Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Zeer efficiënte transfectie van primaire macrofagen met in vitro getranscribeerd mRNA

Published: November 9, 2019 doi: 10.3791/60143
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2,3,4, 1
1Institute for Medical Microbiology, Immunology and Hygiene, Faculty of Medicine and University Hospital Cologne, University of Cologne, 2Center for Molecular Medicine Cologne, 3Cologne Cluster of Excellence on Cellular Stress Responses in Aging-associated Diseases (CECAD), 4German Center for Infection Research (DZIF)

Summary

Macrofagen, vooral primaire macrofagen, zijn uitdagend om te transfect als ze gespecialiseerd zijn in het opsporen van moleculen van niet-eigen oorsprong. We beschrijven een protocol dat een zeer efficiënte transfectie van primaire macrofagen mogelijk maakt met mRNA gegenereerd uit DNA-templates zoals plasmiden.

Abstract

Macrofagen zijn fagocytische cellen gespecialiseerd in het opsporen van moleculen van niet-eigen oorsprong. Daartoe zijn ze uitgerust met een groot aantal patroon herkennings receptoren (PRRs). Helaas maakt dit ook macrofagen bijzonder uitdagend om te transfect als het transfectie-reagens en de getransfuneerde nucleïnezuren vaak worden herkend door de PRRS als niet-zelf. Daarom resulteert transfectie vaak in macrofaag activatie en afbraak van de getransfunde nucleïnezuren of zelfs bij zelfmoord op de macrofagen. Hier beschrijven we een protocol dat een zeer efficiënte transfectie van Murine primaire macrofagen zoals peritoneale macrofagen (PM) en met beenmerg afgeleide macrofagen (BMDM) mogelijk maakt met mRNA in vitro getranscribeerd uit DNA-templates zoals plasmiden. Met dit eenvoudige protocol worden transfectie percentages van ongeveer 50-65% voor PM en ongeveer 85% voor BMDM bereikt zonder cytotoxiciteit of immunogeniciteit waargenomen. We beschrijven in detail de generatie van mRNA voor transfectie van DNA-constructies zoals plasmiden en de transfectie-procedure.

Introduction

Macrofagen zijn fagocytische cellen die gespecialiseerd zijn in het opsporen, inname en vernederende microben, apoptotische cellen en cellulair puin. Bovendien, ze helpen om het orthese van immuunresponsen door het afscheidende cytokines en chemokines en door het presenteren van antigenen aan T-cellen en B-cellen. Macrofagen spelen ook belangrijke rollen in tal van andere processen, zoals wondgenezing, atherosclerose, tumorvorming en obesitas.

Om niet-zelf moleculen zoals pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen (PAMPs) en out-of-place moleculen zoals schade-geassocieerde moleculaire patronen (DAMPs) te kunnen detecteren, zijn macrofagen uitgerust met een groot aantal patroon herkennings receptoren (PRR)1. Helaas maakt dit ook macrofagen bijzonder uitdagend voor transfect2 , omdat de transfectie-reagens 3 en de geoverde nucleïnezuren4,5,6,7 vaak door de PRRS worden herkend als niet-zelf. Om deze reden, transfectie van macrofagen met behulp van chemische of fysische methoden8 resulteert meestal in macrofaag activering en afbraak van de getransfuneerde nucleïnezuren of zelfs in macrofaag zelfmoord via pyroptosis, een vorm van geprogrammeerde lytische celdood geactiveerd na herkenning van cytosolische pamps/DAMPS zoals DNA of buitenlandse RNA9. Biologische transfectie van macrofagen met behulp van virussen zoals adenovirussen of lentivirussen als vectoren is vaak efficiënter, maar de bouw van dergelijke virale vectoren is tijdrovend en vereist bioveiligheid niveau 2-apparatuur10,11.

Dus, hoewel macrofagen het onderwerp zijn van intensief onderzoek, wordt de analyse van hun functies op moleculair niveau belemmerd, omdat een van de belangrijkste instrumenten van moleculaire biologie, de transfectie van nucleïnezuur constructies voor exogene expressie van eiwitten, is nauwelijks toepasbaar. Dit dwingt onderzoekers vaak macrofaag-achtige cellijnen te gebruiken in plaats van bonafide macrofagen. Toepassingen voor nucleïnezuur construct trans fectie omvatten expressie van gemuleerde of gelabelde eiwit versies, overexpressie van een specifiek eiwit, eiwit re-expressie in een respectieve Knockout achtergrond en expressie van eiwitten van andere soorten (bijv. , CRE of of leid RNA en Cas9 voor gerichte genen knock-out).

Hier beschrijven we een protocol dat zeer efficiënte transfectie van (meestal moeilijk te transfect) primaire macrofagen toestaat, dat is Murine peritoneale macrofagen (PM) en met beenmerg afgeleide macrofagen (BMDM) met mRNA gegenereerd uit DNA-sjablonen zoals plasmiden. Belangrijk is dat de in vitro getranscribeerde mRNA die met dit protocol is gegenereerd, de natuurlijk voorkomende gemodificeerde nucleosiden 5-methyl-CtP en pseudo-UTP bevat die de immunogeniciteit verminderen en de stabiliteit verhogen4,6,7,12,13. Bovendien worden de 5 '-uiteinden van de in vitro getranscribeerde mRNA gedefosforyleerd door Antarctische fosfatase om herkenning door de Rig-I complex14,15te voorkomen. Dit minimaliseert de aangeboren immuunherkenning van de in vitro getranscribeerd mRNA. Met ons eenvoudig uit te voeren protocol worden transfectie percentages tussen 50-65% (peritoneale macrofagen (PM)) en 85% (BMDM) bereikt terwijl, belangrijker nog, er geen cytotoxiciteit of immunogeniciteit is waargenomen. We beschrijven in detail (i) hoe de immunologisch gesilenced mRNA voor Transfectie kan worden gegenereerd uit DNA-constructies zoals plasmiden en (II) de transfectie procedure zelf.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Macrofaag isolatie van muizen werd uitgevoerd in overeenstemming met de Dierenbeschermings wetgeving van Duitsland in overeenstemming met de ethische commissie van de Universiteit van Keulen.

Opmerking: Voer alle stappen uit die handschoenen dragen. Voer alle transfectiestappen uit onder een laminaire stroom afzuigkap om besmetting van de cellen te voorkomen. Reinig voordat u met mRNA werkt alle instrumenten zoals pipetten en elk oppervlak met 70% ethanol en/of een RNAse-vernederende oppervlakteactieve stof (tabel met materialen). Zorg ervoor dat alle reactie buisjes RNAse-vrij en steriel zijn. Gebruik alleen steriel, RNAase-vrij water voor verdunningen. Gebruik uitsluitend pipetpunten met filters. Pipetpunten wijzigen na elke Pipetteer stap.

1. generatie van de DNA-template

Opmerking: De DNA-template voor in-vitro mRNA transcriptie met dit protocol moet een T7 promotor sequentie bevatten om de RNA polymerase te kunnen docken. Als het plasmide met de DNA-sequentie van het eiwit van belangstelling al een correct georiënteerde T7 promotor-sequentie bevat die direct stroomopwaarts van de volgorde van belang is, moet de linearisatie van het plasmide (zie stap 1,1.) worden uitgevoerd. Sluit anders een T7 promotor aan op de volgorde van de polymerase kettingreactie (PCR, zie stap 1,2.).

  1. Linearisatie van T7 promotor-bevattende plasmiden
    1. Linearize plasmiden bevatten al een correct georiënteerde T7 promotor-sequentie door spijsvertering met een restrictie-enzym dat stroomafwaarts van de stop codon van de sequentie van belang is. Anders wordt transcriptie niet correct beëindigd na de volgorde van belangstelling.
      Opmerking: Het beste is om restrictie enzymen te gebruiken die botte uiteinden of 5 ' uitsteeklengten verlaten.
    2. Bevestig volledige linearisatie van het plasmide door agarose gel elektroforese van onverteerd versus verteerd plasmide DNA.
    3. Reinig gelineariseerde plasmide DNA voorafgaand aan gebruik als DNA-template voor in-vitro mRNA-transcriptie met behulp van een DNA-zuiverings pakket (tabel met materialen).
  2. Bevestiging van de T7 promotor door PCR
    1. Gebruik een voorwaartse primer met de volgende componenten (in de aangegeven volgorde van 5 ' tot 3 '): ongeveer 5 willekeurige BP stroomopwaarts van de promotor (bijv. GAAAT); de T7 promotor-reeks (TAATACGACTCACTATAG); twee extra GS voor verhoogde transcriptie efficiëntie (GG); het doel sequentie-specifieke deel dat homoloog is aan de plasmide sequentie rond de start codon.
      Opmerking: Het moet bestaan uit: 3-6 BP stroomopwaarts van de KOZAK-sequentie en start codon, de KOZAK-sequentie en start codon (meestal GCCACC ATG G), 12-18 BP stroomafwaarts van de start codon. Als de volgorde van de rente niet al een KOZAK-sequentie of start codon bevat, kunnen deze in deze stap worden bevestigd door ze simpelweg in de primer volgorde te laten opnemen.
    2. Bereken de tm van de voorwaartse primer alleen door rekening te houden met het deel dat homoloog is aan de doel volgorde.
    3. Om te beoordelen dimers/haarspeld vorming gebruik maken van de gehele primer sequentie, die gemakkelijk kan overschrijden 50 BP.
    4. Gebruik een omgekeerde primer gelegen ergens stroomafwaarts van de halte codon.
      Opmerking: Als de volgorde van de rente nog geen stop codon bevat, kan deze in deze stap worden bevestigd door deze simpelweg in de primer volgorde te laten opnemen.
    5. Gebruik de voorwaartse en omgekeerde primers om een PCR uit te voeren met behulp van een high-fidelity polymerase met proeflezen (tabel met materialen).
    6. Bevestig het genereren van een enkel product en ampliconlengte voor temp grootte door agarose gel elektroforese (bijvoorbeeld, gebruik een 1% agarose gel en 100 V constante stroom).
    7. Reinig het PCR-product voorafgaand aan gebruik als DNA-template voor in-vitro mRNA-transcriptie met behulp van een DNA-reinigingsset.

2. mRNA-generatie

  1. Alle componenten van de in-vitro mRNA transcriptie Kit ontdooien (Zie de tabel met materialen). Vortex voor 5 s en spin naar beneden voor 2 s bij 2.000 x g. Blijf op ijs tot het gebruik.
  2. Bereid de reactiemix voor in vitro mRNA-transcriptie in een micro centrifuge-buis van 0,5 mL in de volgende volgorde (totaal volume van 40 μL): 20 μL 10x ARCA/NTP-mix (opgenomen in de in vitro mRNA transcriptie Kit); 0,25 μL 5-methyl-CTP (eindconcentratie (FC) is 1,25 mM; 50% van de totale CTP); 0,25 μL pseudo-UTP (f.c. is 1,25 mM; 50% van de totale UTP); X μL DNA-template; 2 μL T7 RNA polymerase mix (opgenomen in de in vitro mRNA transcriptie Kit); Y μL RNAse-vrij H2O.
    Opmerking: X is een volume dat ten minste 1 μg DNA bevat. Bijvoorbeeld 1,6 μL van een stamoplossing van 625 ng/μL. Y is het reservevolume van het totale volume van 40 μL.
  3. Vortex voor 5 s en spin naar beneden voor 2 s bij 2.000 x g. Incuberen bij 37 °C gedurende 30 minuten bij 400 rpm op een thermische mixer voor in vitro transcriptie.
  4. Voeg vervolgens 2 μL DNase I rechtstreeks toe aan de reactiemix voor het verwijderen van het template-DNA. Vortex voor 5 s en spin naar beneden voor 2 s bij 2.000 x g.
  5. Incuberen bij 37 °C gedurende 15 minuten bij 400 rpm op een thermische mixer. Neem een aliquot van 2 μL voor de control gel (stap 3,3) en bewaar bij-80 °C.
  6. Voeg voor poly (A) de volgende componenten rechtstreeks toe aan de vorige reactiemix (tot een eindvolume van 50 μL): 5 μL van 10x poly (A) polymerase reactiebuffer en 5 μL poly (A) Polymerase (beide opgenomen in de in vitro mRNA transcriptie Kit). Vortex voor 5 s en spin naar beneden voor 2 s bij 2.000 x g.
  7. Inincuberen de mix bij 37 °C gedurende 30 minuten bij 400 rpm op een thermomixer. Neem een aliquot van 2 μL voor de control gel (stap 3,3) en bewaar bij-80 °C.
  8. Voeg voor defosforylering van de 5 ́-uiteinden van de mRNA de volgende componenten rechtstreeks toe aan de vorige reactiemix (tot een eindvolume van 60 μL): 3 μL RNAse-vrij H2O; 6 μL van 10 x Antarctische fosfatase reactiebuffer; 3 μL Antarctische fosfatase (15 eenheden voor reactievolume van 60 μL). Vortex voor 5 s en spin naar beneden voor 2 s bij 2.000 x g.
  9. Inincuberen de mix bij 37 °C gedurende 30 minuten bij 400 rpm op een thermische mixer.
  10. Hitte-inactivatie Antarctische fosfatase door incubatie bij 80 °C gedurende 2 min.
    Opmerking: Gebruik in het ideale geval een aparte thermische mixer, wacht niet tot de eerste mixer de gewenste temperatuur bereikt.

3. zuivering van mRNA

  1. Reinig de in vitro getranscribeerd mRNA met behulp van een speciale RNA zuiverings pakket (tabel van materialen).
    1. Voeg X μL elutie oplossing toe aan de mRNA-reactiemix vanaf stap 2,10. Meng door 5 keer inverteren. Voeg 300 μL binding oplossing concentraat toe. Meng door het zachtjes pipetteren 5 keer.
      Opmerking: X is het reservevolume tot een totaal volume van 100 μL. Voeg bijvoorbeeld 40 μL elutie oplossing toe aan 60 μL mRNA-reactiemix.
    2. Voeg 100 μL RNAase-vrije ethanol toe. Meng door het zachtjes pipetteren 5 keer.
    3. Plaats een filter kolom in een van de meegeleverde opvang buizen. Breng de mRNA-reactiemix voorzichtig over in het midden van het filter zonder het filter aan te raken. Centrifugeer bij 15.000 x g gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur (RT).
    4. Til de filter kolom voorzichtig op en gooi de doorstroom in de opvang buis weg. Plaats de filter kolom terug in dezelfde verzamelbuis.
    5. Voeg 500 μL wasoplossing toe (Vergeet niet om 20 mL RNAase-vrije ethanol toe te voegen voordat u de reinigingsoplossing voor de eerste keer gebruikt).
    6. Centrifugeer op 15.000 x g gedurende 1 minuut bij RT. Herhaal stappen 3.1.4-3.1.6 om nog een keer te wassen.
    7. Centrifugeer op volle snelheid (17.900 x g) gedurende 1 minuut bij RT om eventuele restvloeistof uit de filter kolom te verwijderen. Neem de filter kolom voorzichtig uit het opvang buisje. Plaats de filter kolom in een nieuwe collectie Tube.
    8. Voeg 50 μL elutie buffer toe aan het midden van het filter zonder het filter aan te raken. Inincuberen bij 65 °C gedurende 10 minuten op een thermische mixer.
    9. Centrifugeer op 15.000 x g gedurende 1 minuut bij RT. Verwijder de filter kolom en gooi deze weg.
  2. Meet de concentratie en zuiverheid van de eluteerde mRNA, bijvoorbeeld door gebruik te maken van een microvolume spectrofotometer voor het meten van de extinctie bij 260 en 280 nm.
    Opmerking: Een A260/A280 ratio van 1,8-2,1 is indicatief voor zeer gezuiverde mRNA.
  3. Controleer de aanwezigheid van één product, corrigeer de transcriptie lengte en poly (A) door de aliquots te analyseren uit de stappen 2,5 en 2,7 door agarose gel elektroforese onder denaturerende condities (gebruik bijvoorbeeld een 1,2% agarose gel met 20 mM 3-(N-morpholino) propanesulfoninezuur [MOPS], 5 mM Natriumacetaat, 1 mM EDTA en 20% formaldehyde en lopen in 20 mM MOPS, 5 mM Natriumacetaat, 1 mM EDTA en 0,74% formaldehyde bij 100 V constante stroom).
  4. Bewaar de gezuiverde mRNA in de elutie Tube bij-80 °c tot transfectie. Als het gebruik van slechts lage hoeveelheden van de mRNA voor Transfectie vervolgens aliquot de mRNA om herhaalde bevriezen-ontdooien cycli te voorkomen.
    Opmerking: mRNA kan ongeveer 1 jaar bij-80 °c worden bewaard.

4. macrofaag voorbereiding

  1. Euthanize C57/BL6 muizen (gebruik muizen van hetzelfde geslacht en van 6-24 weken leeftijd) door cervicale dislocatie.
    Opmerking: Dezelfde muizen kunnen worden gebruikt voor isolatie van PM (stap 4,2) en het genereren van BMDM (stappen 4,3 en 4,4). Voor isolatie van PM gebruik ten minste twee muizen. Als alleen BMDM moet worden gegenereerd, is een muis meestal voldoende.
  2. Immunomagnetische verrijking van peritoneale macrofagen.
    1. Vul een spuit van 10 mL met een 0,9 x 40 mm canule met 8 mL ijskoude fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en 2 mL lucht. Spoel de peritoneale holte met PBS. De lucht zal een bubbel vormen die lekkage van de PBS minimaliseert.
    2. Verzamel snel peritoneale spoeling met dezelfde spuit en breng over in een conische centrifugeren-buis van 50 ml. Combineer peritoneale cellen van meerdere muizen indien nodig. Houd de celsuspensie op ijs.
    3. Centrifuge celsuspensie bij 650 x g gedurende 5 minuten bij 4 °c. Gooi het supernatant weg en regeer de celpellet in 5 mL van 0,2% NaCl voor 30 s tot lyse rode bloedcellen.
    4. Voeg 5 mL 1,6% NaCl toe aan een totaal volume van 10 mL om isotone condities te reconstitueren. Centrifugeer bij 650 x g gedurende 5 minuten bij 4 °c.
    5. Gooi het supernatant weg en regeer de celpellet in 97,5 μL magnetische celsortering (MCS) buffer (2 mM ethyleendiaminetetraazijnzuur [EDTA], 5% boviene serumalbumine [BSA] in PBS) per 1 peritoneale spoeling (bijv. als drie muizen zijn gespoeld, hervat in 292,5 μL ).
    6. Voeg 2,5 μL paramagnetische parels toe die zijn geconjugeerd aan een CD11b-specifiek antilichaam per 97,5 μL celsuspensie (bijv. Voeg 7,5 μL toe aan 292,5 μL).
    7. Incuberen op ijs gedurende 15 minuten bij 150 rpm op een rondschudapparaat.
    8. Centrifuge celsuspensie bij 650 x g gedurende 5 minuten bij 4 °c, gooi het supernatant weg en regeer de celpellet in 1 ml mcs-buffer.
    9. Voeg 4 mL MCS-buffer toe aan een totaal volume van 5 mL en was de cellen door drie keer zachtjes op en neer te pipetteren.
    10. Herhaal stap 4.2.8 en 4.2.9 nog twee keer voor een totaal van drie wasstappen.
    11. Plaats tijdens de wasstappen een LS-kolom in een scheidingsteken voor magnetische cellen (Zie tabel met materialen). Spoel de kolom af met 3 mL MCS-buffer.
      Opmerking: Vermijd eventuele bubbels omdat deze de kolom kunnen verstoppen.
    12. Respendeer de celpellet in 1 mL MCS-buffer. Voeg 3 mL MCS buffer toe aan een totaal volume van 4 mL, Meng door pipetteren drie keer omhoog en omlaag.
    13. Breng de 4 mL celsuspensie over naar de kolom gespoeld.
      Opmerking: Nogmaals, Vermijd eventuele bubbels omdat deze de kolom kunnen verstoppen.
    14. Wacht tot het reservoir van de kolom helemaal leeg is. Voeg geen extra vloeistof toe totdat de kolom stopt met druipen.
    15. Voeg 3 mL MCS-buffer toe aan de kolom. Wacht tot het reservoir van de kolom helemaal leeg is. Herhaal stap 4.2.15 nog twee keer.
    16. Plaats de LS-kolom in een conische Centrifugeer buis van 15 mL. Breng 5 mL MCS-buffer aan op de kolom. Wacht tot 2 mL vloeistof door de kolom is gegaan en gebruik vervolgens de zuiger om de overblijvende fractie voorzichtig in de buis te duwen.
    17. Centrifugeer celsuspensie bij 650 x g gedurende 5 minuten bij 4 °c en gooi het supernatant weg.
    18. Respendeer de celpellet in 1 mL DMEM aangevuld met 10% warmte-geïnactiveerd foetaal kalf serum (FCS) (DMEM + FCS).
    19. Bepaal het aantal levensvatbare cellen door in een trypaanse blauwe oplossing in een Neubauer-telkamer en zaadcellen in DMEM + FCS in cultuur platen te tellen.
      Opmerking: Zaad PM bij een dichtheid van 100.000 cellen/goed in een vlakke bodemmicro titer plaat. Gebruik geen weefsel cultuurbehandelde platen als PM kan niet worden losgekoppeld van deze. Gebruik in plaats daarvan niet-behandelde platen.
  3. Generatie van BMDM
    1. Verwijder de huid en spieren van de achterpoten met een schaar. Was elk been met een korte onderdompeling in 70% ethanol.
    2. Maak benen los en open beide uiteinden van het dijbeen en de Tibia door te snijden met een schaar.
    3. Vul een 5 mL spuit gevuld met een 0,6 mm x 30 mm canule met 5 mL zeer lage endotoxine (VLE) RPMI 1640 en spoel het beenmerg uit de geopende botten in een kweek schotel.
    4. Combineer het beenmerg van meerdere muizen indien nodig door de stappen 4.3.1-4.3.3 te herhalen. Breng het beenmerg over in een conische centrifugeren buis van 50 mL.
    5. Centrifugeer de beenmerg suspensie bij 650 x g gedurende 5 minuten bij 4 °c en gooi het supernatant weg.
    6. Respendeer de celpellet in 5 mL rode bloedcel lysisbuffer (8,3% NH4Cl, 0,1 M Tris) en inincuberen gedurende 5 minuten bij RT om de rode bloedcellen te lyseren.
    7. Centrifugeer de celsuspensie bij 650 x g bij 4 ° C gedurende 5 minuten en gooi het supernatant weg.
    8. Respendeer de celpellet in 1 mL VLE RPMI 1640 medium aangevuld met 10% FCS, 1% penicileen/streptomycine, 1% HEPES, 1% natrium pyruvaat en 10 ng/mL recombinant macrofaag kolonie-stimulerende factor (M-CSF) (RPMI++ + + +).
    9. Voeg 4 ml rpmi+ + + + + toe aan een totaal volume van 5 ml.
    10. Bereid 5 92 mm x 16 mm onbehandelde Petri schaaltjes met nokken (Zie de tabel met materialen) per muis Pipetteer 7 ml rpmi+ + + + + medium in elk schaaltje.
    11. Breng de 1 mL celoplossing over naar de 5 bereide kweek gerechten en inincuberen bij 37 °C en 5% CO2.
    12. Voer de cellen na 4 dagen uit door 4 mL RPMI++ + + + toe te voegen. Na 6-7 dagen zijn de beenmergcellen volledig gedifferentieerd in BMDM.
  4. Oogsten van BMDM
    1. Verwijder het medium volledig uit cultuur gerechten. Voeg in PBS 5 mL warme 0,2 mM EDTA toe aan elk gerecht.
    2. Schrapen het hele bord voorzichtig met een celscraper om de BMDM los te maken. Combineer de celsuspensies in een 50 mL conische centrifugatie buis.
    3. Spoel alle 5 gerechten opnieuw uit. Gebruik hetzelfde volume van 5 mL warme 0,2 mM EDTA in PBS voor alle 5 gerechten. Combineer deze celsuspensie met die van de vorige stap.
    4. Centrifugeer de celsuspensie bij 650 x g gedurende 5 minuten bij 4 ° C en gooi het supernatant weg.
    5. Respendeer de celpellet in 1 ml VLE rpmi 1640 medium aangevuld met 10% FCS, 1% Hepes, 1% natrium pyruvaat en 10 ng/ml recombinant M-CSF maar geen antibiotica (rpmi++ + +).
    6. Bepaal het aantal levensvatbare cellen door te tellen in trypaanse blauwe oplossing in een Neubauer telkamer en zaadcellen in RPMI+ + + + in kweek platen.
      Opmerking: Zaad BMDM bij een dichtheid van 50.000 cellen/goed maximaal in een vlakke bodemmicro titer plaat. Gebruik geen weefselcultuur behandelde platen als BMDM kan nauwelijks worden losgekoppeld van deze. Gebruik in plaats daarvan niet-behandelde platen.

5. transfectie van macrofagen met mRNA

  1. Bereken het vereiste volume van de mRNA-transfectie buffer.
    Opmerking: Het volume van de vereiste mRNA-transfectie-buffer is afhankelijk van de grootte: gebruik 200 μL voor Transfectie in een 6-well-plaat, 100 μL in een 12-well-plaat enzovoort. Voeg altijd een beetje reservevolume toe vanwege Pipetteer verlies (maar niet te veel, om overmatige verdunning van mRNA te voorkomen). Gebruik bijvoorbeeld 450 μL in plaats van 4 x 100 μL = 400 μL om in 4 putjes van een 12-Wells plaat te transfect.
  2. Bereken het vereiste volume van het mRNA-transfectiereagens. Het mRNA transfectie-reagens wordt toegevoegd in een verhouding van 1:50. Zo is 9 μl mRNA transfectie-reagens vereist voor een eindvolume van 450 μL.
  3. Bereken het totale bedrag van de vereiste mRNA. Ten minste 100 ng per 100.000 macrofagen zijn nodig voor een efficiënte trans fectie, 200 ng werkt nog beter (bijv. 800 ng mRNA naar transfect 400.000 macrofagen).
    1. Vermenigvuldig de berekende hoeveelheid mRNA die nodig is met het totale aantal putten dat moet worden omgerekend (bijvoorbeeld 4 putten met 400.000 macrofagen elk: 4 x 800 ng = 3.200 ng mRNA is in totaal vereist voor alle putten). Als uw mRNA-voorraad bijvoorbeeld 426,8 ng/μL is, zijn 7,49 μL nodig voor een optimale transfectie van 4 putten met 400.000 macrofagen per stuk.
  4. Voeg het berekende volume van de mRNA transfectie-buffer toe (stap 5,1.) minus de volumes voor mRNA transfectie-reagens (stap 5,2) en de mRNA (stap 5,3) naar een reactie buis. Bijvoorbeeld 450 μL-9 μL-7,49 μL = 433,51 μL.
  5. De mRNA-kolf ontdooien en mengen door de elutie buis voorzichtig te spiegelen. Voeg het berekende volume mRNA (stap 5,3) toe aan de reactie buis met mRNA-reactiebuffer (in het voorbeeld hierboven: 7,49 μL in 433,51 μL).
  6. Vortex voor 5 s en spin naar beneden voor 2 s bij 2.000 x g.
  7. Vortex de mRNA transfectie reagens voor 5 s en spin naar beneden voor 2 s op 2.000 x g.
  8. Voeg het berekende volume mRNA transfectie-reagens (stap 5,2) toe aan de reactie buis met de mRNA-transfectie buffer en de mRNA (in het bovenstaande voorbeeld: 9 μL mRNA-transfectiereagens).
  9. Vortex de transfectie mix voor 5 s en spin naar beneden voor 2 s op 2.000 x g.
  10. Incuberen gedurende 15 minuten bij RT.
  11. Vervang ondertussen het cultuurmedium van de macrofagen met een fris, warm kweekmedium (Zie stappen 4.2.18. en 4.4.5).
  12. Na de incubatie stap 5,10 voegt u de transfectie-mix toe aan de putjes met de macrofagen in een volume dat geschikt is voor de grootte van de put (zie stap 5,1). Voeg de transfectie mix druppelsgewijs in een cirkel van de buitenkant naar het midden van de put.
  13. Zachtjes de plaat, eerst in een verticale en vervolgens in een horizontale richting te zorgen voor een uniforme verdeling van de transfectie mix in de put. Inincuberen bij 37 °C en 5% CO2. Synthese van het eiwit gecodeerd door de getransffecteerde mRNA zal kort na transfectie beginnen. Voor de beste resultaten, inincuberen gedurende ten minste 6 uur.
  14. Analyseer na de incubatie de efficiëntie van de transfectie door (immuno) fluorescentiemicroscopie, Flowcytometrie of immunoblot16, of gebruik de getransfunde macrofagen voor het experiment naar keuze.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

We hebben dit protocol met succes gebruikt om mRNA-codering te genereren voor door de vlag gelabelde NEMO-en IKKβ-varianten voor transfectie van primaire macrofagen16. De plasmiden codering voor Flag-Tagged wild-type (Nemo WT) en C54/347a Mutant Nemo (NemoC54/374a) (Zie de tabel met materialen) bevatten al een T7 promotor in de juiste richting (Figuur 1a). Zo moesten we alleen de plasmiden linealiseren om DNA templates voor in vitro transcriptie te genereren. Hiertoe werd 10 μg plasmide DNA verteerd met 5 μL Xbal resulterend in linearisatie van het plasmide door een enkele snede 3 ' van de aanslag codon. Volledige linearisatie van het plasmide DNA werd geverifieerd door een Elektroforese van agarose gel (Figuur 1B).

De plasmiden codering voor Flag-Tagged wild-type (ikkβWT) en S177/181E Mutant ikkβ (ikkβS177/181E) bevatten geen T7 promotor. Daarom hebben we een T7 promotor door PCR bevestigd om de DNA templates voor in vitro transcriptie te genereren (Figuur 2a). Het genereren van een specifiek PCR-product, d.w.z. een enkel product van de juiste grootte, werd geverifieerd door elektroforese van agarose-gel (Figuur 2B).

Na in vitro transcriptie met behulp van de respectievelijke DNA templates, we geverifieerd generatie van een enkele mRNA product van de juiste grootte en poly (A) die door agarose gel elektroforese onder denaturerende voorwaarden (Figuur 3).

Om te controleren of mRNA die met dit protocol is gegenereerd, de transfectie van primaire macrofagen mogelijk maakt (Zie Figuur 4, B voor flowcytometrische analyses van immunomagnetische verrijking van pm en differentiatie status van bmdm), hebben we mRNA-codering voor EGFP (Figuur 5a-C) gegenereerd en transfectie-efficiëntie geanalyseerd door Flowcytometrie (Figuur 6a). 100.000 PM of 50.000 BMDM per well van een onbehandelde microtiterplaat werden met 50, 100 of 200 ng van eGFP mRNA voor 6, 9 of 24 uur getransffecteerd. In zowel PM en BMDM, hoge niveaus van eGFP expressie kan worden gedetecteerd op 6 h na transfectie. Het transfectie percentage steeg met de hoeveelheid getransffecteerde mRNA en was het hoogst voor 200 ng mRNA (Figuur 6B, C). Voor PM bereikte het transfectie percentage ongeveer 50-65% bij 6 tot 9 uur na de trans fectie (Figuur 6B). Bij 24 h na transfectie was het transfectie percentage aanzienlijk lager wat aangeeft dat de eGFP-uitdrukking afloopt. Dus, PM mag niet worden getransffecteerd 's nachts. Voor BMDM bereikte het transfectie percentage ongeveer 80-85% (Figuur 6C). De daling van de transfectie snelheid na 24 h was veel minder uitgesproken in BMDM. Zo kan BMDM 's nachts worden getransffecteerd. In beide PM (Figuur 6D, E) en bmdm (Figuur 6F, G) steeg het uitdrukkings niveau van EGFP in gederteerde cellen in een tijd-en dosisafhankelijke manier. Belangrijk is dat de transfectie procedure geen lytische of apoptotische celdood induceerde omdat er geen toename was in propidium iodide-positief (PI) of annexin V-positieve macrofagen na trans fectie (Figuur 7A, B).

De transfectie-efficiëntie van de mRNAs-codering voor door vlaggen gelabelde NEMO-of IKKβ-varianten werd geanalyseerd door immunofluorescentie microscopie. 300.000 PM per put van een 12-well plaat werden met 300 ng van de respectieve mRNA voor 6 h. transfectie percentage was ongeveer 60% voor NEMO Mrna's en ongeveer 55% voor IKKβ Mrna's (Figuur 8a, B). Zo waren hun transfectie percentages vergelijkbaar met die van eGFP mRNA die een algemeen transfectie percentage van ongeveer 55% voor PM aangeven.

We hebben dit protocol ook gebruikt voor het genereren van mRNA-codering voor CRE of. Transfectie van 400.000 BMDM van NEMOflox/flox muizen17 per put van een 12-put plaat met 400 ng van CRE of mRNA resulteerde in bijna volledige uitputting voor Nemo eiwit na 48 h (Figuur 9) wat duidt op een zeer efficiënte transfectie van de bmdm.

PM en BMDM afscheiden geen detecteerbare hoeveelheden van IL-1β, IL-6 en TNF na transfectie (Figuur 10A, B). Bovendien, de NF-kB en MAPK signalering trajecten werden niet geactiveerd na transfectie16 die aangeeft dat de transfectie procedure niet proinflammatoire signalering activeert. We hebben ook geen functionele veranderingen waargenomen van getransfunteerde macrofagen in vergelijking met niet-getransfunde macrofagen16.

Figure 1
Figuur 1: linearisatie van Nemo-encoding plasmiden die al een T7 promotor in de juiste richting bevatten. A) sequentie fragment van de plasmide codering voor door de vlag getagde NemoWT of NemoC54/347a. Een T7 promotor in de juiste richting en in de buurt van de KOZAK-reeks en start codon is al aanwezig. De T7 promotor regio, de codeer volgorde (CDS) voor de FLAG tag en NEMO, de start en stop Codons en de beperkings site voor linearisatie met XbaI zijn kleurgecodeerd. B) representatieve 1% agarose-gel die de plasmiden voor en na de linearisatie met xbal weergeeft; per rijstrook werd 1 μL onbehandeld, gelineariseerd of gezuiverd gelineariseerd plasmide DNA geladen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: T7 promotor-gehechtheid aan IKKß-encoding plasmiden door PCR. A) sequentie fragment van de plasmide codering voor de vlag-Tagged IkkβWT of ikkβS177/181E. De plasmiden bevatten geen geschikte T7 promotor, die daarom door PCR wordt bevestigd. Locatie, oriëntatie en volgorde van de voorwaartse primer (met de T7 promotor sequentie die moet worden toegevoegd) en de omgekeerde primer worden aangegeven door de pijlen. De T7 promotor regio, de CD'S voor de FLAG tag en IKKβ en de start en stop Codons zijn kleurgecodeerd. B) representatieve 1% agarose-gel die het genereren van een enkel PCR-product van de juiste omvang verifieert met gebruikmaking van de hierboven aangegeven primers. 1 μL van het gezuiverde PCR-product werd per baan geladen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: mRNA-synthese van Nemo-en IKKβ-encoding DNA-templates. A) representatieve denaturering 1,2% agarose-gel met 0,7% formaldehyde die het gezuiverde MRNA van Nemo en IKKβ-constructies weergeeft voor en na poly (a). 2 μL NEMOWT, NemoC54/347a, ikkβWT en IkkβS177/181E mRNA werden per baan geladen. Een 32 μL ssRNA-ladder werd geladen voor bepaling van de RNA-lengte. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: flowcytometrische analyses van de immunomagnetische verrijking van pm en de differentiatie status van BMDM. A) het percentage F4/80+/cd11b+ pm in de peritoneale spoeling vóór en na immunomagnetische verrijking werd geanalyseerd door Flowcytometrie. (B) expressie van F4/80 en CD11b door bmdm na 6 dagen van differentiatie werd geverifieerd door Flowcytometrie. 10.000 of 5.000 cellen werden geteld per monster, respectievelijk. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM van n = 3 onafhankelijke experimenten, elk. * P < 0,05, * * p < 0,01, * * * p < 0,001 en * * * * p < 0,0001 door student t-toets. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: mRNA-synthese met poly (a) van het eGFP. A) sequentie fragment van de plasmide codering voor EGFP. Het plasmide bevat geen geschikte T7 promotor, die daarom door PCR wordt bevestigd. Locatie, oriëntatie en volgorde van de voorwaartse primer (met de T7 promotor sequentie die moet worden toegevoegd) en de omgekeerde primer worden aangegeven door de pijlen. De T7 promotor regio, de CD'S voor eGFP en de start en stop Codons zijn kleurgecodeerd. B) representatieve 1% agarose-gel die de gezuiverde ampliconlengte voor temp weergeeft na PCR met gebruikmaking van de hierboven aangegeven primers. 1 μL van het gezuiverde PCR-product werd per baan geladen. C) representatieve denaturering 1,2% agarose-gel met 0,7% formaldehyde die het gezuiverde mRNA van EGFP bevat voor en na poly (a). 2 μL eGFP mRNA werd per baan geladen. Een 32 μL ssRNA-ladder werd geladen voor bepaling van de RNA-lengte. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 6
Figuur 6: zeer efficiënte transfectie van zowel peritoneale macrofagen als BMDM met eGFP mRNA. Macrofagen werden geïncubeerd voor 6, 9 of 24 h met 50, 100 of 200 ng van eGFP mRNA gecomplexeerd aan Jetmess enger of met Jetmess enger alleen (mock) en vervolgens geanalyseerd door flow cytometrie. A) strategie voor het bepalen van de populaties van levensvatbare macrofagen, levensvatbare EGFP+ macrofagen en Pi+ (d.w.z. dode) macrofagen. Representatieve gegevens voor Transfectie met 200 ng mRNA voor 6 uur worden weergegeven. (B, C) Transfectie percentages (B) pm en (C) bmdm werden bepaald door het analyseren van het percentage levensvatbare EGFP-positieve cellen door Flowcytometrie (n = 5-7 en n = 4-5 onafhankelijke experimenten, respectievelijk). (D-G) De uitdrukkings niveaus van eGFP werden bepaald door analyse van de gemiddelde fluorescentie intensiteit (MFI) van levensvatbare (D) pm en (F) bmdm en van de levensvatbare en EGFP-positieve subpopulatie van (E) pm en (G) bmdm (n = 5-7 en n = 4-5 onafhankelijke experimenten, respectievelijk). Er werden 10.000 cellen geteld per sample. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM. n.s. = niet significant; * P < 0,05, * * p < 0,01, * * * p < 0,001 en * * * * p < 0,0001 door student t-toets. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 7
Figuur 7: transfectie induceert geen lytische of apoptotische celdood. Transfectie-geïnduceerde celdood van (a) pm en (B) bmdm werd bepaald door het analyseren van het percentage van pi-positieve en annexin V-positieve cellen (n = 5-7 en n = 4-5 onafhankelijke experimenten, respectievelijk). Het percentage dode macrofagen aanwezig in niet-getransfundeerd monsters (een zekere mate van celdood werd veroorzaakt door fysieke loslating van macrofagen uit de putten ondanks het gebruik van niet-behandelde platen) werd afgetrokken van die in de respectieve geoverde monsters om alleen rekening te houden met celdood geïnduceerd door de transfectie procedure. De gating-strategie die wordt gebruikt om de populaties van PI+, annexin v+ en Pi+/annexin v+ macrofagen te definiëren, wordt weergegeven voor een representatieve gegevensverzameling met 200 ng mRNA voor 6 uur worden weergegeven. Staurosporine (50 μM voor 1 uur) werd gebruikt als positieve controle. Er werden 10.000 cellen geteld per sample. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM. n.d. = niet detecteerbaar. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 8
Figuur 8: transfectie tarieven met behulp van mRNA codering voor Nemo en IKK constructies. Transfectie percentages gebruikmakend van mRNA-codering voor (a) Nemo-constructies en (B) IKK-constructies werden gekwantificeerd door immunofluorescentie microscopie (n = 4 onafhankelijke experimenten). Schaalbalk = 4 μm. gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM. n.t. = niet-getransfunteerd, n.s. = niet significant; * P < 0,05, * * p < 0,01, * * * p < 0,001 en * * * * p < 0,0001 door student t-toets. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 9
Figuur 9: transfectie van NemoFL/FL Bmdm met mRNA-codering voor CRE of resulteert in bijna volledige deficiëntie voor Nemo. BMDM van NemoFL/FL muizen werden getransffecteerd met mRNA encoding cre of voor 48 h. deficiëntie voor Nemo eiwit als gevolg van CRE-gemedieerde Knockout werd beoordeeld door Western Blot met behulp van specifieke antilichamen die Nemo of β-actin herkennen en gekwantificeerd door densitometrie (n = 5 onafhankelijke experimenten). Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM. * P < 0,05, * * p < 0,01, * * * p < 0,001 en * * * * p < 0,0001 door student t-toets. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 10
Figuur 10: transfectie induceert geen proinflammatoire respons. (A) pm en (B) Bmdm werden met mRNA-codering voor NemoWT of NemoC54/347agetransffuteerd. Als positieve controle werden macrofagen geïnfecteerd met Listeria monocytogenes bij multipliciteit van een infectie van 1 of gestimuleerd met 5 μg/ml LPS of poly (I:C) voor 5 h (PM) of 24 h (bmdm). De afscheiding van IL-1 β, IL-6 en TNF in het supernatant werd gekwantificeerd door ELISA (n = 3 onafhankelijke experimenten). Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM. n.t. = niet getransfuneerd, n.d. = niet detecteerbaar. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hier presenteren we een protocol voor zeer efficiënte transfectie van meestal moeilijk te transfect primaire macrofagen met in vitro getranscribeerd mRNA. Belangrijk is dat de transfectie van de macrofagen met behulp van dit protocol geen celdood induceert of proinflammatoire signalering activeert die aangeeft dat noch het transfectiereagens noch de getransfunteerde mRNA als niet-zelf worden herkend.

De kwaliteit van de mRNA is van cruciaal belang voor een succesvolle transfectie van macrofagen met behulp van dit protocol. Daarom moet er veel zorg voor worden genomen dat de mRNA niet in aanraking komt met Rnasen (bijvoorbeeld via verontreinigde buffers of flesjes). Bij twijfel, controleren op mRNA afbraak (bijvoorbeeld door agarose gel elektroforese). Transfection rate en expressie niveau waren al maximaal na 6 h na transfectie. Daarom is het mogelijk dat het eiwit van belang wordt uitgedrukt op voldoende niveaus voor analyse op eerdere tijdstippen na trans fectie. We hebben dit echter niet getest. Bovendien kan het transfecteren van grotere hoeveelheden mRNA de transfectie snelheid en/of het uitdrukkings niveau verder verhogen. Echter, transfecting grotere hoeveelheden mRNA kan mogelijk ook leiden tot een zekere mate van immunogeniciteit of zelfs cytotoxiciteit. Het volledige ontbreken daarvan is een van de belangrijkste voordelen van dit protocol. Dus, als grotere hoeveelheden mRNA moeten worden getransffecteerd, moeten immunogeniciteit en cytotoxiciteit zorgvuldig worden geëvalueerd.

Expressie niveau duidelijk gecorreleerd met de hoeveelheid getransfunteerde mRNA. Nog, re-expressie van NEMO in NEMO-deficiënte BMDM resulteerde in soortgelijke NEMO eiwit expressie zoals in wild type BMDM16 waaruit blijkt dat mRNA transfectie met behulp van dit protocol niet leidt tot aanzienlijke overexpressie van het eiwit van belang. Dit protocol kan dus niet geschikt zijn om de gevolgen van overexpressie van het eiwit van belang te bestuderen. We beschouwen dit echter liever als een voordeel, omdat overexpressie van een eiwit zijn gedrag vaak verandert.

De belangrijkste beperking van mRNA transfectie, in het algemeen, is dat het alleen resulteert in voorbijgaande uitdrukking van het eiwit van belang (omdat de mRNA die met behulp van dit protocol worden gegenereerd en getransffecteerd zal worden onderworpen aan normale omzet). PM lijken te uiten van het eiwit van belang voor een kortere periode van tijd in vergelijking met BMDM. Dus, in tegenstelling tot BMDM, mag PM niet 's nachts worden getransffecteerd. Hoe lang een gegeven eiwit van belang zal worden uitgedrukt zal variëren (als zowel de stabiliteit van de mRNA en die van het eiwit zal variëren). We raden niettemin aan om het experiment naar keuze op dezelfde dag als de transfectie uit te voeren. Als de uitdrukking van het eiwit van belang is vereist voor langere tijd, kunnen de cellen waarschijnlijk meerdere malen worden verteerd (bijv., elke dag zoals beschreven in18).

We hebben het protocol dat hier wordt beschreven met succes gebruikt om te transfect Murine PM en BMDM en muis embryonale fibroblasten (MEFs)16. In theorie kan de mRNA die met dit protocol wordt gegenereerd, worden gebruikt om een bepaald celtype van elke zoogdiersoort te transfect. De optimale mRNA transfectie reagens en de inhoud van gemodificeerde nucleosiden kunnen verschillen voor andere celtypen, hoewel.

Veelbelovende toekomstige modificaties omvatten de opname van de 5 '-en 3 '-UTRs. De meeste reeds bestaande plasmiden bevatten alleen de CCD'S van het eiwit van belang, maar niet de 5 '-en 3 '-UTRs. Hun opname (zoals beschreven in19) kan de stabiliteit en expressie van mRNA verder verbeteren. Ook, het bevestigen van epitoop Tags aan het eiwit van belang door simpelweg het opnemen van de volgorde van de epitoop tag in de voorwaartse of omgekeerde primer (voor N-en C-Terminal epitoop tagging, respectievelijk), moet mogelijk zijn.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd gesteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 670).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5-methyl-CTP (100 mM) Jena Biosience NU-1138S stored at -20 °C
Antarctic phosphatase New England BioLabs M0289 stored at -20 °C
Antarctic phosphatase reaction buffer (10x) New England BioLabs B0289 stored at -20 °C
anti-NEMO/IKKγ antibody Invitrogen MA1-41046 stored at -20 °C
anti-β-actin antibody Sigma-Aldrich A2228 stored at -20 °C
Petri dishes 92,16 mm with cams Sarstedt 821,473 stored at RT
CD11b Microbeads mouse and human Miltenyi Biotec 130-049-601 stored at 4 °C
Cre recombinase + T7-Promotor forward primer Sigma-Aldrich 5′-GAAATTAATACGACTCACTATA
GGGGCAGCCGCCACCATGTCC
AATTTACTGACCGTAC-3´, stored at -20 °C
Cre recombinase + T7-Promotor reverse primer Sigma-Aldrich 5′-CTAATCGCCATCTTCCAGCAGG
C-3′, stored at -20 °C
DNA purification kit: QIAquick PCR purification Kit Qiagen 28104 stored at RT
eGFP + T7-Promotor forward primer Sigma-Aldrich 5´-GAAATTAATACGACTCACTATA
GGGATCCATCGCCACCATGGTG
AGCAAGG-3´, stored at -20 °C
eGFP + T7-Promotor reverse primer Sigma-Aldrich 5´-TGGTATGGCTGATTA
TGATCTAGAGTCG-3´, stored at -20 °C
Fast Digest buffer (10x) Thermo Scientific B64 stored at -20 °C
FastDigest XbaI Thermo Scientific FD0684 stored at -20 °C
High-fidelity polymerase with proofreading: Q5 High-Fidelity DNA-Polymerase New England Biolabs Inc M0491S stored at -20 °C
IKKβ + T7-Promotor forward primer Sigma-Aldrich 5′-GAAATTAATACGACTCACTATA
GGGTTGATCTACCATGGACTACA
AAGACG-3′, stored at -20 °C
IKKβ + T7-Promotor reverse primer Sigma-Aldrich 5′-GAGGAAGCGAGAGCT-CCATCTG-3′, stored at -20 °C
In vitro mRNA transcription kit: HiScribe T7 ARCA mRNA kit (with polyA tailing) New England BioLabs E2060 stored at -20 °C
LS Columns Miltenyi Biotec 130-042-401 stored at RT
MACS MultiStand Miltenyi Biotec 130-042-303 stored at RT
mRNA transfection buffer and reagent: jetMESSENGER Polyplus transfection 409-0001DE stored at 4 °C
Mutant IKKβ IKK-2S177/181E plasmid Addgene 11105 stored at -20 °C
Mutant NEMOC54/347A plasmid Addgene 27268 stored at -20 °C
pEGFP-N3 plasmid Addgene 62043 stored at -20 °C
poly(I:C) Calbiochem 528906 stored at -20 °C
pPGK-Cre plasmid F.T. Wunderlich, H. Wildner, K. Rajewsky, F. Edenhofer, New variants of inducible Cre recombinase: A novel mutant of Cre-PR fusion protein exhibits enhanced sensitivity and an expanded range of inducibility. Nucleic Acids Res. 29, 47e (2001). stored at -20 °C
pseudo-UTP (100 mM) Jena Biosience NU-1139S stored at -20 °C
QuadroMACS Separator Miltenyi Biotec 130-090-976 stored at RT
Rat-anti-mouse CD11b antibody, APC-conjugated BioLegend 101212 stored at 4 °C
Rat-anti-mouse F4/80 antibody, PE-conjugated eBioscience 12-4801-82 stored at 4 °C
Recombinant M-CSF Peprotech 315-02 stored at -20 °C
RNA purification kit: MEGAclear transcription clean-up kit ThermoFisher Scientific AM1908 stored at 4 °C
RNAse-degrading surfactant: RnaseZAP Sigma-Aldrich R2020 stored at RT
Ultrapure LPS from E.coli O111:B4 Invivogen stored at -20 °C
Wild type IKKβ plasmid Addgene 11103 stored at -20 °C
Wild type NEMO plasmid Addgene 27268 stored at -20 °C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ley, K., Pramod, A. B., Croft, M., Ravichandran, K. S., Ting, J. P. How Mouse Macrophages Sense What Is Going On. Frontiers in Immunology. 7 (204), (2016).
  2. Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. The expression of exogenous genes in macrophages: obstacles and opportunities. Methods in Molecular Biolology. 531, 123-143 (2009).
  3. Guo, X., et al. Transfection reagent Lipofectamine triggers type I interferon signaling activation in macrophages. Immunology and cell biology. 97 (1), 92-96 (2019).
  4. Kariko, K., Weissman, D. Naturally occurring nucleoside modifications suppress the immunostimulatory activity of RNA: implication for therapeutic RNA development. Current Opinion in Drug Discovery and Development. 10 (5), 523-532 (2007).
  5. Van De Parre, T. J., Martinet, W., Schrijvers, D. M., Herman, A. G., De Meyer, G. R. mRNA but not plasmid DNA is efficiently transfected in murine J774A.1 macrophages. Biochemical and biophysical research communications. 327 (1), 356-360 (2005).
  6. Uchida, S., Kataoka, K., Itaka, K. Screening of mRNA Chemical Modification to Maximize Protein Expression with Reduced Immunogenicity. Pharmaceutics. 7 (3), 137-151 (2015).
  7. Kariko, K., et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability. Molecular Therapy. 16 (11), 1833-1840 (2008).
  8. Khantakova, J. N., et al. Transfection of bone marrow derived cells with immunoregulatory proteins. Cytokine. 108, 82-88 (2018).
  9. Franz, K. M., Kagan, J. C. Innate Immune Receptors as Competitive Determinants of Cell Fate. Molecular Cell. 66 (6), 750-760 (2017).
  10. Kaestner, L., Scholz, A., Lipp, P. Conceptual and technical aspects of transfection and gene delivery. Bioorganic & medicinal chemistry letters. 25 (6), 1171-1176 (2015).
  11. Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).
  12. Kormann, M. S., et al. Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice. Nature Biotechnology. 29 (2), 154-157 (2011).
  13. Kariko, K., Buckstein, M., Ni, H., Weissman, D. Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors: the impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA. Immunity. 23 (2), 165-175 (2005).
  14. Hornung, V., et al. 5'-Triphosphate RNA is the ligand for RIG-I. Science. 314 (5801), 994-997 (2006).
  15. Pichlmair, A., et al. RIG-I-mediated antiviral responses to single-stranded RNA bearing 5'-phosphates. Science. 314 (5801), 997-1001 (2006).
  16. Herb, M., et al. Mitochondrial reactive oxygen species enable proinflammatory signaling through disulfide linkage of NEMO. Science Signaling. 12 (568), (2019).
  17. Schmidt-Supprian, M., et al. NEMO/IKK gamma-deficient mice model incontinentia pigmenti. Molecular Cell. 5 (6), 981-992 (2000).
  18. Mandal, P. K., Rossi, D. J. Reprogramming human fibroblasts to pluripotency using modified mRNA. Nature Protocols. 8 (3), 568-582 (2013).
  19. Oh, S., Kessler, J. A. Design, Assembly, Production, and Transfection of Synthetic Modified mRNA. Methods. 133, San Diego, CA. 29-43 (2018).

Tags

Immunologie en infectie probleem 153 primaire macrofagen peritoneale macrofagen macrofagen uit het beenmerg immuuncellen in vitro transcriptie mRNA transfectie
Zeer efficiënte transfectie van primaire macrofagen met in vitro getranscribeerd mRNA
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Herb, M., Farid, A., Gluschko, A.,… More

Herb, M., Farid, A., Gluschko, A., Krönke, M., Schramm, M. Highly Efficient Transfection of Primary Macrophages with In Vitro Transcribed mRNA. J. Vis. Exp. (153), e60143, doi:10.3791/60143 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter