA储存在-80°C的洗脱管中，直到转染。如果只使用少量的mRNA转染，则与mRNA等分，以避免重复的冻融循环。
注：mRNA可在-80°C下储存约1年。
4. 巨噬菌体准备
- 通过宫颈脱位使C57/BL6小鼠（使用同性小鼠和6-24周年龄的小鼠）实施安乐死。
注：相同的小鼠可用于分离PM（步骤4.2）和生成BMDM（步骤4.3和4.4）。对于 PM 的隔离，请至少使用两只鼠标。如果只生成 BMDM，通常只需一个鼠标就足够了。 - 围肠巨噬细胞的免疫磁富集。
- 将 10 mL 注射器与 8 mL 的冰冷磷酸盐缓冲盐 （PBS） 和 2 mL 空气一起填充 0.9 x 40 mm 管条。用 PBS 冲洗围周腔。空气将形成气泡，以尽量减少 PBS 的泄漏。
- 使用相同的注射器快速收集围网洗漱，并转移到50 mL锥形离心管中。如果需要，结合多只小鼠的围细胞。保持细胞悬浮在冰上。
- 离心细胞悬浮在650 x g下，在4°C下悬浮5分钟。丢弃上清液，将细胞颗粒重新悬浮在5 mL 0.2% NaCl中，30s，以赖以治疗红血球。
- 将 5 mL 的 1.6% NaCl 添加到 10 mL 的总体积中，以重建等向条件。在 650 x g下在 4°C 下离心 5 分钟。
- 每1次围肠洗菌（例如，如果三只小鼠被冲洗，在292.5μL中重新悬浮在PBS中的5%牛血清白蛋白[BSA]）中，在97.5 μL的磁性细胞分拣（MCS）缓冲液（2mM乙二胺乙酸[EDTA]，PBS中的5%牛血清白蛋白[BSA]）中重新悬浮细胞颗粒).
- 每97.5μL细胞悬浮液中加入2.5μL的顺磁珠，加入CD11b特异性抗体（例如，将7.5μL添加到292.5μL）。
- 在轨道摇床上以150rpm的转速在冰上孵育15分钟。
- 在650 x g下，离心细胞悬浮5分钟，在4°C下，丢弃上清液，并在1mL的MCS缓冲液中重新悬浮细胞颗粒。
- 将 4 mL 的 MCS 缓冲液添加到 5 mL 的总体积中，通过轻轻上下移液三次来清洗细胞。
- 重复步骤 4.2.8 和 4.2.9 两次，总共三个洗涤步骤。
- 在洗涤步骤中，在磁性细胞分离器中放置一个LS列（参见材料表）。用 3 mL 的 MCS 缓冲液冲洗该柱。
注：避免任何气泡，因为这些气泡可能会堵塞列。 - 在 MCS 缓冲液的 1 mL 中重新悬浮细胞颗粒。将 3 mL 的 MCS 缓冲液添加到 4 mL 的总体积中，通过上下移液混合三次。
- 将 4 mL 的细胞悬浮液转移到冲洗过的 LS 柱上。
注：同样，避免任何气泡，因为这些气泡可能会堵塞列。 - 等待，直到列的储藏库完全清空。在柱停止滴落之前，不要添加额外的液体。
- 将 3 mL 的 MCS 缓冲区添加到列上。然后，等待，直到列的储层完全清空。重复步骤 4.2.15 再重复两次。
- 将 LS 柱放入 15 mL 锥形离心管中。将 5 mL 的 MCS 缓冲区应用于列。等待 2 mL 的液体通过柱，然后使用柱塞轻轻地将剩余馏分推入管中。
- 离心细胞悬浮在650 x g下，在4°C下悬浮5分钟，并丢弃上清液。
- 在 1 mL 的 DMEM 中重新悬浮细胞颗粒，辅以 10% 热灭活胎儿小牛血清 （FCS） （DMEM+FCS）。
- 通过在 Neubauer 计数室中的锥蓝色溶液中计数，在 DMEM_FCS 中将种子细胞计数到培养板中，确定可存活细胞的数量。
注：种子PM在100，000个细胞/孔的扁平底部微粒板的密度。不要使用组织培养处理的板，因为 PM 不能从这些板分离。改用未经处理的盘子。
- BMDM 的生成
- 用剪刀从后腿上去除皮肤和肌肉。用70%乙醇的短浸液清洗每条腿。
- 用剪刀切开双腿，打开股骨和头骨的两端。
- 将装有0.6 mm x 30 mm管状的5 mL注射器填充，内毒素（VLE）RPMI 1640，并将骨髓从打开的骨骼中冲洗到培养盘中。
- 如果需要重复步骤 4.3.1-4.3.3，结合多个小鼠的骨髓。将骨髓转移到50 mL锥形离心管中。
- 在4°C下将骨髓悬浮液在650 x g下离心5分钟，并丢弃上清液。
- 在5 mL红细胞赖舍缓冲液（8.3% NH4Cl，0.1 M Tris）中重新悬浮细胞颗粒，并在RT孵育5分钟以赖解红血球。
