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Immunology and Infection

Transfecção altamente eficiente de macrófagos primários com mRNA Transcrito in vitro

Published: November 9, 2019 doi: 10.3791/60143
Automatic Translation
1, 1, 1, 1,2,3,4, 1
1Institute for Medical Microbiology, Immunology and Hygiene, Faculty of Medicine and University Hospital Cologne, University of Cologne, 2Center for Molecular Medicine Cologne, 3Cologne Cluster of Excellence on Cellular Stress Responses in Aging-associated Diseases (CECAD), 4German Center for Infection Research (DZIF)

Summary

Macrófagos, especialmente macrófagos primários, são um desafio para transfect como eles se especializam na detecção de moléculas de não-origem auto. Descrevemos um protocolo que permite a transfecção altamente eficiente de macrófagos primários com mRNA gerado a partir de modelos de DNA, como plasmídeos.

Abstract

Macrófagos são células fagocíticas especializadas na detecção de moléculas de origem não-auto. Para este fim, eles estão equipados com uma grande variedade de receptores de reconhecimento de padrões (PRRs). Infelizmente, isso também torna os macrófagos particularmente desafiadores para transfect como o reagente de transfecção e os ácidos nucleicos transinfectados são muitas vezes reconhecidos pelas PRRs como não-auto. Portanto, a transfecção muitas vezes resulta em ativação de macrófagos e degradação dos ácidos nucleicos transinfectados ou mesmo no suicídio dos macrófagos. Aqui, descrevemos um protocolo que permite a transfecção altamente eficiente de macrófagos primários de urina, como macrófagos peritoneal (PM) e macrófagos derivados de medula óssea (BMDM) com mRNA in vitro transcrito de modelos de DNA, como plasmídeos. Com esse protocolo simples, as taxas de transfecção de cerca de 50-65% para PM e cerca de 85% para BMDM são alcançadas sem citotoxicidade ou imunogenicidade observada. Descrevemos em detalhes a geração de mRNA para transfecção a partir de construções de DNA, como plasmídeos e o procedimento de transfecção.

Introduction

Macrófagos são células fagocíticas especializadas na detecção, ingestão e degradação de micróbios, células apoptóticas e detritos celulares. Além disso, eles ajudam a orquestrar as respostas imunes, secretando citocinas e quimiocinas e apresentando antígenos às células T e células B. Macrófagos também desempenham papéis importantes em inúmeros outros processos, como cicatrização de feridas, aterosclerose, tumorigênese e obesidade.

Para ser capaz de detectar moléculas não-auto, como padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs) e moléculas fora do local, como padrões moleculares associados a danos (DAMPs), macrófagos são equipados com uma grande variedade de receptores de reconhecimento de padrões (PRR)1. Infelizmente, isso também torna os macrófagos particularmente desafiadores para transfect2 como o reagente de transfecção3 e os ácidos nucleicos transinfectados4,5,6,7 muitas vezes são reconhecidos pelas PRRs como não-auto. Por esta razão, a transfecção de macrófagos usando métodos químicos ou físicos8 geralmente resulta em ativação de macrófagos e degradação dos ácidos nucleicos transinfectados ou mesmo no suicídio de macrófagos via piroptose, uma forma de morte programada de células líticas desencadeada após o reconhecimento de PAMPs citosólicos/ DAMPs como DNA ouRNA9 estrangeiros . Transfecção biológica de macrófagos usando vírus como adenovírus ou lentivírus como vetores é muitas vezes mais eficiente, mas a construção de tais vetores virais é demorado e requer biossegurança nível 2 equipamento10,11.

Assim, embora os macrófagos sejam objeto de intensa pesquisa, a análise de suas funções no nível molecular é dificultada porque uma das ferramentas mais importantes da biologia molecular, a transfecção de construções de ácido nucleico para expressão exógena de proteínas, não é aplicável. Isso muitas vezes força os pesquisadores a usar linhas celulares semelhantes a macrófagos semelhantes a macrófagos de macrófagos de boa-fé. As aplicações para a transfecção de construção de ácido nucleico incluem expressão de versões proteicas mutadas ou marcadas, superexpressão de uma proteína específica, reexpressão proteica em um respectivo contexto nocaute e expressão de proteínas de outras espécies (por exemplo. , Cre recombinando ou guia RNA e Cas9 para nocaute genético alvo).

Aqui, descrevemos um protocolo que permite a transfecção altamente eficiente de macrófagos primários (geralmente difíceis de transfect), que são macrófagos peritoneal murine (PM) e macrófagos derivados de medula óssea (BMDM) com mRNA geradoa a partir de modelos de DNA, como plasmídeos. Importante, o mRNA transcrito in vitro gerado usando este protocolo contém os nucleosídeos modificados naturais 5-metil-CTPe pseudo-UTP que reduzem a imunogenicidade e aumentam a estabilidade4,6,7,12, 12. Além disso, as extremidades de 5 do mRNA transcrita in vitro são desfosforilado pela fosfatase antártica para evitar o reconhecimento pelo complexo RIG-I14,15. Isso minimiza o reconhecimento imunológico inato do mRNA transcrito in vitro. Com nosso protocolo fácil de executar, as taxas de transfecção entre 50-65% (macrófagos peritoneal (PM)) e 85% (BMDM) são alcançadas enquanto, importante, não há citotoxicidade ou imunogenicidade observada. Descrevemos em detalhes (i) como o mRNA imunologicamente silenciado para transfecção pode ser gerado a partir de construções de DNA, como plasmídeos e (ii) o próprio procedimento de transfecção.

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Protocol

O isolamento de macrófagos de camundongos foi realizado de acordo com a Lei de Proteção animal da Alemanha, em conformidade com o Comitê de Ética da Universidade de Colônia.

