Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Højeffektiv Transfection af primær makrofager med in vitro transkriberet mRNA

Published: November 9, 2019 doi: 10.3791/60143
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2,3,4, 1
1Institute for Medical Microbiology, Immunology and Hygiene, Faculty of Medicine and University Hospital Cologne, University of Cologne, 2Center for Molecular Medicine Cologne, 3Cologne Cluster of Excellence on Cellular Stress Responses in Aging-associated Diseases (CECAD), 4German Center for Infection Research (DZIF)

Summary

Makrofager, især primær makrofager, er udfordrende at transficere, da de specialiserer sig i at opdage molekyler af ikke-selv oprindelse. Vi beskriver en protokol, der giver mulighed for yderst effektiv transfektering af primær makrofager med mRNA genereret fra DNA-skabeloner som plasmider.

Abstract

Makrofager er fagocytiske celler specialiseret i påvisning af molekyler af ikke-selv oprindelse. Til dette formål er de udstyret med et stort udvalg af mønster genkendelses receptorer (PRRs). Desværre gør dette også makrofager særligt udfordrende at transficere som transfektering reagens og transficeret nukleinsyre syrer er ofte anerkendt af PRRS som non-Self. Transfektering medfører derfor ofte makrofagaktivering og nedbrydning af de transficeret nukleinsyrer eller endog selvmord på makrofager. Her beskriver vi en protokol, der giver mulighed for højeffektiv transfektering af murine primær makrofager såsom peritonealdialyse makrofager (PM) og knoglemarv-afledte makrofager (bmdm) med mRNA in vitro transkriberet fra DNA-skabeloner såsom Plasmids. Med denne enkle protokol opnås transfektering på ca. 50-65% for PM og ca. 85% for bmdm uden cytotoksicitet eller immunogenicitet observeret. Vi beskriver i detaljer den generation af mRNA for transfektering fra DNA-konstruktioner som plasmider og transfektering procedure.

Introduction

Makrofager er fagocytiske celler, der specialiserer sig i påvisning, indtagelse og nedværdigende mikrober, apoptotiske celler og cellulære vragrester. Desuden, de bidrager til at orkestrat immunrespons ved at udskilte cytokiner og kemo okiner og ved at præsentere antigener til T-celler og B-celler. Makrofager spiller også vigtige roller i talrige andre processer, såsom sårheling, åreforkalkning, tumor og fedme.

For at kunne detektere ikke-selv molekylære molekyler, såsom patogen-associerede molekyl mønstre (Pjater) og out-of-Place-molekyler såsom skade relaterede molekylære mønstre (DAMPs), er makrofager udstyret med et stort udvalg af mønster genkendelses receptorer (PRR)1. Desværre gør dette også makrofager særligt udfordrende at transficere2 som transfektering reagens3 og transficeret nukleinsyre syrer4,5,6,7 ofte er anerkendt af PRRS som non-Self. Af denne grund resulterer transfektering af makrophager ved hjælp af kemiske eller fysiske metoder8 sædvanligvis i makrofag aktivering og nedbrydning af de transficeret nukleinsyrer eller endda i makrofag selvmord via pyroptose, en form for programmeret lytisk celledød udløst efter anerkendelse af cytosolisk PAMPs/damps såsom DNA eller udenlandsk RNA9. Biologisk transfektering af makrofager ved hjælp af vira såsom adenoviruser eller lentivira som vektorer er ofte mere effektiv, men opførelsen af sådanne virale vektorer er tidskrævende og kræver biosikkerhedsniveau 2 udstyr10,11.

Selv om makrofager er genstand for intensiv forskning, hæmmes analysen af deres funktioner på molekylær niveau, fordi et af de vigtigste værktøjer i molekylær biologi, transfektering af nukleinsyre konstruktioner til eksogen ekspression af proteiner, er næppe anvendelig. Dette tvinger ofte forskerne til at bruge makrofag-lignende cellelinjer frem for bona fide makrofager. Anvendelser for nukleinsyre konstruktions transfektering omfatter ekspression af muterede eller mærkede protein versioner, overekspression af et specifikt protein, protein genekspression i en respektive knockout baggrund og ekspression af proteiner fra andre arter (f. eks. , CRE rekombinase eller guide RNA og Cas9 til målrettet gen-udskæring).

Her beskriver vi en protokol, der giver mulighed for yderst effektiv transfektering (sædvanligvis svær at transfect) primær makrofager, der er murine peritonealdialyse makrofager (PM) og knoglemarv-afledte makrofager (bmdm) med mRNA genereret fra DNA-skabeloner såsom Plasmids. Vigtigere, den in vitro transkriberet mRNA genereret ved hjælp af denne protokol indeholder de naturligt forekommende modificerede Nukleosider 5-methyl-CTP og pseudo-UTP, der reducerer immunogenicitet og øge stabiliteten4,6,7,12,13. Desuden er 5 '-enderne af in vitro transkriberet mRNA defosforyleret af Antarktis fosfatase for at forhindre anerkendelse af riggen-i Complex14,15. Dette minimerer medfødte immun genkendelse af in vitro transkriberet mRNA. Med vores nemme at udføre protokol, er transfektering satser mellem 50-65% (peritoneal makrofager (PM)) og 85% (bmdm) nået, mens, vigtigere, der er ingen cytotoksicitet eller immunogenicitet observeret. Vi beskriver i detaljer (i) hvordan den immunologisk lyddæmpet mRNA for transfektering kan genereres fra DNA-konstruktioner såsom plasmider og (II) selve transfektering procedure.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Makrofag isolation fra mus blev udført i overensstemmelse med loven om dyrebeskyttelse i Tyskland i overensstemmelse med den etiske komité ved universitetet i Köln.

Bemærk: Udfør alle trin iført handsker. Udfør alle transfektering trin under en laminar flow hætte for at forhindre kontaminering af cellerne. Før du arbejder med mRNA, rengør alle instrumenter som pipetter og alle overflader med 70% ethanol og/eller et RNAse-nedværdigende overfladeaktivt stof (tabel over materialer). Sørg for, at alle reaktions slanger er RNAse-frie og sterile. Brug kun sterilt, RNAase-frit vand til fortyndinger. Brug kun pipettespidser med filtre. Skift pipettespidser efter hvert pipette Rings trin.