- 在 4°C 下将细胞悬浮液在 650 x g下离心 5 分钟，然后丢弃上清液。
- 在 1 mL 的 VLE RPMI 1640 介质中重新悬浮细胞颗粒，辅以 10% FCS、1% 青霉素/链霉素、1% HEPES、1% 丙酸钠和 10 纳克/mL 重组巨噬细胞菌群刺激因子 （M-CSF） （RPMI++）。
- 将 4 mL 的 RPMI+添加到 5 mL 的总体积中。
- 将 7 mL 的 RPMI+介质移入每盘，每只鼠标可用凸轮（参见材料表）准备 5 个 92 mm x 16 mm 未经处理的培养皿。
- 将1mL的细胞溶液转移到5个准备好的培养皿中，并在37°C和5%CO2下孵育。
- 4天后，通过添加 4 mL 的 RPMI+来给细胞喂食。6-7天后，骨髓细胞完全分化成BMDM。
- 收获BMDM
- 从培养皿中完全去除介质。在 PBS 中加入 5 mL 的温暖 0.2 mM EDTA 到每道菜中。
- 用细胞刮刀轻轻刮擦整个板，以分离 BMDM。将细胞悬浮液组合在50 mL锥形离心管中。
- 再次冲洗所有 5 道菜。在所有 5 道菜中，在 PBS 中使用相同的 5 mL 热 0.2 mM EDTA 的体积。将此电池悬架与上一步骤中的一个组合。
- 在 4°C 下将细胞悬浮液在 650 x g下离心 5 分钟，然后丢弃上清液。
- 在 1 mL 的 VLE RPMI 1640 介质中重新悬浮细胞颗粒，辅以 10% FCS、1% HEPES、1% 丙酸钠和 10 纳克/mL 重组剂 M-CSF，但没有抗生素 （RPMI+）。
- 通过在 Neubauer 计数室中的锥蓝色溶液中计数，在 RPMI+中将种子细胞计数到培养板中，确定可存活细胞的数量。
注：种子BMDM在平底微粒板中最大密度为50，000个细胞/孔。不要使用组织培养处理的板，因为BMDM很难从这些板分离。改用未经处理的盘子。
5. 巨噬细胞与mRNA的转染
- 计算所需的mRNA转染缓冲液体积。
注：所需的mRNA转染缓冲液的体积取决于井的大小：在6孔板中使用200μL转染，在12孔板中使用100μL，等等。由于移液损失，始终添加一点备用体积（但不要过多，以防止 mRNA 过度稀释）。例如，使用 450 μL 而不是 4 x 100 μL = 400 μL 在 12 孔板的 4 个孔中转染。 - 计算所需的mRNA转染试剂体积。mRNA 转染试剂以 1：50 的比例添加。例如，450 μL的最终体积需要9μL的mRNA转染试剂。
- 计算所需的mRNA总量。高效转染至少需要每100，000个巨噬细胞100纳克，200纳克效果更好（例如，800纳克RNA转染400，000个巨噬细胞）。
- 将计算出的mRNA量与必须转染的孔总数相乘（例如，4口井，每口400，000个巨噬细胞：4个800纳克= 3，200纳克RNA，所有孔总共需要）。例如，如果您的 mRNA 库存为 426.8 纳克/μL，则需要 7.49 μL 才能对 4 口井进行最佳转染，每个井具有 400，000 个巨噬细胞。
- 将mRNA转染缓冲液的计算体积（步骤5.1.）减去mRNA转染试剂（步骤5.2）和mRNA（步骤5.3）的体积，加入反应管。例如，450 μL - 9 μL - 7.49 μL = 433.51 μL。
- 解冻mRNA股票，并通过洗脱管的温和翻转混合。使用 mRNA 反应缓冲液将 mRNA 的计算体积（步骤 5.3）添加到反应管中（在上面提供的示例中：433.51 μL 中的 7.49 μL）。
- 涡旋5s，在2000 x g下旋转2s。
- 涡旋 mRNA 转染试剂 5 s，在 2，000 x g 下旋转 2 s。
- 将mRNA转染试剂的计算体积（步骤5.2）添加到含有mRNA转染缓冲液和mRNA的反应管中（在上面介绍的示例中：mRNA转染试剂的9μL）。
- 涡旋转染混合物5s和旋转2s在2000 x g。
- 在 RT 孵育 15 分钟。
- 同时，用新鲜、温暖的培养基体替换巨噬细胞的培养基（参见步骤4.2.18和4.4.5）。
- 孵育步骤5.10后，将转染混合物添加到含有巨噬细胞的孔中，其体积适合井的大小（参见步骤5.1）。将转染混合物从井外到井中间的圆圈滴入一个圆圈中。
