Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Высокоэффективная трансфекция первичных макрофагов с помощью In Vitro транскрибированная мРНК

Published: November 9, 2019 doi: 10.3791/60143
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2,3,4, 1
1Institute for Medical Microbiology, Immunology and Hygiene, Faculty of Medicine and University Hospital Cologne, University of Cologne, 2Center for Molecular Medicine Cologne, 3Cologne Cluster of Excellence on Cellular Stress Responses in Aging-associated Diseases (CECAD), 4German Center for Infection Research (DZIF)

Summary

Макрофаги, особенно первичные макрофаги, являются сложными для трансфекта, поскольку они специализируются на обнаружении молекул несобственного происхождения. Мы описываем протокол, который позволяет высокоэффективную трансфекцию первичных макрофагов с мРНК, генерируемых из шаблонов ДНК, таких как плазмиды.

Abstract

Макрофаги являются фагоцитическими клетками, специализирующимися на обнаружении молекул несобственного происхождения. С этой целью они оснащены большим массивом рецепторов распознавания образов (PRRs). К сожалению, это также делает макрофаги особенно сложными для трансфекта, как трансфекционный реагент и транс-инфицированных нуклеиевых кислот часто признаются PRRs как не-самостоятельно. Поэтому трансфекция часто приводит к активации макрофагов и деградации трансинфицированных нуклеиновых кислот или даже к самоубийству макрофагов. Здесь мы описываем протокол, который позволяет высокоэффективную трансфекцию основных макрофагов, таких как перитонеальные макрофаги (ТЧ) и макрофаги костного мозга (BMDM) с мРНК в пробирке, транскрибированной из шаблонов ДНК, таких как плазмиды. С помощью этого простого протокола, трансфекционная скорость около 50-65% для ТЧ и около 85% для BMDM достигаются без цитотоксичности или иммуногенности наблюдается. Мы подробно описываем генерацию мРНК для трансфекции из конструкций ДНК, таких как плазмиды и процедура трансфекции.

Introduction

Макрофаги являются фагоцитическими клетками, которые специализируются на обнаружении, глотании и деградации микробов, апоптотарных клеток и клеточного мусора. Кроме того, они помогают организовать иммунную реакцию, выделяя цитокины и хемокины и представляя антигены Т-клеток и В-клеток. Макрофаги также играют важную роль во многих других процессах, таких как заживление ран, атеросклероз, опухолевие и ожирение.

Чтобы быть в состоянии обнаружить не-самостоятельно молекул, таких как патогенные молекулярные модели (PAMPs) и вне места молекул, таких как повреждения связанных молекулярных моделей (DAMPs), макрофаги оснащены большим массивом рецепторов распознавания образов (PRR)1. К сожалению, это также делает макрофаги особенно сложными для трансфекта2 как трансфекционный реагент3 и трансинфицированных нуклеиновых кислот4,5,6,7часто признаются PRRs как не-самостоятельно. По этой причине трансфекция макрофагов с использованием химических или физических методов8 обычно приводит к активации макрофагов и деградации транс-инфицированных нуклеиных кислот или даже в самоубийстве макрофагов с помощью пироптоза, формы запрограммированной гибели литикических клеток, вызванной после распознавания цитосолильных PAMPs/DAMPs, таких как ДНК или чужая РНК9. Биологическая трансфекция макрофагов с использованием вирусов, таких как аденовирусы или лентивирусы в качестве переносчиков часто более эффективна, но строительство таких вирусных векторов занимает много времени и требует биобезопасности уровня 2 оборудования10,11.

Таким образом, хотя макрофаги являются предметом интенсивных исследований, анализ их функций на молекулярном уровне затруднен, поскольку один из важнейших инструментов молекулярной биологии, трансфекция нуклеиновой кислоты строит для экзогенного выражения белки, вряд ли применимы. Это часто заставляет исследователей использовать макрофаговые клеточные линии, а не добросовестные макрофаги. Приложения для трансфекции конструкции нуклеиновой кислоты включают экспрессию мутировавших или помеченных белковых версий, переэкспрессию конкретного белка, повторное выражение белка в соответствующем фоне нокаута и экспрессию белков других видов (например. , Крем рекомбиназы или руководство РНК и Cas9 для целевого нокаута гена).

Здесь мы описываем протокол, который позволяет высокоэффективную трансфекцию (обычно трудно трансфектные) первичные макрофаги, то есть мурин перитонеальных макрофагов (PM) и макрофагов костного мозга (BMDM) с мРНК, генерируемых из шаблонов ДНК, таких как плазмиды. Важно отметить, что в пробирке транскрибируется мРНК, генерируемых с помощью этого протокола содержит естественные модифицированные нуклеозиды 5-метил-CTP и псевдо-UTP, которые снижают иммуногенность и повышают стабильность4,6,7,12,13. Кроме того, 5'-концы в пробирке транскрибируется мРНК дефосфорилированы антарктической фосфатазы, чтобы предотвратить признание RIG-I комплекс14,15. Это сводит к минимуму врожденное иммунное распознавание в пробирке транскрибированной мРНК. С нашим простым в выполнении протокола, скорость трансфекции между 50-65% (перитонеальные макрофаги (PM)) и 85% (BMDM) достигаются в то время как, что важно, нет цитотоксичности или иммуногенности наблюдается. Мы подробно описываем (i) как иммунологически заглушенная мРНК для трансфекции может быть получена из конструкций ДНК, таких как плазмиды и (ii) сама процедура трансфекции.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Макрофаг изоляция от мышей была проведена в соответствии с Законом германии о защите животных в соответствии с Комитетом по этике Кельнского университета.

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняй все ступени в перчатках. Выполняй все этапы трансфекции под ламинарным капотом для предотвращения загрязнения клеток. Перед работой с мРНК очистите все инструменты, такие как пипетки и каждую поверхность с 70% этанола и/или RNAse-унизительным сурфактантом(Таблица Материалов). Убедитесь, что все реакционные трубки не являются РНС и стерильны. Используйте только стерильную, безРНК воду для разбавления. Исключительно использовать пипетки советы с фильтрами. Изменение пипетки советы после каждого шага пипетки.

1. Поколение шаблона ДНК

ПРИМЕЧАНИЕ: Шаблон ДНК для транскрипции in vitro mRNA с помощью этого протокола должен содержать промоторную последовательность T7, позволяющую стыковку РНК-полимераза. Если плазмида, содержащая последовательность ДНК интересуемого белка, уже содержит правильно сориентированный промоторный последовательность T7 непосредственно вверх по течению последовательности интереса, необходимо выполнить линейную линию плазмиды (см. шаг 1.1.). В противном случае прикрепите промотор T7 к последовательности интереса путем полимеразной цепной реакции (PCR, см. шаг 1.2.).