1. generering af DNA-skabelonen

Bemærk: DNA-skabelonen til in vitro mRNA transskription ved hjælp af denne protokol skal indeholde en T7 promotor-sekvens for at tillade docking af RNA-polymerase. Hvis plasmid indeholdende DNA-sekvensen af det protein af interesse allerede indeholder en korrekt orienteret T7 promotor sekvens direkte opstrøms for sekvensen af interesse, linearisering af plasmid (Se trin 1,1.) skal udføres. Ellers skal du vedhæfte en T7 promotor til interesse sekvensen ved polymerasekædereaktion (PCR, se trin 1,2.).

  1. Linearisering af T7 promotor-holdige plasmider
    1. Linearize plasmider, der allerede indeholder en korrekt orienteret T7 promotor sekvens ved fordøjelse med en restriktion enzym skæring nedstrøms for stop codon af sekvensen af interesse. Ellers vil transkriptionen ikke ende korrekt efter sekvensen af interesse.
      Bemærk: Det er bedst at bruge restriktionsenzymer, der forlader stumme ender eller 5 ' udhæng.
    2. Bekræft komplet linearisering af plasmid ved agopstået gel elektroforese af ufordøjet versus fordøjet plasmid DNA.
    3. Purify lineariseret plasmid DNA før brug som DNA-skabelon til in vitro mRNA transskription ved hjælp af en DNA rensning Kit (tabel over materialer).
  2. Udlæg til T7 promotor ved PCR
    1. Brug en Forward primer, der indeholder følgende komponenter (i den angivne rækkefølge fra 5 ' til 3 '): ca. 5 tilfældigt BP opstrøms for promotoren (f. eks. GAAAT); T7 promotor-sekvensen (TAATACGACTCACTATAG); to ekstra GS for øget transkriptionseffektivitet (GG); den målsekvens specifikke del, der er homologe til plasmid-sekvensen omkring start codon.
      Bemærk: Det bør bestå af: 3-6 BP opstrøms for KOZAK sekvens og starte codon, KOZAK sekvens og starte codon (normalt GCCACC ATG G), 12-18 BP nedstrøms for start codon. Hvis sekvensen af interesse ikke allerede indeholder en KOZAK sekvens eller starte codon, disse kan fastgøres i dette trin ved blot at medtage dem i primer sekvens.
    2. Beregn kun tm af fremad primer ved at tage hensyn til den del, der er homologøs til målsekvensen.
    3. For at vurdere dimers/hårnål dannelse bruge hele primer sekvens, som nemt kan overstige 50 BP.
    4. Brug en omvendt primer placeret et sted nedstrøms for stop codon.
      Bemærk: Hvis sekvensen af interesse ikke allerede indeholder et stop codon, kan det være vedhæftet i dette trin ved blot at medtage det i primer sekvens.
    5. Brug Forward og reverse primere til at udføre en PCR ved hjælp af en high-fidelity polymerase med korrekturlæsning (tabel over materialer).
    6. Bekræft generering af et enkelt produkt og amplikonen størrelse ved hjælp af agrose gel elektroforese (f. eks. Brug en 1% agopstået gel og 100 V konstant strøm).
    7. Rense PCR-produktet før brug som DNA-skabelon til in vitro mRNA-transkriptionen ved hjælp af et DNA-rensningsudstyr.

2. mRNA-generering

  1. Tø alle komponenter i in vitro mRNA transkriptionssæt (Se tabellen over materialer). Vortex til 5 s og drej ned i 2 s ved 2.000 x g. Opbevares på is indtil brug.
  2. Reaktionsblandingen forberedes til in vitro-mRNA-transskription i et 0,5 mL mikrocentrifuge glas i følgende rækkefølge (samlet volumen på 40 μL): 20 μL 10x ARCA/NTP-mix (inkluderet i in vitro mRNA transkriptionssæt); 0,25 μL af 5-methyl-CTP (endelig koncentration (f.c.) er 1,25 mM; 50% af total CTP); 0,25 μL pseudo-UTP (f.c. er 1,25 mM; 50% af det samlede UTP); X μL DNA-skabelon; 2 μL T7 RNA polymerase mix (inkluderet i in vitro mRNA transkriptionssæt); Y μL RNAse-fri H2O.
    Bemærk: X er et volumen, der indeholder mindst 1 μg DNA. For eksempel 1,6 μL fra en 625 ng/μL stamopløsning. Y er det ekstra volumen til det totale rumfang på 40 μL.
  3. Vortex til 5 s og drej ned i 2 s ved 2.000 x g. Inkuber ved 37 °C i 30 minutter ved 400 rpm på en termisk mixer til in vitro transkription.
  4. Tilsæt derefter 2 μL DNase i direkte til reaktionsblandingen for at fjerne skabelon-DNA. Vortex til 5 s og drej ned i 2 s ved 2.000 x g.
  5. Der inkubates ved 37 °C i 15 minutter ved 400 rpm på en termisk mixer. Tag en alikvot på 2 μL for kontrol gelen (trin 3,3) og opbevar ved-80 °C.
  6. For poly (A)-detailhandel tilsættes følgende komponenter direkte til den tidligere reaktionsblanding (til en endelig volumen på 50 μL): 5 μL 10x poly (A) polymerasereaktions buffer og 5 μL poly (A) polymerase (begge inkluderet i in vitro mRNA transkriptionssæt). Vortex til 5 s og drej ned i 2 s ved 2.000 x g.
  7. Blandingen inkubates ved 37 °C i 30 minutter ved 400 rpm på en termo ixer. Tag en alikvot på 2 μL for kontrol gelen (trin 3,3) og opbevar ved-80 °C.
  8. Til defosforylering af de 5 ́-ender af mRNA tilsættes følgende komponenter direkte til den tidligere reaktionsblanding (til et endeligt volumen på 60 μL): 3 μL RNAse-fri H2O; 6 μL af 10 x antarktiske fosfatasereaktions buffer; 3 μL antarktiske fosfatase (15 enheder for reaktions volumen på 60 μL). Vortex til 5 s og drej ned i 2 s ved 2.000 x g.
  9. Blandingen inkubates ved 37 °C i 30 minutter ved 400 rpm på en termisk mixer.
  10. Varme-inaktivere Antarktis fosfatase ved inkubation ved 80 °C i 2 min.
    Bemærk: Ideelt set bruge en separat termisk mixer, skal du ikke vente, indtil den første mixer når den ønskede temperatur.