Nota: Realizar todas as etapas usando luvas. Realize todas as etapas de transfecção um capô de fluxo laminar para evitar a contaminação das células. Antes de trabalhar com mRNA, limpe todos os instrumentos, como pipetas e cada superfície com 70% de etanol e/ou um surfactante rnase-degradante(Tabela de Materiais). Certifique-se de que todos os tubos de reação são livres de RNAse e estéreis. Use apenas água estéril, livre de RNAase para diluições. Use exclusivamente dicas de pipeta com filtros. Mude as pontas da pipeta após cada passo de tubulação.

1. Geração do modelo de DNA

Nota: O modelo de DNA para transcrição in vitro mRNA usando este protocolo deve conter uma seqüência promotor T7 para permitir a atracação da polimerase RNA. Se o plasmídeo contendo a seqüência de DNA da proteína de interesse já contém uma sequência de promotor T7 corretamente orientada diretamente a montante da seqüência de interesse, a linearização do plasmídeo (ver passo 1.1.) precisa ser realizada. Caso contrário, anexar um Promotor T7 para a seqüência de interesse por reação em cadeia polimerase (PCR, ver passo 1.2.).

  1. Linearização dos plasmídeos contendo T7 promotor
    1. Linearize plasmids já contendo uma seqüência corretamente orientada T7 promotor por digestão com uma enzima de restrição corte a jusante do codon parada da seqüência de interesse. Caso contrário, a transcrição não terminará corretamente após a seqüência de interesse.
      Nota: É melhor usar enzimas de restrição deixando pontas contundentes ou 5' saliências.
    2. Confirme a linearização completa do plasmídeo por eletroforese de gel agarose de DNA plasmídeo não digerido versus digerido.
    3. Purify linearizado plasmid DNA antes de usar como modelo de DNA para transcrição in vitro mRNA usando um kit de purificação de DNA(Tabela de Materiais).
  2. Anexo do Promotor T7 por PCR
    1. Use uma cartilha para a frente contendo os seguintes componentes (na ordem indicada de 5 a 3'): cerca de 5 bp aleatório a montante do promotor (por exemplo, GAAAT); a sequência do Promotor T7 (TAATACGACTCACTATAG); dois Gs extras para maior eficiência de transcrição (GG); a parte específica da sequência de alvos que é homóloga para a sequência plasmídea em torno do codon inicial.
      Nota: Deve ser composto de: 3-6 bp a montante da seqüência KOZAK e começar codon, a seqüência KOZAK e começar codon (geralmente GCCACC ATG G), 12-18 bp a jusante do codon início. Se a seqüência de interesse ainda não contém uma seqüência KOZAK ou iniciar codon, estes podem ser anexados nesta etapa, simplesmente incluí-los na seqüência primer.
    2. Calcule o tm da cartilha para a frente apenas levando em conta a parte homologous à sequência de destino.
    3. Para avaliar dimers / formação hairpin usar toda a seqüência primer, que facilmente pode exceder 50 bp.
    4. Use uma cartilha reversa localizada em algum lugar a jusante do codon da parada.
      Nota: Se a seqüência de interesse já não contém um codon stop, ele pode ser anexado nesta etapa, simplesmente incluí-lo na seqüência primer.
    5. Use as cartilhas para a frente e reversa para realizar um PCR usando uma polimerização de alta fidelidade com revisão(Tabela de Materiais).
    6. Confirme a geração de um único produto e tamanho amplicon por eletroforese de gel agarose (por exemplo, use um gel agarose de 1% e uma corrente constante de 100 V).
    7. Purifique o produto PCR antes de usar como modelo de DNA para transcrição in vitro mRNA usando um kit de purificação de DNA.

2. geração mRNA

  1. Descongele todos os componentes do kit de transcrição in vitro mRNA (veja a Tabela de Materiais). Vortex para 5 s e girar para baixo para 2 s em 2.000 x g. Mantenha o gelo até usar.
  2. Prepare a mistura de reação para transcrição in vitro mRNA em um tubo de microcentrífuga de 0,5 mL na ordem seguinte (volume total de 40 μL): 20 μL de 10x ARCA/NTP mix (incluído no kit de transcrição in vitro mRNA); 0,25 μL de 5-metil-CTP (concentração final (f.c.) é de 1,25 mM; 50% do ctp total); 0,25 μL de pseudo-UTP (f.c. é de 1,25 mM; 50% do total utp); X μL de modelo de DNA; 2 μL de mistura de polimerase T7 RNA (incluída no kit de transcrição in vitro mRNA); Y μL de RNAse-livre H2O.
    Nota: X é um volume contendo pelo menos 1 μg de DNA. Por exemplo, 1,6 μL de uma solução de ações de 625 ng/μL. Y é o volume de reposição para o volume total de 40 μL.
  3. Vortex para 5 s e girar para baixo para 2 s em 2.000 x g. Incubar a 37 °C por 30 min a 400 rpm em uma batedeira térmica para transcrição in vitro.
  4. Em seguida, adicione 2 μL de DNase eu diretamente na mistura de reação para a remoção do DNA modelo. Vortex para 5 s e girar para baixo para 2 s em 2.000 x g.
  5. Incubar a 37 °C por 15 min a 400 rpm em uma batedeira térmica. Pegue um alibamento de 2 μL para o gel de controle (passo 3.3) e guarde a -80 °C.
  6. Para o rejeito poli (A), adicione os seguintes componentes diretamente na mistura de reação anterior (a um volume final de 50 μL): 5 μL de 10x poli (A) buffer de reação polimerase e 5 μL de poli (A) polimerase (ambos incluídos no kit de transcrição in vitro mRNA). Vortex para 5 s e girar para baixo para 2 s em 2.000 x g.
  7. Incubar a mistura em 37 °C para 30 min em 400 rpm em um thermomixer. Pegue um alibamento de 2 μL para o gel de controle (passo 3.3) e guarde a -80 °C.
  8. Para a desfosforisfolação das 5 ́-extremidades do mRNA, adicione os seguintes componentes diretamente no mix de reação anterior (a um volume final de 60 μL): 3 μL de H2O livre de RNAse; 6 μL de 10x tampão de reação de fósforo antártico; 3 μL de fósforo antártico (15 unidades para 60 μL volume de reação). Vortex para 5 s e girar para baixo para 2 s em 2.000 x g.
  9. Incubar a mistura em 37 °C para 30 min em 400 rpm em um misturador térmico.
  10. Fósforo antártico inativa calor por incubação a 80 °C por 2 min.
    Nota: Idealmente, use uma batedeira térmica separada, não espere até que o primeiro misturador atinja a temperatura desejada.

3. purificação mRNA

  1. Purifique o mRNA transcrito in vitro usando um kit de purificação de RNA dedicado(Tabela de Materiais).
    1. Adicionar X μL de solução de elução para a mistura de reação mRNA do passo 2.10. Misture invertendo 5 vezes. Adicione 300 μL de concentrado de solução de ligação. Misture por pipetting suave 5 vezes.
      Nota: X é o volume de reposição a um volume total de 100 μL. Por exemplo, adicione a solução de elução de 40 μL ao mix de reação de 60 μL mRNA.
    2. Adicione 100 μL de etanol rnaase-livre. Misture por pipetting suave 5 vezes.
    3. Coloque uma coluna de filtro em um dos tubos de coleta fornecidos. Transfira a mistura de reação mRNA suavemente para o centro do filtro sem tocar no filtro. Centrífuga a 15.000 x g por 1 min à temperatura ambiente (RT).
    4. Levante cuidadosamente a coluna do filtro e descarte o fluxo no tubo de coleta. Coloque a coluna de filtro de volta para o mesmo tubo de coleta.
    5. Adicione 500 μL de solução de lavagem (não se esqueça de adicionar 20 mL de etanol rnaase-livre antes de usar a solução de lavagem pela primeira vez).
    6. Centrífuga em 15.000 x g para 1 min em RT. Repita etapas 3.1.4-3.1.6 para lavar mais uma vez.
    7. Centrífuga a toda velocidade (17.900 x g)por 1 min na RT para remover qualquer fluido residual da coluna de filtro. Retire cuidadosamente a coluna de filtro do tubo de coleta. Coloque a coluna de filtro em um novo tubo de coleta.
    8. Adicione 50 μL de tampão de elução no centro do filtro sem tocar no filtro. Incubar a 65 °C por 10 min em uma batedeira térmica.
    9. Centrífuga a 15.000 x g por 1 min na RT. Retire a coluna de filtro e descarte-a.
  2. Medir a concentração e pureza do mRNA eluted, por exemplo, usando um espectrômetro de microvolume para medir a absorção em 260 e 280 nm.
    Nota: Uma relação A260/A280 de 1,8-2,1 é indicativa de mRNA altamente purificado.
  3. Verifique a presença de um único produto, comprimento correto da transcrição e poli (A) que segue analisando os aliquots das etapas 2.5 e 2.7 pela eleforese do gel do agarose circunstâncias de denaturing (por exemplo, use um gel de agarose de 1.2% que contem 20 mM 3-(N-morpholino) ácido propanesulfonic [MOPS], acetato de sódio de 5 mM, 1 mM EDTA e 20% formaldeído e executado em 20 mM MOPS, 5 mM acetato de sódio, 1 mEDTA e 0,74 % formaldeído em 100 V corrente constante).
  4. Guarde o mRNA purificado no tubo de elução a -80 °C até a transfecção. Se usar apenas quantidades baixas do mRNA para transfecção, em seguida, abitar o mRNA para evitar ciclos repetidos de congelamento-degelo.
    NOTA: mRNA pode ser armazenado a -80 °C por cerca de 1 ano.

