Summary
マクロファージ、特に一次マクロファージは、非自己起源の分子の検出に特化しているため、トランスフェクトに挑戦しています。プラスミドなどのDNAテンプレートから生成されたmRNAを用いた一次マクロファージの高効率トランスフェクションを可能にするプロトコルについて説明する。
Abstract
マクロファージは、非自己起源の分子の検出に特化した貪食細胞です。この用に、それらはパターン認識受容体(PRR)の大きな配列を備えている。残念ながら、これはまた、トランスフェクション試薬としてトランスフェクトに特に困難なマクロファージを作り、トランスフェクトされた核酸は、多くの場合、非自己としてPRRによって認識されます。したがって、トランスフェクションは、多くの場合、トランスファージの活性化とトランスフェクション核酸の分解、あるいはマクロファージの自殺をもたらす。ここでは、腹腹マクロファージ(PM)や骨髄由来マクロファージ(BMDM)などのマウス一次マクロファージの高効率トランスフェクションを可能にするプロトコルを、プラスミドなどのDNAテンプレートから転写したmRNAを用いて説明する。この単純なプロトコルを使用すると、PMのトランスフェクション率は約50〜65%、BMDMのトランスフェクション率は、細胞傷害性または免疫原性が観察されずに達成される。プラスミドなどのDNA構築物からのトランスフェクションのためのmRNAの生成とトランスフェクション手順について詳しく説明する。
Introduction
マクロファージは、微生物、アポトーシス細胞、細胞破片の検出、摂取、分解に特化した貪食細胞です。さらに、サイトカインやケモカインを分泌し、T細胞やB細胞に抗原を提示することで免疫応答を調整するのに役立ちます。マクロファージはまた、創傷治癒、アテローム性動脈硬化症、腫瘍形成および肥満のような他の多くのプロセスにおいて重要な役割を果たす。
病原体関連分子パターン(PAMP)や損傷関連分子パターン(DamP)などの場外分子などの非自己分子を検出できるように、マクロファージは、大きなパターン認識受容体(PRR)1を備えている。残念ながら、これはまた、トランスフェクション試薬3およびトランスフェクト核酸4、5、6、7としてトランスフェクト2に特に困難なマクロファージを作り、多くの場合、PrRによって非自己として認識される。このため、化学的または物理的方法8を用いたマクロファージのトランスフェクションは、通常、トランスフェクトされた核酸のマクロファージ活性化および分解、あるいはピロ球症を介したマクロファージ自殺においても、DNAまたは外来RNA9などのサイトソリックPamPs/Dammpの認識後に引き起こされるプログラムされた溶解細胞死の形態をもたらす。アデノウイルスやレンチウイルスなどのウイルスをベクターとして用いたマクロファージの生物学的トランスフェクションは、より効率的であることが多いが、そのようなウイルスベクターの構築には時間がかかり、バイオセーフティレベル2装置10、11を必要とする。
したがって、マクロファージは集中的な研究の対象であるが、分子生物学の最も重要なツールの一つである、発出性発現のための核酸構築物のトランスフェクションにより、分子レベルにおけるその機能の解析が妨げられる。タンパク質は、ほとんど適用できない。これはしばしば、研究者がボナ・フィデス・マクロファージではなくマクロファージ様細胞株を使用することを強制する。核酸構築トランスフェクションのアプリケーションには、変異またはタグ付けされたタンパク質バージョンの発現、特定のタンパク質の過剰発現、それぞれのノックアウトバックグラウンドでのタンパク質再発現および他の種からのタンパク質の発現(例えば.、クレリコンゲナーゼまたはガイドRNAおよびCas9を標的遺伝子ノックアウト用)。
ここでは、プラスミドなどのDNAテンプレートから生成されたmRNAを用いたマウス腹蓋マクロファージ(PM)および骨髄由来マクロファージ(BMDM)である一次マクロファージの非常に効率的なトランスフェクションを可能にするプロトコルについて説明する。重要なことに、このプロトコルを用いて生成されたインビトロ転写mRNAには、免疫原性を低下させ、安定性を高める天然の修飾ヌクレオシド5-メチル-CTPおよび擬似UTPが含まれており、安定性を高める4、6、7、12、13である。また、インビトロ転写mRNAの5'末端は、RIG-I複合体14、15による認識を防止するために南極ホスファターゼによって脱リン酸化される。これは、インビトロ転写mRNAの自然免疫認識を最小限に抑える。プロトコルを実行しやすいので、トランスフェクション率は50~65%(腹蓋マクロファージ(PM))~85%(BMDM)に達し、重要なことに、細胞傷害性や免疫原性は認められません。(i)トランスフェクション用の免疫学的に沈黙したmRNAが、プラスミドや(ii)トランスフェクション手順そのものなどのDNA構築物からどのように生成できるかを詳しく説明する。
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Protocol
マウスからのマクロファージ分離は、ケルン大学の倫理委員会に準拠してドイツ動物保護法に従って行われた。
注:手袋を着用してすべてのステップを実行します。細胞の汚染を防ぐために、層流フードの下ですべてのトランスフェクションステップを実行します。mRNAを使用する前に、ピペットやすべての表面などのすべての機器を70%エタノールおよび/またはRNAse分解界面活性剤(材料のテーブル)で洗浄します。すべての反応管がRNAseフリーで無菌であることを確認してください。希釈には無菌のRNAase-free水のみを使用してください。フィルターでピペットの先端を排他的に使用します。すべてのピペットステップの後にピペットの先端を変更します。
1. DNAテンプレートの生成
注:このプロトコルを用いたin vitro mRNA転写のためのDNAテンプレートには、RNAポリメラーゼのドッキングを可能にするT7プロモーター配列が含まれている必要があります。目的のタンパク質のDNA配列を含むプラスミドに、目的の配列の直流上方に正しい配向T7プロモーター配列が既に含まれている場合、プラスミドの線形化(ステップ1.1を参照)を行う必要がある。それ以外の場合は、ポリメラーゼ連鎖反応によって目的の配列にT7プロモーターを取り付ける(PCR、ステップ1.2を参照)。
-
T7プロモーター含有プラスミドの線形化
- 目的とする配列のストップコドンの下流に切断する制限酵素による消化によって正しく配向されたT7プロモーター配列を既に含むプラスミドを線形化する。そうしないと、一連の目的の後に転写が正しく終了しません。
注:鈍い端または5'オーバーハングを残して制限酵素を使用することをお勧めします。 - 未消化プラスミドDNAと消化したプラスミドDNAのアガロースゲル電気泳動によるプラスミドの完全な線形化を確認する。
- DNA精製キット(材料表)を用いてインビトロmRNA転写用DNAテンプレートとして使用する前に、線形化プラスミドDNAを精製する。
- 目的とする配列のストップコドンの下流に切断する制限酵素による消化によって正しく配向されたT7プロモーター配列を既に含むプラスミドを線形化する。そうしないと、一連の目的の後に転写が正しく終了しません。
-
PCRによるT7プロモーターの取り付け
- 次のコンポーネントを含むフォワードプライマーを使用します(5'から3'までの指示の順序で):プロモーターの上流約5ランダムbp(例えば、GAAAT)。T7プロモーターシーケンス(TAATACGACTACTATAG);転写効率を高めるために2つの余分なGs(GG);。開始コドンを取り囲むプラスミド配列に相同である標的配列特異的部分。
注:これは、KOZAK配列の上流に3〜6bp、コドンを開始し、コザック配列と開始コドン(通常GCCACC ATG G)、開始コドンの下流12〜18bpで構成されるべきである。目的のシーケンスに KOZAK配列または開始コドンがまだ含まれていない場合は、プライマー配列に含めるだけでこのステップでアタッチできます。 - ターゲットシーケンスに相同な部分を考慮して、前方プライマーのtmを計算します。
- ダイマー/ヘアピン形成を評価するために、簡単に50 bpを超えることができる全体のプライマー配列を使用します。
- ストップコドンの下流にある逆プライマーを使用します。
注:目的のシーケンスにストップコドンがまだ含まれていない場合は、プライマーシーケンスに含めるだけでこのステップでアタッチできます。 - フォワードプライマーとリバースプライマーを使用して、校正付きの忠実度の高いポリメラーゼを使用して PCR を実行します (材料の表)。
- アガロースゲル電気泳動による単一の生成およびアンプリコンサイズの生成を確認する(例えば、1%アガロースゲルおよび100V定電流を使用)。
- DNA精製キットを使用して、インビトロmRNA転写のDNAテンプレートとして使用する前にPCR製品を精製します。
- 次のコンポーネントを含むフォワードプライマーを使用します(5'から3'までの指示の順序で):プロモーターの上流約5ランダムbp(例えば、GAAAT)。T7プロモーターシーケンス(TAATACGACTACTATAG);転写効率を高めるために2つの余分なGs(GG);。開始コドンを取り囲むプラスミド配列に相同である標的配列特異的部分。
2. mRNA生成
- in vitro mRNA転写キットのすべてのコンポーネントを解凍します(材料表を参照)。5 s のボルテックスと 2,000 x gで 2 s のスピンダウン .使用するまで氷の上に置いておきなさい。
- 0.5 mLマイクロ遠心管中のインビトロmRNA転写のための反応ミックスを次の順序で調製する(総体積40°L):10x ARCA/NTPミックスの20°L(インビトロmRNA転写キットに含まれる)。5-メチル-CTPの0.25 μL(最終濃度(f.c.)は1.25 mM;全CTPの50%)。擬似UTPの0.25°L(f.c.は1.25 mM、全UTPの50%)。DNAテンプレートのX μL;T7 RNAポリメラーゼミックスの2 μL(インビトロmRNA転写キットに含まれています)RNAseフリーH2OのY μL。
注:Xは、少なくとも1μgのDNAを含む体積である。たとえば、625 ng/μL の原液から 1.6 μL です。Yは40μLの総容積に対する予備容積である。 - 5 s のボルテックスと 2,000 x gで 2 s のスピンダウン .インビトロ転写のためのサーマルミキサーで400 rpmで37°Cで30分間インキュベートする。
- 次いで、テンプレートDNAを除去するための反応ミックスにDNase Iの2μLを直接添加する。5 s のボルテックスと 2,000 x gで 2 s のスピンダウン .
- サーマルミキサーで400rpmで37°Cで15分間インキュベートします。コントロールゲル用に2μLのアリコートを取り、-80°Cで保存します。
- poly(A) テーリングの場合は、前の反応ミックスに直接以下の成分を加えます(最終体積50°L):10xポリ(A)ポリメラーゼ反応バッファーの5μLとポリ(A)ポリメラーゼの5μL(いずれもインビトロmRNA転写キットに含まれています)。5 s のボルテックスと 2,000 x gで 2 s のスピンダウン .
- サーモミキサーで400rpmで30分間37°Cでミックスをインキュベートします。コントロールゲル用に2μLのアリコートを取り、-80°Cで保存します。
- mRNAの5°末端の脱リン酸化のために、前の反応ミックスに直接以下の成分を加える(60μLの最終容積に):3 μLのRNA無酸化H2O;10x南極ホスファターゼ反応バッファーの6 μL;南極ホスファターゼの3μL(60μL反応体積で15単位)。5 s のボルテックスと 2,000 x gで 2 s のスピンダウン .
- サーマルミキサーで400rpmで30分間37°Cでミックスをインキュベートします。
- 80°Cで2分間インキュベートすることにより、熱不活性化南極ホスファターゼ。
注:理想的には、別のサーマルミキサーを使用して、最初のミキサーが所望の温度に達するまで待たないでください。
3. mRNA精製
- 専用RNA精製キット(材料表)を用いてインビトロ転写mRNAを精製する。
- ステップ2.10のmRNA反応ミックスにXμLの溶出液を加える。5回反転して混ぜます。濃縮する結合液を300μL加えます。穏やかなピペット5回で混ぜます。
注:Xは、100μLの総容積に対する予備容積である。例えば、60μL mRNA反応ミックスに40μL溶出液を加えます。 - RNAaseフリーエタノールを100μL添加します。穏やかなピペット5回で混ぜます。
- 付属のコレクションチューブの1つにフィルタ列を配置します。フィルターに触れることなく、mRNA反応ミックスをフィルターの中心に穏やかに移します。室温(RT)で1分間15,000 x gで遠心分離機。
- 慎重にフィルター列を持ち上げ、回収管内の流れを破棄します。フィルター列を同じコレクション チューブに戻します。
- 500 μL の洗浄液を追加します (初めて洗浄液を使用する前に、20 mL の RNAase フリーエタノールを追加することを忘れないでください)。
- RTで1分間15,000 x gで遠心分離機を行い、手順3.1.4~3.1.6をもう一度洗います。
- RTで1分間全速力(17,900 x g)で遠心分離し、フィルタカラムから残留流体を除去します。慎重に収集チューブからフィルタ列を取ります。フィルター列を新しいコレクション チューブに配置します。
- フィルターに触れることなく、50 μLの溶出バッファをフィルターの中心に追加します。サーマルミキサーで65°Cで10分間インキュベートします。
- RT で 1 分間 15,000 x g で遠心分離します。
- ステップ2.10のmRNA反応ミックスにXμLの溶出液を加える。5回反転して混ぜます。濃縮する結合液を300μL加えます。穏やかなピペット5回で混ぜます。
- 溶出したmRNAの濃度および純度を測定し、例えば、マイクロボリューム分光光度計を用いて260および280nmでの吸光度を測定する。
注:1.8-2.1のA260/A280比は高度に精製されたmRNAを示す。 - 変性条件下でアガロースゲル電気泳動によってステップ2.5および2.7のアリコートを分析することにより、単一の製品、正しい転写長およびポリ(A)テーリングの存在を確認する(例えば、20 mM 3-(N-モルホリノ)を含む1.2%アガロースゲルを使用する)プロパンスルホン酸[MOPS]、5mM酢酸ナトリウム、1 mM EDTAおよび20%ホルムアルデヒドと20 mM MOPS、5 mM酢酸ナトリウム、1 mM EDTAおよび0.74%ホルムアルデヒドを100V定電流で実行する。
- 精製したmRNAを溶出するまで-80°Cの溶出管に保管します。トランスフェクションのために少量のmRNAのみを使用する場合は、繰り返し凍結融解サイクルを避けるためにmRNAをアリコートします。
注:mRNAは約1年間-80°Cで保存できます。
4. マクロファージ準備
- 子宮頸部脱臼によるC57/BL6マウス(同性および6〜24週齢のマウスを使用する)を安楽死させる。
注:同じマウスをPM(ステップ4.2)およびBMDMの生成(ステップ4.3および4.4)の単離に使用することができる。PMの単離のために、少なくとも2匹のマウスを使用する。BMDMのみを生成する場合は、通常、1つのマウスで十分です。 - 腹腹マクロファージの免疫磁気濃縮
- 10 mL の注射器に 0.9 x 40 mm のカニューレを 8 mL の氷冷リン酸緩衝生理食塩線 (PBS) と 2 mL の空気で満たします。腹腔をPBSで洗い流します。空気はPBSの漏れを最小にする気泡を形成する。
- すぐに同じ注射器で腹膜洗浄を収集し、50 mL円錐形遠心分離管に移します。必要に応じて、複数のマウスの腹腹細胞を組み合わせます。細胞懸濁液を氷の上に置いてください。
- 遠心分離機細胞懸濁液650xgで4°Cで5分間。 上清を捨て、赤血球をリゼする30sのために0.2%NaClの5 mLで細胞ペレットを再サスペンドする。
- 10 mLの合計体積に1.6%NaClの5 mLを加え、等張条件を再構成します。4 °Cで5分間650 x gで遠心分離機。
- 上清を廃棄し、磁気細胞選別(MCS)緩衝液(2mMエチレンジアミンテトラ酢酸[EDTA]、PBSの5%ウシ血清アルブミン[BSA])あたり1腹膜洗浄機(例えば、3匹のマウスを洗い流した場合、292.5μLで再サスペンド)).
- 結合した2.5μLの常磁性ビーズを、97.5μLの細胞懸濁液あたりCD11b特異的抗体に加えます(例えば、292.5μLに7.5μLを加える)。
- 軌道シェーカーで150rpmで氷上で15分間インキュベートします。
- 遠心分離細胞懸濁液を650xgで4°Cで5分間、上清を廃棄し、MCS緩衝液の1mLで細胞ペレットを再懸濁する。
- 4 mLのMCSバッファーを5mLの総容積に加え、3回軽くピペットをして細胞を洗浄します。
- 手順 4.2.8 と 4.2.9 をさらに 2 回繰り返し、合計 3 回の洗浄手順を実行します。
- 洗浄手順では、LSカラムを磁気セルセパレータに配置します(材料表を参照)。3 mL の MCS バッファでカラムをすすいでください。
注:これらは、列を詰まらせる可能性があるため、気泡を避けてください。 - 細胞ペレットをMCS緩衝液の1mLで再サスペンドします。3 mLのMCSバッファを合計4mLに加え、上下に3回ピペットで混ぜます。
- 4 mL の細胞懸濁液をすすいだ LS カラムに移す。
注:繰り返しますが、これらは列を詰まらせる可能性があるため、気泡は避けてください。 - 柱の貯水池が完全に空になるまで待ちます。柱が垂れ落ちなくなるまで、流体を追加しないでください。
- 3 mL の MCS バッファをカラムに追加します。次に、柱の貯水池が完全に空になるまで待ちます。手順 4.2.15 をさらに 2 回繰り返します。
- LSカラムを15 mL円錐円遠心分離管に入れます。5 mL の MCS バッファをカラムに適用します。2 mL の流体がカラムを通過するまで待ってから、プランジャーを使用して残りの分数をチューブにゆっくりと押し込みます。
- 遠心分離細胞懸濁液を650xgで4°Cで5分間、上清を廃棄した。
- 10%熱不活性化胎児子牛血清(FCS)(DMEM+FCS)を補充したDMEMの1mLで細胞ペレットを再サスペンドします。
- ノイバウアー計数チャンバー内のトリパンブルー溶液でカウントし、DMEM+FCSの種子細胞を培養プレートにカウントして、生存細胞の数を決定します。
注:平らな底のマイクロチター板の100,000細胞/井戸の密度でPMを種子。PMはこれらから剥離できないため、組織培養処理プレートを使用しないでください。代わりに、非処理プレートを使用してください。
- BMDMの生成
- はさみを使って後ろ足から皮膚と筋肉を取り除きます。70%エタノールで短い水没で各脚を洗浄します。
- 脚を取り外し、大腿骨と脛骨の両端をはさみで切断して開きます。
- 0.6 mm x 30 mm カニューレを 5 mL の非常に低い内毒素 (VLE) RPMI 1640 で満たし、開いた骨から骨髄を培養皿に洗い流します。
- 必要に応じて複数のマウスの骨髄を組み合わせ、手順4.3.1~4.3.3を繰り返します。骨髄を50mL円錐円遠心分離管に移します。
- 骨髄懸濁液を650×gで4°Cで5分間遠心分離し、上清を廃棄する。
- 赤血球リゼスバッファー(8.3%NH4Cl,0.1 Mトリス)の5mLで細胞ペレットを再サーデし、赤血球をリサートするためにRTで5分間インキュベートする。
- 細胞懸濁液を4°Cで650xgで5分間遠心分離し、上清を廃棄する。
- 10%FCS、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、1%HEPES、1%ピルビン酸ナトリウム、10 ng/mL組換えマクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)(RPMI+++)を添加したVLE RPMI 1640培地の1mLで細胞ペレットを再スマースします。
- 合計 5 mL の合計ボリュームに 4 mL の RPMI+++++を追加します。
- 7 mL の RPMI+++++媒体を各皿にパイプで取り込むことで、マウスあたり 5 個の 92 mm x 16 mm 未処理のペトリ料理をカムで準備します (材料の表を参照)。
- 1 mLの細胞溶液を5つの調製培養皿に移し、37°Cおよび5%CO2でインキュベートする。
- 4 日後、4 mL の RPMI+++++を追加してセルにフィードします。6〜7日後、骨髄細胞はBMDMに完全に分化する。
- BMDMの収穫
- 培養料理から培地を完全に取り除きます。各皿にPBSで暖かい0.2 mM EDTAの5 mLを追加します。
- セルスクレーパーでプレート全体をゆっくりと削り取り、BMDMを取り外します。50 mL円錐円錐円間膜チューブに細胞懸濁液を組み合わせます。
- 5つの皿をもう一度洗い流します。すべての5つの料理のためのPBSで暖かい0.2 mM EDTAの5 mLの同じ容積を使用してください。このセル懸濁液を前のステップのものと組み合わせます。
- 細胞懸濁液を650xgで4°Cで5分間遠心分離し、上清を廃棄する。
- 10%FCS、1%HEPES、1%ピルビン酸ナトリウム、10ng/mL組換えM-CSFを添加したVLE RPMI 1640培地の1mLで細胞ペレットを再散用するが、抗生物質は含まない(RPMI++++)。
- 生細胞の数を決定するには、ノイバウアー計数チャンバー内のトリパンブルー溶液でカウントし、RPMI++++の種子細胞を培養プレートに入れます。
注:平らな底のマイクロチター版の50,000細胞/ウェル最大の密度の種子BMDM。BMDMはこれらから剥離しにくいので、組織培養処理プレートを使用しないでください。代わりに、非処理プレートを使用してください。
5. mRNAによるマクロファージのトランスフェクション
- mRNAトランスフェクションバッファの必要量を計算します。
注:必要なmRNAトランスフェクションバッファの体積は、ウェルサイズに依存します:6ウェルプレートのトランスフェクションには200μL、12ウェルプレートには100°Lを使用します。ピペット損失のために常に少し予備ボリュームを追加します(しかし、mRNAの過度の希釈を防ぐために、あまりにも多くはありません)。たとえば、4 x 100 μL = 400 μL の代わりに 450 μL を使用して、12 ウェル プレートの 4 ウェルにトランスフェクトします。 - mRNAトランスフェクション試薬の必要量を計算します。mRNAトランスフェクション試薬は1:50の割合で添加される。例えば、450μLの最終容積には9μLのmRNAトランスフェクション試薬が必要です。
- 必要な mRNA の合計量を計算します。効率的なトランスフェクションには100,000個あたり少なくとも100ngが必要であり、200ngはさらに良く動作します(例えば、トランスフェクト400,000マクロファージに800ng mRNA)。
- トランスフェクトする必要があるウェルの総数を必要とするmRNAの計算量を乗算します(例えば、400,000マクロファージを持つ4つのウェル:4 x 800 ng = 3,200 ng mRNAがすべてのウェルに対して合計で必要です)。例えば、mRNAストックが426.8 ng/μLの場合、400,000個のマクロファージを持つ4つのウェルの最適なトランスフェクションには7.49 μLが必要です。
- mRNAトランスフェクションバッファーの計算体積(ステップ5.1.)からmRNAトランスフェクション試薬(ステップ5.2)とmRNA(ステップ5.3)の体積を差し引いた値を反応管に加えます。たとえば、450 μL - 9 μL - 7.49 μL = 433.51 μL です。
- mRNAストックを解凍し、溶出チューブの穏やかな反転によってそれを混合します。mRNAの計算体積(ステップ5.3)をmRNA反応バッファーで反応管に加えます(上記の例では、433.51 μLで7.49°L)。
- 5 s のボルテックスと 2,000 x gで 2 s のスピンダウン .
- 5s用のmRNAトランスフェクション試薬をボルテックスし、2,000 x gで2s回転させる。
- mRNAトランスフェクション試薬(ステップ5.2)の計算体積を、mRNAトランスフェクションバッファーとmRNAを含む反応管に添加する(上記の例では:mRNAトランスフェクション試薬の9μL)。
- トランスフェクションミックスを5sでボルテックスし、2,000 x gで2sスピンダウンします。
- RTで15分間インキュベートします。
- 一方、マクロファージの培養培地を新鮮で温かい培養培地に置き換えます(ステップ4.2.18.および4.4.5を参照)。
- インキュベーションステップ5.10の後、マクロファージを含むウェルにトランスフェクションミックスを井戸の大きさに適したボリュームに添加する(ステップ5.1参照)。トランスフェクションミックスを外側から井戸の真ん中に円形にドロップワイズで加えます。
- プレートを穏やかに揺らし、まず垂直方向に、次に水平方向に、ウェル内のトランスフェクションミックスの均一な分布を確保します。次いで、37°Cでインキュベートし、5%CO2.トランスフェクトされたmRNAによってコードされるタンパク質の合成は、トランスフェクションの直後に開始されます。最良の結果を得るには、少なくとも6時間インキュベートする。
- インキュベーション後、(免疫)蛍光顕微鏡によるトランスフェクション効率を分析し、フローサイトメトリーまたは免疫ブロット16、またはトランスフェクトされたマクロファージを選択した実験に使用する。
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Representative Results
このプロトコルを使用して、FLAG タグ付き NEMO および IKKβ バリアントの mRNA エンコーディングを生成し、一次マクロファージ16をトランスフェクションしました。FLAG タグ付きワイルドタイプ (NEMOWT)および C54/347A 変異型 NEMO (NEMOC54/374A)のプラスミドエンコーディング (材料表を参照) には、正しい向きの T7 プロモータが既に含まれています (図 1A)。したがって、インビトロ転写のためのDNAテンプレートを生成するためにプラスミドを線形化するだけでした。この端に、プラスミドDNAの10μgを5μL Xbalで消化し、ストップコドンの単一カット3'によるプラスミドの線形化をもたらした。プラスミドDNAの完全な線形化をアガロースゲル電気泳動により検証した(図1B)。
FLAG タグ付き野生型 (IKKβWT)および S177/181E 変異型 IKKβ (IKKβS177/181E)のプラスミドコードには、T7 プロモータが含まれていません。そこで、PCRによるT7プロモーターを取り付け、インビトロ転写用のDNAテンプレートを生成しました(図2A)。特定のPCR産物の生成、すなわち、正しいサイズの単一の生成物を、アガロースゲル電気泳動により検証した(図2B)。
それぞれのDNAテンプレートを用いたインビトロ転写後、変性条件下でのアガロースゲル電気泳動による正しいサイズおよびポリ(A)テーリングの単一mRNA産物の生成を検証した(図3)。
このプロトコルを使用して生成されたmRNAが一次マクロファージのトランスフェクションを可能にすることを確認するために(図4A,Bを参照してPMの免疫磁性濃縮のフローサイトメトリック分析とBMDMの分化状態)、eGFPのmRNA符号化を生成し(図5A-C)、フローサイトメトリー(図6A)によるトランスフェクション効率を解析しました。未処理のマイクロタイタープレートのウェル当たり100,000 PMまたは50,000 BMDMを、6、9または24時間のeGFP mRNAの50、100または200ngでトランスフェクトした。PMとBMDMの両方で、トランスフェクション後6時間で高レベルのeGFP発現を検出することができました。トランスフェクション率はトランスフェクトmRNAの量とともに増加し、200ng mRNAで最も高かった(図6B,C)。PMの場合、トランスフェクション率はトランスフェクション後6〜9時間で約50〜65%に達した(図6B)。トランスフェクション後24時間で、トランスフェクション率はeGFP発現の満了を示す実質的に低かった。したがって、PMは一晩でトランスフェクトされるべきではありません。BMDMの場合、トランスフェクション率は約80~85%に達した(図6C)。24時間後のトランスフェクション率の低下は、BMDMでははるかに顕著ではなかった。したがって、BMDMは一晩でトランスフェクトすることができる。PM(図6D,E)とBMDM(図6F,G)の両方において、トランスフェクトされた細胞におけるeGFPの発現レベルは、時間および用量依存的に増加した。重要なことに、トランスフェクション手順は、トランスフェクション後のヨウ化プロピジウム陽性(PI)またはアネキシンV陽性マクロファージの増加がなかったため、溶解またはアポトーシス細胞死を誘発しなかった(図7A,B)。
FLAGタグ付きNEMOまたはIKKβ変異体に対するmRNAコードのトランスフェクション効率を免疫蛍光顕微鏡で分析した。12ウェルプレートのウェル当たり300,000 PMを6時間の各mRNAの300ngでトランスフェクションしたところ、NEMO mRNAでは約60%、IKKβ mRNAでは約55%であった(図8A,B)。従って、これらのトランスフェクション率は、PMに対する一般的なトランスフェクション率が約55%であることを示すeGFP mRNAのトランスフェクション率と同様であった。
また、このプロトコルを使用して、クレコンビナーゼの mRNA エンコーディングを生成しました。NEMOフロックス/フロックスマウスから400,000 BMDMのトランスフェクションは、クレコンビナーゼmRNAの400ngを有する12ウェルプレートのウェル当たり17回のフェクションにより、48時間後にNEMOタンパク質のほぼ完全な枯渇をもたらした(図9)、BMDMの非常に効率的なトランスフェクションを示した。
PMおよびBMDMは、トランスフェクション後にIL-1β、IL-6およびTNFの検出可能な量を分泌しなかった(図10A,B)。また、NF-kBおよびMAPKシグナル伝達経路は、トランスフェクション16後に活性化されなかったが、トランスフェクション手順が炎症性シグナル伝達を活性化しないことを示す。また、トランスフェクトされていないマクロファージ16と比較して、トランスフェクトされたマクロファージの機能的変化は観察されていない。
図1:正しい向きで既にT7プロモーターを含むNEMOコードプラスミドの線形化。(A) FLAG タグ付き NEMOWTまたは NEMOC54/347Aのプラスミドエンコーディングのシーケンス抜粋 。コザック配列と開始コドンに近い正しい向きのT7プロモーターがすでに存在する。T7プロモータ領域には、FLAGタグおよびNEMOの符号化配列(CDS)、開始および停止コドンおよびXbaIを用いた線形化のための制限部位が色分けされる。(B)代表1%アガロースゲルは、Xbalで線形化の前後にプラスミドを示す;未処理の、線形化または精製された線形化プラスミドDNAの1μLをレーンごとに装填した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:PCRによるIKKs-コード化プラスミドへのT7プロモータ接続。(A)FLAG タグ IKKβWTまたは IKKβS177/181Eに対するプラスミド符号化の配列抜粋 .プラスミドは、PCRによって結合される適切なT7プロモーターを含んでいない。前方プライマーの位置、向きおよび配列(追加されるT7プロモーターシーケンスを含む)および逆プライマーは矢印で示される。T7 プロモータ領域には、FLAG タグと IKKβ 用の CDS と開始コドンとストップ コドンが色分けされています。(B)代表1%アガロースゲルは、上に示したプライマーを用いて正しいサイズの単一PCR産物の生成を検証する。精製されたPCR産物の1μLをレーンごとに装填した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:NEMO-およびIKKβコードDNAテンプレートからのmRNA合成(A)代表変性1.2%アガロースゲルを含有し、0.7%ホルムアルデヒドを含有し、ポリ(A)テーリング前後のNEMOおよびIKKβ構築物の精製mRNAを示す。NEMOWTの2μL、NEMOC54/347A、IKKβWTおよびIKKβS177/181E mRNAをレーンごとに装填した。32 μL ssRNAラダーをRNA長判定のために装填した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:PMの免疫磁気濃縮とBMDMの分化状態のフローサイトメトリック解析(A)免疫磁気濃縮前後の腹膜洗浄におけるF4/80+/CD11b+PMの割合をフローサイトメトリーにより分析した。(B)6日間の分化後のBMDMによるF4/80およびCD11bの発現をフローサイトメトリーにより検証した。それぞれ1サンプルにつき10,000または5,000個の細胞をカウントした。データは、それぞれn=3の独立した実験の平均±SEMとして示される。* P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001 と **** P < 0.0001 学生のt検定による.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:eGFPのポリ(A)テーリングを用いたmRNA合成(A)eGFP用プラスミド符号化の配列抜粋。プラスミドは、PCRによって結合される適切なT7プロモーターを含んでいない。前方プライマーの位置、向きおよび配列(追加されるT7プロモーターシーケンスを含む)および逆プライマーは矢印で示される。T7プロモータ領域、eGFP用CDS、および開始コドンとストップコドンは色分けされています。(B)代表1%アガロースゲルは、上に示したプライマーを用いてPCR後の精製増幅子を示す。精製されたPCR産物の1μLをレーンごとに装填した。(C)代表的な変性1.2%アガロースゲルを含有し、0.7%ホルムアルデヒドを含有し、ポリ(A)テーリング前後のeGFPの精製mRNAを示す。eGFP mRNAの2μLをレーンごとに装填した。32 μL ssRNAラダーをRNA長判定のために装填した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:eGFP mRNAを有する腹腹マクロファージおよびBMDMの両方の非常に効率的なトランスフェクション。マクロファージを6、9、または24時間、jetMESSENGERに複合体化したeGFP mRNAの50、100または200ngで、またはjetMESSENGER単独(モック)でインキュベートし、フローサイトメトリーによって分析した。(A)生存マクロファージ、実行可能なeGFP+マクロファージおよびPI+(すなわち、死んだ)マクロファージの集団を定義するために使用されるゲーティング戦略。6時間の200ng mRNAを用いたトランスフェクションの代表的なデータを示す。(B,C)(B)PMおよび(C)BMDMのトランスフェクション率は、フローサイトメトリー(n=5-7およびn=4-5独立実験)による生存可能なeGFP陽性細胞の割合をそれぞれ分析することによって決定した。(D-G)eGFPの発現量は、生存可能な平均蛍光強度(MFI)の生存性(D)PMおよび(F)BMDMおよび(E)PMおよび(G)BMDM(n=5-7およびn=4-5独立実験)の生存可能かつeGFP陽性サブ集団の平均蛍光強度(MFI)をそれぞれ分析することによって決定した。1サンプルあたり10,000個の細胞をカウントした。データは平均 ± SEM. n.s. = 有意でない値として表示されます。* P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001 と **** P < 0.0001 学生のt検定による.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図7:トランスフェクションは、溶解またはアポトーシス細胞死を誘発しない。(A)PMおよび(B)BMDMのトランスフェクション誘導細胞死は、PI陽性およびアネキシンV陽性細胞の割合(それぞれn=5-7およびn=4-5独立実験)を分析することによって決定した。トランスフェクトされていないサンプルに存在する死んだマクロファージのパーセンテージ(ある程度の細胞死は、非処理されたプレートの使用にもかかわらず、ウェルからのマクロファージの物理的な剥離によって引き起こされた)は、トランスフェクション手順によって誘発される細胞死のみを考慮するために、それぞれのトランスフェクトされたサンプルのそれから差し引かれた。PI+、アネキシンV+およびPI+/annexinV+マクロファージの集団を定義するために使用されるゲーティング戦略は、6時間200ng mRNAでトランスフェクトされたPMの代表的なデータセットについて示されている。スタウロスポリン(1時間50μM)を陽性対照として用った。1サンプルあたり10,000個の細胞をカウントした。データは平均± SEM. n.d. = 検出不能として表示されます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図8:NEMOおよびIKKコンストラクトのmRNA符号化を用いたトランスフェクションレート(A)NEMO構築物および(B)IKK構築物に対するmRNAコードを用いたトランスフェクション率は、免疫蛍光顕微鏡法(n=4独立実験)により定量した。スケールバー = 4 μm. データは平均 ± SEM. n.t. = トランスフェクトされず、n.s. = 有意でないと表示されます。* P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001 と **** P < 0.0001 学生のt検定による.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図9:クレリコンビナーゼのmRNA符号化を用いたNEMOfl/fl BMDMのトランスフェクションは、NEMOに対してほぼ完全な欠乏をもたらす。NEMOfl/flマウス由来のBMDMを、CRE媒介ノックアウトの結果としてNEMOタンパク質に対するCreリコンビナーゼをコードするmRNAでトランスフェクトし、NEMOまたはβアクチンを認識する特異的抗体を用いてウェスタンブロットによって評価し、デンシトメトリー(n=5独立実験)により定量した。データは、平均 ± SEM. * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001 および **** P < 0.0001 学生の t 検定によって表示されます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図10:トランスフェクションは炎症反応を誘発しない。(A)PM および (B)BMDM は NEMOWTまたは NEMOC54/347Aの mRNA エンコーディングでトランスフェクトされました。陽性対照として、マクロファージは1の感染の多重度でリステリア単球遺伝子に感染したか、5μg/mL LPSまたはポリ(I:C)で5時間(PM)または24時間(BMDM)で刺激された。上清へのIL-1β、IL-6、およびTNFの分泌をELISA(n=3独立実験)により定量した。データは平均±SEM. n.t. = トランスフェクトされていない、n.d. = 検出不能として示される。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ここでは、インビトロ転写mRNAを用いた通常はトランスフェクト性の高い一次マクロファージの非常に効率的なトランスフェクションのためのプロトコルを提示する。重要なことに、このプロトコルを用いたマクロファージのトランスフェクションは、細胞死を誘導したり、トランスフェクション試薬もトランスフェクトされたmRNAも非自己として認識されていないことを示す炎症シグナル伝達を活性化しない。
mRNAの品質は、このプロトコルを使用してマクロファージのトランスフェクションを成功させるために重要です。したがって、mRNAがRNA(汚染されたバッファやバイアルを介してなど)と接触しないことを細心の注意を払う必要があります。疑わしい場合は、mRNA分解(例えば、アガロースゲル電気泳動による)をチェックします。トランスフェクション率及び発現量は、トランスフェクション後6時間で既に最大であった。従って、目的のタンパク質は、トランスフェクション後の早期時点での分析に十分なレベルで発現することができる。しかし、私たちはこれをテストしていません。さらに、より大量のmRNAをトランスフェクトすると、トランスフェクション速度および/または発現レベルがさらに増加する可能性があります。しかしながら、より大量のmRNAをトランスフェクトすると、ある程度の免疫原性または細胞毒性につながる可能性もある。その完全な欠如は、このプロトコルの主な利点の一つです。したがって、より大量のmRNAをトランスフェクトする場合は、免疫原性および細胞毒性を慎重に評価する必要があります。
発現レベルは、トランスフェクトされたmRNAの量と明確に相関する。しかし、NEMO欠損BMDMにおけるNEMOの再発現は、このプロトコルを用いたmRNAトランスフェクションが目的のタンパク質の実質的な過剰発現につながらないことを示す野生型BMDM16と同様のNEMOタンパク質発現をもたらした。したがって、このプロトコルは、目的のタンパク質の過剰発現の結果を研究するために適さない可能性がある。しかし、タンパク質の過剰発現がしばしばその挙動を変えるので、これはむしろ利点であると考えています。
mRNAトランスフェクションの主な制限は、一般に、目的のタンパク質の一過性発現をもたらすだけである(このプロトコルを使用して生成およびトランスフェクトされたmRNAは通常のターンオーバーの対象となるため)。PMは、BMDMと比較して、より短い期間、関心のあるタンパク質を発現しているようです。したがって、BMDMとは対照的に、PMは一晩でトランスフェクトされるべきではありません。目的のタンパク質が発現される期間はさまざまです(mRNAの安定性とタンパク質の安定性の両方が異なるため)。それにもかかわらず、トランスフェクションと同じ日に選択の実験を行うことはお勧めします。目的のタンパク質の発現が長期間必要な場合、細胞はおそらく複数回トランスフェクトされ得る(例えば、18に記載された毎日)。
ここで説明するプロトコルを使用して、マウスPMおよびBMDMおよびマウス胚性線維芽細胞(MEF)16をトランスフェクトすることに成功した。理論的には、このプロトコルを用いて生成されたmRNAは、任意の哺乳動物種の任意の細胞型をトランスフェクトするために使用することができる。しかし、最適なmRNAトランスフェクション試薬および修飾ヌクレオシドの含有量は、他の細胞タイプによって異なる場合があります。
将来の有望な変更には、5'-および 3'-UTR の組み込みが含まれます。ほとんどの既存のプラスミドは、目的のタンパク質のCCDSのみを含み、5'-および3'-UTRは含まない。これらの包含(19で説明したように)は、mRNA安定性および発現をさらに増強し得る。また、前方または逆プライマーにエピトープタグの配列を含むだけで目的のタンパク質にエピトープタグを付着させることが可能である(それぞれN-およびC末端エピトープタグ付けの場合)。
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Disclosures
著者たちは何も開示する必要はない。
Acknowledgments
この作品はドイツ・フォルシュチュングゲマイインシャフト(SFB 670)によって支えられた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-methyl-CTP (100 mM) | Jena Biosience | NU-1138S | stored at -20 °C |
| Antarctic phosphatase | New England BioLabs | M0289 | stored at -20 °C |
| Antarctic phosphatase reaction buffer (10x) | New England BioLabs | B0289 | stored at -20 °C |
| anti-NEMO/IKKγ antibody | Invitrogen | MA1-41046 | stored at -20 °C |
| anti-β-actin antibody | Sigma-Aldrich | A2228 | stored at -20 °C |
| Petri dishes 92,16 mm with cams | Sarstedt | 821,473 | stored at RT |
| CD11b Microbeads mouse and human | Miltenyi Biotec | 130-049-601 | stored at 4 °C |
| Cre recombinase + T7-Promotor forward primer | Sigma-Aldrich | 5′-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGGCAGCCGCCACCATGTCC AATTTACTGACCGTAC-3´, stored at -20 °C |
|
| Cre recombinase + T7-Promotor reverse primer | Sigma-Aldrich | 5′-CTAATCGCCATCTTCCAGCAGG C-3′, stored at -20 °C |
|
| DNA purification kit: QIAquick PCR purification Kit | Qiagen | 28104 | stored at RT |
| eGFP + T7-Promotor forward primer | Sigma-Aldrich | 5´-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGATCCATCGCCACCATGGTG AGCAAGG-3´, stored at -20 °C |
|
| eGFP + T7-Promotor reverse primer | Sigma-Aldrich | 5´-TGGTATGGCTGATTA TGATCTAGAGTCG-3´, stored at -20 °C |
|
| Fast Digest buffer (10x) | Thermo Scientific | B64 | stored at -20 °C |
| FastDigest XbaI | Thermo Scientific | FD0684 | stored at -20 °C |
| High-fidelity polymerase with proofreading: Q5 High-Fidelity DNA-Polymerase | New England Biolabs Inc | M0491S | stored at -20 °C |
| IKKβ + T7-Promotor forward primer | Sigma-Aldrich | 5′-GAAATTAATACGACTCACTATA GGGTTGATCTACCATGGACTACA AAGACG-3′, stored at -20 °C |
|
| IKKβ + T7-Promotor reverse primer | Sigma-Aldrich | 5′-GAGGAAGCGAGAGCT-CCATCTG-3′, stored at -20 °C | |
| In vitro mRNA transcription kit: HiScribe T7 ARCA mRNA kit (with polyA tailing) | New England BioLabs | E2060 | stored at -20 °C |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | stored at RT |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | stored at RT |
| mRNA transfection buffer and reagent: jetMESSENGER | Polyplus transfection | 409-0001DE | stored at 4 °C |
| Mutant IKKβ IKK-2S177/181E plasmid | Addgene | 11105 | stored at -20 °C |
| Mutant NEMOC54/347A plasmid | Addgene | 27268 | stored at -20 °C |
| pEGFP-N3 plasmid | Addgene | 62043 | stored at -20 °C |
| poly(I:C) | Calbiochem | 528906 | stored at -20 °C |
| pPGK-Cre plasmid | F.T. Wunderlich, H. Wildner, K. Rajewsky, F. Edenhofer, New variants of inducible Cre recombinase: A novel mutant of Cre-PR fusion protein exhibits enhanced sensitivity and an expanded range of inducibility. Nucleic Acids Res. 29, 47e (2001). stored at -20 °C | ||
| pseudo-UTP (100 mM) | Jena Biosience | NU-1139S | stored at -20 °C |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | stored at RT |
| Rat-anti-mouse CD11b antibody, APC-conjugated | BioLegend | 101212 | stored at 4 °C |
| Rat-anti-mouse F4/80 antibody, PE-conjugated | eBioscience | 12-4801-82 | stored at 4 °C |
| Recombinant M-CSF | Peprotech | 315-02 | stored at -20 °C |
| RNA purification kit: MEGAclear transcription clean-up kit | ThermoFisher Scientific | AM1908 | stored at 4 °C |
| RNAse-degrading surfactant: RnaseZAP | Sigma-Aldrich | R2020 | stored at RT |
| Ultrapure LPS from E.coli O111:B4 | Invivogen | stored at -20 °C | |
| Wild type IKKβ plasmid | Addgene | 11103 | stored at -20 °C |
| Wild type NEMO plasmid | Addgene | 27268 | stored at -20 °C |
References
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