3. mRNA rensning

  1. Rense in vitro transkriberet mRNA ved hjælp af en dedikeret RNA rensning Kit (tabel over materialer).
    1. Tilsæt X μL elueringsopløsning til mRNA-reaktionsblandingen fra trin 2,10. Bland med invertering 5 gange. Tilsæt 300 μL bindings opløsning koncentrat. Bland med blid pipettering 5 gange.
      Bemærk: X er det ekstra volumen til et samlet volumen på 100 μL. For eksempel tilsættes 40 μL elueringsopløsning til 60 μL mRNA-reaktionsblanding.
    2. Tilsæt 100 μL RNAase-Fri ethanol. Bland med blid pipettering 5 gange.
    3. Placer en filterkolonne i et af de medfølgende indsamlings slanger. Overfør forsigtigt mRNA-reaktionsblandingen til midten af filteret uden at røre ved filteret. Centrifugeres ved 15.000 x g i 1 min. ved stuetemperatur (RT).
    4. Løft forsigtigt filter kolonnen og kassér gennemstrømningen i opsamlingsrøret. Placer filter kolonnen tilbage i samme opsamlings slange.
    5. Tilsæt 500 μL vaskeopløsning (glem ikke at tilsætte 20 mL RNAase-frit ethanol, før Vaskeopløsningen anvendes første gang).
    6. Centrifugeres ved 15.000 x g i 1 minut ved rt. Gentag trin 3.1.4-3.1.6 for at vaske en gang til.
    7. Centrifugeres ved fuld hastighed (17.900 x g) i 1 min ved rt for at fjerne eventuel restvæske fra filter kolonnen. Tag forsigtigt filter søjlen fra opsamlingsrøret. Placer filter kolonnen i et nyt opsamlings glas.
    8. Tilsæt 50 μL elueringsbuffer til midten af filteret uden at røre ved filteret. Der inkubates ved 65 °C i 10 min. på en termisk mixer.
    9. Centrifuge ved 15.000 x g i 1 min ved RT. Fjern filter kolonnen, og kassér den.
  2. Koncentrationen og renheden af elueret mRNA måles for eksempel ved hjælp af et mikrovolumen Spektrofotometer til måling af absorbans ved 260 og 280 Nm.
    Bemærk: Et A260/A280 forhold på 1,8-2,1 er betegnende for højt renset mRNA.
  3. Kontrollere tilstedeværelsen af et enkelt produkt, korrekte transkriptionen længde og poly (a) detailhandel ved at analysere de aliquoter fra trin 2,5 og 2,7 ved agrose gel elektroforese under Denaturerings betingelser (for eksempel bruge en 1,2% agopstået gel indeholdende 20 mm 3-(N-morpholino) propanesulfonsyre [MOPS], 5 mM natriumacetat, 1 mM EDTA og 20% formaldehyd og køre i 20 mM MOPS, 5 mM natriumacetat, 1 mM EDTA og 0,74% formaldehyd ved 100 V konstant strøm).
  4. Den rensede mRNA opbevares i elueringsrøret ved-80 °C indtil transfection. Hvis du bruger kun små mængder af mRNA for transfektering derefter alikvot mRNA for at undgå gentagne fryse-tø cyklusser.
    Bemærk: mRNA kan opbevares ved-80 °c i ca. 1 år.

4. præparat til makrofag

  1. Euthanize C57/BL6 mus (brug mus af samme køn og 6-24 ugers alderen) ved livmoderhals dislokation.
    Bemærk: De samme mus kan bruges til isolering af PM (trin 4,2) og generation af BMDM (trin 4,3 og 4,4). For isolation af PM bruge mindst to mus. Hvis kun BMDM skal genereres en mus normalt er nok.
  2. Immunomagnetisk berigelse af peritonealdialyse makrofager.
    1. Fyld en 10 mL sprøjte med en 0,9 x 40 mm kanyle med 8 mL iskold fosfat-bufferet saltvand (PBS) og 2 mL luft. Skyl peritonealhulen med PBS. Luften vil danne en boble, der minimerer lækage af PBS.
    2. Hurtig opsamling af peritonealdialyse skylning med den samme sprøjte og overførsel til et 50 ml konisk Centrifugerings slange. Kombiner peritonealceller af flere mus, hvis det er nødvendigt. Hold cellesuspensionen på isen.
    3. Centrifuge cellesuspension ved 650 x g i 5 min ved 4 °c. Supernatanten kasseres, og celle pellet resuspenderes i 5 mL 0,2% NaCl for 30 s for at lyserøde blodlegemer.
    4. Der tilsættes 5 mL 1,6% NaCl til et samlet volumen på 10 mL for at rekonstruere isotoniske tilstande. Centrifugeres ved 650 x g i 5 minutter ved 4 °c.
    5. Supernatanten kasseres, og celle pellet resuspenderes i 97,5 μL magnetisk celle sortering (MCS) buffer (2 mM ethylenediaminetetraeddikesyre [EDTA], 5% bovint serumalbumin [BSA] i PBS) pr. 1 peritonealdialyse skylning (f. eks. Hvis tre mus blev skyllet, resuspension i 292,5 μL ).
    6. Tilsæt 2,5 μL Paramagnetiske perler konjugeret til et CD11b-specifikt antistof pr. 97,5 μL cellesuspension (f. eks. tilsættes 7,5 μL til 292,5 μL).
    7. Inkubér på is i 15 minutter ved 150 rpm på en orbital shaker.
    8. Centrifuge cellesuspension ved 650 x g i 5 minutter ved 4 °c, kassér supernatanten og resuspender celle pellet i 1 ml MCS buffer.
    9. Der tilsættes 4 mL MCS-buffer til et samlet volumen på 5 mL, og cellerne vaskes ved forsigtigt at pipettere op og ned tre gange.
    10. Gentag trin 4.2.8 og 4.2.9 to gange mere for i alt tre vaske trin.
    11. Under vask trin placere en LS kolonne i en magnetisk celle separator (Se tabel over materialer). Kolonnen skylles med 3 mL MCS-buffer.
      Bemærk: Undgå bobler, da disse kan tilstoppe søjlen.
    12. Resuspension af celle pellet i 1 mL MCS buffer. Der tilsættes 3 mL MCS-buffer til et samlet rumfang på 4 mL, som blandes ved pipettering op og ned tre gange.
    13. 4 mL cellesuspension overføres til kolonnen med skyllede LS.
      Bemærk: Igen, undgå eventuelle bobler, da disse kan tilstoppe kolonnen.
    14. Vent, indtil beholderen til søjlen er helt tom. Tilsæt ikke yderligere væske, før kolonnen holder op med at dryppe.
    15. Føj 3 mL MCS-buffer til kolonnen. Derefter, vente, indtil reservoiret af søjlen er helt tom. Gentag trin 4.2.15 to gange mere.
    16. Placer kolonnen LS i et 15 mL konisk Centrifugerings rør. Anvend 5 mL MCS-buffer på kolonnen. Vent, indtil 2 mL væske er passeret gennem søjlen, og brug derefter stemplet til forsigtigt at skubbe den resterende fraktion ind i røret.
    17. Centrifuge cellesuspension ved 650 x g i 5 min ved 4 °c og kassér supernatanten.
    18. Celle pellet opslæmmes i 1 mL DMEM suppleret med 10% varme inaktiveret føtal kalv serum (FCS) (DMEM + FCS).
    19. Bestem antallet af levedygtige celler ved at tælle i trypan og et blå opløsning i en Neubauer tælle kammer og frøceller i DMEM + FCS i kultur plader.
      Bemærk: Seed PM ved en tæthed på 100.000 celler/godt i en flad bund mikrotiterplade. Brug ikke vævskultur behandlede plader, da PM ikke kan adskilles fra disse. Brug ikke-behandlede plader i stedet.
  3. Generering af BMDM
    1. Fjern hud og muskler fra bagbenene ved hjælp af et par saks. Vask hvert ben ved kort nedsænkning i 70% ethanol.
    2. Frigør benene og Åbn begge ender af femur og skinneben ved at skære med saks.
    3. Fyld en 5 ml sprøjte fyldt med 0,6 mm x 30 mm kanyle med 5 ml meget lavt endotoksin (VLE) rpmi 1640 og skyl knoglemarven ud af de åbnede knogler i en kulturret.
    4. Kombiner knoglemarv af flere mus, hvis det kræves, ved at gentage trin 4.3.1-4.3.3. Knoglemarven overføres til et 50 mL konisk Centrifugerings rør.
    5. Centrifuger knoglemarvs suspensionen ved 650 x g i 5 minutter ved 4 °c, og supernatanten kasseres.
    6. Resuspension celle pellet i 5 mL røde blodlegemer lyse buffer (8,3% NH4Cl, 0,1 M Tris) og inkubere i 5 min ved rt at lysere de røde blodlegemer.
    7. Centrifuger cellesuspensionen ved 650 x g ved 4 ° C i 5 min., og supernatanten kasseres.
    8. Resuspension celle pellet i 1 mL VLE RPMI 1640 medium suppleret med 10% FCS, 1% penicillin/streptomycin, 1% HEPES, 1% natriumpyruvat og 10 ng/mL rekombinant makrofag koloni-stimulerende faktor (M-CSF) (RPMI+ ++ + +).
    9. Der tilsættes 4 ml rpmi+ + + + + til et samlet volumen på 5 ml.
    10. Forbered 5 92 mm x 16 mm ubehandlede Petri skåle med cams (Se tabel over materialer) pr. mus ved Pipettering af 7 ml rpmi+ + + + + medium i hver skål.
    11. 1 mL celle opløsning overføres til de 5 tilberedte kultur retter, og inkubaten ved 37 °C og 5% CO2.
    12. Efter 4 dage, fodre cellerne ved at tilføje 4 mL RPMI+ ++ + +. Efter 6-7 dage er knoglemarv cellerne fuldt differentieret til BMDM.
  4. Høst af BMDM
    1. Fjern mediet helt fra kultur retterne. Tilsæt 5 mL varm 0,2 mM EDTA i PBS til hver skål.
    2. Skrabe forsigtigt hele pladen med en celle skraber for at løsne BMDM. Kombinér celle suspensionerne i et 50 mL konisk Centrifugerings slange.
    3. Skyl alle 5 retter igen. Brug det samme volumen på 5 mL varm 0,2 mM EDTA i PBS til alle 5 retter. Kombiner denne cellesuspension med en fra det forrige trin.
    4. Centrifuger cellesuspensionen ved 650 x g i 5 minutter ved 4 ° C, og kassér supernatanten.
    5. Resuspension celle pellet i 1 mL af VLE RPMI 1640 medium suppleret med 10% FCS, 1% HEPES, 1% natriumpyruvat og 10 ng/mL rekombinant M-CSF men ingen antibiotika (RPMI+ ++ +).
    6. Bestem antallet af levedygtige celler ved at tælle i trypan og et blå opløsning i en Neubauer tælle kammer og frøceller i RPMI+ + + til kultur plader.
      Bemærk: Seed BMDM ved en densitet på 50.000 celler/godt maksimum i en flad bund mikrotiterplade. Brug ikke vævskultur behandlede plader, da BMDM næppe kan adskilles fra disse. Brug ikke-behandlede plader i stedet.

5. overførsel af makrofager med mRNA

  1. Beregn det påkrævede volumen af mRNA transfektering buffer.
    Bemærk: Mængden af mRNA transfektering buffer kræves afhænger af brønd størrelse: Brug 200 μl til transfektering i en 6-brønd plade, 100 μl i en 12-brønd plade og så videre. Tilføj altid lidt ekstra volumen på grund af pipette Rings tabet (men ikke for meget for at forhindre unødig fortynding af mRNA). Brug for eksempel 450 μl i stedet for 4 x 100 μl = 400 μl til transficere i 4 brønde af en 12-brønd plade.
  2. Beregn det påkrævede volumen af mRNA transfektering reagens. MRNA transfektering reagens tilsættes i forholdet 1:50. For eksempel kræves der 9 μl mRNA transfektering reagens til et endeligt volumen på 450 μl.
  3. Beregn den samlede mængde mRNA, der kræves. Der kræves mindst 100 ng pr. 100.000 makrofager til effektiv transfection, 200 ng virker endnu bedre (f. eks. 800 ng mRNA til transficere 400.000
    1. Multiplicer den beregnede mængde mRNA kræves med det samlede antal brønde, der skal transficeret (f. eks 4 brønde med 400.000 makrofager hver: 4 x 800 NG = 3.200 ng mRNA er påkrævet i alt for alle brønde). For eksempel, hvis din mRNA bestand er 426,8 ng/μl, 7,49 μl er nødvendige for optimal transfektering af 4 brønde med 400.000 makrofager hver.
  4. Tilføj den beregnede volumen af mRNA transfektering buffer (trin 5,1.) minus volumener for mRNA transfektering reagens (trin 5,2) og mRNA (trin 5,3) til et reaktions slange. For eksempel 450 μL-9 μL-7,49 μL = 433,51 μL.
  5. Tø mRNA-bestanden op, og bland den med en blid vending af elueringsrøret. Tilsæt den beregnede volumen af mRNA (trin 5,3) til reaktionsrøret med mRNA-reaktionsbuffer (i eksemplet ovenfor: 7,49 μL i 433,51 μL).
  6. Vortex til 5 s og drej ned i 2 s ved 2.000 x g.
  7. Vortex mRNA transfektering reagens til 5 s og drej ned i 2 s ved 2.000 x g.
  8. Tilsæt den beregnede volumen af mRNA transfektering reagens (trin 5,2) til reaktionsrøret indeholdende mRNA transfektering buffer og mRNA (i eksemplet præsenteret ovenfor: 9 μl mRNA transfektering reagens).
  9. Vortex transfektering mix for 5 s og spin ned for 2 s ved 2.000 x g.
  10. Inkuber i 15 minutter ved RT.
  11. Udskift i mellemtiden kulturmediet for makrofager med et frisk, varmt dyrkningsmedium (Se trin 4.2.18. og 4.4.5).
  12. Efter inkubations trin 5,10 tilsættes transfektering-blandingen til brøndene med makrofager i et volumen, der passer til brøndens størrelse (Se trin 5,1). Tilsæt transfektering mix dråbevis i en cirkel udefra til midten af brønden.
  13. Forsigtigt klippe pladen, først i en lodret og derefter i en horisontal retning for at sikre en ensartet fordeling af transfektering mix i brønden. Derefter inkubates ved 37 °C og 5% CO2. Syntesen af proteinet kodet af den transficeret mRNA vil begynde kort efter transfection. For de bedste resultater, Inkuber i mindst 6 timer.
  14. Efter inkubationen analyseres transfektering effektivitet ved (immuno) Fluorescens mikroskopi, flowcytometri eller immun16, eller brug de transficeret makrophages for det valgte eksperiment.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi har med succes brugt denne protokol til at generere mRNA-kodning for flag-Tagged Nemo og ikkβ varianter for transfektering af primære makrofager16. Plasmider-kodningen for flag-Tagged Wild-type (Nemo WT) og C54/347a mutant Nemo (Nemo C54/374a) (Se tabellen over materialer) indeholder allerede en T7 promotor i den korrekte retning (figur 1a). Således var vi kun nødt til at linearisere plasmider at generere DNA-skabeloner til in vitro transskription. Til dette formål blev 10 μg plasmid-DNA fordøjet med 5 μL Xbal, hvilket resulterede i lineariseringen af plasmid på grund af et enkelt cut 3 ' af stop codon. Komplet linearisering af plasmid-DNA blev verificeret af agrose gel elektroforese (figur 1B).

Plasmider-kodningen for flag-Tagged Wild-type (ikkβWT) og S177/181e mutant ikkβ (ikkβS177/181e) indeholder ikke en T7 promotor. Derfor har vi vedhæftet en T7 promotor ved PCR for at generere DNA-skabelonerne til in vitro-transskription (figur 2a). Generering af et specifikt PCR-produkt, nemlig et enkelt produkt af korrekt størrelse, blev verificeret af agrose gel elektroforese (figur 2B).

Efter in vitro transskription ved hjælp af de respektive DNA-skabeloner, vi verificeret generation af et enkelt mRNA produkt af korrekt størrelse og poly (A) detailhandel ved agrose gel elektroforese under Denaturerings betingelser (figur 3).

For at kontrollere, at mRNA, der er genereret ved hjælp af denne protokol, muliggør transfektering af primæreB for flow cytometriske analyser af immunomagnetisk berigelse af PM og differentierings status for bmdm), har vi genereret mRNA-kodning for egfp (figur 5a-C) og analyseret transfektering effektivitet ved flowcytometri (figur 6a). 100.000 PM eller 50.000 BMDM pr. brønd af en ubehandlet mikrotiterplade blev transficeret med 50, 100 eller 200 ng af eGFP mRNA for 6, 9 eller 24 timer. I både PM og BMDM kan der detekteres høje niveauer af eGFP-ekspression ved 6 timer efter transfection. Transfection steg med mængden af transficeret mRNA og var højest for 200 ng mRNA (figur 6B, C). For PM, transfektering sats nået omkring 50-65% ved 6 til 9 h efter transfektering (figur 6B). Ved 24 timer efter transfektering var transfektering væsentligt lavere, hvilket indikerer, at egfp-ekspression udløb. Således, PM bør ikke transficeret natten. For bmdm nåede transfektering med ca. 80-85% (figur 6C). Faldet i transfektering efter 24 timer var langt mindre udtalt i bmdm. Således kan bmdm transficeret natten. I begge PM (figur 6D, E) og bmdm (figur 6F, G) steg ekspressions niveauet for egfp i transficeret celler i en tid-og dosisafhængig måde. Det er vigtigt, at transfektering-proceduren ikke inducerede lytisk eller apoptotisk celledød, da der ikke var nogen stigning i propidium iodide-positive (PI) eller annektering i V-positive makrofager efter transformationen (figur 7A, B).

Transfection effektivitet af mRNAs-kodning for FLAG-mærkede NEMO eller IKKβ varianter blev analyseret af immunofluorescens mikroskopi. 300.000 PM pr brønd af en 12-brønd plade blev transficeret med 300 ng af respektive mRNA for 6 h. transfection var ca. 60% for Nemo mRNAs og ca. 55% for ikkβ mRNAs (figur 8a, B). Deres transfektering var således lig med egfp mRNA, hvilket indikerer en generel transfektering på ca. 55% for PM.

Vi har også brugt denne protokol til at generere mRNA-kodning til CRE rekombinase. Transfektering af 400.000 bmdm fra Nemoflox/flox mus17 per brønd af en 12-brønd plade med 400 ng af CRE rekombinase mRNA resulterede i næsten fuldstændig nedbrydning for Nemo protein efter 48 h (figur 9), hvilket indikerer meget effektiv transfektering af bmdm.

PM og bmdm udskilte ikke påvise bare mængder af Il-1β, IL-6 og TNF efter transfektering (figur 10A, B). Desuden blev NF-kB-og MAPK-signalering-veje ikke aktiveret efter transfektering16 , hvilket indikerer, at transfektering-proceduren ikke aktiverer proinflammatorisk signalering. Vi har heller ikke observeret nogen funktionelle ændringer af transfunderes makrofager i forhold til ikke transfunderes makrofager16.

Figure 1
Figur 1: linearisering af Nemo-kodning plasmider allerede indeholder en T7 promotor i den korrekte retning. (A) sekvens uddrag af plasmid-kodning for flag-Tagged NemoWT eller NemoC54/347a. En T7 promotor i korrekt orientering og tæt på KOZAK-sekvensen og start codon er allerede til stede. T7 promotor-regionen, kodnings sekvensen (CDS) for flaget tag og Nemo, start og stop kodon og restriktions stedet for linearisering med xbai er farvekodede. B) repræsentativ 1% agopstået gel, der viser plasmiderne før og efter lineariseringen med xbal 1 μL ubehandlet, lineariseret eller renset lineariseret plasmid-DNA blev indlæst pr. Lane. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: T7 promotor-fastgørelse til ikkß-kodning af plasmider ved PCR. A) sekvens uddrag af plasmid-KODNINGEN for flag-Tagged IkkβWT eller IkkβS177/181e. Plasmiderne indeholder ikke en egnet T7 promotor, som derfor er fastgjort af PCR. Placering, retning og sekvens af fremad primer (indeholdende T7 promotor sekvens, der skal tilføjes) og den omvendte primer er angivet med pilene. T7 promotor-regionen, cd'erne for flaget tag og ikkβ og start og stop kodon er farvekodede. B) repræsentativ 1% agopstået gel, der verificerer generering af et enkelt PCR-produkt af korrekt størrelse ved hjælp af de ovenfor angivne primere. 1 μL af det rensede PCR-produkt blev indlæst pr. vognbane. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: mRNA-syntese fra Nemo-og IKKβ-kodning af DNA-skabeloner. A) repræsentativ denaturering 1,2% agopstået gel indeholdende 0,7% formaldehyd, der viser den rensede mRNA af Nemo og ikkβ konstruktioner før og efter poly (A)-handelen. 2 μL NEMOWT, NemoC54/347a, IKKβWT og ikkβS177/181e mRNA blev indlæst pr. vognbane. En 32 μL ssRNA-stige blev lastet til bestemmelse af RNA-længde. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: flow cytometriske analyser af den immunomagnetiske berigelse af PM og BMDM-differentierings status. A) procentdelen af F4/80+/cd11b+ PM i peritonealdialyse skylning før og efter immunomagnetisk berigelse blev analyseret ved flowcytometri. (B) ekspression af F4/80 og CD11B af bmdm efter 6 dages differentiering blev verificeret af flowcytometri. 10.000 eller 5.000 celler blev talt pr. prøve hhv. Data vises som middel ± SEM af n = 3 uafhængige eksperimenter, hver. * P < 0,05, * * p < 0,01, * * * p < 0,001 og * * * * p < 0,0001 af student's t-test. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: mRNA-syntese med poly (A)-detailhandel med eGFP. (A) sekvens uddrag af plasmid-kodning for egfp. Plasmid indeholder ikke en egnet T7 promotor, som derfor er fastgjort af PCR. Placering, retning og sekvens af fremad primer (indeholdende T7 promotor sekvens, der skal tilføjes) og den omvendte primer er angivet med pilene. T7 promotor-regionen, cd'erne til egfp og start og stop kodon er farvekodede. B) repræsentativt 1% agopstået gel, der viser den rensede amplikonen efter PCR med de ovenfor angivne primere. 1 μL af det rensede PCR-produkt blev indlæst pr. vognbane. C) repræsentativ denaturering 1,2% agopstået gel indeholdende 0,7% formaldehyd, der viser den rensede mRNA af egfp før og efter poly (A)-handelen. der blev indlæst 2 μL eGFP mRNA pr. vognbane. En 32 μL ssRNA-stige blev lastet til bestemmelse af RNA-længde. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: meget effektiv transfektering af både peritonealdialyse makrofager og bmdm med egfp mRNA. Makrofager blev inkuberet for 6, 9 eller 24 timer med 50, 100 eller 200 ng af egfp mRNA kompleks til jetmessenger eller med jetmessenger alene (mock) og derefter analyseret af flow cytometry. A) gating-strategi, der anvendes til at definere populationer af levedygtige makrofager, levedygtige egfp+ makrofager og PI+ (dvs. døde) makrofager. Der vises repræsentative data for transfektering med 200 ng mRNA for 6 timer. (B, C) Transfection rater af (B) PM og (C) bmdm blev bestemt ved at analysere procentdelen af levedygtige egfp-positive celler ved flow cytometri (n = 5-7 og n = 4-5 uafhængige eksperimenter, hhv.). (D-G) Ekspressions niveauerne for egfp blev bestemt ved at analysere den gennemsnitlige fluorescens intensitet (MFI) af levedygtige (D) PM og (F) bmdm og den levedygtige og egfp-positive delpopulation af (E) PM og (G) bmdm (n = 5-7 og n = 4-5 uafhængige eksperimenter). 10.000 celler blev talt pr. prøve. Data vises som middelværdien ± SEM. n.s. = ikke signifikant; * P < 0,05, * * p < 0,01, * * * p < 0,001 og * * * * p < 0,0001 af student's t-test. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: Transfection inducerer ikke lytisk eller apoptotisk celledød. Transfection-induceret celledød af (A) PM og (B) bmdm blev bestemt ved at analysere procentdelen af pi-positive og bilagI V-positive celler (henholdsvis n = 5-7 og n = 4-5 uafhængige eksperimenter). Procentdelen af døde makrofager i utransplerede prøver (en vis grad af celledød skyldtes fysisk udstationering af makrofager fra brøndene på trods af brugen af ikke-behandlede plader) blev trukket fra den i de respektive transficeret prøver til kun at tage hensyn til celledød induceret af transfektering procedure. Den gating-strategi, der anvendes til at definere populationerne af PI+, Bilagin v+ og PI+/bilagin v+ makrofager, vises for et repræsentativt datasæt af PM transficeret med 200 ng mRNA for 6 timer. Staurosporin (50 μM for 1 time) blev anvendt som positiv kontrol. 10.000 celler blev talt pr. prøve. Data vises som middelværdien ± SEM. n.d. = ikke detekterbar. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 8
Figur 8: Transfection satser ved hjælp af mRNA-kodning for Nemo og IKK konstruktioner. Transfection satser ved hjælp af mRNA-kodning for (A) Nemo-konstruktioner og (B) ikk-konstruktioner blev kvantificeret ved immunofluorescens mikroskopi (n = 4 uafhængige eksperimenter). Scale bar = 4 μm. data vises som middelværdien ± SEM. n.t. = ikke transfected, n.s. = ikke signifikant; * P < 0,05, * * p < 0,01, * * * p < 0,001 og * * * * p < 0,0001 af student's t-test. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 9
Figur 9: Transfection af Nemofl/fl Bmdm med mRNA-kodning for CRE-rekombinase resulterer i næsten fuldstændig mangel for Nemo. Bmdm fra Nemofl/fl mus blev transficeret med mRNA-kodning CRE rekombinase for 48 h. mangel for Nemo-protein som følge af CRE-medieret knockout blev vurderet af Western blot ved hjælp af specifikke antistoffer, der anerkender Nemo eller β-actin og kvantificeret ved densitometri (n = 5 uafhængige eksperimenter). Data vises som Mean ± SEM. * p < 0,05, * * p < 0,01, * * * p < 0,001 og * * * * p < 0,0001 af elevens t-test. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 10
Figur 10: Transfection inducerer ikke en proinflammatorisk respons. (A) PM og (B) bmdm blev Transficeret med mRNA-kodning for NemoWT eller NemoC54/347a. Som positiv kontrol blev makrofager inficeret med Listeria monocytogenes ved en mangfoldighed af infektion på 1 eller stimuleret med 5 μg/ml LPS eller poly (I:C) i 5 timer (PM) eller 24 timer (bmdm). Udskillelsen af IL-1 β, IL-6 og TNF i supernatanten blev kvantificeret ved ELISA (n = 3 uafhængige eksperimenter). Data vises som middelværdien ± SEM. n.t. = ikke transfected, n.d. = ikke detekterbar. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her præsenterer vi en protokol for højeffektiv transfektering af sædvanligvis svære at transfect primære makro fagter med in vitro transkriberet mRNA. Vigtigere, transfektering af makrofager ved hjælp af denne protokol ikke fremkalde celledød eller aktivere proinflammatorisk signalering indikerer, at hverken transfektering reagens eller transficeret mRNA er anerkendt som non-Self.