4. Preparação de macrófagos

  1. Eutanásia c57/bl6 camundongos (uso de ratos do mesmo sexo e de 6-24 semanas de idade) por luxação cervical.
    Nota: Os mesmos camundongos podem ser usados para isolamento de PM (passo 4.2) e geração de BMDM (etapas 4.3 e 4.4). Para o isolamento da PM usar pelo menos dois ratos. Se somente BMDM deve ser gerado um rato é geralmente bastante.
  2. Enriquecimento imunológico de macrófagos peritoneal.
    1. Encha uma seringa de 10 mL com uma cânula de 0,9 x 40 mm com 8 mL de solhafilógico gelado (PBS) e 2 mL de ar. Lave a cavidade peritoneal com PBS. O ar formará uma bolha que minimiza o vazamento da PBS.
    2. Coletar rapidamente a lavagem peritoneal com a mesma seringa e transferir para um tubo de centrifugação cônica de 50 mL. Combine células peritoneal de vários ratos, se necessário. Mantenha a suspensão celular no gelo.
    3. Suspensão celular centrífuga a 650 x g por 5 min a 4 °C. Descarte o supernatant e resuspenda a pelota da pilha em 5 mL de 0.2% NaCl para 30 s para lyse glóbulos vermelhos.
    4. Adicionar 5 mL de 1,6% NaCl a um volume total de 10 mL para reconstituir condições isotônicas. Centrífuga a 650 x g por 5 min a 4 °C.
    5. Descarte o ácido supernatant e resuspenda a pelota celular em 97,5 μL de tampão de classificação de células magnéticas (MCS) (2 mM de etilediaminatetraacetic ácido [EDTA], 5% albumina de soro bovina [BSA] em PBS) por 1 lavage peritoneal (por exemplo, se três camundongos foram liberados, resuspendem em 292,5 μL ).
    6. Adicione 2,5 μL de contas paramagnéticas conjugadas a um anticorpo específico do CD11b por 97,5 μL de suspensão celular (por exemplo, adicione 7,5 μL a 292,5 μL).
    7. Incubar no gelo por 15 min em 150 rpm em um shaker orbital.
    8. Suspensão de célulacentrífuga a 650 x g por 5 min a 4 °C, descartar o supernatant e resuspender a pelota de célula em 1 mL de buffer MCS.
    9. Adicione 4 mL de tampão MCS a um volume total de 5 mL e lave as células suavemente tubulação para cima e para baixo três vezes.
    10. Repita os passos 4.2.8 e 4.2.9 duas vezes mais para um total de três etapas da lavagem.
    11. Durante a lavagem, coloque uma coluna ls em um separador de células magnéticas (ver Tabela de Materiais). Lave a coluna com 3 mL de tampão MCS.
      Nota: Evite quaisquer bolhas, pois estas podem entupir a coluna.
    12. Resuspenda a pelota de célula em 1 mL de buffer MCS. Adicione 3 mL de buffer MCS para um volume total de 4 mL, misture por pipetting cima e para baixo três vezes.
    13. Transfira os 4 mL de suspensão celular para a coluna LS enxaguada.
      Nota: Mais uma vez, evitar quaisquer bolhas como estes podem entupir a coluna.
    14. Espere até que o reservatório da coluna esteja completamente vazio. Não adicione líquido adicional até que a coluna pare de pingar.
    15. Adicione 3 mL de buffer MCS na coluna. Em seguida, espere até que o reservatório da coluna esteja completamente vazio. Repita o passo 4.2.15 mais duas vezes.
    16. Coloque a coluna LS em um tubo de centrifugação cônica de 15 mL. Aplique 5 mL de buffer MCS na coluna. Espere até 2 mL de fluido passou pela coluna, em seguida, usar o desentupidor para empurrar suavemente a fração restante para o tubo.
    17. Suspensão de célulacentrífuga a 650 x g por 5 min a 4 °C e descartar o supernatant.
    18. Resuspende a pelota celular em 1 mL de DMEM complementada com 10% de soro de vitela fetal inativado de calor (FCS) (DMEM+FCS).
    19. Determine o número de células viáveis contando em solução azul trypan em uma câmara de contagem neubauer e células de sementes em DMEM +FCS em placas de cultura.
      Nota: Semente PM em uma densidade de 100.000 pilhas/bem em uma placa inferior plana do microtiter. Não use placas tratadas com cultura de tecido, pois a PM não pode ser separada delas. Em vez disso, use placas não tratadas.
  3. Geração de BMDM
    1. Retire a pele e os músculos das patas traseiras usando um par de tesouras. Lave cada perna por submersão curta em 70% de etanol.
    2. As pernas desaparam e abrem as duas extremidades do fêmur e da tíbia cortando com tesoura.
    3. Encha uma seringa de 5 mL cheia com uma cânula de 0,6 mm x 30 mm com 5 mL de endotoxina muito baixa (VLE) RPMI 1640 e jogue a medula óssea para fora dos ossos abertos em um prato de cultura.
    4. Combine a medula óssea de vários camundongos, se necessário, repetindo etapas 4.3.1-4.3.3. Transfira a medula óssea para um tubo de centrifugação cônica de 50 mL.
    5. Centrífuga a suspensão da medula óssea em 650 x g para 5 min a 4 °C e descartar o supernatant.
    6. Resuspenda a pelota celular em 5 mL de tampão de lyse de células vermelhas do sangue (8,3% NH4Cl, 0,1 M Tris) e incubar por 5 min em RT para lyse os glóbulos vermelhos.
    7. Centrífuga a suspensão celular a 650 x g a 4° C por 5 min e descartar o supernatant.
    8. Resuspenda a pelota celular em 1 mL de VLE RPMI 1640 médio complementado com 10% FCS, 1% penicilina/estreptomicina, 1% HEPES, 1% de piruvate de sódio e fator de estímulo de colônia de macrófagos recombinante de 10 ng/mL (M-CSF) (RPMI++++).
    9. Adicione 4 mL de RPMI+++++ a um volume total de 5 mL.
    10. Prepare 5 92 mm x 16 mm pratos de Petri não tratados com cams (veja a Mesa de Materiais)por mouse, canalizando 7 mL de RPMI++++ médio em cada prato.
    11. Transfira a solução de 1 mL de célula para os 5 pratos de cultura preparados e incubar a 37 °C e 5% CO2.
    12. Após 4 dias, alimente as células adicionando 4 mL de RPMI+++++. Após 6-7 dias, as células da medula óssea são totalmente diferenciadas em BMDM.
  4. Colheita de BMDM
    1. Retire completamente o meio dos pratos de cultura. Adicione 5 mL de 0,2 m MM EDTA quente em PBS para cada prato.
    2. Raspe suavemente a placa inteira com um raspador de células para separar o BMDM. Combine as suspensões celulares em um tubo de centrifugação cônica de 50 mL.
    3. Lave todos os 5 pratos novamente. Use o mesmo volume de 5 mL de 0,2 mM EDTA quente em PBS para todos os 5 pratos. Combine esta suspensão celular com a da etapa anterior.
    4. Centrífuga a suspensão celular em 650 x g para 5 min a 4° C e descartar o supernatant.
    5. Resuspender a pelota celular em 1 mL de VLE RPMI 1640 médio complementado com 10% FCS, 1% HEPES, 1% piruvato de sódio e 10 ng/mL recombinante M-CSF, mas sem antibióticos (RPMI++++).
    6. Determine o número de células viáveis contando em solução azul trypan em uma câmara de contagem neubauer e células de sementes em RPMI++++ em placas de cultura.
      Nota: Bmdm semente em uma densidade de 50.000 pilhas/bem máximo em uma placa inferior plana do microtiter. Não use placas cultura-tratadas do tecido porque BMDM pode mal ser destacado destes. Em vez disso, use placas não tratadas.

5. Transfecção de Macrófagos com mRNA

  1. Calcule o volume necessário de buffer de transfecção mRNA.
    Nota: O volume de buffer de transfecção mRNA necessário depende do tamanho do poço: use 200 μL para transfecção em uma placa de 6 poços, 100 μL em uma placa de 12 poços e assim por diante. Adicione sempre um pouco de volume de reposição por causa da perda de pipetting (mas não demasiado, para impedir a diluição imprópria do mRNA). Por exemplo, use 450 μL em vez de 4 x 100 μL = 400 μL para transfect em 4 poços de uma placa de 12 poços.
  2. Calcule o volume necessário de reagente de transfecção mRNA. O reagente de transfecção mRNA é adicionado a uma proporção de 1:50. Por exemplo, 9 μL de reagente de transfecção mRNA é necessário para um volume final de 450 μL.
  3. Calcule a quantidade total de mRNA necessária. Pelo menos 100 ng por 100.000 macrófagos são necessários para transfecção eficiente, 200 ng funciona ainda melhor (por exemplo, 800 ng mRNA para transfect 400.000 macrófagos).
    1. Multiplique a quantidade calculada de mRNA necessária com o número total de poços que precisam ser transinfectados (por exemplo, 4 poços com 400.000 macrófagos cada: 4 x 800 ng = 3.200 ng mRNA é necessário no total para todos os poços). Por exemplo, se o seu estoque de mRNA é 426,8 ng/μL, 7,49 μL são necessários para a transfecção ideal de 4 poços com 400.000 macrófagos cada.
  4. Adicione o volume calculado de buffer de transfecção mRNA (passo 5.1.) menos os volumes para reagente de transfecção mRNA (passo 5.2) e o mRNA (passo 5.3) a um tubo de reação. Por exemplo, 450 μL - 9 μL - 7.49 μL = 433.51 μL.
  5. Descongele o estoque de mRNA e misture-o lançando suavemente do tubo de elução. Adicione o volume calculado de mRNA (passo 5.3) ao tubo de reação com buffer de reação mRNA (no exemplo apresentado acima: 7,49 μL em 433,51 μL).
  6. Vortex para 5 s e girar para baixo para 2 s em 2.000 x g.
  7. Vortex o reagente de transfecção mRNA para 5 s e girar para baixo para 2 s em 2.000 x g.
  8. Adicione o volume calculado de reagente de transfecção mRNA (passo 5.2) ao tubo de reação contendo o buffer de transfecção mRNA e o mRNA (no exemplo apresentado acima: 9 μL de reagente de transfecção mRNA).
  9. Vortex a mistura de transfecção para 5 s e girar para baixo para 2 s em 2.000 x g.
  10. Incubar por 15 min em RT.
  11. Enquanto isso, substitua o meio cultural dos macrófagos por um meio de cultura fresco e quente (ver etapas 4.2.18. e 4.4.5).
  12. Após a etapa de incubação 5.10, adicione a mistura de transfecção aos poços que contêm os macrófagos em um volume apropriado para o tamanho do poço (ver passo 5.1). Adicione a mistura de transfecção dropwise em um círculo de fora para o meio do poço.
  13. Balance suavemente a placa, primeiro em uma vertical e depois em uma direção horizontal para garantir a distribuição uniforme da mistura de transfecção no poço. Em seguida, incubar a 37 °C e 5 % CO2. A síntese da proteína codificada pelo mRNA transinfectado começará logo após a transfecção. Para obter melhores resultados, incubar pelo menos 6 h.
  14. Após a incubação, analise a eficiência da transfecção por microscopia (imuno)fluorescência, citometria de fluxo ou imunoblota16,ou use os macrófagos transinfectados para o experimento de escolha.

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Representative Results

Usamos com sucesso este protocolo para gerar codificação de mRNA para variantes NEMO e IKKβ marcadas pela BANDEIRA para transfecção de macrófagos primários16. Os plasmídeos codificando para o tipo selvagem marcado pela BANDEIRA (NEMOWT)e o mutante C54/347A NEMO (NEMOC54/374A)(ver a Tabela de Materiais)já contêm um promotor T7 na orientação correta (Figura 1A). Assim, só tivemos que linearizar os plasmídeos para gerar modelos de DNA para transcrição in vitro. Para este fim, 10 μg de DNA plasmídeo foram digeridos com 5 μL Xbal resultando em linearização do plasmídeo devido a um único corte de 3' do codon stop. A linearização completa do DNA plasmídeo foi verificada pela eletroforese de gel agarose(Figura 1B).

Os plasmídeos codificando para o tipo selvagem marcado pela FLAG (IKKβWT)e o mutante IkKβ (IKKβS177/181E)não contêm um promotor T7. Portanto, anexamos um promotor T7 por PCR para gerar os modelos de DNA para transcrição in vitro (Figura 2A). A geração de um produto específico pcr, ou seja, um único produto de tamanho correto, foi verificada por eletroforese de gel agarose (Figura 2B).

Após a transcrição in vitro usando os respectivos modelos de DNA, verificamos a geração de um único produto mRNA de tamanho correto e rejeito poli (A) por eletroforese de gel agarose em condições de desinturação (Figura 3).

Para verificar se o mRNA gerado por meio desse protocolo permite a transfecção de macrófagos primários (ver Figura 4A,B para análises citométricas de fluxo de enriquecimento imunológico da PM e status de diferenciação do BMDM), geramos codificação de mRNA para eGFP (Figura 5A-C)e analisamos a eficiência da transfecção pela citometria fluída(Figura 6A). 100.000 PM ou 50.000 BMDM por poço de uma placa de microtiter não tratada foram transfected com 50, 100 ou 200 ng do mRNA do eGFP para 6, 9 ou 24 h. Tanto na PM quanto no BMDM, altos níveis de expressão do eGFP puderam ser detectados às 6 h após a transfecção. A taxa de transfecção aumentou com a quantidade de mRNA transinfectado e foi maior para 200 ng mRNA (Figura 6B,C). Para a PM, a taxa de transfecção atingiu cerca de 50-65% a 6 a 9 h após a transfecção(Figura 6B). Às 24 h após a transfecção, a taxa de transfecção foi substancialmente menor, indicando a expressão do eGFP expirando. Assim, pm não deve ser transfected durante a noite. Para bmdm, taxa de transfecção atingiu cerca de 80-85%(Figura 6C). A queda na taxa de transfecção após 24 h foi muito menos pronunciada no BMDM. Assim, bmdm pode ser transfected durante a noite. Tanto na PM (Figura 6D,E)e BMDM (Figura 6F,G),o nível de expressão do eGFP em células transinfectadas aumentou de forma dependente de tempo e dose. É importante ressaltar que o procedimento de transfecção não induziu a morte de células líticas ou apoptoticas, pois não houve aumento no propídio positivo (PI) ou macrófagos positivos à anexação V após transfecção (Figura 7A,B).

A eficiência da transfecção das variantes de MRNAs para NEMO ou IKKβ marcadas pela FLAG foi analisada por microscopia de imunofluorescência. 300.000 PM por poço de uma placa de 12 poços foram transfected com 300 ng de mRNA respectivo para 6 h. Taxa de transfecção foi de cerca de 60% para mRNAs NEMO e cerca de 55% para IKKβ mRNAs (Figura 8A, B). Assim, suas taxas de transfecção foram semelhantes às do eGFP mRNA, indicando uma taxa geral de transfecção de cerca de 55% para pm.

Também usamos esse protocolo para gerar codificação de mRNA para recombinação de Crecombinase. A transfecção de 400.000 BMDM de camundongos NEMOflox/flox 17 por poço de uma placa de 12 poços com 400 ng de Cre recombinante mRNA resultou em esgotamento quase completo para proteína NEMO após 48 h (Figura 9)indicando transfecção altamente eficiente do BMDM.

Pm e BMDM não secretaram nenhuma quantidade detectável de IL-1β, IL-6 e TNF após transfecção (Figura 10A,B). Além disso, as vias de sinalização NF-kB e MAPK não foram ativadas após a transfecção16, indicando que o procedimento de transfecção não ativa a sinalização proinflamatória. Também não observamos alterações funcionais de macrófagos transinfectados em comparação com macrófagos não transatlânticos16.

Figure 1
Figura 1: Linearização de plasmídeos de codificação de NEMO já contendo um promotor T7 na orientação correta. (A) Trecho da sequência da codificação plasmídeo para A BANDEIRA-marcado NEMoWT ou NEMOC54/347A. Um promotor T7 na orientação correta e perto da seqüência KOZAK e codon início já está presente. A região do promotor T7, a sequência de codificação (CDS) para a tag FLAG e nemo, o início e parar codons e o site de restrição para linearização com XbaI são codificados por cores. (B) Representante 1% de gel agarose mostrando os plasmídeos antes e depois da linearização com Xbal; 1 μL de DNA plasmídeo linearizado não tratado, linearizado ou purificado foi carregado por pista. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figure 2
Figura 2: T7 promotor anexo a plasmídeos ikkß-codificação por PCR. (A) Trecho da sequência da codificação de plasmídeos para IKKβWT ou IKKβS177/181E. Os plasmídeos não contêm um promotor T7 adequado, que é, portanto, anexado por PCR. Localização, orientação e seqüência do primer para a frente (contendo a seqüência promotor T7 a ser adicionado) e a cartilha reversa são indicadas pelas setas. A região do promotor T7, o CDS para a tag FLAG e IKKβ e os codons de início e parada são codificados por cores. (B) Representante 1% agarose gel verificando geração de um único produto PCR de tamanho correto usando as cartilhas indicadas acima. 1 μL do produto PCR purificado foi carregado por pista. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figure 3
Figura 3: síntese de mRNA de modelos de DNA nemo e ikkβ-codificando. (A)Representante que deturing 1.2% gel do agarose que contem o formaldehyde de 0.7% que mostra o mRNA purificado de NEMO e de IKKβ constrói antes e depois da poli (A) que segue. 2 μL de NEMOWT, NEMOC54/347A, IKKβWT e IKKβS177/181E mRNA foram carregados por pista. Uma escada de 32 μL ssRNA foi carregada para determinação do comprimento do RNA. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figure 4
Figura 4: Análises citométricas de fluxo do enriquecimento imunológico da PM e do status de diferenciação do BMDM. (A) O percentual de F4/80+/CD11b+ PM na lavagem peritoneal antes e depois do enriquecimento imunomagnético foi analisado por citometria de fluxo. (B) Expressão de F4/80 e CD11b por BMDM após 6 dias de diferenciação foi verificada por citometria de fluxo. 10.000 ou 5.000 células foram contadas por amostra, respectivamente. Os dados são mostrados como média ± SEM de n = 3 experimentos independentes, cada um. * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001 e **** P < 0,0001 pelo t-test do estudante. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figure 5
Figura 5: síntese mRNA com poli (A) rejeito do eGFP. (A)Trecho da sequência da codificação plasmídea para eGFP. O plasmídeo não contém um promotor T7 adequado, que é, portanto, anexado por PCR. Localização, orientação e seqüência do primer para a frente (contendo a seqüência promotor T7 a ser adicionado) e a cartilha reversa são indicadas pelas setas. A região do Promotor T7, o CDS para eGFP e os codons de início e parada são codificados por cores. (B) Representante 1% de gel agarose mostrando o amplicon purificado após PCR usando as cartilhas indicadas acima. 1 μL do produto PCR purificado foi carregado por pista. (C)Representante que deturing 1.2% gel agarose contendo 0.7% formaldehyde que mostra o mRNA purificado do eGFP antes e depois da poli (A) que segue. 2 μL de mRNA eGFP foram carregados por pista. Uma escada de 32 μL ssRNA foi carregada para determinação do comprimento do RNA. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figure 6
Figura 6: Transfecção altamente eficiente de macrófagos peritoneal e BMDM com mRNA eGFP. Macrófagos foram incubados por 6, 9 ou 24 h com 50, 100 ou 200 ng de mRNA eGFP complexo para jetMESSENGER ou com jetMESSENGER sozinho (mock) e, em seguida, analisados por citometria de fluxo. (A)Estratégia de gating usada para definir as populações de macrófagos viáveis, eGFP viável+ macrófagos e PI+ (ou seja, mortos) macrófagos. Dados representativos para transfecção com 200 ng mRNA para 6 h são mostrados. (B,C) ( B,C) As taxas de transfecção de (B)PM e (C)BMDM foram determinadas pela análise do percentual de células eGFP-positivas viáveis por citometria de fluxo (n = 5-7 e n = 4-5 experimentos independentes, respectivamente). (D-G) Os níveis de expressão do eGFP foram determinados pela análise da intensidade média da fluorescência (IFM) de VIável (D)PM e (F)BMDM e da subpopulação viável e eGFP-positiva de (E)PM e (G)BMDM (n = 5-7 e n = 4-5 experimentos independentes, respectivamente). 10.000 células foram contadas por amostra. Os dados são mostrados como média ± SEM. n.s. = não significativo; * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001 e **** P < 0,0001 pelo t-test do estudante. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figure 7
Figura 7: A transfecção não induz a morte de células líticas ou apoptoticas. A morte celular induzida pela transfecção de(A)PM e (B)BMDM foi determinada pela análise do percentual de células V-positivas e anexadas (n = 5-7 e n = 4-5 experimentos independentes, respectivamente). O percentual de macrófagos mortos presentes em amostras não transacionadas (algum grau de morte celular foi causado pelo desprendimento físico de macrófagos dos poços, apesar do uso de placas não tratadas) foi subtraído do que nas respectivas amostras transinfectadas para levar em conta a morte celular induzida pelo procedimento de transfecção. A estratégia de gating usada para definir as populações de PI+, annexin V+ e PI+/annexin V+ macrófagos é mostrada para um conjunto de dados representativo spm transfected com 200 ng mRNA para 6 h são mostrados. A staurosporina (50 μM por 1 h) foi utilizada como controle positivo. 10.000 células foram contadas por amostra. Os dados são mostrados como média ± SEM. n.d. = não detectável. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figure 8
Figura 8: Taxas de transfecção usando codificação de mRNA para construções NEMO e IKK. As taxas de transfecção usando codificação de mRNA para(A)as construções NEMO e(B)as construções do IKK foram quantificadas pela microscopia de imunofluorescência (n = 4 experimentos independentes). Barra de escala = 4 μm. Os dados são mostrados como média ± SEM. n.t. = não transinfectados, n.s. = não significativos; * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001 e **** P < 0,0001 pelo t-test do estudante. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figure 9
Figura 9: Transfecção de NEMOfl/fl BMDM com codificação de mRNA para cre resultados recombinanos em deficiência quase completa para NEMO. Bmdm de nemofl / fl camundongos foram transfected com mRNA codificação Cre recombinação para 48 h. Deficiência de proteína NEMO como resultado de cre-mediado nocaute foi avaliado por mancha ocidental usando anticorpos específicos reconhecendo NEMO ou β-actin e quantificado pela densitometria (n = 5 experimentos independentes). Os dados são mostrados como média ± SEM. * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001 e **** P < 0,0001 pelo t-teste do aluno. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figure 10
Figura 10: A transfecção não induz uma resposta pró-inflamatória. (A)PM e (B)BMDM foram transinfectados com codificação de mRNA para NEMOWT ou NEMOC54/347A. Como controle positivo, os macrófagos foram infectados com Listeria monocytogenes na multiplicidade de infecção de 1 ou estimulados com 5 μg/mL LPS ou poli (I:C) por 5 h (PM) ou 24 h (BMDM). A secreção de IL-1 β, IL-6 e TNF no supernatant foi quantificada pela ELISA (n = 3 experimentos independentes). Os dados são mostrados como média ± SEM. n.t. = não transinfectados, n.d. = não detectável. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

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Discussion

Aqui apresentamos um protocolo para transfecção altamente eficiente de macrófagos primários geralmente difíceis de transfect com mRNA transcrita in vitro. É importante ressaltar que a transfecção dos macrófagos que utilizam este protocolo não induz a morte celular nem ativa a sinalização proinflamatória indicando que nem o reagente da transfecção nem o mRNA transinfectado são reconhecidos como não-eu.

A qualidade do mRNA é de importância fundamental para a transfecção bem-sucedida de macrófagos utilizando este protocolo. Assim, deve-se tomar grande cuidado para que o mRNA não entre em contato com RNAses (por exemplo, por meio de amortecedores ou frascos contaminados). Em caso de dúvida, verifique se há degradação do mRNA (por exemplo, por eletroforese de gel agarose). A taxa de transfecção e o nível de expressão já eram máximos às 6 h após a transfecção. Portanto, é possível que a proteína de interesse seja expressa em níveis suficientes para análise em pontos anteriores após a transfecção. Mas não testamos isso. Além disso, a transfecção de quantidades maiores de mRNA pode aumentar ainda mais a taxa de transfecção e/ou o nível de expressão. No entanto, transfecting maiores quantidades de mRNA pode potencialmente também levar a algum grau de imunogenicidade ou mesmo citotoxicidade. A completa falta dela é uma das principais vantagens deste protocolo. Assim, para que quantidades maiores de mRNA sejam infectadas, a imunogenicidade e a citotoxicidade têm de ser cuidadosamente avaliadas.

O nível de expressão correlacionou-se claramente com a quantidade de mRNA transfected. No entanto, a reexpressão de NEMO em BMDM nemo deficiente resultou em expressão de proteína NEMO semelhante como no wildtype BMDM16 indicando que a transfecção mRNA usando este protocolo não leva a uma superexpressão substancial da proteína de interesse. Assim, este protocolo pode não ser adequado para estudar as consequências da superexpressão da proteína de interesse. Consideramos isso uma vantagem, no entanto, como a superexpressão de uma proteína muitas vezes altera seu comportamento.

A principal limitação da transfecção de mRNA, em geral, é que ela só resulta em expressão transitória da proteína de interesse (pois o mRNA gerado e transinfectado usando esse protocolo estará sujeito ao volume de negócios normal). Pm parecem expressar a proteína de interesse por um período mais curto de tempo em comparação com BMDM. Assim, em contraste com o BMDM, a PM não deve ser transacionada durante a noite. Quanto tempo uma determinada proteína de interesse será expressa variará (como a estabilidade do mRNA e a da proteína variará). No entanto, recomendamos realizar o experimento de escolha no mesmo dia da transfecção. Se a expressão da proteína de interesse é necessária por longos períodos de tempo, as células provavelmente podem ser transacionadas várias vezes (por exemplo, todos os dias, conforme descrito em18).

Usamos com sucesso o protocolo descrito aqui para transfect murine PM e BMDM e fibroblastos embrionários de camundongos (MEFs)16. Em teoria, o mRNA gerado usando este protocolo pode ser usado para transfect qualquer tipo de célula dada de qualquer espécie de mamífero. O reagente ideal da transfecção do mRNA e o índice de nucleosides modificados podem diferir para outros tipos da pilha, embora.

As modificações futuras promissoras incluem a inclusão dos 5'- e 3'-UTRs. A maioria dos plasmídeos pré-existentes contém apenas o CCDS da proteína de interesse, mas não os 5'- e 3'-UTRs. Sua inclusão (como descrito em19)pode aumentar ainda mais a estabilidade e expressão do mRNA. Além disso, anexar etiquetas de epítopo saem da proteína de interesse simplesmente incluindo a sequência da etiqueta epitope na cartilha para a frente ou para trás (para marcação de epitopos de N e C, respectivamente), deve ser possível.

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Disclosures

Os autores não têm nada a divulgar.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado pela Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 670).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5-methyl-CTP (100 mM) Jena Biosience NU-1138S stored at -20 °C
Antarctic phosphatase New England BioLabs M0289 stored at -20 °C
Antarctic phosphatase reaction buffer (10x) New England BioLabs B0289 stored at -20 °C
anti-NEMO/IKKγ antibody Invitrogen MA1-41046 stored at -20 °C
anti-β-actin antibody Sigma-Aldrich A2228 stored at -20 °C
Petri dishes 92,16 mm with cams Sarstedt 821,473 stored at RT
CD11b Microbeads mouse and human Miltenyi Biotec 130-049-601 stored at 4 °C
Cre recombinase + T7-Promotor forward primer Sigma-Aldrich 5′-GAAATTAATACGACTCACTATA
GGGGCAGCCGCCACCATGTCC
AATTTACTGACCGTAC-3´, stored at -20 °C
Cre recombinase + T7-Promotor reverse primer Sigma-Aldrich 5′-CTAATCGCCATCTTCCAGCAGG
C-3′, stored at -20 °C
DNA purification kit: QIAquick PCR purification Kit Qiagen 28104 stored at RT
eGFP + T7-Promotor forward primer Sigma-Aldrich 5´-GAAATTAATACGACTCACTATA
GGGATCCATCGCCACCATGGTG
AGCAAGG-3´, stored at -20 °C
eGFP + T7-Promotor reverse primer Sigma-Aldrich 5´-TGGTATGGCTGATTA
TGATCTAGAGTCG-3´, stored at -20 °C
Fast Digest buffer (10x) Thermo Scientific B64 stored at -20 °C
FastDigest XbaI Thermo Scientific FD0684 stored at -20 °C
High-fidelity polymerase with proofreading: Q5 High-Fidelity DNA-Polymerase New England Biolabs Inc M0491S stored at -20 °C
IKKβ + T7-Promotor forward primer Sigma-Aldrich 5′-GAAATTAATACGACTCACTATA
GGGTTGATCTACCATGGACTACA
AAGACG-3′, stored at -20 °C
IKKβ + T7-Promotor reverse primer Sigma-Aldrich 5′-GAGGAAGCGAGAGCT-CCATCTG-3′, stored at -20 °C
In vitro mRNA transcription kit: HiScribe T7 ARCA mRNA kit (with polyA tailing) New England BioLabs E2060 stored at -20 °C
LS Columns Miltenyi Biotec 130-042-401 stored at RT
MACS MultiStand Miltenyi Biotec 130-042-303 stored at RT
mRNA transfection buffer and reagent: jetMESSENGER Polyplus transfection 409-0001DE stored at 4 °C
Mutant IKKβ IKK-2S177/181E plasmid Addgene 11105 stored at -20 °C
Mutant NEMOC54/347A plasmid Addgene 27268 stored at -20 °C
pEGFP-N3 plasmid Addgene 62043 stored at -20 °C
poly(I:C) Calbiochem 528906 stored at -20 °C
pPGK-Cre plasmid F.T. Wunderlich, H. Wildner, K. Rajewsky, F. Edenhofer, New variants of inducible Cre recombinase: A novel mutant of Cre-PR fusion protein exhibits enhanced sensitivity and an expanded range of inducibility. Nucleic Acids Res. 29, 47e (2001). stored at -20 °C
pseudo-UTP (100 mM) Jena Biosience NU-1139S stored at -20 °C
QuadroMACS Separator Miltenyi Biotec 130-090-976 stored at RT
Rat-anti-mouse CD11b antibody, APC-conjugated BioLegend 101212 stored at 4 °C
Rat-anti-mouse F4/80 antibody, PE-conjugated eBioscience 12-4801-82 stored at 4 °C
Recombinant M-CSF Peprotech 315-02 stored at -20 °C
RNA purification kit: MEGAclear transcription clean-up kit ThermoFisher Scientific AM1908 stored at 4 °C
RNAse-degrading surfactant: RnaseZAP Sigma-Aldrich R2020 stored at RT
Ultrapure LPS from E.coli O111:B4 Invivogen stored at -20 °C
Wild type IKKβ plasmid Addgene 11103 stored at -20 °C
Wild type NEMO plasmid Addgene 27268 stored at -20 °C

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References

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Herb, M., Farid, A., Gluschko, A., Krönke, M., Schramm, M. Highly Efficient Transfection of Primary Macrophages with In Vitro Transcribed mRNA. J. Vis. Exp. (153), e60143, doi:10.3791/60143 (2019).

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