- 轻轻摇动板，先垂直，然后水平方向，以确保转染混合物在井中均匀分布。然后，在37°C和5%CO2孵育。转染mRNA编码的蛋白质的合成将在转染后不久开始。为获得最佳效果，孵育至少6小时。
- 孵育后，通过（免疫）荧光显微镜、流式细胞学或免疫管16分析转染效率，或使用转染巨噬细胞进行首选实验。
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Representative Results
我们已经成功地使用该协议为FLAG标记的NEMO和IKK+变体生成mRNA编码，用于转染原巨噬细胞16。FLAG 标记野生型 （NEMOWT） 和 C54/347A 突变 NEMO （NEMOC54/374A）（见材料表）的质粒编码已经包含方向正确的 T7 前电机 （图 1A）。因此，我们只需要线性化质粒，以生成体外转录的DNA模板。为此，用5μL Xbal消化10μg质粒DNA，由于停止科顿的单切3'，导致质粒线性化。质粒DNA的完全线性化通过胶质凝胶电泳验证（图1B）。
FLAG 标记野生型 （IKK+WT）和 S177/181E 突变 IKK® （IKK+S177/181E）的质粒编码不包含 T7 前动机。因此，我们附加了PCR的T7前动机，以生成体外转录的DNA模板（图2A）。通过阿加辛胶电泳（图2B）验证了特定PCR产品的生成，即尺寸正确的单一产品。
在使用各自的DNA模板进行体外转录后，我们验证了在变性条件下通过阿加松凝胶电泳生成了一种尺寸正确的和多（A）尾的单个mRNA产物（图3）。
为了验证使用该协议生成的mRNA确实能够进行原性巨噬细胞的转染（参见图4A，B，用于对PM的免疫磁富集和BMDM的分化状态进行流式细胞测定分析），我们为eGFP生成了mRNA编码（图5A-C），并通过流细胞测定法分析了转染效率（图6A）。 100，000 PM 或 50，000 BMDM 每孔未经处理的微蒂剂板转染 50、100 或 200 ng eGFP mRNA，时间为 6、9 或 24 小时。在PM和BMDM中，在转染后6小时可检测到高水平的eGFP表达。转染率随转染mRNA的量而增加，200纳克RNA最高（图6B，C）。对于PM，转染率在转染后6至9小时达到约50-65%（图6B）。转染后24小时，转染率明显较低，表明eGFP表达即将到期。因此，PM 不应在一夜之间转染。对于BMDM，转染率达到约80-85%（图6C）。24小时后转染率的下降在BMDM中明显。因此，BMDM 可以在一夜之间转染。在PM（图6D，E）和BMDM（图6F，G）中，转染细胞中的eGFP表达水平以时间与剂量相关的方式增加。重要的是，转染程序没有诱发溶酶或凋亡细胞死亡，因为转染后碘化阳性（PI）或附件五阳性巨噬细胞没有增加（图7A，B）。
免疫荧光显微镜对FLAG标记NEMO或IKK®变异的mRNA编码的转染效率进行了分析。12孔板每孔30000PM转染300纳克相应mRNA6小时。NEMO mRNA的转染率约为60%，IKK®mRNA约为55%（图8A，B）。因此，它们的转染率与eGFP mRNA相似，表明PM的一般转染率约为55%。
我们还使用该协议为Cre重组酶生成mRNA编码。从NEMOflox/flox小鼠中转染400，000BMDM，每孔17孔，含有400纳克的Cre重组酶mRNA，在48小时（图9）后，NEMO蛋白几乎完全耗尽，表明BMDM的高效转染。
PM和BMDM在转染后未分泌任何可检测到的IL-1、IL-6和TNF（图10A，B）。此外，NF-kB和MAPK信号通路在转染16后未激活，表明转染过程不激活前列腺炎信号。与未转染的巨噬细胞16相比，我们也没有观察到转染巨噬细胞的任何功能变化。
图1：NEMO编码质粒的线性化已经包含了正确方向的T7前马达。（A） 为 FLAG 标记的 NEMOWT或 NEMOC54/347A的质粒编码序列摘录。T7 前电机方向正确且接近 KOZAK 序列并启动科顿。T7 前电机区域、FLAG 标记和 NEMO 的编码序列 （CDS）、开始和停止密码子以及 XbaI 线性化的限制站点都是颜色编码的。（B） 代表1%的角胶凝胶，显示与Xbal线性化前后的质粒;每个通道加载1μL未经处理、线性或纯化的线性质粒DNA。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：T7 Promotor附件通过PCR对IKK®编码质粒。（A） FLAG 标记 IKK®WT或 IKK®S177/181E的质粒编码序列摘录。质粒不包含合适的T7前马达，因此由PCR连接。前进底漆的位置、方向和顺序（包含要添加的 T7 前运动序列）和反向引漆由箭头指示。T7 前电机区域、FLAG 标记和 IKK+ 的 CDS 以及启动和停止密码子均以颜色编码。（B） 代表1%甘草凝胶验证产生一个正确大小的单PCR产品使用上述引色。每通道加载 1 μL 的纯化 PCR 产品。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：来自NEMO和IKK+编码DNA模板的mRNA合成。（A） 代表性变性1.2%的甘草糖凝胶含有0.7%甲醛，显示NEMO和IKK®在聚（A）尾矿前后的纯化mRNA。2 μL 的 NEMOWT、 NEMOC54/347A、 IKK®WT和 IKK®S177/181E mRNA 每条通道均加载。装载了32μL ssRNA阶梯，用于确定RNA长度。请点击此处查看此图的较大版本。
图4：PM免疫磁富集和BMDM分化状态的流式细胞测定分析。（A） 通过流式细胞测定法分析免疫磁富集前后的围肠洗漱中F4/80+/CD11b+ PM的百分比。（B） BMDM在分化6天后对F4/80和CD11b的表达，通过流式细胞学验证。每个样本分别计算10，000或5，000个细胞。数据显示为 n = 3 个独立实验的均值 = SEM，每个实验。• P < 0.05， = P < 0.01， = P < 0.001 按学生 t 测试进行。 请点击此处查看此图的较大版本。
图5：mRNA合成与eGFP的聚（A）尾矿。（A） eGFP 的质粒编码序列摘录.质粒不包含合适的T7前马达，因此由PCR连接。前进底漆的位置、方向和顺序（包含要添加的 T7 前运动序列）和反向引漆由箭头指示。T7 前电机区域、用于 eGFP 的 CDS 以及启动和停止密码子均以颜色编码。（B） 代表1%的甘蔗凝胶，使用上述引物在PCR后显示纯化的阿曲龙。每通道加载 1 μL 的纯化 PCR 产品。（C） 代表变性1.2%的甘露胶含有0.7%甲醛，显示聚（A）尾矿前后eGFP的纯化mRNA。每条通道加载2μL的eGFP mRNA。装载了32μL ssRNA阶梯，用于确定RNA长度。请点击此处查看此图的较大版本。
图6：利用eGFP mRNA对围肠巨噬细胞和BMDM进行高效转染。巨噬细胞孵育6、9或24小时，与50、100或200纳克的eGFP mRNA复合到jetMESSENGER或单独使用jetMESSENGER（模拟），然后通过流式细胞学进行分析。（A） 用于定义活的巨噬细胞、可行的 eGFP+巨噬细胞和 PI= （即死亡）巨噬细胞的种群的定格策略。显示了6小时200纳克mRNA转染的代表性数据。（B，C）通过通过流动细胞测定（n = 5-7和n = 4-5独立实验）分析活的eGFP阳性细胞的百分比，确定了（B）PM和（C）BMDM的转染率。（D-G）eGFP的表达水平是通过分析活 （D） PM 和 （F） BMDM 的平均荧光强度 （MFI） 以及（E） PM 和 （G） BMDM （n = 5-7 和 n = 4-5 独立实验） 的活和 eGFP 阳性亚群来确定的。每个样本计算了10，000个细胞。数据显示为均值 = SEM. n.s. = 不显著;• P < 0.05， = P < 0.01， = P < 0.001 按学生 t 测试进行。 请点击此处查看此图的较大版本。
图7：转染不导致溶血细胞死亡或凋亡细胞死亡。通过分析PI阳性和附件V阳性细胞的百分比（n= 5-7和n= 4-5独立实验），确定了BMDM的转染诱导细胞死亡。未转染样本中存在的死巨噬细胞的百分比（某种程度的细胞死亡是由于使用未经处理的板体，但巨噬细胞从井中物理分离引起），在相应的转染样本中减去，只考虑到转染程序引起的细胞死亡。显示用于定义 PI+、附件 V+和 PI+/附件 V=巨噬细胞的浇注策略，用于用 200 ng mRNA 转染的具有代表性的 PM 数据集，6 小时。施陶罗斯波林（50 μM，1小时）用作正对照。每个样本计算了10，000个细胞。数据显示为均值 = SEM. n.d. = 不可检测。请点击此处查看此图的较大版本。
图8：NEMO和IKK构造使用mRNA编码的转染率。使用mRNA编码的NEMO构造和（B）IKK结构的转染率通过免疫荧光显微镜（n = 4个独立实验）进行量化。比例条 = 4 μm. 数据显示为平均值 = SEM. n.t. = 未转染，n.s. = 不显著;• P < 0.05， = P < 0.01， = P < 0.001 按学生 t 测试进行。 请点击此处查看此图的较大版本。
图9：对NeMOfl/fl BMDM的转染，用mRNA编码进行Cre重组酶，导致NEMO几乎完全缺乏。NEMOfl/fl小鼠的BMDM用mRNA编码Cre重组酶转染48小时。数据显示为平均值 = SEM. = P < 0.05， = P < 0.01， = P < 0.001 和 = P < 0.0001 通过学生 t 测试。请点击此处查看此图的较大版本。
图10：转染不引起前列腺炎反应。（A） PM 和 （B） BMDM 用 mRNA 编码转染为 NEMOWT或 NEMOC54/347A。作为积极对照，巨噬细胞在1倍感染时感染李斯特菌单细胞基因，或用5μg/mL LPS或聚（I：C）刺激5小时（PM）或24小时（BMDM）。ELISA（n = 3个独立实验）对将IL-1α、IL-6和TNF分泌到上清液中进行了量化。数据显示为均值 = SEM.n.t. = 不可转染，n.d. = 不可检测。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
在这里，我们提出了一个协议，用于使用体外转录mRNA对通常难以转染的通常难以转染的初级巨噬细胞进行高效转染。重要的是，使用该协议的巨噬细胞转染不会诱发细胞死亡或激活亲炎信号，表明转染试剂和转染的mRNA均不被识别为非自体。
mRNA的质量对于使用该协议成功转染巨噬细胞至关重要。因此，应非常小心，mRNA不会与RNA接触（例如，通过受污染的缓冲液或小瓶）。如有疑问，请检查mRNA降解（例如，通过胶质电泳）。转染速率和表达水平在转染后6小时已达最大值。因此，感兴趣的蛋白质可能以转染后早期时间点足以进行分析的水平表示。不过，我们还没有测试过这一点。此外，转染大量mRNA可能进一步增加转染率和/或表达水平。然而，转染大量mRNA也可能导致一定程度的免疫原性，甚至细胞毒性。完全缺乏是该协议的主要优点之一。因此，如果要转染大量mRNA，必须仔细评估免疫原性和细胞毒性。
表达水平与转染的mRNA量明显相关。然而，NEMO在NEMO缺乏的BMDM中的重新表达导致与野生型BMDM16类似的NEMO蛋白表达，表明使用该协议的mRNA转染不会导致感兴趣的蛋白质大量过度表达。因此，此协议可能不适合研究过度表达感兴趣的蛋白质的后果。然而，我们宁愿认为这是一个优势，因为蛋白质的过度表达往往会改变它的行为。
mRNA 转染的主要局限性，一般来说，它只导致感兴趣的蛋白质的瞬态表达（因为使用该协议生成和转染的 mRNA 将受到正常周转的影响）。与BMDM相比，PM似乎以较短的时间表达感兴趣的蛋白质。因此，与 BMDM 相比，PM 不应在一夜之间转染。感兴趣的给定蛋白质表示的时间会有所不同（因为 mRNA 的稳定性和蛋白质的稳定性也会不同）。不过，我们建议在转染的同一天进行选择的实验。如果感兴趣的蛋白质的表达需要较长的时间，细胞可能可以转染多次（例如，每天如18所述）。
我们已经成功地使用这里描述的协议转染鼠PM和BMDM和小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）16。理论上，使用该协议生成的mRNA可用于转染任何哺乳动物物种的任何特定细胞类型。不过，其他细胞类型的最佳mRNA转染试剂和修饰核苷的含量可能有所不同。
未来有希望的修改包括列入5'和3'--UtRs。大多数预先存在的质粒只含有感兴趣的蛋白质的CCDS，但不包括5'和3'--UtR。它们包括（如19所述）可能进一步增强mRNA的稳定性和表达。此外，只需将表位标记序列在正向或反向引物中（分别用于 N 和 C 端表位标记），即可将表位标记附加到感兴趣的蛋白质上。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了德国福森斯金舍夫（SFB 670）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-methyl-CTP (100 mM) | Jena Biosience | NU-1138S | stored at -20 °C |
| Antarctic phosphatase | New England BioLabs | M0289 | stored at -20 °C |
| Antarctic phosphatase reaction buffer (10x) | New England BioLabs | B0289 | stored at -20 °C |
| anti-NEMO/IKKγ antibody | Invitrogen | MA1-41046 | stored at -20 °C |
| anti-β-actin antibody | Sigma-Aldrich | A2228 | stored at -20 °C |
| Petri dishes 92,16 mm with cams | Sarstedt | 821,473 | stored at RT |
| CD11b Microbeads mouse and human | Miltenyi Biotec | 130-049-601 | stored at 4 °C |
| Cre recombinase + T7-Promotor forward primer | Sigma-Aldrich | 5′-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGGCAGCCGCCACCATGTCC AATTTACTGACCGTAC-3´, stored at -20 °C |
|
| Cre recombinase + T7-Promotor reverse primer | Sigma-Aldrich | 5′-CTAATCGCCATCTTCCAGCAGG C-3′, stored at -20 °C |
|
| DNA purification kit: QIAquick PCR purification Kit | Qiagen | 28104 | stored at RT |
| eGFP + T7-Promotor forward primer | Sigma-Aldrich | 5´-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGATCCATCGCCACCATGGTG AGCAAGG-3´, stored at -20 °C |
|
| eGFP + T7-Promotor reverse primer | Sigma-Aldrich | 5´-TGGTATGGCTGATTA TGATCTAGAGTCG-3´, stored at -20 °C |
|
| Fast Digest buffer (10x) | Thermo Scientific | B64 | stored at -20 °C |
| FastDigest XbaI | Thermo Scientific | FD0684 | stored at -20 °C |
| High-fidelity polymerase with proofreading: Q5 High-Fidelity DNA-Polymerase | New England Biolabs Inc | M0491S | stored at -20 °C |
| IKKβ + T7-Promotor forward primer | Sigma-Aldrich | 5′-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGTTGATCTACCATGGACTACA AAGACG-3′, stored at -20 °C |
|
| IKKβ + T7-Promotor reverse primer | Sigma-Aldrich | 5′-GAGGAAGCGAGAGCT-CCATCTG-3′, stored at -20 °C | |
| In vitro mRNA transcription kit: HiScribe T7 ARCA mRNA kit (with polyA tailing) | New England BioLabs | E2060 | stored at -20 °C |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | stored at RT |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | stored at RT |
| mRNA transfection buffer and reagent: jetMESSENGER | Polyplus transfection | 409-0001DE | stored at 4 °C |
| Mutant IKKβ IKK-2S177/181E plasmid | Addgene | 11105 | stored at -20 °C |
| Mutant NEMOC54/347A plasmid | Addgene | 27268 | stored at -20 °C |
| pEGFP-N3 plasmid | Addgene | 62043 | stored at -20 °C |
| poly(I:C) | Calbiochem | 528906 | stored at -20 °C |
| pPGK-Cre plasmid | F.T. Wunderlich, H. Wildner, K. Rajewsky, F. Edenhofer, New variants of inducible Cre recombinase: A novel mutant of Cre-PR fusion protein exhibits enhanced sensitivity and an expanded range of inducibility. Nucleic Acids Res. 29, 47e (2001). stored at -20 °C | ||
| pseudo-UTP (100 mM) | Jena Biosience | NU-1139S | stored at -20 °C |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | stored at RT |
| Rat-anti-mouse CD11b antibody, APC-conjugated | BioLegend | 101212 | stored at 4 °C |
| Rat-anti-mouse F4/80 antibody, PE-conjugated | eBioscience | 12-4801-82 | stored at 4 °C |
| Recombinant M-CSF | Peprotech | 315-02 | stored at -20 °C |
| RNA purification kit: MEGAclear transcription clean-up kit | ThermoFisher Scientific | AM1908 | stored at 4 °C |
| RNAse-degrading surfactant: RnaseZAP | Sigma-Aldrich | R2020 | stored at RT |
| Ultrapure LPS from E.coli O111:B4 | Invivogen | stored at -20 °C | |
| Wild type IKKβ plasmid | Addgene | 11103 | stored at -20 °C |
| Wild type NEMO plasmid | Addgene | 27268 | stored at -20 °C |
References
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