Mrna's kvalitet er af afgørende betydning for en vellykket transfektering af makrophages ved hjælp af denne protokol. Derfor bør man være meget forsigtig med, at mRNA ikke kommer i kontakt med RNAses (f. eks. gennem kontaminerede buffere eller hætteglas). Hvis du er i tvivl, så kontroller for mRNA nedbrydning (f. eks. ved agrose gel elektroforese). Transfection sats og ekspressionsniveau var allerede maksimal ved 6 timer efter transfection. Det er derfor muligt, at det pågældende protein udtrykkes på et niveau, der er tilstrækkeligt til analyse på tidligere tidspunkter efter transfection. Vi har ikke testet dette, selv om. Desuden kan transftionering af større mængder mRNA yderligere øge transfektering sats og/eller ekspressionsniveau. Imidlertid kan transftering af større mængder mRNA muligvis også føre til en vis grad af immunogenicitet eller endog cytotoksicitet. Den fuldstændige mangel på samme er en af de vigtigste fordele ved denne protokol. Hvis større mængder mRNA skal transfteres, skal immunogeniciteten og cytotoksiciteten derfor evalueres nøje.

Udtryks niveauet er klart korreleret med mængden af transficeret mRNA. Endnu, genekspression af Nemo i Nemo-mangelfuld bmdm resulterede i lignende Nemo protein udtryk som i dværg bmdm16 indikerer, at mRNA transfektering ved hjælp af denne protokol ikke fører til væsentlig overekspression af det protein af interesse. Således kan denne protokol ikke være egnet til at studere konsekvenserne af overekspression af det protein af interesse. Vi mener snarere, at dette en fordel, dog, som over ekspression af et protein ofte ændrer sin adfærd.

Den væsentligste begrænsning af mRNA-transfection er generelt, at den kun resulterer i forbigående ekspression af det pågældende protein (fordi den mRNA, der genereres og transfteres ved hjælp af denne protokol, vil være underlagt normal omsætning). PM synes at udtrykke det protein af interesse for en kortere periode sammenlignet med BMDM. Således, i modsætning til bmdm, PM bør ikke transficeret natten. Hvor længe et givet protein af interesse vil blive udtrykt vil variere (som både stabiliteten af mRNA og at af proteinet vil variere). Vi anbefaler dog, at du udfører det valg, du har på samme dag som transfection. Hvis det er nødvendigt at ekspressions proteinet i længere perioder, kan cellerne sandsynligvis transfteres flere gange (f. eks. hver dag som beskrevet i18).

Vi har med succes brugt den protokol, der er beskrevet her, til transficere murine PM og bmdm og mus embryonale fibroblaster (mefs)16. I teorien, mRNA genereret ved hjælp af denne protokol kan bruges til at transficere enhver given celletype af pattedyrarter. Den optimale mRNA transfektering reagens og indholdet af modificerede Nukleosider kan variere for andre celletyper, selv om.

Lovende fremtidige ændringer omfatter inddragelse af 5 '-og 3 '-UTRs. De fleste præ-eksisterende plasmid'er indeholder kun CCD'ER af proteinet af interesse, men ikke 5 '-og 3 '-UTRs. Deres inklusion (som beskrevet i19) kan yderligere øge mRNA stabilitet og udtryk. Det bør også være muligt at vedhæfte epitop-Tags til proteinet af interesse ved blot at medtage sekvensen af epitop-tagget i den fremadgående eller omvendte primer (henholdsvis N-og C-Terminal epitop-tagging).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 670).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5-methyl-CTP (100 mM) Jena Biosience NU-1138S stored at -20 °C
Antarctic phosphatase New England BioLabs M0289 stored at -20 °C
Antarctic phosphatase reaction buffer (10x) New England BioLabs B0289 stored at -20 °C
anti-NEMO/IKKγ antibody Invitrogen MA1-41046 stored at -20 °C
anti-β-actin antibody Sigma-Aldrich A2228 stored at -20 °C
Petri dishes 92,16 mm with cams Sarstedt 821,473 stored at RT
CD11b Microbeads mouse and human Miltenyi Biotec 130-049-601 stored at 4 °C
Cre recombinase + T7-Promotor forward primer Sigma-Aldrich 5′-GAAATTAATACGACTCACTATA
GGGGCAGCCGCCACCATGTCC
AATTTACTGACCGTAC-3´, stored at -20 °C
Cre recombinase + T7-Promotor reverse primer Sigma-Aldrich 5′-CTAATCGCCATCTTCCAGCAGG
C-3′, stored at -20 °C
DNA purification kit: QIAquick PCR purification Kit Qiagen 28104 stored at RT
eGFP + T7-Promotor forward primer Sigma-Aldrich 5´-GAAATTAATACGACTCACTATA
GGGATCCATCGCCACCATGGTG
AGCAAGG-3´, stored at -20 °C
eGFP + T7-Promotor reverse primer Sigma-Aldrich 5´-TGGTATGGCTGATTA
TGATCTAGAGTCG-3´, stored at -20 °C
Fast Digest buffer (10x) Thermo Scientific B64 stored at -20 °C
FastDigest XbaI Thermo Scientific FD0684 stored at -20 °C
High-fidelity polymerase with proofreading: Q5 High-Fidelity DNA-Polymerase New England Biolabs Inc M0491S stored at -20 °C
IKKβ + T7-Promotor forward primer Sigma-Aldrich 5′-GAAATTAATACGACTCACTATA
GGGTTGATCTACCATGGACTACA
AAGACG-3′, stored at -20 °C
IKKβ + T7-Promotor reverse primer Sigma-Aldrich 5′-GAGGAAGCGAGAGCT-CCATCTG-3′, stored at -20 °C
In vitro mRNA transcription kit: HiScribe T7 ARCA mRNA kit (with polyA tailing) New England BioLabs E2060 stored at -20 °C
LS Columns Miltenyi Biotec 130-042-401 stored at RT
MACS MultiStand Miltenyi Biotec 130-042-303 stored at RT
mRNA transfection buffer and reagent: jetMESSENGER Polyplus transfection 409-0001DE stored at 4 °C
Mutant IKKβ IKK-2S177/181E plasmid Addgene 11105 stored at -20 °C
Mutant NEMOC54/347A plasmid Addgene 27268 stored at -20 °C
pEGFP-N3 plasmid Addgene 62043 stored at -20 °C
poly(I:C) Calbiochem 528906 stored at -20 °C
pPGK-Cre plasmid F.T. Wunderlich, H. Wildner, K. Rajewsky, F. Edenhofer, New variants of inducible Cre recombinase: A novel mutant of Cre-PR fusion protein exhibits enhanced sensitivity and an expanded range of inducibility. Nucleic Acids Res. 29, 47e (2001). stored at -20 °C
pseudo-UTP (100 mM) Jena Biosience NU-1139S stored at -20 °C
QuadroMACS Separator Miltenyi Biotec 130-090-976 stored at RT
Rat-anti-mouse CD11b antibody, APC-conjugated BioLegend 101212 stored at 4 °C
Rat-anti-mouse F4/80 antibody, PE-conjugated eBioscience 12-4801-82 stored at 4 °C
Recombinant M-CSF Peprotech 315-02 stored at -20 °C
RNA purification kit: MEGAclear transcription clean-up kit ThermoFisher Scientific AM1908 stored at 4 °C
RNAse-degrading surfactant: RnaseZAP Sigma-Aldrich R2020 stored at RT
Ultrapure LPS from E.coli O111:B4 Invivogen stored at -20 °C
Wild type IKKβ plasmid Addgene 11103 stored at -20 °C
Wild type NEMO plasmid Addgene 27268 stored at -20 °C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ley, K., Pramod, A. B., Croft, M., Ravichandran, K. S., Ting, J. P. How Mouse Macrophages Sense What Is Going On. Frontiers in Immunology. 7 (204), (2016).
  2. Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. The expression of exogenous genes in macrophages: obstacles and opportunities. Methods in Molecular Biolology. 531, 123-143 (2009).
  3. Guo, X., et al. Transfection reagent Lipofectamine triggers type I interferon signaling activation in macrophages. Immunology and cell biology. 97 (1), 92-96 (2019).
  4. Kariko, K., Weissman, D. Naturally occurring nucleoside modifications suppress the immunostimulatory activity of RNA: implication for therapeutic RNA development. Current Opinion in Drug Discovery and Development. 10 (5), 523-532 (2007).
  5. Van De Parre, T. J., Martinet, W., Schrijvers, D. M., Herman, A. G., De Meyer, G. R. mRNA but not plasmid DNA is efficiently transfected in murine J774A.1 macrophages. Biochemical and biophysical research communications. 327 (1), 356-360 (2005).
  6. Uchida, S., Kataoka, K., Itaka, K. Screening of mRNA Chemical Modification to Maximize Protein Expression with Reduced Immunogenicity. Pharmaceutics. 7 (3), 137-151 (2015).
  7. Kariko, K., et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability. Molecular Therapy. 16 (11), 1833-1840 (2008).
  8. Khantakova, J. N., et al. Transfection of bone marrow derived cells with immunoregulatory proteins. Cytokine. 108, 82-88 (2018).
  9. Franz, K. M., Kagan, J. C. Innate Immune Receptors as Competitive Determinants of Cell Fate. Molecular Cell. 66 (6), 750-760 (2017).
  10. Kaestner, L., Scholz, A., Lipp, P. Conceptual and technical aspects of transfection and gene delivery. Bioorganic & medicinal chemistry letters. 25 (6), 1171-1176 (2015).
  11. Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).
  12. Kormann, M. S., et al. Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice. Nature Biotechnology. 29 (2), 154-157 (2011).
  13. Kariko, K., Buckstein, M., Ni, H., Weissman, D. Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors: the impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA. Immunity. 23 (2), 165-175 (2005).
  14. Hornung, V., et al. 5'-Triphosphate RNA is the ligand for RIG-I. Science. 314 (5801), 994-997 (2006).
  15. Pichlmair, A., et al. RIG-I-mediated antiviral responses to single-stranded RNA bearing 5'-phosphates. Science. 314 (5801), 997-1001 (2006).
  16. Herb, M., et al. Mitochondrial reactive oxygen species enable proinflammatory signaling through disulfide linkage of NEMO. Science Signaling. 12 (568), (2019).
  17. Schmidt-Supprian, M., et al. NEMO/IKK gamma-deficient mice model incontinentia pigmenti. Molecular Cell. 5 (6), 981-992 (2000).
  18. Mandal, P. K., Rossi, D. J. Reprogramming human fibroblasts to pluripotency using modified mRNA. Nature Protocols. 8 (3), 568-582 (2013).
  19. Oh, S., Kessler, J. A. Design, Assembly, Production, and Transfection of Synthetic Modified mRNA. Methods. 133, San Diego, CA. 29-43 (2018).

Tags

Immunologi og infektion primære makrofager peritoneale makrofager knoglemarv-afledte makrofager immunceller in vitro transkription mRNA transfektering
Højeffektiv Transfection af primær makrofager med in vitro transkriberet mRNA
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Herb, M., Farid, A., Gluschko, A.,… More

Herb, M., Farid, A., Gluschko, A., Krönke, M., Schramm, M. Highly Efficient Transfection of Primary Macrophages with In Vitro Transcribed mRNA. J. Vis. Exp. (153), e60143, doi:10.3791/60143 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter