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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Transfection très efficace des macrophages primaires avec ARNm transcrit in vitro

Published: November 9, 2019 doi: 10.3791/60143
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2,3,4, 1
1Institute for Medical Microbiology, Immunology and Hygiene, Faculty of Medicine and University Hospital Cologne, University of Cologne, 2Center for Molecular Medicine Cologne, 3Cologne Cluster of Excellence on Cellular Stress Responses in Aging-associated Diseases (CECAD), 4German Center for Infection Research (DZIF)

Summary

Les macrophages, en particulier les macrophages primaires, sont difficiles à transfect car ils se spécialisent dans la détection de molécules de non-auto-origine. Nous décrivons un protocole qui permet une transfection très efficace des macrophages primaires avec l'ARNm généré à partir de modèles d'ADN tels que les plasmides.

Abstract

Les macrophages sont des cellules phagocytiques spécialisées dans la détection de molécules non auto-d'origine. À cette fin, ils sont équipés d'un large éventail de récepteurs de reconnaissance de motifs (PrR). Malheureusement, cela rend également les macrophages particulièrement difficiles à transfect que le réactif transfection et les acides nucléiques transfectés sont souvent reconnus par les PrR comme non-auto. Par conséquent, la transfection entraîne souvent l'activation et la dégradation des acides nucléiques transfectés ou même le suicide des macrophages. Ici, nous décrivons un protocole qui permet la transfection très efficace des macrophages primaires de murine tels que les macrophages péritonéaux (PM) et les macrophages marrow-dérivés de moelle (BMDM) avec ARNm in vitro transcrits des modèles d'ADN tels que des plasmides. Avec ce protocole simple, les taux de transfection d'environ 50-65% pour PM et environ 85% pour BMDM sont réalisés sans cytotoxicité ou immunogénicité observée. Nous décrivons en détail la génération de l'ARNm pour la transfection des constructions d'ADN telles que les plasmides et la procédure de transfection.

Introduction

Les macrophages sont des cellules phagocytiques qui se spécialisent dans la détection, l'ingestion et la dégradation des microbes, des cellules apoptotiques et des débris cellulaires. En outre, ils aident à orchestrer les réponses immunitaires en sécrétant des cytokines et des chemokines et en présentant des antigènes aux lymphocytes T et aux cellules B. Les macrophages jouent également un rôle important dans de nombreux autres processus, tels que la cicatrisation des plaies, l'athérosclérose, la tumorigénèse et l'obésité.

Pour être en mesure de détecter des molécules non autonomes telles que les modèles moléculaires associés aux agents pathogènes (PAMP) et les molécules hors de place telles que les modèles moléculaires associés aux dommages (DAMP), les macrophages sont équipés d'un large éventail de récepteurs de reconnaissance de modèles (PRR)1. Malheureusement, cela rend également les macrophages particulièrement difficiles à transfect2 que le réactif transfection3 et les acides nucléiques transfectés4,5,6,7sont souvent reconnus par les PrR comme non-auto. Pour cette raison, la transfection des macrophages utilisant des méthodes chimiques ou physiques8 entraîne généralement l'activation et la dégradation des macrophages des acides nucléiques transfectés ou même dans le suicide par macrophage par pyroptose, une forme de mort cellulaire lytique programmée déclenchée après la reconnaissance des PAMP/DAMP cytosoliques tels que l'ADN ou l'ARN étranger9. La transfection biologique des macrophages à l'aide de virus tels que les adénovirus ou les lentivirus comme vecteurs est souvent plus efficace, mais la construction de tels vecteurs viraux prend beaucoup de temps et nécessite un équipement de niveau 2 de biosécurité10,11.

Ainsi, bien que les macrophages soient l'objet de recherches intensives, l'analyse de leurs fonctions au niveau moléculaire est entravée parce que l'un des outils les plus importants de la biologie moléculaire, la transfection des constructions d'acide nucléique pour l'expression exogène de protéines, n'est guère applicable. Cela oblige souvent les chercheurs à utiliser des lignées cellulaires semblables à des macrophages plutôt que des macrophages de bonne foi. Les applications pour la transfection de construction d'acide nucléique incluent l'expression des versions mutées ou marquées de protéine, la surexpression d'une protéine spécifique, la réexpression de protéine dans un fond askouteux respectif et l'expression des protéines d'autres espèces (par exemple. , Cre recombinase ou guide RNA et Cas9 pour le gène ko ciblé).

Ici, nous décrivons un protocole qui permet la transfection très efficace des macrophages primaires (généralement difficiles à transfect), c'est-à-dire les macrophages péritonéaux de la murine (PM) et les macrophages dérivés de la moelle osseuse (BMDM) avec l'ARNM généré à partir de modèles d'ADN tels que les plasmides. Fait important, l'ARNm transcrit in vitro généré à l'aide de ce protocole contient les nucléosides modifiés naturels 5-méthyl-CTP et pseudo-UTP qui réduisent l'immunogénicité et améliorent la stabilité4,6,7,12,13. En outre, les 5'-extrémités de l'ARNm transcrit in vitro sont déphosphorylées par la phosphatase antarctique pour empêcher la reconnaissance par le complexe RIG-I14,15. Ceci minimise la reconnaissance immunitaire innée de l'ARNm transcrit in vitro. Grâce à notre protocole facile à réaliser, les taux de transfection se siant entre 50 et 65 % (macrophages péritonéaux (PM)) et 85 % (BMDM) sont atteints alors que, ce qui est important, il n'y a pas de cytotoxicité ou d'immunogénicité observée. Nous décrivons en détail (i) comment l'ARNm immunologiquement réduit au silence pour la transfection peut être généré à partir de constructions d'ADN telles que les plasmides et (ii) la procédure de transfection elle-même.

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Protocol

L'isolement des macrophages chez les souris a été effectué conformément à la loi allemande sur la protection des animaux, conformément au Comité d'éthique de l'Université de Cologne.

REMARQUE: Effectuez toutes les étapes en portant des gants. Effectuer toutes les étapes de transfection sous une hotte à débit laminaire pour éviter la contamination des cellules. Avant de travailler avec l'ARNm, nettoyez tous les instruments tels que les pipettes et chaque surface avec 70% d'éthanol et/ou un surfactant dégradant RNAse (Tableau des matériaux). Assurez-vous que tous les tubes de réaction sont exempts de RNAse et stériles. Utilisez uniquement de l'eau stérile et exempte de RNAase pour les dilutions. Utilisez exclusivement des pointes de pipette avec des filtres. Changez les conseils de pipette après chaque étape de pipetage.

1. Génération du modèle d'ADN

REMARQUE: Le modèle d'ADN pour la transcription in vitro d'ARNm utilisant ce protocole doit contenir une séquence promotrice de T7 pour permettre l'amarrage de la polymérase d'ARN. Si le plasmide contenant la séquence d'ADN de la protéine d'intérêt contient déjà une séquence promotrice T7 correctement orientée directement en amont de la séquence d'intérêt, la linéarisation du plasmide (voir l'étape 1.1.) doit être effectuée. Sinon, attachez un promoteur T7 à la séquence d'intérêt par réaction en chaîne de polymérase (PCR, voir étape 1.2.).

  1. La linéarisation des plasmides contenant des promoteurs T7
    1. Linéarisez les plasmides contenant déjà une séquence promotrice T7 correctement orientée par digestion avec une enzyme de restriction coupant en aval du codon d'arrêt de la séquence d'intérêt. Dans le cas contraire, la transcription ne se terminera pas correctement après la séquence d'intérêt.
      REMARQUE: Il est préférable d'utiliser des enzymes de restriction laissant des extrémités émoussées ou 5' surplombs.
    2. Confirmer la linéarisation complète du plasmide par l'électrophoresis de gel d'agarose de l'ADN plasmide non digéré contre digéré.
    3. Purifiez l'ADN plasmide linéaire avant d'être utilisé comme modèle d'ADN pour la transcription in vitro de l'ARNm à l'aide d'un kit de purification de l'ADN (Tableau des matériaux).
  2. Pièce jointe du promoteur T7 par PCR
    1. Utiliser une amorce avant contenant les composants suivants (dans l'ordre indiqué de 5' à 3') : environ 5 bp aléatoires en amont du promoteur (p. ex. GAAAT); la séquence promotrice T7 (TAATACGACTCACTATAG); deux G supplémentaires pour une efficacité de transcription accrue (GG); la partie spécifique à la séquence cible qui est homologue à la séquence plasmide entourant le codon de départ.
      REMARQUE: Il devrait être composé de: 3-6 bp en amont de la séquence KOZAK et codon de départ, la séquence KOZAK et codon de départ (généralement GCCACC ATG G), 12-18 bp en aval du codon de départ. Si la séquence d'intérêt ne contient pas déjà une séquence KOZAK ou un codon de démarrage, celles-ci peuvent être jointes à cette étape en les incluant simplement dans la séquence d'amorce.
    2. Calculez le tm de l'amorce avant seulement en tenant compte de la partie homologue de la séquence cible.
    3. Pour évaluer les diététistes/formation d'épingles à cheveux, utilisez toute la séquence d'amorce, qui peut facilement dépasser 50 pb.
    4. Utilisez une amorce inversée située quelque part en aval du codon d'arrêt.
      REMARQUE: Si la séquence d'intérêt ne contient pas déjà un codon d'arrêt, elle peut être jointe à cette étape en l'incluant simplement dans la séquence d'amorce.
    5. Utilisez les amorces avant et inverses pour effectuer un PCR à l'aide d'une polymérase haute fidélité avec relecture (Tableau des matériaux).
    6. Confirmer la génération d'un seul produit et de la taille d'amplicon par électrophorèse de gel d'agarose (par exemple, employer un gel d'agarose de 1% et le courant constant de 100 V).
    7. Purifiez le produit PCR avant d'être utilisé comme modèle d'ADN pour la transcription in vitro de l'ARNm à l'aide d'un kit de purification de l'ADN.

2. Génération d'ARNm

  1. Décongeler tous les composants du kit de transcription in vitro de l'ARNm (voir le Tableau des matériaux). Vortex pour 5 s et tourner vers le bas pour 2 s à 2.000 x g. Conserver sur la glace jusqu'à utilisation.
  2. Préparer le mélange de réaction pour la transcription in vitro de l'ARNm dans un tube microcentrifuge de 0,5 ml dans l'ordre suivant (volume total de 40 l) : 20 oL de mélange ARCA/NTP 10x (inclus dans le kit de transcription in vitro de l'ARNm); 0,25 ML de 5-méthyl-CTP (concentration finale (f.c.) est de 1,25 mM; 50 % du Total du CTP); 0,25 l de pseudo-UTP (f.c. est de 1,25 mM; 50 % de l'UTP total); X l de modèle d'ADN; 2 L de mélange de polymérase à ARN T7 (inclus dans le kit de transcription de l'ARNm in vitro); Y l de RNAse-free H2O.
    REMARQUE: X est un volume contenant au moins 1 g d'ADN. Par exemple, 1,6 L à partir d'une solution de stock de 625 ng/L. Y est le volume de rechange pour le volume total de 40 L.
  3. Vortex pour 5 s et tourner vers le bas pour 2 s à 2.000 x g. Incuber à 37 oC pendant 30 min à 400 tr/min sur un batteur thermique pour la transcription in vitro.
  4. Ensuite, ajoutez 2 L de DNase i directement dans le mélange de réaction pour le retrait de l'ADN du modèle. Vortex pour 5 s et tourner vers le bas pour 2 s à 2.000 x g.
  5. Incuber à 37 oC pendant 15 min à 400 tr/min sur un batteur thermique. Prendre un aliquot de 2 l pour le gel de contrôle (étape 3.3) et stocker à -80 oC.
  6. Pour les résidus poly(A), ajouter les composants suivants directement dans le mélange de réaction précédent (à un volume final de 50 L) : 5 L de 10x poly(A) tampon de réaction en polymérase et 5 L de polymérase poly (A) (tous deux inclus dans le kit de transcription de l'ARNm in vitro). Vortex pour 5 s et tourner vers le bas pour 2 s à 2.000 x g.
  7. Incuber le mélange à 37 oC pendant 30 min à 400 tr/min sur un thermomélangeur. Prendre un aliquot de 2 l pour le gel de contrôle (étape 3.3) et stocker à -80 oC.
  8. Pour la déphosphorylation des 5 extrémités de l'ARNm, ajouter les composants suivants directement dans le mélange de réaction précédent (à un volume final de 60 L) : 3 'L de H2O sans RNAse; 6 L de 10x tampon de réaction à la phosphatase antarctique; 3 L de phosphatase antarctique (15 unités pour un volume de réaction de 60 L). Vortex pour 5 s et tourner vers le bas pour 2 s à 2.000 x g.
  9. Incuber le mélange à 37 oC pendant 30 min à 400 tr/min sur un batteur thermique.
  10. Phosphatase antarctique inactive par incubation à 80 oC pendant 2 min.
    REMARQUE: Idéalement, utilisez un mélangeur thermique séparé, n'attendez pas que le premier mélangeur atteigne la température désirée.

3. Purification de l'ARNm

  1. Purifier l'ARNm transcrit in vitro à l'aide d'un kit de purification de l'ARN dédié (Tableau des matériaux).
    1. Ajouter X 'L de la solution d'élution au mélange de réaction de l'ARNm à partir de l'étape 2.10. Mélanger en inversant 5 fois. Ajouter 300 l de concentré de solution de liaison. Mélanger par pipetting douce 5 fois.
      REMARQUE: X est le volume de rechange à un volume total de 100 L. Par exemple, ajoutez une solution d'élution de 40 L au mélange de réaction de 60 l à ARNm.
    2. Ajouter 100 l'éthanol sans RNAase. Mélanger par pipetting douce 5 fois.
    3. Placez une colonne de filtre dans l'un des tubes de collecte fournis. Transférer le mélange de réaction de l'ARNm doucement sur le centre du filtre sans toucher le filtre. Centrifugeuse à 15 000 x g pendant 1 min à température ambiante (RT).
    4. Soulevez soigneusement la colonne de filtre et jetez le flux dans le tube de collecte. Placez la colonne de filtre dans le même tube de collecte.
    5. Ajouter 500 l de solution de lavage (n'oubliez pas d'ajouter 20 ml d'éthanol sans RNAase avant d'utiliser la solution de lavage pour la première fois).
    6. Centrifugeuse à 15 000 x g pendant 1 min à RT. Répétez les étapes 3.1.4-3.1.6 pour laver une fois de plus.
    7. Centrifugeuse à pleine vitesse (17 900 x g)pendant 1 min à RT pour enlever tout liquide résiduel de la colonne de filtre. Prenez soigneusement la colonne de filtre du tube de collecte. Placez la colonne de filtre dans un nouveau tube de collecte.
    8. Ajouter 50 ll de tampon d'élution sur le centre du filtre sans toucher le filtre. Incuber à 65 oC pendant 10 min sur un batteur thermique.
    9. Centrifugeuse à 15 000 x g pendant 1 min à RT. Retirez la colonne de filtre et jetez-la.
  2. Mesurer la concentration et la pureté de l'ARNm éluté, par exemple, en utilisant un spectrophotomètre de microvolume pour mesurer l'absorption à 260 et 280 nm.
    REMARQUE: Un rapport A260/A280 de 1,8-2.1 est indicatif de l'ARNm fortement purifié.
  3. Vérifier la présence d'un seul produit, la longueur correcte de la transcription et le résidu poly(A) en analysant les aliquots des étapes 2.5 et 2.7 par électrophorèse de gel d'agarose dans des conditions dénaturantes (par exemple, employer un gel d'agarose de 1,2% contenant 20 mM 3-(N-morpholino) acide propanesulfonic [MOPS], 5 mM d'acétate de sodium, 1 mM EDTA et 20 % de formaldéhyde et fonctionne en 20 mMo MOPS, 5 mM d'acétate de sodium, 1 mM EDTA et 0,74 % de formaldéhyde à 100 V courant constant).
  4. Conserver l'ARNm purifié dans le tube d'élution à -80 oC jusqu'à ce que la transfection. Si vous n'utilisez que de faibles quantités de l'ARNm pour la transfection, puis aliquot l'ARNm pour éviter les cycles répétés de gel-dégel.
    REMARQUE : l'ARNm peut être stocké à -80 oC pendant environ 1 an.

4. Préparation macrophage

  1. Euthanasiez les souris C57/BL6 (utiliser des souris du même sexe et de 6 à 24 semaines) par luxation cervicale.
    REMARQUE: Les mêmes souris peuvent être utilisées pour l'isolement des particules (étape 4.2) et de la génération de BMDM (étapes 4.3 et 4.4). Pour l'isolement de PM utiliser au moins deux souris. Si seulement BMDM doivent être générés une souris est généralement suffisant.
  2. L'enrichissement immunomagnétique des macrophages péritonéaux.
    1. Remplir une seringue de 10 ml d'une canule de 0,9 x 40 mm avec 8 ml de saline tamponnée de phosphate à froid (PBS) et 2 ml d'air. Rincer la cavité péritonéale avec du PBS. L'air formera une bulle qui minimise les fuites du PBS.
    2. Recueillir rapidement le lavage péritonéal avec la même seringue et le transférer dans un tube de centrifugation conique de 50 ml. Combinez les cellules péritonéales de plusieurs souris si nécessaire. Maintenir la suspension cellulaire sur la glace.
    3. Suspension de cellules centrifugeuses à 650 x g pendant 5 min à 4 oC. Jeter le supernatant et resuspendre la pastille cellulaire dans 5 ml de 0,2 % NaCl pour 30 s pour lyse les globules rouges.
    4. Ajouter 5 mL de 1,6 % de NaCl à un volume total de 10 ml pour reconstituer des conditions isotoniques. Centrifugeuse à 650 x g pendant 5 min à 4 oC.
    5. Jeter le supernatant et resuspendre le granule cellulaire dans 97,5 l de tampon de tri des cellules magnétiques (MCS) (2 mM d'acide éthylènediaminetetraacetic [EDTA], 5% d'albumine de sérum bovin [BSA] en PBS) par 1 lavage péritonéal (par exemple, si trois souris ont été rincées, resuspend en 292.5 L ).
    6. Ajouter 2,5 L de perles paramagnetiques conjuguées à un anticorps spécifique CD11b par 97,5 l de suspension cellulaire (p. ex., ajouter 7,5 l à 292,5 l).
    7. Incuber sur glace pendant 15 min à 150 tr/min sur un shaker orbital.
    8. Suspension de cellule centrifugeà 650 x g pendant 5 min à 4 oC, jetez le supernatant et suspendez la pastille cellulaire dans 1 ml de tampon MCS.
    9. Ajouter 4 mL de tampon MCS à un volume total de 5 ml et laver les cellules en pipetting doucement de haut en bas trois fois.
    10. Répétez les étapes 4.2.8 et 4.2.9 deux fois de plus pour un total de trois étapes de lavage.
    11. Pendant les étapes de lavage placer une colonne LS dans un séparateur de cellules magnétiques (voir Tableau des matériaux). Rincer la colonne avec 3 ml de tampon MCS.
      REMARQUE: Évitez les bulles car celles-ci peuvent obstruer la colonne.
    12. Resuspendre la pastille cellulaire dans 1 ml de tampon MCS. Ajouter 3 mL de tampon MCS à un volume total de 4 ml, mélanger en pipetting de haut en bas trois fois.
    13. Transférer les 4 ml de suspension cellulaire sur la colonne LS rincée.
      REMARQUE: Encore une fois, éviter les bulles car celles-ci peuvent obstruer la colonne.
    14. Attendez que le réservoir de la colonne soit complètement vide. N'ajoutez pas de liquide supplémentaire jusqu'à ce que la colonne cesse de couler.
    15. Ajouter 3 mL de tampon MCS sur la colonne. Ensuite, attendez que le réservoir de la colonne soit complètement vide. Répétez l'étape 4.2.15 deux fois de plus.
    16. Placer la colonne LS dans un tube de centrifugation conique de 15 ml. Appliquer 5 ml de tampon MCS sur la colonne. Attendez jusqu'à ce que 2 ml de liquide soit passé à travers la colonne, puis utilisez le piston pour pousser doucement la fraction restante dans le tube.
    17. Suspension de cellule centrifugeà 650 x g pendant 5 min à 4 oC et jetez le supernatant.
    18. Resuspendre la pastille cellulaire dans 1 ml de DMEM complétée par 10% de sérum fœtal de veau inactivé par la chaleur (FCS) (DMEM-FCS).
    19. Déterminez le nombre de cellules viables en comptant dans la solution bleu trypan dans une chambre de comptage Neubauer et les cellules de semencedans dMEM-FCS dans les plaques de culture.
      REMARQUE: Seed PM à une densité de 100 000 cellules/puits dans une plaque de microtimètre à fond plat. N'utilisez pas de plaques traitées à la culture tissulaire, car les particules ne peuvent pas être détachées de celles-ci. Utilisez plutôt des plaques non traitées.
  3. Génération de BMDM
    1. Enlever la peau et les muscles des pattes postérieures à l'aide d'une paire de ciseaux. Laver chaque jambe par une submersion courte à 70 % d'éthanol.
    2. Détachez les jambes et ouvrez les deux extrémités du fémur et du tibia en coupant avec des ciseaux.
    3. Remplissez une seringue de 5 ml remplie d'une canule de 0,6 mm x 30 mm avec 5 ml d'endotoxine très faible (VLE) RPMI 1640 et rincer la moelle osseuse des os ouverts dans un plat de culture.
    4. Combinez la moelle osseuse de plusieurs souris si nécessaire en répétant les étapes 4.3.1-4.3.3.3. Transférer la moelle osseuse dans un tube de centrifugation conique de 50 ml.
    5. Centrifuger la suspension de la moelle osseuse à 650 x g pendant 5 min à 4 oC et jeter le supernatant.
    6. Resuspendre la pastille cellulaire dans 5 ml de tampon de lyse des globules rouges (8,3 % NH4Cl, 0,1 M Tris) et couver pendant 5 min à RT pour lyser les globules rouges.
    7. Centrifuger la suspension cellulaire à 650 x g à 4 oC pendant 5 min et jeter le supernatant.
    8. Resuspendre la pastille cellulaire dans 1 ml de VLE RPMI 1640 moyen complété par 10% FCS, 1% pénicilline / streptomycine, 1% HEPES, 1% de pyruvate de sodium et 10 ng/mL recombinant macrophage macrophage facteur de stimulation de la colonie (M-CSF) (RPMI).
    9. Ajouter 4 ml deRPMI à un volume total de 5 ml.
    10. Préparer 5 plats Petri non traités de 92 mm x 16 mm avec des cames (voir le tableau des matériaux) par souris en pipetting 7 mL de RPMI- milieu dans chaque plat.
    11. Transférer le 1 ml de solution cellulaire aux 5 plats de culture préparés et couver à 37 oC et 5 % de CO2.
    12. Après 4 jours, nourrir les cellules en ajoutant 4 ml deRPMI. Après 6-7 jours, les cellules de moelle sont entièrement différenciées en BMDM.
  4. Récolte de BMDM
    1. Retirez complètement le support des plats de culture. Ajouter 5 ml d'EDTA chaud de 0,2 mM en PBS à chaque plat.
    2. Gratter délicatement toute la plaque avec un grattoir cellulaire pour détacher le BMDM. Mélanger les suspensions cellulaires dans un tube de centrifugation conique de 50 ml.
    3. Rincer à nouveau les 5 plats. Utilisez le même volume de 5 ml d'EDTA chaud de 0,2 mM en PBS pour les 5 plats. Combinez cette suspension cellulaire avec celle de l'étape précédente.
    4. Centrifuger la suspension cellulaire à 650 x g pendant 5 min à 4 oC et jeter le supernatant.
    5. Resuspendre la pastille cellulaire dans 1 ml de VLE RPMI 1640 moyen complété par 10% FCS, 1% HEPES, 1% de pyruvate de sodium et 10 ng/mL recombinant M-CSF, mais pas d'antibiotiques (RPMI.
    6. Déterminez le nombre de cellules viables en comptant dans la solution bleu trypan dans une chambre de comptage Neubauer et les cellules de semences dans RPMI- dans les plaques de culture.
      REMARQUE: Graine BMDM à une densité de 50.000 cellules/puits maximum dans une plaque de microtiter à fond plat. N'utilisez pas de plaques traitées par la culture tissulaire, car le BMDM peut difficilement être détaché de ceux-ci. Utilisez plutôt des plaques non traitées.

5. Transfection des macrophages avec ARNm

  1. Calculer le volume requis de tampon de transfection de l'ARNm.
    REMARQUE: Le volume de tampon de transfection d'ARNm requis dépend de la taille du puits : utiliser 200 l pour la transfection dans une plaque de 6 puits, 100 l dans une plaque de 12 puits et ainsi de suite. Toujours ajouter un peu de volume de rechange en raison de la perte de pipetting (mais pas trop, pour éviter la dilution indue de l'ARNm). Par exemple, utilisez 450 L au lieu de 4 x 100 l et 400 l pour transfect dans 4 puits d'une plaque de 12 puits.
  2. Calculer le volume requis de réactif de transfection de l'ARNm. Le réactif de transfection d'ARNm est ajouté à un rapport de 1:50. Par exemple, 9 L de réactif de transfection d'ARNm sont nécessaires pour un volume final de 450 L.
  3. Calculer la quantité totale d'ARNm requise. Au moins 100 ng pour 100 000 macrophages sont nécessaires pour une transfection efficace, 200 ng fonctionne encore mieux (par exemple, 800 ng ARNm pour transfect 400 000 macrophages).
    1. Multipliez la quantité calculée d'ARNm requise avec le nombre total de puits qui doivent être transfectés (p. ex., 4 puits avec 400 000 macrophages chacun : 4 x 800 ng - 3 200 ng ARNm est requis au total pour tous les puits). Par exemple, si votre stock d'ARNm est de 426,8 ng/L, 7,49 L sont nécessaires pour une transfection optimale de 4 puits avec 400 000 macrophages chacun.
  4. Ajoutez le volume calculé de tampon de transfection de l'ARNm (étape 5.1.) moins les volumes pour le réactif de transfection de l'ARNm (étape 5.2) et l'ARNm (étape 5.3) à un tube de réaction. Par exemple, 450 l - 9 l - 7,49 'L ' 433,51 'L.
  5. Décongeler le stock d'ARNm et le mélanger en retournant doucement du tube d'élution. Ajouter le volume calculé de l'ARNm (étape 5,3) au tube de réaction avec tampon de réaction de l'ARNm (dans l'exemple présenté ci-dessus : 7,49 L en 433,51 l).
  6. Vortex pour 5 s et tourner vers le bas pour 2 s à 2.000 x g.
  7. Vortex le réactif de transfection de l'ARNm pour 5 s et tourner vers le bas pour 2 s à 2 000 x g.
  8. Ajouter le volume calculé de réactif de transfection de l'ARNm (étape 5.2) au tube de réaction contenant le tampon de transfection de l'ARNm et l'ARNm (dans l'exemple présenté ci-dessus : 9 L de réactif de transfection de l'ARNm).
  9. Vortex le mélange de transfection pour 5 s et tourner vers le bas pour 2 s à 2.000 x g.
  10. Incuber pendant 15 min à RT.
  11. Pendant ce temps, remplacez le milieu de culture des macrophages par un milieu de culture frais et chaud (voir les étapes 4.2.18. et 4.4.5).
  12. Après l'étape d'incubation 5.10, ajouter le mélange de transfection aux puits contenant les macrophages dans un volume approprié à la taille du puits (voir l'étape 5.1). Ajouter le mélange de transfection dans le sens de la chute dans un cercle de l'extérieur au milieu du puits.
  13. Basculer doucement la plaque, d'abord en verticale, puis dans une direction horizontale pour assurer une distribution uniforme du mélange de transfection dans le puits. Ensuite, incuber à 37 oC et 5 % de CO2. La synthèse de la protéine codée par l'ARNm transfecté commencera peu de temps après la transfection. Pour de meilleurs résultats, incuber pendant au moins 6 h.
  14. Après l'incubation, analyser l'efficacité de la transfection par microscopie (immuno)fluorescence, cytométrie du débit ou immunoblot16, ou utiliser les macrophages transfectés pour l'expérience de choix.

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Representative Results

Nous avons utilisé avec succès ce protocole pour générer un codage de l'ARNm pour les variantes NEMO et IKKMD étiquetées FLAG pour la transfection des macrophages primaires16. Les plasmides codants pour FLAG-tagged wild-type (NEMOWT) et C54/347A mutant NEMO (NEMOC54/374A) (voir le tableau des matériaux) contiennent déjà un promoteur T7 dans la bonne orientation (Figure 1A). Ainsi, nous n'avons eu qu'à légaliser les plasmides pour générer des modèles d'ADN pour la transcription in vitro. À cette fin, 10 g d'ADN plasmide ont été digérés avec 5 Xbal ll, ce qui a entraîné une linéarisation du plasmide en raison d'une seule coupe de 3' du codon d'arrêt. La linéarisation complète de l'ADN plasmide a été vérifiée par électrophoresis de gel d'agarose (figure 1B).

Les plasmides codants pour flag-tagged wild-type (IKKWT) et S177/181E mutant IKKMD (IKKMDS177/181E) ne contiennent pas de promoteur T7. Par conséquent, nous avons joint un promoteur T7 par PCR pour générer les modèles d'ADN pour la transcription in vitro (Figure 2A). La génération d'un produit PCR spécifique, c'est-à-dire un seul produit de taille correcte, a été vérifiée par électrophoresis de gel d'agarose (figure 2B).

Après la transcription in vitro à l'aide des modèles d'ADN respectifs, nous avons vérifié la génération d'un seul produit d'ARNm de taille correcte et de résidus poly(A) par électrophorèse de gel d'agarose dans des conditions dénaturantes (figure 3).

Pour vérifier que l'ARNm généré à l'aide de ce protocole permet la transfection des macrophages primaires (voir la figure 4A,B pour les analyses cytométriques de flux de l'enrichissement immunomagnétique des particules et de l'état de différenciation de BMDM), nous avons généré l'encodage de l'ARNm pour l'eGFP (figure 5A-C) et analysé l'efficacité de la transfection par cytométrie de flux (Figure 6A). 100 000 PM ou 50 000 BMDM par puits d'une plaque de microtimètre non traitée ont été transfectés avec 50, 100 ou 200 ng d'ARNm eGFP pendant 6, 9 ou 24 h. Dans PM et BMDM, des niveaux élevés d'expression eGFP ont pu être détectés à 6 h après transfection. Le taux de transfection a augmenté avec la quantité d'ARNm transfecté et était le plus élevé pour 200 ng arnde (figure 6B,C). Pour les particules, le taux de transfection a atteint environ 50-65% à 6 à 9 h après transfection (figure 6B). À 24 h après transfection, le taux de transfection était sensiblement inférieur indiquant l'expression expirant d'eGFP. Ainsi, le PM ne devrait pas être transfecté du jour au lendemain. Pour le BMDM, le taux de transfection a atteint environ 80-85%(figure 6C). La baisse du taux de transfection après 24 h a été beaucoup moins prononcée dans BMDM. Ainsi, BMDM peut être transfecté du jour au lendemain. Dans les deux PM (Figure 6D,E) et BMDM (Figure 6F,G), le niveau d'expression de l'eGFP dans les cellules transfectées a augmenté d'une manière dépendante du temps et de la dose. Fait important, la procédure de transfection n'a pas induit la mort des cellules lytiques ou apoptotiques, car il n'y avait pas d'augmentation des macrophages positifs à l'iodure de propidium (PI) ou à l'annexine V-positive après la transfection (figure 7A,B).

L'efficacité de transfection des ARNm codant pour les variantes NEMO ou IKKMD étiquetées PAR FLAG a été analysée par microscopie immunofluorescence. 300 000 PM par puits d'une plaque de 12 puits ont été transfectés avec 300 ng d'ARNm respectif pour 6 h. Le taux de transfection était d'environ 60 % pour les ARM NEMO et d'environ 55 % pour les ARNM D'IKKMD(figure 8A,B). Ainsi, leurs taux de transfection étaient semblables à ceux de l'ARNm eGFP indiquant un taux de transfection général d'environ 55 % pour les particules.

Nous avons également utilisé ce protocole pour générer l'encodage de l'ARNm pour Cre recombinase. La transfection de 400 000 BMDM à partir de souris NEMOflox/flox 17 par puits d'une plaque de 12 puits avec 400 ng d'ARNm Cre recombinase a entraîné un appauvrissement presque complet de la protéine NEMO après 48 h (figure 9) indiquant une transfection très efficace du BMDM.

PM et BMDM n'ont sécrétisé aucune quantité détectable d'IL-1, d'IL-6 et de TNF après la transfection (figure 10A,B). En outre, les voies de signalisation NF-kB et MAPK n'ont pas été activées après la transfection16 indiquant que la procédure de transfection n'active pas la signalisation proinflammatoire. Nous n'avons pas non plus observé d'altérations fonctionnelles des macrophages transfectés par rapport aux macrophages non transfectés16.

Figure 1
Figure 1 : La linéarisation des plasmides encodants NEMO contenant déjà un promoteur T7 dans la bonne orientation. (A) Extrait de séquence de l'encodage plasmide pour L'OMT NEMO marqué par LE FLAG ou NEMOC54/347A. Un promoteur T7 dans l'orientation correcte et proche de la séquence KOZAK et codon de démarrage est déjà présent. La région promotrice T7, la séquence de codage (CDS) pour l'étiquette FLAG et NEMO, les codons de démarrage et d'arrêt et le site de restriction pour la linéarisation avec XbaI sont codés en couleur. (B) Gel agarose représentant 1 % montrant les plasmides avant et après la linéarisation avec Xbal; 1 L d'ADN plasmide linéaire non traité, linéaire ou purifié a été chargé par voie. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Attachement promoteur T7 aux plasmides de codage IKKMD par PCR. (A) Extrait de séquence de l'encodage plasmide pour FLAG-marqué IKKWT ou IKKS177/181E. Les plasmides ne contiennent pas de promoteur T7 approprié, qui est donc attaché par PCR. L'emplacement, l'orientation et la séquence de l'amorce avant (contenant la séquence promotrice T7 à ajouter) et l'amorce inverse sont indiqués par les flèches. La région promotrice T7, le CDS pour l'étiquette FLAG et IKKMD et les codons de démarrage et d'arrêt sont codés en couleur. (B) Représentant 1% gel agarose vérifier la génération d'un seul produit PCR de taille correcte à l'aide des amorces indiquées ci-dessus. 1 L du produit PCR purifié a été chargé par voie. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : synthèse de l'ARNm à partir de modèles d'ADN codant s'encoder par NEMO et IKKMD. (A) Représentant dénaturant 1,2 % de gel d'agarose contenant 0,7 % de formaldéhyde montrant l'ARNm purifié des constructions NEMO et IKK-constructions avant et après le résidu poly(A). 2 'L de NEMOWT, NEMOC54/347A, IKKMDWT et IKKMDS177/181E ARNm ont été chargés par voie. Une échelle de ssRNA de 32 L a été chargée pour la détermination de longueur d'ARN. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Analyses cytométriques de flux de l'enrichissement immunomagnétique des particules et de l'état de différenciation de la BMDM. (A) Le pourcentage de F4/80etde CD11bet de PM dans le lavage péritonéal avant et après l'enrichissement immunomagnétique a été analysé par cytométrie de flux. (B) L'expression de F4/80 et CD11b par BMDM après 6 jours de différenciation a été vérifiée par cytométrie de flux. 10 000 ou 5 000 cellules ont été comptées par échantillon, respectivement. Les données sont présentées comme étant la moyenne de 3 expériences indépendantes, chacune. P 'lt; 0.05, 'P 'lt; 0.01, 'P 'lt; 0.001 et 'P 'lt; 0.0001 par le t-test de l'étudiant. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5 : synthèse de l'ARNm avec la poly(A) de la queue d'eGFP. (A) Extrait de séquence de l'encodage plasmide pour eGFP. Le plasmide ne contient pas de promoteur T7 approprié, qui est donc attaché par PCR. L'emplacement, l'orientation et la séquence de l'amorce avant (contenant la séquence promotrice T7 à ajouter) et l'amorce inverse sont indiqués par les flèches. La région promotrice T7, le CDS pour l'eGFP et les codons de démarrage et d'arrêt sont codés en couleur. (B) Gel agarose représentant 1% montrant l'amplicon purifié après PCR utilisant les amorces indiquées ci-dessus. 1 L du produit PCR purifié a été chargé par voie. (C) Représentant dénaturant 1,2% gel d'agarose contenant 0,7% de formaldéhyde montrant l'ARNm purifié de l'eGFP avant et après le résidu poly(A). 2 L d'ARNm eGFP ont été chargés par voie. Une échelle de ssRNA de 32 L a été chargée pour la détermination de longueur d'ARN. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 6
Figure 6 : Transfection très efficace des macrophages péritonéaux et du BMDM avec l'ARNm eGFP. Les macrophages ont été incubés pendant 6, 9 ou 24 h avec 50, 100 ou 200 ng d'ARNm eGFP complexeàs à jetMESSENGER ou avec jetMESSENGER seul (mock) et ensuite analysés par cytométrie de flux. (A) Stratégie de gating utilisée pour définir les populations de macrophages viables, de macrophages viableset de macrophages (c.-à-d. morts). Des données représentatives pour la transfection avec 200 ng arnde pour 6 h sont montrées. (B,C) Les taux de transfection de (B) PM et (C) BMDM ont été déterminés en analysant le pourcentage de cellules eGFP-positives viables par cytométrie de flux (n - 5-7 et n - 4-5 expériences indépendantes, respectivement). (D-G) Les niveaux d'expression de l'eGFP ont été déterminés en analysant l'intensité moyenne de fluorescence (IMF) de la PM viable (D) et (F) BMDM et de la sous-population viable et eGFP-positive de (E) PM et (G) BMDM (n - 5-7 et n - 4-5 expériences indépendantes, respectivement). 10 000 cellules ont été comptées par échantillon. Les données sont présentées comme étant moyennes , SEM. n.s. - non significatives; P 'lt; 0.05, 'P 'lt; 0.01, 'P 'lt; 0.001 et 'P 'lt; 0.0001 par le t-test de l'étudiant. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 7
Figure 7 : La transfection n'induit pas la mort des cellules lytiques ou apoptotiques. La mort cellulaire induite par la transfection de (A) PM et (B) BMDM a été déterminée en analysant le pourcentage de cellules V-positives par PI et d'annexine (n ' 5-7 et n - 4-5 expériences indépendantes, respectivement). Le pourcentage de macrophages morts présents dans les échantillons non transfectés (un certain degré de mort cellulaire a été causé par le détachement physique des macrophages des puits malgré l'utilisation de plaques non traitées) a été soustrait de celui dans les échantillons transfectés respectifs pour ne tenir compte que de la mort cellulaire induite par la procédure de transfection. La stratégie de gating utilisée pour définir les populations de PI,l'annexeV et l'IPetl'annexe V- macrophages est montrée pour un ensemble de données représentatifs de PM transfectés avec 200 ng ARNm pour 6 h sont montrés. La staurosporine (50 M pour 1 h) a été utilisée comme contrôle positif. 10 000 cellules ont été comptées par échantillon. Les données sont affichées comme étant moyennes , SEM. n.d. - non détectables. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 8
Figure 8 : Taux de transfection à l'aide de l'encodage de l'ARNm pour les constructions NEMO et IKK. Les taux de transfection à l'aide de l'encodage de l'ARNm pour les constructions (A) NEMO et (B) les constructions IKK ont été quantifiés par microscopie immunofluorescence (n - 4 expériences indépendantes). Barre d'échelle de 4 m. Les données sont affichées comme moyennes : SEM. n.t. et non transfectées, n.s. - non significatives; P 'lt; 0.05, 'P 'lt; 0.01, 'P 'lt; 0.001 et 'P 'lt; 0.0001 par le t-test de l'étudiant. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 9
Figure 9 : La transfection de NEMOfl/fl BMDM avec l'encodage d'ARNm pour Cre recombinase entraîne une carence presque complète pour NEMO. BMDM de souris NEMOfl/fl ont été transfectées avec l'ARNm codant Cre recombinase pendant 48 h. L'insuffisance pour la protéine de NEMO à la suite du knock-out Cre-mediated a été évaluée par tache occidentale utilisant des anticorps spécifiques reconnaissant NEMO ou 'actin et quantifiée par la densitométrie (n - 5 expériences indépendantes). Les données sont affichées en moyenne : SEM. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 10
Figure 10 : La transfection n'induit pas de réponse proinflammatoire. (A) PM et (B) BMDM ont été transfectés avec l'encodage d'ARNm pour NEMOWT ou NEMOC54/347A. Comme contrôle positif, les macrophages ont été infectés par Listeria monocytogenes à la multiplicité de l'infection de 1 ou stimulés avec 5 G/mL LPS ou poly(I:C) pendant 5 h (PM) ou 24 h (BMDM). La sécrétion de l'IL-1, de l'IL-6 et du TNF dans le supernatant a été quantifiée par ELISA (n ' 3 expériences indépendantes). Les données sont présentées comme étant moyennes : SEM. n.t. - non transfected, n.d. - non détectable. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

Ici nous présentons un protocole pour la transfection très efficace des macrophages primaires habituellement difficiles-à-transfect avec l'ARNm transcrit in vitro. Fait important, la transfection des macrophages utilisant ce protocole n'induit pas la mort cellulaire ou n'active pas la signalisation proinflammatoire indiquant que ni le réactif transfection ni l'ARNm transfecté ne sont reconnus comme non-auto.

La qualité de l'ARNm est d'une importance capitale pour la transfection réussie des macrophages à l'aide de ce protocole. Par conséquent, il faut prendre grand soin que l'ARNm n'entre pas en contact avec les ARN (par exemple, par des tampons ou des flacons contaminés). En cas de doute, vérifiez la dégradation de l'ARNm (par exemple, par électrophoresis de gel d'agarose). Le taux de transfection et le niveau d'expression étaient déjà maximaux à 6 h après la transfection. Par conséquent, il est possible que la protéine d'intérêt soit exprimée à des niveaux suffisants pour l'analyse à des moments plus précoces après la transfection. Nous n'avons pas testé cela, cependant. De plus, le fait de transfecter de plus grandes quantités d'ARNm peut augmenter davantage le taux de transfection et/ou le niveau d'expression. Cependant, la transfectification de plus grandes quantités d'ARNm peut potentiellement également conduire à un certain degré d'immunogénicité ou même de cytotoxicité. L'absence totale de celui-ci est l'un des principaux avantages de ce protocole. Ainsi, si de plus grandes quantités d'ARNm doivent être transfectées, l'immunogénicité et la cytotoxicité doivent être soigneusement évaluées.

Niveau d'expression clairement corrélé avec la quantité d'ARNm transfecté. Pourtant, la réexpression de NEMO dans le BMDM NEMO-déficient a eu comme conséquence l'expression semblable de protéine de NEMO comme dans le type sauvage BMDM16 indiquant que la transfection d'ARNm utilisant ce protocole ne mène pas à l'surexpression substantielle de la protéine d'intérêt. Ainsi, ce protocole peut ne pas être adapté pour étudier les conséquences de la surexpression de la protéine d'intérêt. Nous considérons plutôt cela comme un avantage, cependant, que la surexpression d'une protéine modifie souvent son comportement.

La principale limitation de la transfection de l'ARNm, en général, est qu'elle n'entraîne que l'expression transitoire de la protéine d'intérêt (parce que l'ARNm généré et transfecté à l'aide de ce protocole sera soumis à un roulement normal). PM semblent exprimer la protéine d'intérêt pour une période plus courte de temps par rapport à BMDM. Ainsi, contrairement à BMDM, les particules ne devraient pas être transfectées du jour au lendemain. Combien de temps une protéine d'intérêt donnée sera exprimée variera (comme la stabilité de l'ARNm et celle de la protéine variera). Nous vous recommandons néanmoins d'effectuer l'expérience de choix le même jour que la transfection. Si l'expression de la protéine d'intérêt est nécessaire pendant de plus longues périodes de temps, les cellules peuvent probablement être transfectées plusieurs fois (par exemple, tous les jours comme décrit dans18).

Nous avons utilisé avec succès le protocole décrit ici pour transfect murine PM et BMDM et la souris fibroblastes embryonnaires (MEFs)16. En théorie, l'ARNm généré à l'aide de ce protocole peut être utilisé pour transfect n'importe quel type de cellule donnée de toute espèce de mammifères. Le réactif optimal de transfection d'ARNM et le contenu des nucléosides modifiés peuvent différer pour d'autres types de cellules, cependant.

Parmi les modifications futures prometteuses, mentionnons l'inclusion des 5'- et 3'-UTR. La plupart des plasmides préexistants ne contiennent que le CCDS de la protéine d'intérêt, mais pas les 5'- et 3'-UTRs. Leur inclusion (comme décrit dans19) peut encore améliorer la stabilité et l'expression de l'ARNm. En outre, l'attachement des étiquettes d'épitope à la protéine d'intérêt en incluant simplement la séquence de l'étiquette d'épitope dans l'amorce avant ou inverse (pour le marquage d'épitope N- et C-terminal, respectivement), devrait être possible.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 670).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5-methyl-CTP (100 mM) Jena Biosience NU-1138S stored at -20 °C
Antarctic phosphatase New England BioLabs M0289 stored at -20 °C
Antarctic phosphatase reaction buffer (10x) New England BioLabs B0289 stored at -20 °C
anti-NEMO/IKKγ antibody Invitrogen MA1-41046 stored at -20 °C
anti-β-actin antibody Sigma-Aldrich A2228 stored at -20 °C
Petri dishes 92,16 mm with cams Sarstedt 821,473 stored at RT
CD11b Microbeads mouse and human Miltenyi Biotec 130-049-601 stored at 4 °C
Cre recombinase + T7-Promotor forward primer Sigma-Aldrich 5′-GAAATTAATACGACTCACTATA
GGGGCAGCCGCCACCATGTCC
AATTTACTGACCGTAC-3´, stored at -20 °C
Cre recombinase + T7-Promotor reverse primer Sigma-Aldrich 5′-CTAATCGCCATCTTCCAGCAGG
C-3′, stored at -20 °C
DNA purification kit: QIAquick PCR purification Kit Qiagen 28104 stored at RT
eGFP + T7-Promotor forward primer Sigma-Aldrich 5´-GAAATTAATACGACTCACTATA
GGGATCCATCGCCACCATGGTG
AGCAAGG-3´, stored at -20 °C
eGFP + T7-Promotor reverse primer Sigma-Aldrich 5´-TGGTATGGCTGATTA
TGATCTAGAGTCG-3´, stored at -20 °C
Fast Digest buffer (10x) Thermo Scientific B64 stored at -20 °C
FastDigest XbaI Thermo Scientific FD0684 stored at -20 °C
High-fidelity polymerase with proofreading: Q5 High-Fidelity DNA-Polymerase New England Biolabs Inc M0491S stored at -20 °C
IKKβ + T7-Promotor forward primer Sigma-Aldrich 5′-GAAATTAATACGACTCACTATA
GGGTTGATCTACCATGGACTACA
AAGACG-3′, stored at -20 °C
IKKβ + T7-Promotor reverse primer Sigma-Aldrich 5′-GAGGAAGCGAGAGCT-CCATCTG-3′, stored at -20 °C
In vitro mRNA transcription kit: HiScribe T7 ARCA mRNA kit (with polyA tailing) New England BioLabs E2060 stored at -20 °C
LS Columns Miltenyi Biotec 130-042-401 stored at RT
MACS MultiStand Miltenyi Biotec 130-042-303 stored at RT
mRNA transfection buffer and reagent: jetMESSENGER Polyplus transfection 409-0001DE stored at 4 °C
Mutant IKKβ IKK-2S177/181E plasmid Addgene 11105 stored at -20 °C
Mutant NEMOC54/347A plasmid Addgene 27268 stored at -20 °C
pEGFP-N3 plasmid Addgene 62043 stored at -20 °C
poly(I:C) Calbiochem 528906 stored at -20 °C
pPGK-Cre plasmid F.T. Wunderlich, H. Wildner, K. Rajewsky, F. Edenhofer, New variants of inducible Cre recombinase: A novel mutant of Cre-PR fusion protein exhibits enhanced sensitivity and an expanded range of inducibility. Nucleic Acids Res. 29, 47e (2001). stored at -20 °C
pseudo-UTP (100 mM) Jena Biosience NU-1139S stored at -20 °C
QuadroMACS Separator Miltenyi Biotec 130-090-976 stored at RT
Rat-anti-mouse CD11b antibody, APC-conjugated BioLegend 101212 stored at 4 °C
Rat-anti-mouse F4/80 antibody, PE-conjugated eBioscience 12-4801-82 stored at 4 °C
Recombinant M-CSF Peprotech 315-02 stored at -20 °C
RNA purification kit: MEGAclear transcription clean-up kit ThermoFisher Scientific AM1908 stored at 4 °C
RNAse-degrading surfactant: RnaseZAP Sigma-Aldrich R2020 stored at RT
Ultrapure LPS from E.coli O111:B4 Invivogen stored at -20 °C
Wild type IKKβ plasmid Addgene 11103 stored at -20 °C
Wild type NEMO plasmid Addgene 27268 stored at -20 °C

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References

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Transfection très efficace des macrophages primaires avec ARNm transcrit in vitro
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