  1. Линейная денализация промоторосодержащих плазмидов Т7
    1. Линейная плазмиды, уже содержащая правильно ориентированную промоторную последовательность T7 путем пищеварения с ферментом ограничения, вырезающий вниз по течению стоп-кодон последовательности интереса. В противном случае, транскрипция не закончится должным образом после последовательности интересов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Лучше всего использовать ферменты ограничения оставляя тупые концы или 5' свесы.
    2. Подтвердите полную линейную дисмидацию агарозным гелем электрофораса непереваренной против переваренной плазмидной ДНК.
    3. Очистка линейной плазмидной ДНК до использования в качестве шаблона ДНК для транскрипции in vitro mRNA с помощью комплекта для очистки ДНК(Таблица материалов).
  2. Прикрепление промотора T7 пЧР
    1. Используйте передний грунт, содержащий следующие компоненты (в указанном порядке от 5'до 3'): около 5 случайных bp вверх по течению промотора (например, GAAAT); промоторная последовательность Т7 (TAATACGACTACTACTATAG); два дополнительных Gs для повышения эффективности транскрипции (GG); целевая последовательность-специфическая часть, которая гомологична к плазмидной последовательности, окружающей стартовый кодон.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Она должна состоять из: 3-6 bp вверх по течению последовательности KO'АКИи и начать кодон, последовательность KO'АКИ и начать кодон (обычно GCCACC ATG G), 12-18 bp вниз по течению стартового кодона. Если последовательность интересов уже не содержит последовательность KO'A или начала кодона, они могут быть прикреплены в этом шаге, просто включив их в последовательность грунтовки.
    2. Рассчитайте тм переднего грунтовки только с учетом гомологии детали в целевой последовательности.
    3. Для оценки димеров/формирования шпильки используйте всю последовательность грунтовки, которая легко может превышать 50 б.п.
    4. Используйте обратную грунтовку, расположенную где-то ниже по течению от стоп-кодона.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если последовательность интересов уже не содержит стоп-кодон, она может быть прикреплена в этом шаге, просто включив его в последовательность грунтовки.
    5. Используйте передние и обратные грунтовки для выполнения ПЦР с использованием полимеразы высокой точности с корректуры (Таблица материалов).
    6. Подтвердите генерацию одного продукта и размер амплитона с помощью электрофореза агарозного геля (например, используйте 1% геля агарозы и 100 В постоянного тока).
    7. Очистите продукт ПЦР перед использованием в качестве шаблона ДНК для транскрипции in vitro mRNA с помощью комплекта для очистки ДНК.

2. поколение мРНК

  1. Оттепель все компоненты комплекта транскрипции in vitro mRNA (см. Таблицу материалов). Vortex для 5 с и спина вниз на 2 с на 2000 х г. Держите на льду до использования.
  2. Подготовьте реакционную смесь для транскрипции in vitro mRNA в микроцентрифуге объемом 0,5 мл в следующем порядке (общий объем 40 зл): 20 кЛ 10-x ARCA/NTP смеси (входит в комплект транскрипции in vitro mRNA); 0,25 л 5-метил-КТП (окончательная концентрация (f.c.) составляет 1,25 мМ; 50% от общего объема CtP); 0,25 л псевдо-UTP (f.c. составляет 1,25 мМ; 50% от общего объема UTP); X Зл шаблона ДНК; 2 зл и l смеси полимеразов T7 РНК (входит в комплект транскрипции in vitro mRNA); Y ЗЛ без РНАЗ Н2О.
    ПРИМЕЧАНИЕ: X - это объем, содержащий не менее 1 мкг ДНК. Например, 1,6 л от 625 нг/Л биржевого раствора. Y является запасным объемом в общем объеме 40 Зл.
  3. Vortex для 5 с и спина вниз на 2 с на 2000 х г. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 30 мин при 400 об/мин на тепловом миксере для транскрипции in vitro.
  4. Затем добавьте 2 Зл dNase I непосредственно в смесь реакции для удаления шаблона ДНК. Vortex для 5 с и спина вниз на 2 с на 2000 х г.
  5. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 15 мин при 400 об/мин на термальных смесителях. Возьмите аликот из 2 л для контрольного геля (шаг 3.3) и храните при -80 градусов по Цельсию.
  6. Для поли(A) хвостохранилища добавьте следующие компоненты непосредственно в предыдущую смесь реакции (до конечного объема 50 Зл): 5 кЛ 10x полимеразы реакции буфера и 5 Зл поли(A) полимеразы (оба включены в комплект транскрипции in vitro mRNA). Vortex для 5 с и спина вниз на 2 с на 2000 х г.
  7. Инкубировать смесь при 37 градусах по Цельсию в течение 30 мин при 400 об/мин на термомиксере. Возьмите аликот из 2 л для контрольного геля (шаг 3.3) и храните при -80 градусов по Цельсию.
  8. Для дефосфорилирования 5 и концей мРНК добавьте следующие компоненты непосредственно в предыдущую реакционную смесь (до окончательного объема 60 Зл): 3 КЛ без РНАЗа H2O; 6 кл. 10-ти антарктического буфера реакции фосфатазы; 3 зЛ антарктического фосфатазы (15 единиц при 60 мл объема реакции). Vortex для 5 с и спина вниз на 2 с на 2000 х г.
  9. Инкубировать смесь при 37 градусах по Цельсию в течение 30 мин при 400 об/мин на термальных смесителях.
  10. Теплоинактивирует антарктическую фосфатаза путем инкубации при температуре 80 градусов по Цельсию в течение 2 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В идеале используйте отдельный термомикс, не ждите, пока первый миксер достигнет желаемой температуры.

3. Очистка мРНК

  1. Очистите in vitro транскрибированной мРНК с помощью специального комплекта очистки РНК(Таблица материалов).
    1. Добавьте X Зл раствора elution в смесь реакции мРНК со ступени 2.10. Смешайте путем инвертирования 5 раз. Добавьте 300 л связывающего стена раствора. Смешайте нежным пайпеттингом 5 раз.
      ПРИМЕЧАНИЕ: X является запасной объем в общей объеме 100 Л. Например, добавьте раствор elution 40 л л к 60 мРНК-смеси реакции.
    2. Добавьте 100 л этанола без РНАза. Смешайте нежным пайпеттингом 5 раз.
    3. Поместите столбец фильтра в одну из поставляемых коллекторских труб. Передача мРНК реакции смесь осторожно на центр фильтра, не касаясь фильтра. Центрифуга при температуре 15 000 х г в течение 1 мин при комнатной температуре (RT).
    4. Аккуратно поднимите столбец фильтра и отбросьте проточный поток в трубке для сбора. Поместите столбец фильтра обратно в ту же трубку сбора.
    5. Добавьте 500 л раствора для мытья (не забудьте добавить 20 мл этанола без РНАза перед использованием раствора для мытья в первый раз).
    6. Центрифуга при 15 000 х г в течение 1 мин на RT. Повторите шаги 3.1.4-3.1.6 для мытья еще раз.
    7. Центрифуга на полной скорости (17900 х г)в течение 1 мин на RT, чтобы удалить любую остаточную жидкость из столбца фильтра. Аккуратно возьмите столбец фильтра из трубки для сбора. Поместите столбец фильтра в новую трубку для сбора.
    8. Добавьте 50 зл буфера элюции в центр фильтра, не касаясь фильтра. Инкубировать при 65 градусах по Цельсию в течение 10 минут на термальный миксер.
    9. Центрифуга при 15 000 х г в течение 1 мин на RT. Удалите столбец фильтра и отбросьте ее.
  2. Измерьте концентрацию и чистоту элетированной мРНК, например, с помощью микротомного спектрофотометра для измерения абсорбции на уровне 260 и 280 нм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Коэффициент A260/A280 1,8-2,1 свидетельствует о высокоочищенной мРНК.
  3. Проверить наличие одного продукта, правильной длины стенограммы и поли(A) хвостохранилища путем анализа aliquots из шагов 2.5 и 2.7 по агарозного геля электрофорез в условиях денатурирования (например, использовать 1,2% агарозный гель, содержащий 20 мМ 3-(N-морфино) пропанесульфоновая кислота «MOPS», ацетат натрия 5 мМ, 1 мМ EDTA и 20% формальдегид и работают в 20 mM MOPS, 5 мМ ацетат натрия, 1 мМ EDTA и 0,74% формальдегида при 100 V постоянном токе).
  4. Храните очищенную мРНК в трубке elution при -80 градусах По Цельсию до трансфекции. При использовании только низких количеств мРНК для трансфекции, то aliquot мРНК, чтобы избежать повторных циклов замораживания-оттепели.
    ПРИМЕЧАНИЕ: мРНК может храниться при -80 градусов по Цельсию в течение 1 года.

4. Подготовка макрофагов

  1. Эвтаназия C57/BL6 мышей (использование мышей того же пола и 6-24 недель возраста) путем вывиха шейки матки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Те же мыши могут быть использованы для изоляции ТЧ (шаг 4.2) и генерации BMDM (шаги 4.3 и 4.4). Для изоляции ТЧ используйте как минимум двух мышей. Если только BMDM должны быть сгенерированы одной мыши, как правило, достаточно.
  2. Иммуномагнитное обогащение перитонеальных макрофагов.
    1. Заполните 10 мл шприц с 0,9 х 40 мм канюли с 8 мл ледяной фосфат-буферный солей (PBS) и 2 мл воздуха. Промыть перитонеальной полости с ПОМОЩЬю PBS. Воздух образует пузырь, который минимизирует утечку PBS.
    2. Быстро соберите перитонеальный промывку с тем же шприцем и перенесите в коническую центрифугацию 50 мл трубки. Объедините перитонеальные клетки нескольких мышей, если это необходимо. Держите клеточную подвеску на льду.
    3. Суспензия центрифуг и цельсия при 650 х г в течение 5 мин при 4 градусах По кв. Откажитесь от супернатанта и resuspend клеточной гранулы в 5 мл 0,2 % NaCl для 30 с лиза красных кровяных телец.
    4. Добавьте 5 мл 1,6% NaCl к общему объему 10 мл для восстановления изотонических условий. Центрифуга при 650 х г в течение 5 мин при 4 градусах По цельсию.
    5. Откажитесь от супернатанта и повторно отретим в клеточные гранулы в 97,5 л сортировки магнитных клеток (MCS) буфер (2 мМ этиленденедиацетическая кислота "EDTA", 5% бычьей сыворотки альбумина в PBS) на 1 перитонеальной проваглицательной (например, если три мыши были промыты, resuspend в 292,5 л. ).
    6. Добавьте 2,5 л парамагнитных бусинок, спряжение к антителу, специфичному для CD11b на 97,5 л клеточной подвески (например, добавьте 7,5 л до 292,5 л).
    7. Инкубировать на льду 15 мин при 150 об/мин на орбитальном шейкере.
    8. Суспензия клеток Centrifuge на уровне 650 х г в течение 5 мин при 4 градусах По Цельсию, отбросить супернатант и отложить клеточные гранулы в 1 мл буфера MCS.
    9. Добавьте 4 мл буфера MCS в общий объем 5 мл и промойте клетки, аккуратно потянив вверх и вниз три раза.
    10. Повторите шаги 4.2.8 и 4.2.9 еще два раза в общей сложности три шага мытья.
    11. Во время стирки шаги место LS колонки в магнитных клеток сепаратора (см. Таблица материалов). Промыть столбец с 3 мл буфера MCS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте пузырьков, поскольку они могут засорить столбец.
    12. Отрежь пеллетку ячейки в 1 мл буфера MCS. Добавьте 3 мл буфера MCS в общий объем 4 мл, смешайте путем трижды смешайте трубку вверх и вниз.
    13. Перенесите 4 мл клеточной подвески на промытую колонку LS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Опять же, избежать каких-либо пузырьков, поскольку они могут засорить столбец.
    14. Подождите, пока резервуар колонны полностью пуст. Не добавляйте дополнительную жидкость до тех пор, пока столбец не прекратит капать.
    15. Добавьте 3 мл буфера MCS в столбец. Затем подождите, пока резервуар колонны полностью опустеет. Повторите шаг 4.2.15 еще два раза.
    16. Поместите колонну LS в коническую центрифугацию 15 мл. Нанесите 5 мл буфера MCS на столбец. Подождите, пока 2 мл жидкости прошла через колонку, а затем использовать поршень, чтобы осторожно нажать оставшуюся фракцию в трубку.
    17. Центрифуги подвески клеток на 650 х г в течение 5 мин при 4 кв и отбросить супернатант.
    18. Приостанавливайте действие клеточной гранулы в 1 мл DMEM, дополненной 10% теплоинактивированной сывороткой плода (FCS) (DMEM-FCS).
    19. Определите количество жизнеспособных клеток, отсчитав в трипан синем растворе в камере подсчета Нойбауэра и семенных клетках в DMEM-FCS в культурные пластины.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Семенной PM при плотности 100 000 клеток/колодца в плоской нижней микротитерной пластине. Не используйте ткани культуры обработанных пластин, как PM не может быть отделена от них. Вместо этого используйте необработанные пластины.
  3. Поколение БМДМ
    1. Удалить кожу и мышцы с задних ног с помощью ножниц. Вымойте каждую ногу коротким погружением в 70% этанола.
    2. Отсоедините ноги и откройте оба конца бедренной кости и голени, разрезая ножницами.
    3. Заполните 5 мл шприц заполнены 0,6 мм х 30 мм канюли с 5 мл очень низкого эндотоксина (VLE) RPMI 1640 и промыть костного мозга из открытых костей в культуре блюдо.
    4. Объедините костный мозг нескольких мышей, если требуется, повторяя шаги 4.3.1-4.3.3. Перенесите костный мозг в коническую центрифугацию 50 мл.
    5. Centrifuge суспензии костного мозга на 650 х г в течение 5 мин при 4 кв и отбросить супернатант.
    6. Приостановить клеточные гранулы в 5 мл крови лизовых буфера (8,3% NH4Cl, 0,1 М Tris) и инкубировать в течение 5 минут на RT, чтобы линза красных кровяных телец.
    7. Centrifuge подвески клетки на 650 х г при 4 "C в течение 5 минут и отбросить супернатант.
    8. Повторное действие клеточных гранул в 1 мл VLE RPMI 1640 средний дополнен 10% FCS, 1% пенициллина / стрептомицина, 1% HEPES, 1% пируват натрия и 10 нг /мЛ рекомбинантных макрофаг колонии стимулирующий фактор (M-CSF) (RPMI.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
    9. Добавьте 4 млRPMI к общему объему 5 мл.
    10. Приготовьте 5 92 мм х 16 мм необработанных блюд Петри с кулачками (см. таблицу материалов) на мышь путем пайпетики 7 мл RPMI.
    11. Перенесите 1 мл клеточного раствора в 5 приготовленных культурных блюд и инкубировать при 37 градусах Цельсия и 5% CO2.
    12. Через 4 дня кормите клетки, добавляя 4 млRPMI. Через 6-7 дней клетки костного мозга полностью дифференцированы в БМДМ.
  4. Сбор бМДМ
    1. Полностью удалить медиум из культуры блюд. Добавьте 5 мл теплой 0,2 мм EDTA в PBS к каждому блюду.
    2. Аккуратно соскребите всю тарелку с помощью клеточного скребока, чтобы отсоединить БМДМ. Объедините клеточные суспензии в конической центрифугальной трубке 50 мл.
    3. Промыть все 5 блюд снова. Используйте тот же объем 5 мл теплой 0,2 мм EDTA в PBS для всех 5 блюд. Объедините эту подвеску ячейки с той, что была на предыдущем этапе.
    4. Centrifuge клеточной подвески на 650 х г в течение 5 мин при 4 "C и отбросить супернатант.
    5. Повторное использование клеточных гранул в 1 мл VLE RPMI 1640 средних дополнен 10% FCS, 1% HEPES, 1% пируват натрия и 10 нг/мл рекомбинантных M-CSF, но без антибиотиков (RPMI)).
    6. Определите количество жизнеспособных клеток, подсчитав в трипан синем растворе в камере подсчета Нойбауэра и семенных клетках вRPMI в культурные пластины.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Семена BMDM при плотности 50000 клеток / хорошо максимум в плоской нижней микротитер пластины. Не используйте ткани культуры обработанных пластин, как BMDM вряд ли может быть отделена от них. Вместо этого используйте необработанные пластины.

5. Трансфекция макрофагов с мРНК

  1. Рассчитайте необходимый объем буфера трансфекционного промена мРНК.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Требуемый объем буфера трансфекции мРНК зависит от размера скважины: используйте 200 л для трансфекции в 6-колодецной пластине, 100 л в 12-колодской пластине и так далее. Всегда добавляйте немного запасного объема из-за потери трубаций (но не слишком много, чтобы предотвратить неоправданное разбавление мРНК). Например, используйте 450 qL вместо 4 х 100 л и 400 л для трансфекта в 4 скважинах 12-колодца пластины.
  2. Рассчитайте необходимый объем трансфекционного реагента мРНК. Трансфекционный реагент mRNA добавляется в соотношении 1:50. Например, для окончательного объема в 450 л требуется 9 л трансфекционного реагента мРНК.
  3. Рассчитайте общее количество требуемых мРНК. По крайней мере 100 нг на 100 000 макрофагов необходимы для эффективного трансфекции, 200 нг работает еще лучше (например, 800 нг мРНК для трансфекта 400 000 макрофагов).
    1. Умножьте расчетное количество мРНК, необходимое, с общим количеством скважин, которые должны быть трансинфицированы (например, 4 скважины с 400 000 макрофагов каждый: 4 х 800 нг и 3200 нг мРНК требуется в общей сложности для всех скважин). Например, если ваш запас мРНК составляет 426,8 нг/Л, для оптимального трансфекции 4 скважин с 400 000 макрофагов требуется 7,49 л.
  4. Добавьте расчетный объем буфера трансфекционного переноса мРНК (шаг 5.1.) за вычетом объемов для реагента трансфекционного реагента мРНК (шаг 5.2) и мРНК (шаг 5.3) к реакционной трубке. Например, 450 л - 9 л - 7,49 л и 433,51 л.
  5. Оттаиваете запас мРНК и смешайте его нежным переворачиванием трубки элютации. Добавьте расчетный объем мРНК (шаг 5.3) в реакционную трубку с буфером реакции мРНК (в приведенном выше примере: 7,49 л в 433,51 л).
  6. Vortex для 5 с и спина вниз на 2 с на 2000 х г.
  7. Vortex мРНК трансфекционный реагент для 5 с и спина вниз на 2 с на 2000 х г.
  8. Добавьте расчетный объем реагента трансфекционного реактива мРНК (шаг 5.2) в реакционную трубку, содержащую буфер трансфекционного мРНК и мРНК (в приведенном выше примере: 9 ЗЛ трансфекционного реагента мРНК).
  9. Vortex трансфекционной смеси для 5 с и спина вниз на 2 с на 2000 х г.
  10. Инкубировать в течение 15 минут на RT.
  11. Между тем, замените культурную среду макрофагов свежей, теплой культурой среды (см. шаги 4.2.18. и 4.4.5).
  12. После инкубационного шага 5.10 добавьте трансфекционную смесь в скважины, содержащие макрофаги, в объеме, соответствующем размеру скважины (см. шаг 5.1). Добавить трансфекционную смесь dropwise в круг снаружи к середине скважины.
  13. Аккуратно раскачивать пластину, сначала в вертикальном, а затем в горизонтальном направлении, чтобы обеспечить равномерное распределение трансфекционной смеси в скважине. Затем, инкубировать при 37 градусах По цельсии и 5 % CO2. Синтез белка, кодированного трансинфицированной мРНК, начнется вскоре после трансфекции. Для достижения наилучших результатов, инкубировать, по крайней мере 6 ч.
  14. После инкубации, анализ эффективности трансфекции с помощью (иммуно) флуоресценции микроскопии, потока цитометрии или иммуноблот16, или использовать транс-инфицированных макрофагов для эксперимента выбора.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Мы успешно использовали этот протокол для создания кодирования мРНК для вариантов NEMO и IKK, отмеченных FLAG, для трансфекции первичных макрофагов16. Плазмиды, кодирующие для FLAG-tagged дикого типа (NEMOWT)и C54/347A мутант NEMO (NEMOC54/374A) (см. Таблица материалов) уже содержат промотор T7 в правильной ориентации(рисунок 1A). Таким образом, мы только должны были линейной плазмиды для создания шаблонов ДНК для транскрипции in vitro. С этой целью, 10 мкг плазмидной ДНК были уварены с 5 Л Xbal в результате линейной линии плазмида из-за одного разреза 3 ' остановки кодон. Полная линейная линия плазмидной ДНК была проверена электрофорусом агарозного геля(рисунок 1В).

Плазмиды, кодируя для FLAG-tagged дикого типа (IKK'WT) и S177/181E мутант IKK ( IKKS177/181E) не содержат промотор T7. Таким образом, мы прикрепили T7 промотор ПЦР для создания шаблонов ДНК для транскрипции in vitro(Рисунок 2A). Поколение конкретного пЦР-продукта, т.е. одного продукта правильного размера, было проверено электрофорусом агарозного геля(рисунок 2В).

После транскрипции in vitro с использованием соответствующих шаблонов ДНК, мы проверили генерацию одного мРНК продукта правильного размера и поли (A) хвостохранилище агарозным гелем электрофорезом в условиях денатурации(рисунок 3).

Чтобы убедиться, что мРНК, генерируемый с помощью этого протокола, позволяет трансфекцию первичных макрофагов (см. Рисунок 4А, B для цитометрического анализа потока иммуномагнитного обогащения ТЧ и дифференциации статуса BMDM), мы создали мРНК кодирование для eGFP(Рисунок 5A-C) и проанализировали эффективность трансфекции по цитометрии потока(рисунок 6A). 100 000 PM или 50 000 BMDM на скважину необработанной пластины микротитера были переинфицированы 50, 100 или 200 нг eGFP mRNA за 6, 9 или 24 ч. Как в ТЧ, так и в БМДМ высокие уровни экспрессии eGFP могут быть обнаружены на уровне 6 ч после трансфекции. Скорость трансфекции увеличилась с количеством трансинфицированной мРНК и была самой высокой для 200 нг мРНК(рисунок 6B,C). Для PM, скорость трансфекции достигла около 50-65% на 6 до 9 ч после трансфекции(рисунок 6B). На 24 ч после трансфекции, скорость трансфекции была значительно ниже, что свидетельствует о истекающих выражениях eGFP. Таким образом, ТЧ не следует трансфицировать в одночасье. Для БМДМ скорость трансфекции достигла около 80-85%(рисунок 6С). Снижение частоты трансфекций после 24 ч было гораздо менее выраженным в БМДМ. Таким образом, BMDM может быть транссексуалом в одночасье. В обоих PM(Рисунок 6D, E) и BMDM(Рисунок 6F,G), уровень экспрессии eGFP в транс-инфицированных клетках увеличился во времени и зависимости от дозы образом. Важно отметить, что процедура трансфекции не вызывала гибели литикических или апоптотической клеток, так как не было увеличения пропидий-йодид-позитивного (PI) или приложения V-положительных макрофагов после трансфекции(рисунок 7A, B).

Эффективность трансфекции мРНК, кодирующих для вариантов NEMO или IKK, помеченных FLAG, была проанализирована с помощью иммунофлюоресценционной микроскопии. 300 000 ТЧ на скважину 12-ну колодец были переинфицированы 300 нг соответствующего мРНК на 6 ч. Скорость трансфекции составила около 60% для NEMO mRNAs и около 55% для IkK' mRNA(рисунок 8A,B). Таким образом, их показатели трансфекции были аналогичны показателям eGFP mRNA, указывающим на общий уровень трансфекции около 55% для ТЧ.

Мы также использовали этот протокол для создания кодирования мРНК для рекомбиназы. Трансфекция 400 000 BMDM от neMOflox/flox мышей17 в скважину из 12-хорошо пластины с 400 нг Cre recombinase мРНК привело к почти полному истощению белка NEMO после 48 ч(Рисунок 9) с указанием высокоэффективного трансфекции BMDM.

PM и BMDM не выделяют никаких обнаруживаемых количеств IL-1, IL-6 и TNF после трансфекции(рисунок 10A,B). Кроме того, сигнальные пути NF-kB и MAPK не были активированы после трансфекции16, указывающие на то, что процедура трансфекции не активирует провоспалительные сигнализации. Мы также не наблюдали никаких функциональных изменений транс-инфицированных макрофагов по сравнению с нетрансинфицированными макрофагами16.

Figure 1
Рисунок 1: Линейная амортизация плазмид NEMO-кодирования, уже содержащего промотор T7 в правильной ориентации. (A) Последовательность выдержка плазмид кодирования для FLAG помечены NEMOВТ или NEMOC54/347A. Промотор T7 в правильной ориентации и близко к последовательности KO'АКИ и старту кодона уже присутствует. Промоторная область T7, последовательность кодирования (CDS) для тега FLAG и NEMO, кодоны старта и остановки и место ограничения для линейной атриаризации с помощью XbaI являются цветными кодированными. (B) Представитель 1% агарозный гель, показывающий плазмиды до и после линейности с Xbal; 1 Л необработанной, линейной или очищенной линейной плазмидной ДНК был загружен на полосу. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Промоторное крепление T7 к плазмидным плазмидам ИККЗ пЦР. (A) Последовательность выдержки из плазмидкодирования для FLAG-тегами IKK'WT или IKKs177/181E. Плазмиды не содержат подходящего promotor T7, который поэтому прилагается ПЦР. Местоположение, ориентация и последовательность переднего грунтовки (содержащей промоторную последовательность T7, которая будет добавлена) и обратная грунтовка указаны стрелками. Промоторная область T7, CDS для тега FLAG и IKK, а также кодоны старта и стопа имеют цветовую кодон. (B) Представитель 1% агарозный гель проверки поколения одного продукта ПЦР правильного размера с помощью грунтовки, указанные выше. 1 зл очищенного продукта ПЦР был загружен на полосу. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: синтез мРНК из шаблонов ДНК NEMO- и IKK- кодирования. ()Представитель denaturing 1,2% агарозный гель, содержащий 0,7% формальдегида, показывающий очищенный мРНК конструкций NEMO и IKK' до и после поли(A) хвостохранилища. 2 Зл NEMOWT, NEMOC54/347A, IKK'WT и IKKS177/181E mRNA были загружены на полосу. Лестница ssRNA 32 зЛ была загружена для определения длины РНК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4: Поток цитометрического анализа иммуномагнитного обогащения ТЧ и дифференциации статуса БМДМ. (A) Процент F4/80/CD11bPM в перитонеальной промывке до и после иммуномагнитного обогащения был проанализирован цитометрией потока. (B) Выражение F4/80 и CD11b BMDM после 6 дней дифференциации было проверено цитометрией потока. На выборку, соответственно, было подсчитано 10 000 или 5000 клеток. Данные отображаются как средние - SEM n 3 независимых эксперимента, каждый из них. - П Злт; 0,05, П.л.; 0,01, П .л.; 0,001 и П.л.; 0,0001 с помощью студенческая t-test. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 5
Рисунок 5: синтез мРНК с поли(А) хвостохранилищем eGFP. (A) Последовательность выдержка плазмид кодирования для eGFP. Плазмида не содержит подходящего promotor T7, который поэтому прилагается ПЦР. Местоположение, ориентация и последовательность переднего грунтовки (содержащей промоторную последовательность T7, которая будет добавлена) и обратная грунтовка указаны стрелками. Промоторная область T7, CDS для eGFP и стартовые и стоп-кодоны имеют цветовую кодированную. (B) Представитель 1% агарозный гель, показывающий очищенный ампромотпосле после ПЦР с использованием грунтовок, указанных выше. 1 зл очищенного продукта ПЦР был загружен на полосу. (C) Представитель denaturing 1.2% агарозный гель, содержащий 0,7% формальдегида, показывающий очищенную мРНК eGFP до и после поли(A) хвостохранилища. На одну полосу были загружены 2 ЗЛ мРНК eGFP. Лестница ssRNA 32 зЛ была загружена для определения длины РНК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 6
Рисунок 6: Высокоэффективная трансфекция как перитонеальных макрофагов, так и БМДМ с помощью eGFP mRNA. Макрофаги были инкубированы для 6, 9 или 24 ч с 50, 100 или 200 нг eGFP мРНК комплекса для jetMESSENGER или с jetMESSENGER только (mock), а затем проанализированы поток цитометрии. (A) Стратегия Gating используемая для того чтобы определить населенности жизнеспособных макрофагов, жизнеспособных eGFP- макрофагов иPI (т.е. мертвых) макрофагов. Показаны репрезентативные данные для трансфекции с 200 нг мРНК на 6 ч. (B, C) Скорость трансфекции(B) PM и(C) BMDM были определены путем анализа процента жизнеспособных eGFP-положительных клеток по цитометрии потока (n No 5-7 и n 4-5 независимых экспериментов, соответственно). (D-G) Уровни экспрессии eGFP были определены путем анализа средней интенсивности флуоресценции (МФО) жизнеспособной(D)PM и(F)BMDM и жизнеспособной и eGFP-позитивной субпопуляции (E)PM и (G) BMDM (n no 5-7 и n 4-5 независимых экспериментов, соответственно). На выборку было подсчитано 10 000 клеток. Данные отображаются как средние - SEM. n.s. - не значительные; - П Злт; 0,05, П.л.; 0,01, П .л.; 0,001 и П.л.; 0,0001 с помощью студенческая t-test. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 7
Рисунок 7: Трансфекция не вызывает гибели литикических или апоптотической клеток. Трансфекционно-индуцированная клеточная смерть(A)PM и (B) BMDM была определена путем анализа процента PI-положительных и аннексировано V-положительных клеток (n No 5-7 и n 4-5 независимых экспериментов, соответственно). Процент мертвых макрофагов, присутствующих в нетрансинфицированных образцах (некоторая степень клеточной смерти была вызвана физическим отрывом макрофагов из скважин, несмотря на использование необработанных пластин), был вычтен из того, что в соответствующих транс-инфицированных образцах учитывается только гибель клеток, вызванная процедурой трансфекции. Стратегия gating, используемая для определения популяцийИП,приложенияV иPI/annexin V- макрофагов показана для репрезентативного набора данных PM, трансфицирующегося с 200 нг мРНК на 6 ч. В качестве положительного контроля использовался ставоспоррин (50 мкм на 1 ч). На выборку было подсчитано 10 000 клеток. Данные отображаются как средние - SEM. n.d. - не обнаруживаемые. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 8
Рисунок 8: Коэффициенты трансфекции с использованием кодирования мРНК для конструкций NEMO и IKK. Коэффициенты трансфекции с использованием мРНК кодирования для(A) КОНСТРУКЦИи NEMO и (B) Конструкции IKK были количественно с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии (n No 4 независимых экспериментов). Шкала бар No 4 мкм. Данные отображаются как средние - SEM. n.t. - не трансфицируется, n.s. - не значительные; - П Злт; 0,05, П.л.; 0,01, П .л.; 0,001 и П.л.; 0,0001 с помощью студенческая t-test. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 9
Рисунок 9: Трансфекция NEMOfl/fl BMDM с мРНК кодированием для рекомбиназы приводит к почти полному дефициту для NEMO. BMDM от NEMOfl/fl мышей были трансинфицированы мРНК кодирования Рек рекомбиназы для 48 ч. Дефицит белка NEMO в результате Cre-опосредованного нокаута был оценен западной помок с использованием конкретных антител, распознающих NEMO или актина и количественно денситометрии (n 5 независимых экспериментов). Данные отображаются как средние значения : SEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 10
Рисунок 10: Трансфекция не вызывает провоспалительный ответ. (A) PM и (B) BMDM были трансинфицированы с мРНК кодирования для NEMOWT или NEMOC54/347A. В качестве положительного контроля макрофаги были инфицированы моноцитогенами Listeria при множественности инфекции 1 или стимулировались 5 мкг/мл ЛПС или поли (I:C) в течение 5 ч (PM) или 24 ч (BMDM). Секретность IL-1, IL-6 и TNF в супернатант была количественно оценена ELISA (n no 3 независимых экспериментов). Данные отображаются как средние - SEM. n.t. - не трансфицируются, n.d. - не обнаруживаются. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Здесь мы представляем протокол для высокоэффективного трансфекции обычно труднопередаваемых первичных макрофагов с транскрибированной мРНК in vitro. Важно отметить, что трансфекция макрофагов с помощью этого протокола не вызывает гибель клеток и не активирует провоспалительные сигнализации, указывающие на то, что ни трансфекционный реагент, ни трансинфицированная мРНК не признаются несамостоятельным.

Качество мРНК имеет ключевое значение для успешного трансфекции макрофагов с помощью этого протокола. Таким образом, следует позаботиться о том, чтобы мРНК не соприкасалась с РНК (например, через загрязненные буферы или флаконы). Если вы сомневаетесь, проверьте на наличие мРНК деградации (например, агарозным гелем электрофорисисом). Скорость трансфекции и уровень экспрессии уже были максимальными на уровне 6 ч после трансфекции. Таким образом, возможно, что белок интереса выражается на уровнях, достаточных для анализа в более ранние точки времени после трансфекции. Мы не проверяли это, однако. Кроме того, трансфектирование больших количеств мРНК может еще больше увеличить скорость трансфекции и/или уровень экспрессии. Тем не менее, трансфектирование больших количеств мРНК потенциально может также привести к определенной степени иммуногенности или даже цитотоксичности. Полное их отсутствие является одним из главных преимуществ этого протокола. Таким образом, для того чтобы трансфицировать большие количества мРНК, необходимо тщательно оценить иммуногенность и цитотоксичность.

Уровень экспрессии четко коррелировал с количеством трансинфицированной мРНК. Тем не менее, повторное выражение NEMO в NEMO-дефицитных BMDM привело к аналогичной экспрессии белка NEMO, как и в диком типе BMDM16, что свидетельствует о том, что трансфекция мРНК с помощью этого протокола не приводит к существенному переэкспрессии белка интерес. Таким образом, этот протокол может не подходить для изучения последствий переэкспрессии интересующего белка. Однако мы считаем это преимуществом, так как переэкспрессия белка часто изменяет его поведение.

Основное ограничение трансфекции мРНК, в общем, заключается в том, что она приводит лишь к переходному выражению белка интереса (потому что мРНК, генерируемая и трансфицируемая с помощью этого протокола, будет зависеть от нормального оборота). PM, кажется, выражает интерес к белку в течение более короткого периода времени по сравнению с BMDM. Таким образом, в отличие от БМДМ, ПМ не следует трансфицировать в одночасье. Как долго будет выражен данный интерес белок будет варьироваться (так как стабильность мРНК и белка будет меняться). Тем не менее, мы рекомендуем провести эксперимент по выбору в тот же день, что и трансфекция. Если выражение интересуемого белка требуется в течение более длительных периодов времени, клетки, вероятно, могут быть трансинфицированы несколько раз (например, каждый день, как описано в18).

Мы успешно использовали описанный здесь протокол для трансфекта murine PM и BMDM и мыши эмбриональных фибробластов (MEFs)16. Теоретически мРНК, генерируемая с помощью этого протокола, может быть использована для трансфектора любого типа клеток любого вида млекопитающих. Оптимальный реагент трансфекционного реагента мРНК и содержание модифицированных нуклеозидов могут отличаться для других типов клеток.

Перспективные будущие модификации включают в себя включение 5'- и 3'-UTRs. Большинство уже существующих плазмиды содержат только CCDS белка интерес, но не 5'- и 3'-UTRs. Их включение (как описано в19) может еще больше повысить стабильность мРНК и экспрессию. Кроме того, присоединение эпитопных тегов к интересуемому белку, просто включив последовательность тега эпитопа в переднюю или обратную грунтовку (для n- и C-терминала эпитопа пометки, соответственно), должно быть возможным.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 670).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5-methyl-CTP (100 mM) Jena Biosience NU-1138S stored at -20 °C
Antarctic phosphatase New England BioLabs M0289 stored at -20 °C
Antarctic phosphatase reaction buffer (10x) New England BioLabs B0289 stored at -20 °C
anti-NEMO/IKKγ antibody Invitrogen MA1-41046 stored at -20 °C
anti-β-actin antibody Sigma-Aldrich A2228 stored at -20 °C
Petri dishes 92,16 mm with cams Sarstedt 821,473 stored at RT
CD11b Microbeads mouse and human Miltenyi Biotec 130-049-601 stored at 4 °C
Cre recombinase + T7-Promotor forward primer Sigma-Aldrich 5′-GAAATTAATACGACTCACTATA
GGGGCAGCCGCCACCATGTCC
AATTTACTGACCGTAC-3´, stored at -20 °C
Cre recombinase + T7-Promotor reverse primer Sigma-Aldrich 5′-CTAATCGCCATCTTCCAGCAGG
C-3′, stored at -20 °C
DNA purification kit: QIAquick PCR purification Kit Qiagen 28104 stored at RT
eGFP + T7-Promotor forward primer Sigma-Aldrich 5´-GAAATTAATACGACTCACTATA
GGGATCCATCGCCACCATGGTG
AGCAAGG-3´, stored at -20 °C
eGFP + T7-Promotor reverse primer Sigma-Aldrich 5´-TGGTATGGCTGATTA
TGATCTAGAGTCG-3´, stored at -20 °C
Fast Digest buffer (10x) Thermo Scientific B64 stored at -20 °C
FastDigest XbaI Thermo Scientific FD0684 stored at -20 °C
High-fidelity polymerase with proofreading: Q5 High-Fidelity DNA-Polymerase New England Biolabs Inc M0491S stored at -20 °C
IKKβ + T7-Promotor forward primer Sigma-Aldrich 5′-GAAATTAATACGACTCACTATA
GGGTTGATCTACCATGGACTACA
AAGACG-3′, stored at -20 °C
IKKβ + T7-Promotor reverse primer Sigma-Aldrich 5′-GAGGAAGCGAGAGCT-CCATCTG-3′, stored at -20 °C
In vitro mRNA transcription kit: HiScribe T7 ARCA mRNA kit (with polyA tailing) New England BioLabs E2060 stored at -20 °C
LS Columns Miltenyi Biotec 130-042-401 stored at RT
MACS MultiStand Miltenyi Biotec 130-042-303 stored at RT
mRNA transfection buffer and reagent: jetMESSENGER Polyplus transfection 409-0001DE stored at 4 °C
Mutant IKKβ IKK-2S177/181E plasmid Addgene 11105 stored at -20 °C
Mutant NEMOC54/347A plasmid Addgene 27268 stored at -20 °C
pEGFP-N3 plasmid Addgene 62043 stored at -20 °C
poly(I:C) Calbiochem 528906 stored at -20 °C
pPGK-Cre plasmid F.T. Wunderlich, H. Wildner, K. Rajewsky, F. Edenhofer, New variants of inducible Cre recombinase: A novel mutant of Cre-PR fusion protein exhibits enhanced sensitivity and an expanded range of inducibility. Nucleic Acids Res. 29, 47e (2001). stored at -20 °C
pseudo-UTP (100 mM) Jena Biosience NU-1139S stored at -20 °C
QuadroMACS Separator Miltenyi Biotec 130-090-976 stored at RT
Rat-anti-mouse CD11b antibody, APC-conjugated BioLegend 101212 stored at 4 °C
Rat-anti-mouse F4/80 antibody, PE-conjugated eBioscience 12-4801-82 stored at 4 °C
Recombinant M-CSF Peprotech 315-02 stored at -20 °C
RNA purification kit: MEGAclear transcription clean-up kit ThermoFisher Scientific AM1908 stored at 4 °C
RNAse-degrading surfactant: RnaseZAP Sigma-Aldrich R2020 stored at RT
Ultrapure LPS from E.coli O111:B4 Invivogen stored at -20 °C
Wild type IKKβ plasmid Addgene 11103 stored at -20 °C
Wild type NEMO plasmid Addgene 27268 stored at -20 °C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ley, K., Pramod, A. B., Croft, M., Ravichandran, K. S., Ting, J. P. How Mouse Macrophages Sense What Is Going On. Frontiers in Immunology. 7 (204), (2016).
  2. Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. The expression of exogenous genes in macrophages: obstacles and opportunities. Methods in Molecular Biolology. 531, 123-143 (2009).
  3. Guo, X., et al. Transfection reagent Lipofectamine triggers type I interferon signaling activation in macrophages. Immunology and cell biology. 97 (1), 92-96 (2019).
  4. Kariko, K., Weissman, D. Naturally occurring nucleoside modifications suppress the immunostimulatory activity of RNA: implication for therapeutic RNA development. Current Opinion in Drug Discovery and Development. 10 (5), 523-532 (2007).
  5. Van De Parre, T. J., Martinet, W., Schrijvers, D. M., Herman, A. G., De Meyer, G. R. mRNA but not plasmid DNA is efficiently transfected in murine J774A.1 macrophages. Biochemical and biophysical research communications. 327 (1), 356-360 (2005).
  6. Uchida, S., Kataoka, K., Itaka, K. Screening of mRNA Chemical Modification to Maximize Protein Expression with Reduced Immunogenicity. Pharmaceutics. 7 (3), 137-151 (2015).
  7. Kariko, K., et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability. Molecular Therapy. 16 (11), 1833-1840 (2008).
  8. Khantakova, J. N., et al. Transfection of bone marrow derived cells with immunoregulatory proteins. Cytokine. 108, 82-88 (2018).
  9. Franz, K. M., Kagan, J. C. Innate Immune Receptors as Competitive Determinants of Cell Fate. Molecular Cell. 66 (6), 750-760 (2017).
  10. Kaestner, L., Scholz, A., Lipp, P. Conceptual and technical aspects of transfection and gene delivery. Bioorganic & medicinal chemistry letters. 25 (6), 1171-1176 (2015).
  11. Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).
  12. Kormann, M. S., et al. Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice. Nature Biotechnology. 29 (2), 154-157 (2011).
  13. Kariko, K., Buckstein, M., Ni, H., Weissman, D. Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors: the impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA. Immunity. 23 (2), 165-175 (2005).
  14. Hornung, V., et al. 5'-Triphosphate RNA is the ligand for RIG-I. Science. 314 (5801), 994-997 (2006).
  15. Pichlmair, A., et al. RIG-I-mediated antiviral responses to single-stranded RNA bearing 5'-phosphates. Science. 314 (5801), 997-1001 (2006).
  16. Herb, M., et al. Mitochondrial reactive oxygen species enable proinflammatory signaling through disulfide linkage of NEMO. Science Signaling. 12 (568), (2019).
  17. Schmidt-Supprian, M., et al. NEMO/IKK gamma-deficient mice model incontinentia pigmenti. Molecular Cell. 5 (6), 981-992 (2000).
  18. Mandal, P. K., Rossi, D. J. Reprogramming human fibroblasts to pluripotency using modified mRNA. Nature Protocols. 8 (3), 568-582 (2013).
  19. Oh, S., Kessler, J. A. Design, Assembly, Production, and Transfection of Synthetic Modified mRNA. Methods. 133, San Diego, CA. 29-43 (2018).

Tags

Иммунология и инфекция Выпуск 153 Первичные макрофаги перитонеальные макрофаги макрофаги костного мозга иммунные клетки транскрипция в пробирке мРНК трансфекция
Высокоэффективная трансфекция первичных макрофагов с помощью In Vitro транскрибированная мРНК
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Herb, M., Farid, A., Gluschko, A.,… More

Herb, M., Farid, A., Gluschko, A., Krönke, M., Schramm, M. Highly Efficient Transfection of Primary Macrophages with In Vitro Transcribed mRNA. J. Vis. Exp. (153), e60143, doi:10.3791/60143 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter