Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Svært effektiv Transfeksjoner av primær makrofager med in vitro skrives mRNA

Published: November 9, 2019 doi: 10.3791/60143

Summary

Makrofager, spesielt primære makrofager, er utfordrende å transfect som de spesialiserer seg på å oppdage molekyler av ikke-selv opprinnelse. Vi beskriver en protokoll som gir svært effektiv transfeksjoner av primære makrofager med mRNA generert fra DNA-maler som plasmider.

Abstract

Makrofager er phagocytic celler spesialisert i å oppdage molekyler av ikke-selv opprinnelse. For dette formål, de er utstyrt med et stort utvalg av mønster anerkjennelse reseptorer (PRRs). Dessverre gjør dette også makrofager spesielt utfordrende å transfect som transfeksjoner reagens og transfekterte nukleinsyre syrer er ofte anerkjent av PRRs som ikke-selv. Derfor transfeksjoner ofte resulterer i macrophage aktivering og degradering av transfekterte nukleinsyre syrer eller selv i selvmord av makrofager. Her beskriver vi en protokoll som gir svært effektiv transfeksjoner av murine primære makrofager som bukhulen (PM) og benmarg avledede makrofager (BMDM) med mRNA in vitro som kan skrives ut fra DNA-maler som plasmider. Med denne enkle protokollen, transfeksjoner priser på ca 50-65% for PM og ca 85% for BMDM oppnås uten cytotoksisitet eller immunogenisitet observert. Vi beskriver i detalj generering av mRNA for transfeksjoner fra DNA-konstruksjoner som plasmider og transfeksjoner prosedyren.

Introduction

Makrofager er phagocytic celler som spesialiserer seg på å oppdage, inntak og nedverdigende mikrober, apoptotisk celler og cellulære rusk. Videre bidrar de til å organisere immunresponser ved sekresjon cytokiner og chemokiner og ved å presentere antigener til T-celler og B-celler. Makrofager spiller også viktige roller i en rekke andre prosesser, slik som sår helbredelse, aterosklerose, tumorigenesis og fedme.

For å kunne oppdage ikke-selv molekyler som patogen-assosiert molekylære mønstre (PAMPs) og out-of-Place molekyler som skade-forbundet molekylære mønstre (demper), makrofager er utstyrt med et stort utvalg av mønster anerkjennelse reseptorer (PRR)1. Dessverre, dette gjør også makrofager spesielt utfordrende å transfect2 som transfeksjoner reagens3 og transfekterte nukleinsyre syrer4,5,6,7 ofte er anerkjent av PRRs som ikke-selv. Av denne grunn, transfeksjoner av makrofager bruker kjemiske eller fysiske metoder8 vanligvis resulterer i macrophage aktivering og degradering av transfekterte nukleinsyre syrer eller selv i macrophage selvmord via pyroptosis, en form for programmert lytisk celle død utløst etter anerkjennelse av cytosolic PAMPs/DEMPER som DNA eller utenlandsk RNA9. Biologiske transfeksjoner av makrofager bruker virus som adenoviruses eller lentiviruses som vektorer er ofte mer effektiv, men byggingen av slike viral vektorer er tidkrevende og krever biosafety nivå 2 utstyr10,11.

Selv om makrofager er gjenstand for intensiv forskning, er analyse av deres funksjoner på molekylnivå hemmet fordi en av de viktigste verktøyene for molekylærbiologi, transfeksjoner av nukleinsyre yre konstruksjoner for eksogene uttrykk for proteiner, er neppe aktuelt. Dette tvinger ofte forskere til å bruke macrophage-lignende cellelinjer snarere enn bona fide makrofager. Søknader om nukleinsyre yre konstruere transfeksjoner inkluderer uttrykk for muterte eller merkede protein versjoner, overuttrykte av et bestemt protein, protein re-uttrykk i en respektive knockout bakgrunn og uttrykk for proteiner fra andre arter (f. eks , Grobunn recombinase eller guide RNA og Cas9 for målrettet gen knockout).

Her beskriver vi en protokoll som gir svært effektiv transfeksjoner av (vanligvis vanskelig å transfect) primære makrofager, som er murine i bukhulen (PM) og benmarg-avledet makrofager (BMDM) med mRNA generert fra DNA-maler som plasmider. Viktigst, in vitro transkribere mRNA generert ved hjelp av denne protokollen inneholder naturlig forekommende modifisert nucleosides 5-metyl-CTP og pseudo-UTP som reduserer immunogenisitet og forbedre stabiliteten4,6,7,12,13. Dessuten blir 5 '-endene av in vitro-mRNA dephosphorylated av Antarktis fosfatase for å forhindre anerkjennelse av riggen-i kompleks14,15. Dette minimerer medfødt uimottakelig anerkjennelse av in vitro skrives mRNA. Med vår lett å utføre protokollen, transfeksjoner priser mellom 50-65% (bukhulen makrofager (PM)) og 85% (BMDM) er nådd stund, viktigere, det er ingen cytotoksisitet eller immunogenisitet observert. Vi beskriver i detalj (i) hvordan immunologisk taushet mRNA for transfeksjoner kan genereres fra DNA-konstruksjoner som plasmider og (II) transfeksjoner prosedyren selv.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Macrophage isolasjon fra mus ble utført i samsvar med Dyrevern loven i Tyskland i samsvar med etikk komité ved Universitetet i Köln.

Merk: Utfør alle trinnene iført hansker. Utfør alle transfeksjoner trinnene under en laminær strømnings hette for å hindre kontaminering av cellene. Før du arbeider med mRNA, rengjør du alle instrumenter som Pipetter og alle overflater med 70% etanol og/eller et RNAse overflateaktivt middel (tabell med materialer). Sørg for at alle reaksjons rørene er RNAse-frie og sterile. Bruk bare sterilt, RNAase vann til fortynninger. Bruk kun pipette tips med filtre. Endre pipette-tips etter hvert pipettering trinn.

1. generering av DNA-mal

Merk: DNA-malen for in vitro mRNA-transkripsjon som bruker denne protokollen, må inneholde en T7 Promotor sekvens for å tillate forankring av RNA-polymerase. Hvis plasmider som inneholder DNA-sekvensen av protein av interesse allerede inneholder en riktig orientert T7 Promotor sekvens direkte oppstrøms av sekvensen av interesse, linearization av plasmider (se trinn 1,1.) må utføres. Hvis ikke, legger du til en T7-Promotor i sekvensen av interesse ved polymerase kjedere reaksjon (PCR, se trinn 1,2.).

  1. Linearization av T7 Promotor-inneholdende plasmider
    1. Linearize plasmider allerede inneholder en riktig orientert T7 Promotor sekvens av fordøyelsen med en restriksjon enzym kutte nedstrøms av stopp Codon av sekvensen av interesse. Ellers vil transkripsjon ikke slutte riktig etter sekvensen av interesse.
      Merk: Det er best å bruke begrensning enzymer forlate sløv ender eller 5 ' overheng.
    2. Bekreft fullstendig linearization av plasmider ved agarose gel elektroforese av ufordøyd versus fordøyd plasmider DNA.
    3. Rens linearized plasmider DNA før bruk som DNA mal for in vitro mRNA transkripsjon ved hjelp av en DNA rensing Kit (tabell av materialer).
  2. Vedlegg av T7 Promotor av PCR
    1. Bruk en primer som inneholder følgende komponenter (i den indikerte rekkefølgen fra 5 til 3 '): ca 5 tilfeldige BP oppstrøms av Promotor (f. eks, GAAAT); T7 Promotor sekvensen (TAATACGACTCACTATAG); to ekstra GS for økt transkripsjon effektivitet (GG); mål sekvens spesifikke delen som er homologe til plasmider sekvensen rundt Start Codon.
      Merk: Det bør være sammensatt av: 3-6 BP oppstrøms av KOZAK sekvensen og starte Codon, den KOZAK sekvensen og starte Codon (vanligvis GCCACC ATG G), 12-18 BP nedstrøms av Start Codon. Hvis sekvensen av interesse ikke allerede inneholder en KOZAK sekvens eller starte Codon, kan disse festes i dette trinnet ved ganske enkelt å inkludere dem i primer sekvensen.
    2. Beregn tm i fremover primer bare ved å ta hensyn til den delen homologe til målet sekvensen.
    3. For å vurdere dimers/slam formasjon bruke hele primer sekvensen, som lett kan overstige 50 BP.
    4. Bruk en omvendt primer plassert et sted nedstrøms av stopp Codon.
      Merk: Hvis sekvensen av interesse ikke allerede inneholder en stopp Codon, kan det festes i dette trinnet ved å inkludere den i primer sekvensen.
    5. Bruk frem-og revers-primere til å utføre en PCR ved hjelp av en polymerase med høy kvalitet ved korrekturlesing (tabell med materialer).
    6. Bekreft generering av et enkelt produkt og amplicon størrelse ved agarose gel elektroforese (f. eks, bruk en 1% agarose gel og 100 V konstant strøm).
    7. Rens PCR produktet før bruk som DNA mal for in vitro mRNA transkripsjon ved hjelp av en DNA rensing kit.

2. mRNA generasjon

  1. Tine alle komponenter i in vitro mRNA transkripsjon Kit (se tabell over materialer). Vortex på 5 s og spinne ned for 2 s på 2 000 x g. Hold på isen til bruk.
  2. Klargjør reaksjonsblandingen for in vitro mRNA-transkripsjon i et 0,5 mL mikrosentrifugen rør i følgende rekkefølge (totalt volum på 40 μL): 20 μL av 10x ARCA/NTP mix (inkludert i in vitro mRNA transkripsjon Kit); 0,25 μL av 5-metyl-CTP (siste konsentrasjon (f.c.) er 1,25 mM; 50% av total CTP); 0,25 μL av pseudo-UTP (f.c. er 1,25 mM; 50% av total UTP); X μL av DNA-mal; 2 μL av T7 RNA polymerase mix (inkludert i in vitro mRNA transkripsjon Kit); Y μL av RNAse-Free H2O.
    Merk: X er et volum som inneholder minst 1 mikrogram DNA. For eksempel 1,6 μL fra en 625 ng/μL lagerløsning. Y er Reserve volumet til det totale volumet på 40 μL.
  3. Vortex på 5 s og spinne ned for 2 s på 2 000 x g. Ruge ved 37 ° c i 30 min ved 400 RPM på en termisk mikser for in vitro transkripsjon.
  4. Deretter tilsett 2 μL av DNase jeg direkte inn i reaksjonsblandingen for fjerning av malen DNA. Vortex på 5 s og spinne ned for 2 s på 2 000 x g.
  5. Ruge ved 37 ° c i 15 minutter ved 400 RPM på en termisk mikser. Ta en alikvot på 2 μL for kontroll gelen (trinn 3,3) og oppbevar ved-80 ° c.
  6. For Poly (A) Tailing, Legg til følgende komponenter direkte i den forrige reaksjonsblandingen (til et endelig volum på 50 μL): 5 μL av 10x Poly (A) polymerase reaksjonsbuffer og 5 μL av Poly (A) polymerase (begge inkludert i in vitro mRNA transkripsjon Kit). Vortex på 5 s og spinne ned for 2 s på 2 000 x g.
  7. Ruge blandingen ved 37 ° c i 30 min ved 400 RPM på en thermomixer. Ta en alikvot på 2 μL for kontroll gelen (trinn 3,3) og oppbevar ved-80 ° c.
  8. For defosforylering av de 5 ́-endene av mRNA, Legg til følgende komponenter direkte i den forrige reaksjonsblandingen (til et endelig volum på 60 μL): 3 μL av RNAse-Free H2O; 6 μL av 10x reaksjonsbuffer i Antarktis fosfatase; 3 μL av Antarktis fosfatase (15 enheter for 60, μL reaksjons volum). Vortex på 5 s og spinne ned for 2 s på 2 000 x g.
  9. Ruge blandingen ved 37 ° c i 30 min ved 400 RPM på en termisk mikser.
  10. Varm-Deaktiver Antarktis fosfatase av inkubasjons ved 80 ° c i 2 min.
    Merk: Ideelt sett bruke en egen termisk mikser, ikke vent til den første mikseren når ønsket temperatur.

3. mRNA rensing

  1. Rens in vitro mRNA ved hjelp av et dedikert RNA rensesett (tabell med materialer).
    1. Tilsett X μL av eluering løsning på mRNA reaksjons miks fra trinn 2,10. Bland med invertere 5 ganger. Tilsett 300 μL av bindings løsnings konsentrat. Bland med milde pipettering 5 ganger.
      Merk: X er Reserve volumet til et total volum på 100 μL. Legg for eksempel 40 μL eluering oppløsning til 60 μL mRNA reaksjons miks.
    2. Tilsett 100 μL av RNAase-fri etanol. Bland med milde pipettering 5 ganger.
    3. Plasser en filter kolonne i ett av de leverte Prøvetakings rørene. Overfør mRNA-reaksjonen forsiktig mot midten av filteret uten å berøre filteret. Sentrifuger ved 15 000 x g i 1 min ved romtemperatur (RT).
    4. Løft filterkolonnen forsiktig og kast Gjennomstrømningsmengden i oppsamlings røret. Sett filterkolonnen tilbake i samme prøvetakingsrør.
    5. Tilsett 500 μL vaskeløsning (ikke glem å legge til 20 mL RNAase-fri etanol før du bruker vaskeløsningen for første gang).
    6. Sentrifuger på 15 000 x g i 1 min ved RT. Gjenta trinn 3.1.4-3.1.6 for å vaske en gang til.
    7. Sentrifuger med full hastighet (17 900 x g) i 1 min ved RT for å fjerne eventuell gjenværende væske fra filter søylen. Ta forsiktig filter søylen fra oppsamlings røret. Plasser filterkolonnen i et nytt prøvetakingsrør.
    8. Tilsett 50 μL av eluering buffer på midten av filteret uten å berøre filteret. Ruge ved 65 ° c i 10 minutter på en termisk mikser.
    9. Sentrifuger på 15 000 x g for 1 min ved RT. Fjern filterkolonnen og Forkast den.
  2. Mål konsentrasjon og renhet av eluert mRNA, for eksempel ved hjelp av en microvolume spektrofotometer å måle absorbansen på 260 og 280 NM.
    Merk: En A260/A280 ratio på 1,8-2.1 er et tegn på svært renset mRNA.
  3. Verifisere tilstedeværelsen av et enkelt produkt, riktig transkripsjon lengde og Poly (A) Tailing ved å analysere alikvoter fra trinn 2,5 og 2,7 av agarose gel elektroforese under denaturering forhold (for eksempel bruke en 1,2% agarose gel inneholder 20 mM 3-(N-morpholino) propanesulfonic acid [MOPPER], 5 mM natrium acetate, 1 mM EDTA og 20% formaldehyd og kjøre i 20 mM MOPPER, 5 mM natrium acetate, 1 mM EDTA og 0,74% formaldehyd ved 100 V konstant strøm).
  4. Oppbevar renset mRNA i eluering røret ved-80 ° c til transfeksjoner. Hvis du bruker bare lave mengder av mRNA for transfeksjoner deretter alikvot mRNA å unngå gjentatte fryse-tine sykluser.
    Merk: mRNA kan oppbevares ved-80 ° c i ca. 1 år.

4. macrophage forberedelse

  1. Euthanize C57/BL6 mus (bruk mus av samme kjønn og av 6-24 ukers alder) ved cervical forvridning.
    Merk: Det samme mus kan brukes til isolering av PM (trinn 4,2) og generering av BMDM (trinn 4,3 og 4,4). For isolering av PM bruke minst to mus. Hvis bare BMDM skal genereres en mus vanligvis er nok.
  2. Immunomagnetisk Innfanging berikelse av bukhulen makrofager.
    1. Fyll en 10 mL sprøyte med en 0,9 x 40 mm kanyle med 8 mL iskaldt fosfat-bufret saltvann (PBS) og 2 mL luft. Skyll bukhulen med PBS. Luften vil danne en boble som minimerer lekkasje av PBS.
    2. Samle opp bukhulen raskt med samme sprøyte og overfør den til et 50 mL konisk sentrifugering rør. Kombiner bukhulen celler med flere mus hvis nødvendig. Hold celle oppheng på is.
    3. Sentrifuge celle fjæring ved 650 x g i 5 min ved 4 ° c. Kast supernatanten og resuspend celle pellet i 5 mL 0,2% NaCl for 30 s til lyse røde blodlegemer.
    4. Tilsett 5 mL 1,6% NaCl til et total volum på 10 mL for å Rekonstituer isoton forhold. Sentrifuger ved 650 x g i 5 min ved 4 ° c.
    5. Kast supernatanten og resuspend celle pellet i 97,5 til μL av magnetisk celle sortering (MCS) buffer (2 mM ethylenediaminetetraacetic acid [EDTA], 5% storfe serum albumin [BSA] i PBS) per 1 bukhulen (f. eks, hvis tre mus ble spyles, resuspend i 292,5 μL ).
    6. Tilsett 2,5 μL av spinn perler som bøyes likt til et CD11b-spesifikt antistoff per 97,5 μL av celle oppheng (f.eks. Legg til 7,5 μL til 292,5 μL).
    7. Ruge på isen i 15 minutter ved 150 RPM på en orbital shaker.
    8. Sentrifuge celle fjæring ved 650 x g i 5 min ved 4 ° c, kast supernatanten og resuspend celle pellet i 1 ml MCS-buffer.
    9. Tilsett 4 mL MCS buffer til et total volum på 5 mL og vask cellene ved forsiktig pipettering opp og ned tre ganger.
    10. Gjenta trinn 4.2.8 og 4.2.9 to ganger til til sammen tre vasketrinn.
    11. Under vaske trinnene plasseres en LS-kolonne i et magnetisk celle skille (se tabell over materialer). Skyll kolonnen med 3 mL MCS-buffer.
      Merk: Unngå eventuelle bobler, da disse kan tette spalten.
    12. Resuspend celle pellet i 1 mL MCS buffer. Tilsett 3 mL MCS buffer til et total volum på 4 mL, bland ved pipettering opp og ned tre ganger.
    13. Overfør 4 mL celle suspensjonen til den skylles LS-kolonnen.
      Merk: Igjen, unngå eventuelle bobler da disse kan tette kolonnen.
    14. Vent til beholderen i kolonnen er helt tom. Ikke Legg til ekstra væske før søylen slutter å dryppe.
    15. Tilsett 3 mL MCS-buffer på søylen. Deretter venter du til reservoaret i kolonnen er helt tom. Gjenta trinn 4.2.15 to ganger til.
    16. Plasser LS-kolonnen i et 15 mL konisk sentrifugering rør. Påfør 5 mL MCS-buffer på søylen. Vent til 2 mL væske har passert gjennom kolonnen, og bruk deretter stempelet til å skyve den resterende fraksjonen forsiktig inn i røret.
    17. Sentrifuger celle fjæring ved 650 x g i 5 min ved 4 ° c og kast supernatanten.
    18. Resuspend cellen pellet i 1 mL DMEM supplert med 10% varme-deaktivert fosterets kalv serum (FCS) (DMEM + FCS).
    19. Bestem antall levedyktige celler ved å telle i trypan blå løsning i en Neubauer telling kammer og frø celler i DMEM + FCS i kultur plater.
      Merk: Seed PM i en tetthet på 100 000 celler/brønn i en flat bunn mikrotiterbrønnene plate. Ikke bruk vevs kultur-behandlede plater som PM kan ikke kobles fra disse. Bruk ikke-behandlede plater i stedet.
  3. Generering av BMDM
    1. Fjern hud og muskler fra bakbena ved hjelp av en saks. Vask hver etappe med kort nedsenking i 70% etanol.
    2. Løsne bena og åpne begge endene av femur og Tibia ved å kutte med saks.
    3. Fyll en 5 mL sprøyte fylt med en 0,6 mm x 30 mm kanyle med 5 mL svært lav endotoksin (VLE) RPMI 1640 og skyll benmargen ut av de åpne beina til en kultur rett.
    4. Kombiner benmarg av flere mus hvis nødvendig ved å gjenta trinnene 4.3.1-4.3.3. Overfør benmargen til et 50 mL konisk sentrifugering rør.
    5. Sentrifuger benmarg fjæringen ved 650 x g i 5 min ved 4 ° c og kast supernatanten.
    6. Resuspend celle pellet i 5 mL rød blod cellelyse Rings buffer (8,3% NH4Cl, 0,1 M Tris) og ruge i 5 min ved RT å lyse de røde blodcellene.
    7. Sentrifuger celle fjæringen ved 650 x g ved 4 ° C i 5 min og kast supernatanten.
    8. Resuspend cellen pellet i 1 mL av VLE RPMI 1640 medium supplert med 10% FCS, 1% penicillin/Streptomycin, 1% HEPES, 1% natrium pyruvat og 10 ng/mL rekombinant macrophage koloni-stimulerende faktor (M-CSF) (RPMI+ + ++ +).
    9. Tilsett 4 ml RPMI+ + + + + til et total volum på 5 ml.
    10. Forbered 5 92 mm x 16 mm ubehandlet Petri retter med cams (se tabellen av materialer) per mus ved pipettering 7 ml RPMI + ++ + + medium i hver tallerken.
    11. Overfør 1 mL celle løsning til de 5 tilberedte kultur rettene og ruge ved 37 ° c og 5% CO2.
    12. Etter 4 dager, mate cellene ved å legge til 4 mL RPMI+ + + + +. Etter 6-7 dager, benmarg cellene er fullt differensiert i BMDM.
  4. Høsting av BMDM
    1. Fjern mediet fra kultur rettene helt. Tilsett 5 mL varm 0,2 mM EDTA i PBS til hver tallerken.
    2. Forsiktig skrape hele platen med en celle skraper å løsne BMDM. Kombiner celle suspensjoner i en 50 mL konisk sentrifugering tube.
    3. Skyll alle 5 rettene igjen. Bruk samme volum på 5 mL varm 0,2 mM EDTA i PBS for alle 5 retter. Kombiner denne celle suspensjonen med en fra forrige trinn.
    4. Sentrifuger celle fjæringen ved 650 x g i 5 min ved 4 ° C og kast supernatanten.
    5. Resuspend celle pellet i 1 mL av VLE RPMI 1640 medium supplert med 10% FCS, 1% HEPES, 1% natrium pyruvat og 10 ng/mL rekombinant M-CSF men ingen antibiotika (RPMI+ + + +).
    6. Bestem antall levedyktige celler ved å telle i trypan blå løsning i en Neubauer telling kammer og frø celler i RPMI+ + + + til kultur plater.
      Merk: Seed BMDM i en tetthet på 50 000 celler/vel maksimum i en flat bunn mikrotiterbrønnene plate. Ikke bruk vev kultur-behandlede plater som BMDM kan neppe være løsrevet fra disse. Bruk ikke-behandlede plater i stedet.

5. transfeksjoner av makrofager med mRNA

  1. Beregn det nødvendige volumet av mRNA transfeksjoner buffer.
    Merk: Volumet av mRNA transfeksjoner buffer kreves avhengig av brønn størrelse: Bruk 200 μL for transfeksjoner i en 6-brønn plate, 100 μL i en 12-brønn plate og så videre. Alltid legge litt ekstra volum på grunn av pipettering tap (men ikke for mye, for å hindre unødig fortynning av mRNA). Bruk for eksempel 450 μL i stedet for 4 x 100 μL = 400 μL til transfect i 4 brønner av en 12-brønn plate.
  2. Beregn det nødvendige volumet av mRNA transfeksjoner reagens. MRNA transfeksjoner reagens tilsettes i forholdet 1:50. For eksempel kreves 9 μL av mRNA transfeksjoner reagens for et endelig volum på 450 μL.
  3. Beregn den totale mengden mRNA som kreves. Minst 100 ng per 100 000 makrofager er nødvendig for effektiv transfeksjoner, 200 ng fungerer enda bedre (f. eks 800 ng mRNA å transfect 400 000 makrofager).
    1. Multipliser den beregnede mengden av mRNA som kreves med det totale antall brønner som må transfekterte (f. eks, 4 brønner med 400 000 makrofager hver: 4 x 800 ng = 3 200 ng mRNA kreves totalt for alle brønner). Hvis for eksempel mRNA-aksjen er 426,8 ng/μL, er 7,49 μL nødvendig for optimal transfeksjoner av 4 brønner med 400 000 makrofager hver.
  4. Legg til det beregnede volumet av mRNA transfeksjoner buffer (trinn 5,1.) minus volumene for mRNA transfeksjoner reagens (trinn 5,2) og mRNA (trinn 5,3) til et reaksjons rør. For eksempel 450 μL-9 μL-7,49 μL = 433,51 μL.
  5. Tine mRNA lager og bland det ved forsiktig blar av eluering røret. Legg til det beregnede volumet av mRNA (trinn 5,3) i reaksjonsrøret med mRNA reaksjonsbuffer (i eksempelet presentert ovenfor: 7,49 μL i 433,51 μL).
  6. Vortex på 5 s og spinne ned for 2 s på 2 000 x g.
  7. Vortex mRNA transfeksjoner reagens for 5 s og spinne ned for 2 s ved 2 000 x g.
  8. Legg til det beregnede volumet av mRNA transfeksjoner reagens (trinn 5,2) i reaksjonsrøret som inneholder mRNA transfeksjoner buffer og mRNA (i eksempelet ovenfor: 9 μL av mRNA transfeksjoner reagens).
  9. Vortex transfeksjoner mix for 5 s og spinne ned for 2 s ved 2 000 x g.
  10. Ruge for 15 min ved RT.
  11. I mellomtiden erstatte kultur medium av makrofager med friskt, varmt kultur medium (se trinn 4.2.18. og 4.4.5).
  12. Etter inkubasjons trinn 5,10, tilsett transfeksjoner Mix til brønnene som inneholder makrofager i et volum som passer for størrelsen på brønnen (se trinn 5,1). Legg til transfeksjoner Mix dråpevis i en sirkel fra utsiden til midten av brønnen.
  13. Forsiktig rock platen, først i en vertikal og deretter i en horisontal retning for å sikre jevn fordeling av transfeksjoner blandingen i brønnen. Deretter ruge ved 37 ° c og 5% CO2. Syntese av proteinet kodet av transfekterte mRNA vil begynne kort tid etter transfeksjoner. For best resultat, ruge i minst 6 timer.
  14. Etter inkubasjons, analysere transfeksjoner effektivitet ved (Immuno) fluorescens mikroskopi, Flow flowcytometri eller immunoblot16, eller bruke transfekterte makrofager for eksperimentet av valget.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi har med hell brukt denne protokollen til å generere mRNA-koding for FLAG-Tagged NEMO og IKKβ varianter for transfeksjoner av primære makrofager16. Plasmider koding for FLAG-Tagged Wild-type (NEMOWT) og C54/347A mutant NEMO (NemoC54/374A) (se tabell over materialer) inneholder allerede en T7 Promotor i riktig retning (figur 1a). Således, vi bare måtte linearize den plasmider å generere DNA maler for in vitro transkripsjon. For dette formål ble 10 mikrogram plasmider DNA fordøyd med 5 μL Xbal, noe som resulterte i linearization av plasmider på grunn av en enkelt cut 3 ' av stopp Codon. Fullstendig linearization av plasmider DNA ble verifisert av agarose gel elektroforese (figur 1B).

Plasmider koding for flaggmerket vill-type (IKKβWT) og S177/181E mutant IKKβ (IKKβS177/181E) inneholder ikke en T7 Promotor. Derfor har vi festet en T7 Promotor av PCR for å generere DNA-malene for in vitro-transkripsjon (figur 2a). Generering av et bestemt PCR-produkt, det vil si et enkelt produkt av riktig størrelse, ble verifisert av agarose gel-elektroforese (figur 2B).

Etter in vitro transkripsjon ved hjelp av de respektive DNA-maler, bekreftet vi generering av en enkelt mRNA produkt av riktig størrelse og Poly (A) Tailing av agarose gel elektroforese under denaturering forhold (Figur 3).

For å verifisere at mRNA generert ved hjelp av denne protokollen aktiverer transfeksjoner av primær makrofager (se Figur 4a, B for Flow analytiske analyser av immunomagnetisk Innfanging berikelse av pm og differensiering status BMDM), har vi generert mRNA koding for eGFP (figur 5A-C) og analysert transfeksjoner effektivitet ved flyt flowcytometri (figur 6a). 100 000 PM eller 50 000 BMDM per brønn av en ubehandlet mikrotiterbrønnene plate ble transfekterte med 50, 100 eller 200 ng av eGFP mRNA for 6, 9 eller 24 h. I både PM og BMDM, kan høye nivåer av eGFP uttrykk oppdages ved 6 h etter transfeksjoner. Transfeksjoner rate økte med mengden av transfekterte mRNA og var høyest for 200 ng mRNA (figur 6B, C). For PM, transfeksjoner rate nådde ca 50-65% ved 6 til 9 h etter transfeksjoner (figur 6B). Ved 24 h etter transfeksjoner, transfeksjoner rate var vesentlig lavere indikerer utløper eGFP uttrykk. Dermed bør PM ikke være transfekterte over natten. For BMDM, transfeksjoner rate nådde ca 80-85% (figur 6C). Fall i transfeksjoner rate etter 24 h var mye mindre uttalt i BMDM. Dermed kan BMDM være transfekterte over natten. I begge PM (figur 6D, E) og BMDM (figur 6F, G), uttrykket nivå av eGFP i transfekterte celler økte i en tid-og dose avhengig måte. Viktigere, gjorde transfeksjoner prosedyren ikke indusere lytisk eller apoptotisk celle død som det ikke var noen økning i propidium iodide-positive (PI) eller annexin V-positive makrofager etter transfeksjoner (figur 7A, B).

Transfeksjoner effektiviteten av mRNAs koding for FLAG-Tagged NEMO eller IKKβ varianter ble analysert av immunofluorescence mikroskopi. 300 000 PM per brønn av en 12-brønn plate ble transfekterte med 300 ng av respektive mRNA for 6 h. Transfeksjoner rate var ca 60% for NEMO mRNAs og om 55% for IKKβ mRNAs (Figur 8a, B). Således, deres transfeksjoner ratene var analog med det av eGFP mRNA angir en General transfeksjoner rate av om 55% for PM.

Vi har også brukt denne protokollen til å generere mRNA-koding for grobunn recombinase. Transfeksjoner av 400 000 BMDM fra NEMOflox/flox mus17 per brønn av en 12-brønn plate med 400 ng av grobunn recombinase mRNA resulterte i nesten fullstendig tømming for NEMO-protein etter 48 h (figur 9) som indikerer svært effektiv transfeksjoner av BMDM.

PM og BMDM ikke skiller ut noen synlige mengder IL-1β, IL-6 og TNF etter transfeksjoner (Figur 10A, B). Videre, NF-kB og MAPK signalering trasé ble ikke aktivert etter transfeksjoner16 indikerer at transfeksjoner prosedyren ikke aktiverer proinflammatoriske signalering. Vi har heller ikke observert funksjonelle endringer av transfekterte makrofager sammenlignet med untransfected makrofager16.

Figure 1
Figur 1: linearization av Nemo-Encoding plasmider som allerede inneholder en T7-Promotor i riktig retning. (A) sekvens utdrag av plasmider koding for Flag-Tagged NemoWT eller NemoC54/347A. En T7-Promotor i riktig retning og nær KOZAK-sekvensen og start Codon er allerede til stede. Den T7 Promotor regionen, kodingen sekvensen (CDS) for FLAGGET Tag og NEMO, start og stopp kodon og begrensningen området for linearization med XbaI er fargekodet. (B) representant 1% agarose gel som viser plasmider før og etter linearization med Xbal; 1 μL av ubehandlet, linearized eller renset linearized plasmider DNA ble lastet per kjørefelt. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: T7 Promotor vedlegg til IKKß-Encoding plasmider av PCR. (A) sekvens utdrag av plasmider koding for Flag-Tagged IKKβWT eller IKKβS177/181E. Plasmider inneholder ikke en passende T7-Promotor, som derfor er festet av PCR. Plassering, orientering og sekvens av fremover primer (som inneholder T7 Promotor sekvensen som skal legges) og omvendt primer er indikert med pilene. Den T7 Promotor regionen, CDS for FLAGGET Tag og IKKβ og start og stopp kodon er fargekodet. (B) representative 1% agarose gel som verifiserer generering av et enkelt PCR-produkt av riktig størrelse ved hjelp av primere angitt ovenfor. 1 μL av renset PCR-produktet ble lastet per kjørefelt. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: mRNA syntese fra Nemo-og IKKβ-koding DNA maler. (A) Representative denaturering 1,2% agarose gel inneholder 0,7% formaldehyd viser renset MRNA av Nemo og IKKβ konstruksjoner før og etter Poly (A) Tailing. 2 μL av NEMOWT, NemoC54/347A, IKKβWT og IKKβS177/181E mRNA ble lastet per kjørefelt. En 32 μL ssRNA stige ble lastet for RNA lengde bestemmelse. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Flow analytiske analyser av immunomagnetisk Innfanging berikelse av pm og differensiering status BMDM. (A) prosentandelen av F4/80+/CD11b+ PM i bukhulen før og etter immunomagnetisk Innfanging berikelse ble analysert av Flow flowcytometri. (B) uttrykk for F4/80 og CD11B av BMDM etter 6 dager med differensiering ble verifisert av Flow flowcytometri. 10 000 eller 5 000 celler ble telt per prøve, henholdsvis. Data vises som gjennomsnittet ± SEM av n = 3 uavhengige eksperimenter, hver. * P < 0,05, * * p < 0,01, * * * p < 0,001 og * * * * p < 0,0001 av student t-test. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: mRNA syntese med Poly (A) Tailing av eGFP. (A) sekvens utdrag av plasmider koding for eGFP. Plasmider inneholder ikke en passende T7-Promotor, som derfor er vedlagt av PCR. Plassering, orientering og sekvens av fremover primer (som inneholder T7 Promotor sekvensen som skal legges) og omvendt primer er indikert med pilene. Den T7 Promotor regionen, CDS for eGFP og start og stopp kodon er fargekodet. (B) representant 1% agarose gel som viser renset AMPLICON etter PCR ved hjelp av primere angitt ovenfor. 1 μL av renset PCR-produktet ble lastet per kjørefelt. (C) Representative denaturering 1,2% agarose gel inneholdende 0,7% formaldehyd viser renset MRNA av eGFP før og etter Poly (A) Tailing. 2 μL av eGFP mRNA ble lastet per kjørefelt. En 32 μL ssRNA stige ble lastet for RNA lengde bestemmelse. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: svært effektiv transfeksjoner av både bukhulen makrofager og BMDM med EGFP mRNA. Makrofager ble inkubert for 6, 9 eller 24 timer med 50, 100 eller 200 ng av eGFP mRNA complexed til jetMESSENGER eller med jetMESSENGER alene (mock) og deretter analysert av Flow flowcytometri. (A) gating strategi brukes til å definere populasjoner av levedyktige makrofager, levedyktig eGFP+ makrofager og pi+ (dvs. døde) makrofager. Representative data for transfeksjoner med 200 ng mRNA for 6 timer vises. (B, C) Transfeksjoner rater på (B) pm og (C) BMDM ble bestemt ved å analysere prosentandelen levedyktige eGFP celler ved Flow flowcytometri (n = 5-7 og n = 4-5 uavhengige eksperimenter, henholdsvis). (D-G) Expression nivåer av eGFP ble bestemt ved å analysere gjennomsnittlig fluorescens intensitet (MFI) av levedyktige (D) pm og (F) BMDM og av levedyktig og EGFP pasientpopulasjonen av (E) pm og (G) BMDM (n = 5-7 og n = 4-5 uavhengige eksperimenter, henholdsvis). 10 000 celler telles per prøve. Data vises som gjennomsnittet ± SEM. n.s. = ikke signifikant; * P < 0,05, * * p < 0,01, * * * p < 0,001 og * * * * p < 0,0001 av student t-test. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7: transfeksjoner ikke indusere lytisk eller apoptotisk celle død. Transfeksjoner-indusert celle død (A) pm og (B) BMDM ble bestemt ved å analysere prosentandelen av PI-positive og annexin V-positive celler (n = 5-7 og n = 4-5 uavhengige eksperimenter, henholdsvis). Andelen døde makrofager til stede i untransfected prøver (en viss grad av celle død ble forårsaket av fysisk avløsning av makrofager fra brønnene til tross for bruk av ikke-behandlede plater) ble trukket fra at i de respektive transfekterte prøvene å bare ta hensyn til celle død indusert av transfeksjoner prosedyren. Den gating strategien som brukes til å definere populasjoner av PI+, annexin v+ og pi+/annexin V+ makrofager er vist for en representativ datasett med PM transfekterte med 200 ng mRNA for 6 h vises. Staurosporine (50 μM for 1 time) ble brukt som positiv kontroll. 10 000 celler telles per prøve. Data vises som gjennomsnittet ± SEM. n.d. = ikke synlig. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 8
Figur 8: transfeksjoner priser ved hjelp av mRNA-koding for Nemo-og ikk-konstruksjoner. Transfeksjoner priser ved hjelp av mRNA-koding for (A) Nemo konstruksjoner og (B) ikk konstruksjoner ble kvantifisert av immunofluorescence mikroskopi (n = 4 uavhengige eksperimenter). Scale bar = 4 μm. data vises som gjennomsnittet ± SEM. n.t. = ikke transfekterte, n.s. = ikke signifikant; * P < 0,05, * * p < 0,01, * * * p < 0,001 og * * * * p < 0,0001 av student t-test. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 9
Figur 9: Transfeksjoner av Nemofl/fl BMDM med MRNA-koding for grobunn recombinase resulterer i nesten fullstendig mangel for Nemo. BMDM fra Nemofl/fl mus ble transfekterte med mRNA koding grobunn recombinase for 48 h. mangel på Nemo protein som følge av grobunn-mediert knockout ble vurdert av Western Blot ved hjelp av spesifikke antistoffer gjenkjenne Nemo eller β-utgangen og kvantifisert av densitometri (n = 5 uavhengige eksperimenter). Data vises som gjennomsnittet ± SEM. * p < 0,05, * * p < 0,01, * * * p < 0,001 og * * * * p < 0,0001 av student t-test. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 10
Figur 10: transfeksjoner induserer ikke en proinflammatoriske respons. (A) pm og (B) BMDM ble transfekterte med MRNA koding for NemoWT eller NemoC54/347A. Som positiv kontroll ble makrofager infisert med Listeria monocytogenes ved et mangfold av infeksjoner på 1 eller stimulert med 5 μg/ml LPS eller Poly (I:C) for 5 h (PM) eller 24 h (BMDM). Sekresjon av IL-1 β, IL-6, og TNF i supernatanten ble kvantifisert av ELISA (n = 3 uavhengige eksperimenter). Data vises som gjennomsnittet ± SEM. n.t. = ikke transfekterte, n.d. = ikke synlig. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her presenterer vi en protokoll for svært effektiv transfeksjoner av vanligvis hard-til-transfect primære makrofager med in vitro skrives mRNA. Viktigere, transfeksjoner av makrofager bruker denne protokollen ikke induserer celle død eller aktivere proinflammatoriske signalering som indikerer at verken transfeksjoner reagens eller transfekterte mRNA er anerkjent som ikke-selv.

Kvaliteten på mRNA er av avgjørende betydning for vellykket transfeksjoner av makrofager som bruker denne protokollen. Derfor bør det utvises stor forsiktighet for at mRNA ikke kommer i kontakt med RNAses (for eksempel gjennom forurensede buffere eller hetteglass). Hvis du er i tvil, sjekk for mRNA degradering (for eksempel ved agarose gel elektroforese). Transfeksjoner rate og uttrykks nivå var allerede maksimalt ved 6 h etter transfeksjoner. Derfor er det mulig at protein av interesse uttrykkes på nivåer tilstrekkelig for analyse på tidligere tidspunkt poeng etter transfeksjoner. Vi har ikke testet dette, though. Videre kan transfecting større mengder mRNA ytterligere øke transfeksjoner rate og/eller uttrykks nivå. Imidlertid kan transfecting større mengder mRNA potensielt også føre til en viss grad av immunogenisitet eller til og med cytotoksisitet. Den komplette mangelen derav er en av de viktigste fordelene med denne protokollen. Således, hvis større mengder av mRNA skal transfekterte, immunogenisitet og cytotoksisitet må vurderes nøye.

Expression nivå klart korrelert med mengden av transfekterte mRNA. Likevel, re-uttrykk for NEMO i NEMO-mangelfull BMDM resulterte i lignende NEMO protein uttrykk som i wildtype BMDM16 indikerer at mRNA transfeksjoner bruker denne protokollen ikke fører til betydelige overuttrykte av protein av interesse. Dermed kan denne protokollen ikke være egnet for å studere konsekvensene av overuttrykte av protein av interesse. Vi heller vurdere dette en fordel, men som overuttrykte av et protein endrer ofte sin oppførsel.

Den viktigste begrensningen av mRNA transfeksjoner, generelt, er at det bare resulterer i forbigående uttrykk for protein av interesse (fordi mRNA generert og transfekterte bruker denne protokollen vil være gjenstand for normal omsetning). PM synes å uttrykke protein av interesse for en kortere periode i forhold til BMDM. Således, i motsetning til BMDM, PM bør ikke være transfekterte over natten. Hvor lenge en gitt protein av interesse vil bli uttrykt vil variere (som både stabiliteten i mRNA og at av proteinet vil variere). Vi anbefaler likevel å utføre eksperimentet av valget på samme dag som transfeksjoner. Hvis uttrykk for protein av interesse er nødvendig for lengre perioder av gangen, cellene sannsynligvis kan bli transfekterte flere ganger (f. eks, hver dag som beskrevet i18).

Vi har med hell brukt protokollen som er beskrevet her for å transfect murine PM og BMDM og mus embryonale fibroblaster (MEFs)16. I teorien kan mRNA generert ved hjelp av denne protokollen brukes til å transfect en gitt celle type av alle pattedyrarter. Den optimale mRNA transfeksjoner reagens og innhold av modifiserte nucleosides kan variere for andre celletyper, skjønt.

Lovende fremtidige modifikasjoner inkluderer inkludering av 5 '-og 3 '-UTRs. De fleste pre-eksisterende plasmider inneholder bare ACIS av protein av interesse, men ikke 5 '-og 3 '-UTRs. Deres inkludering (som beskrevet i19) kan ytterligere forsterke mRNA stabilitet og uttrykk. Også feste epitope koder til protein av interesse ved å inkludere sekvensen av epitope koden i fremover eller revers primer (for N-og C-terminal epitope merking, henholdsvis), bør være mulig.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 670).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5-methyl-CTP (100 mM) Jena Biosience NU-1138S stored at -20 °C
Antarctic phosphatase New England BioLabs M0289 stored at -20 °C
Antarctic phosphatase reaction buffer (10x) New England BioLabs B0289 stored at -20 °C
anti-NEMO/IKKγ antibody Invitrogen MA1-41046 stored at -20 °C
anti-β-actin antibody Sigma-Aldrich A2228 stored at -20 °C
Petri dishes 92,16 mm with cams Sarstedt 821,473 stored at RT
CD11b Microbeads mouse and human Miltenyi Biotec 130-049-601 stored at 4 °C
Cre recombinase + T7-Promotor forward primer Sigma-Aldrich 5′-GAAATTAATACGACTCACTATA
GGGGCAGCCGCCACCATGTCC
AATTTACTGACCGTAC-3´, stored at -20 °C
Cre recombinase + T7-Promotor reverse primer Sigma-Aldrich 5′-CTAATCGCCATCTTCCAGCAGG
C-3′, stored at -20 °C
DNA purification kit: QIAquick PCR purification Kit Qiagen 28104 stored at RT
eGFP + T7-Promotor forward primer Sigma-Aldrich 5´-GAAATTAATACGACTCACTATA
GGGATCCATCGCCACCATGGTG
AGCAAGG-3´, stored at -20 °C
eGFP + T7-Promotor reverse primer Sigma-Aldrich 5´-TGGTATGGCTGATTA
TGATCTAGAGTCG-3´, stored at -20 °C
Fast Digest buffer (10x) Thermo Scientific B64 stored at -20 °C
FastDigest XbaI Thermo Scientific FD0684 stored at -20 °C
High-fidelity polymerase with proofreading: Q5 High-Fidelity DNA-Polymerase New England Biolabs Inc M0491S stored at -20 °C
IKKβ + T7-Promotor forward primer Sigma-Aldrich 5′-GAAATTAATACGACTCACTATA
GGGTTGATCTACCATGGACTACA
AAGACG-3′, stored at -20 °C
IKKβ + T7-Promotor reverse primer Sigma-Aldrich 5′-GAGGAAGCGAGAGCT-CCATCTG-3′, stored at -20 °C
In vitro mRNA transcription kit: HiScribe T7 ARCA mRNA kit (with polyA tailing) New England BioLabs E2060 stored at -20 °C
LS Columns Miltenyi Biotec 130-042-401 stored at RT
MACS MultiStand Miltenyi Biotec 130-042-303 stored at RT
mRNA transfection buffer and reagent: jetMESSENGER Polyplus transfection 409-0001DE stored at 4 °C
Mutant IKKβ IKK-2S177/181E plasmid Addgene 11105 stored at -20 °C
Mutant NEMOC54/347A plasmid Addgene 27268 stored at -20 °C
pEGFP-N3 plasmid Addgene 62043 stored at -20 °C
poly(I:C) Calbiochem 528906 stored at -20 °C
pPGK-Cre plasmid F.T. Wunderlich, H. Wildner, K. Rajewsky, F. Edenhofer, New variants of inducible Cre recombinase: A novel mutant of Cre-PR fusion protein exhibits enhanced sensitivity and an expanded range of inducibility. Nucleic Acids Res. 29, 47e (2001). stored at -20 °C
pseudo-UTP (100 mM) Jena Biosience NU-1139S stored at -20 °C
QuadroMACS Separator Miltenyi Biotec 130-090-976 stored at RT
Rat-anti-mouse CD11b antibody, APC-conjugated BioLegend 101212 stored at 4 °C
Rat-anti-mouse F4/80 antibody, PE-conjugated eBioscience 12-4801-82 stored at 4 °C
Recombinant M-CSF Peprotech 315-02 stored at -20 °C
RNA purification kit: MEGAclear transcription clean-up kit ThermoFisher Scientific AM1908 stored at 4 °C
RNAse-degrading surfactant: RnaseZAP Sigma-Aldrich R2020 stored at RT
Ultrapure LPS from E.coli O111:B4 Invivogen stored at -20 °C
Wild type IKKβ plasmid Addgene 11103 stored at -20 °C
Wild type NEMO plasmid Addgene 27268 stored at -20 °C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ley, K., Pramod, A. B., Croft, M., Ravichandran, K. S., Ting, J. P. How Mouse Macrophages Sense What Is Going On. Frontiers in Immunology. 7 (204), (2016).
  2. Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. The expression of exogenous genes in macrophages: obstacles and opportunities. Methods in Molecular Biolology. 531, 123-143 (2009).
  3. Guo, X., et al. Transfection reagent Lipofectamine triggers type I interferon signaling activation in macrophages. Immunology and cell biology. 97 (1), 92-96 (2019).
  4. Kariko, K., Weissman, D. Naturally occurring nucleoside modifications suppress the immunostimulatory activity of RNA: implication for therapeutic RNA development. Current Opinion in Drug Discovery and Development. 10 (5), 523-532 (2007).
  5. Van De Parre, T. J., Martinet, W., Schrijvers, D. M., Herman, A. G., De Meyer, G. R. mRNA but not plasmid DNA is efficiently transfected in murine J774A.1 macrophages. Biochemical and biophysical research communications. 327 (1), 356-360 (2005).
  6. Uchida, S., Kataoka, K., Itaka, K. Screening of mRNA Chemical Modification to Maximize Protein Expression with Reduced Immunogenicity. Pharmaceutics. 7 (3), 137-151 (2015).
  7. Kariko, K., et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA yields superior nonimmunogenic vector with increased translational capacity and biological stability. Molecular Therapy. 16 (11), 1833-1840 (2008).
  8. Khantakova, J. N., et al. Transfection of bone marrow derived cells with immunoregulatory proteins. Cytokine. 108, 82-88 (2018).
  9. Franz, K. M., Kagan, J. C. Innate Immune Receptors as Competitive Determinants of Cell Fate. Molecular Cell. 66 (6), 750-760 (2017).
  10. Kaestner, L., Scholz, A., Lipp, P. Conceptual and technical aspects of transfection and gene delivery. Bioorganic & medicinal chemistry letters. 25 (6), 1171-1176 (2015).
  11. Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).
  12. Kormann, M. S., et al. Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice. Nature Biotechnology. 29 (2), 154-157 (2011).
  13. Kariko, K., Buckstein, M., Ni, H., Weissman, D. Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors: the impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA. Immunity. 23 (2), 165-175 (2005).
  14. Hornung, V., et al. 5'-Triphosphate RNA is the ligand for RIG-I. Science. 314 (5801), 994-997 (2006).
  15. Pichlmair, A., et al. RIG-I-mediated antiviral responses to single-stranded RNA bearing 5'-phosphates. Science. 314 (5801), 997-1001 (2006).
  16. Herb, M., et al. Mitochondrial reactive oxygen species enable proinflammatory signaling through disulfide linkage of NEMO. Science Signaling. 12 (568), (2019).
  17. Schmidt-Supprian, M., et al. NEMO/IKK gamma-deficient mice model incontinentia pigmenti. Molecular Cell. 5 (6), 981-992 (2000).
  18. Mandal, P. K., Rossi, D. J. Reprogramming human fibroblasts to pluripotency using modified mRNA. Nature Protocols. 8 (3), 568-582 (2013).
  19. Oh, S., Kessler, J. A. Design, Assembly, Production, and Transfection of Synthetic Modified mRNA. Methods. 133, San Diego, CA. 29-43 (2018).

Tags

Immunologi og infeksjon primær makrofager bukhulen makrofager benmarg-avledet makrofager immunceller in vitro transkripsjon mRNA transfeksjoner
Svært effektiv Transfeksjoner av primær makrofager med in vitro skrives mRNA
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Herb, M., Farid, A., Gluschko, A.,More

Herb, M., Farid, A., Gluschko, A., Krönke, M., Schramm, M. Highly Efficient Transfection of Primary Macrophages with In Vitro Transcribed mRNA. J. Vis. Exp. (153), e60143, doi:10.3791/60143 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter