Summary
Ein Protokoll wird für die Formulierung einer blutfreien künstlichen Ernährung zur Fütterung von Anopheles-Mücken in Gefangenschaft vorgelegt. Diese Diät hat eine ähnliche Leistung wie Wirbeltierblut und löst Oogenese und Eireifung aus und produziert lebensfähige Erwachsene Nachkommen.
Abstract
Malariaforschung erfordert groß angelegte Zucht- und Produktionsbedingungen für Mücken(Anopheles spp.) in Gefangenschaft. Die nachhaltige und zuverlässige Produktion von Mücken wird derzeit durch die Versorgung mit frischem Wirbeltierblut gehemmt. Alternativen zum Blut sind erforderlich, um effiziente Kontrollstrategien für Malaria und andere vektorübertragene Krankheiten zu fördern, die von blutfütternden Insekten übertragen werden. Vor diesem Hintergrund wurden künstliche flüssige Diäten als Ersatz für frisches Wirbeltierblut formuliert. Hierin berichten wir von einer blutfreien künstlichen Flüssigkeitsdiät, die Futterraten liefert, die dem Blut ähneln und die physiologischen Wirkungen einer frischen Wirbeltierblutmahlzeit imitiert. Die Ernährung induziert Eierstock- und Eireifung von Anopheles-Mücken und produziert auch ein gutes Larvenüberleben und die Entwicklung von funktionellen Erwachsenen. Die formulierte blutfreie flüssige Ernährung ist ein wichtiger Fortschritt hin zu einer nachhaltigen Mückenzucht in Gefangenschaft und wird die Erhaltungskosten von Mückenkolonien senken und den Bedarf an frischem Wirbeltierblut eliminieren.
Introduction
Vektorübertragene Krankheiten betreffen weltweit mehrere Millionen Menschen und verursachen jedes Jahr Millionen von Todesfällen. Sie werden von Insekten übertragen, die mit krankheitserzeugenden Mikroorganismen (Protozoen, Viren) infiziert sind, die erworben wurden, wenn sie sich von Blut eines infizierten Wirts ernähren. Anschließend überträgt der infizierte Vektor den Erreger während der nächsten Blutmahlzeit an einen neuen Wirt. Malaria ist die tödlichste vektorübertragene Krankheit, die von mehreren verschiedenen Arten der Anopheles-Mücke übertragen wird und 40% der Weltbevölkerung betrifft1. Der Malaria-Protist-Parasit ist für mehr als 400.000 Todesfälle pro Jahr verantwortlich, von denen die meisten Kinder unter 5 Jahren sind (Weltgesundheitsorganisation). Die weibliche Anopheles-Mücke überträgt den Malariaparasiten der Gattung Plasmodium zwischen Menschen und anderen Tieren, wenn sie sich von Wirbeltierblut ernährt, ein notwendiger Schritt für die Eiproduktion und Entwicklung2.
Aktuelle Strategien zur Ausrottung von Malaria und anderen aufkommenden tödlichen, durch Mücken übertragenen Krankheiten beruhen auf der Entwicklung innovativer Mückenbekämpfungsstrategien3,4,5, die die Freisetzung von einer großen Anzahl von Insektien in die Wildnis umfassen. Ein entscheidender begrenzender Faktor ist jedoch die Abhängigkeit von einer Versorgung mit frischem Blut für eine effektive Mückenzucht und -zucht. Die variable Zusammensetzung des Wirbeltierblutes kann sich negativ auf die Fruchtbarkeit von Mücken und die Nachkommenfitness auswirken und die Zuverlässigkeit und Nachhaltigkeit von Zuchtkolonien in Gefangenschaft einschränken. Mückenfreisetzungs- und -bekämpfungsprogramme erfordern großflächige Mückenproduktionssysteme und eine regelmäßige Versorgung mit großen Mengen Wirbeltierblut. Dies stellt ein großes Hindernis für die Mückenproduktion dar und wirft eine Reihe ethischer Fragen im Zusammenhang mit der Verwendung lebender Tiere und logistischer Einschränkungen auf, die durch die damit verbundenen anspruchsvollen Sicherheitsvorschriften verursacht werden. Dies erhöht die Kosten für die Erhaltung und Sicherheit von Mückenvölkern und stellt die Nachhaltigkeit der derzeitigen Mückenzuchtpraktiken in Herausforderungen, insbesondere in Ländern mit niedrigem Einkommen, in denen die Malariagefahr weitaus größer ist.
In letzter Zeit Forschung wurde auf die Entwicklung von Blutersatzstoffen konzentriert, die eine Wirbeltier-Blutmahlzeit imitieren, aber bisher wurde nur begrenzter Erfolg erreicht6,7,8,9. Eine erfolgreiche künstliche Ernährung muss (1) die vollständige weibliche Mückenengorgement provozieren, (2) die Vitellogeninproduktion auslösen, (3) große Chargen lebensfähiger Eier produzieren und (4) heidnische Nachkommen erzeugen10. Darüber hinaus haben künstliche Diäten eine Standardzusammensetzung und sind somit zuverlässiger für die Produktion von Mücken zu Forschungs- und Kontrollzwecken. Erfolgreiche blutfreie Diäten wurden für Aedes-Mücken entwickelt (rezensiert von Gonzales und Hansen11), aber nicht für Anopheles spp. Bestehende künstliche Diäten enthalten ein Phagostimulans (z.B. ATP10), eine Proteinquelle für die Eireifung6,12, Kohlenhydrate als Energiequelle und Aminosäuren (aa)13, die für die Eiproduktion von grundlegender Bedeutung sind und ein wichtiger begrenzender Faktor für die Mückenfruchtbarkeit14sind. Eine künstliche blutfreie Ernährung muss auch Cholesterin15liefern, das die Eiproduktion verbessert. Hier beschreiben wir eine künstliche blutfreie Ernährung für weibliche Anopheles-Mücken und zeigen, dass sie eine konsistente und gleichwertige Leistung wie eine hochwertige Wirbeltierblutmahlzeit hat.
Protocol
Mäuse wurden aus dem IHMT-Tierhaus gewonnen. Tierversuche wurden in strikter Übereinstimmung mit dem portugiesischen Gesetz und den Richtlinien für die Verwendung von Labortieren durchgeführt. Das Ministério da Agricultura do Desenvolvimento Rural e das Pescas ( Portugal) genehmigte alle Studienprotokolle (id-Zulassungen: 023351 und 023355).
HINWEIS: Führen Sie alle Fütterungstests bei 26 °C durch.
1. Moskitos
- Bewahren Sie Anopheles coluzzii (ehemalige Anopheles gambiae M Form) Yaoundé Stamm Mücken bei 26 °C, 75% Luftfeuchtigkeit unter einem 12 h:12 h Licht: dunkel Zyklus. Hausmücken unter Verwendung von Standard-Insektenbedingungen, um eine Paarung zu gewährleisten.
- Sammeln Sie Mückenpupas in einem kleinen Wasserbehälter. Legen Sie den Behälter in einen Mückenkäfig, damit erwachsene Mücken auftauchen und sich paaren können. Bieten Sie 10% Glukose-Fütterungslösung. Drei Tage nach der Entstehung sammeln Die notwendige Anzahl von Mücken aus dem Stockkäfig mit einem Aspirator.
- Entfernen Sie einen Tag vor den Fütterungsversuchen die 10% Glukose-Fütterungslösung.
HINWEIS: Während der Experimente wurden 3 Tage alte Mücken eingesetzt.
2. Mückenfütterung
- Zubereitung künstlicher flüssiger Diäten
- Bereiten Sie die künstliche Flüssigkeitsdiät unter sterilen Bedingungen in einem laminaren Strömungsschrank vor. Bereiten Sie die reiche flüssige Ernährung (r-liq_diet) vor, indem Sie der anfänglichen flüssigen Ernährung Folgendes hinzufügen (i-liq_diet; Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium [hohe Glukose mit L-Glutamin], siehe Tabelle 1):0,55 g/L ATP, 1 g/L-Cholesterin und 200 g/L Rinderserumalbumin (BSA). Mischen Sie alle Zutaten gründlich und filtern Sie mit einem 0,45 m Mikrofilter.
HINWEIS: Bewahren Sie die Diäten nicht auf; Bereiten Sie Diäten frisch aus den Lagerlösungen für jedes Experiment, wie sie Qualität verlieren, wenn gelagert. Die Bestandteile der Diäten sind in Tabelle 1beschrieben.
- Bereiten Sie die künstliche Flüssigkeitsdiät unter sterilen Bedingungen in einem laminaren Strömungsschrank vor. Bereiten Sie die reiche flüssige Ernährung (r-liq_diet) vor, indem Sie der anfänglichen flüssigen Ernährung Folgendes hinzufügen (i-liq_diet; Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium [hohe Glukose mit L-Glutamin], siehe Tabelle 1):0,55 g/L ATP, 1 g/L-Cholesterin und 200 g/L Rinderserumalbumin (BSA). Mischen Sie alle Zutaten gründlich und filtern Sie mit einem 0,45 m Mikrofilter.
- Maus-Blutentnahme
- Anästhetisieren Sie 6-8 Wochen alte CD1-Mäuse (Mus musculus) mit Ketamin (120 mg/kg) und Xylazin (16 mg/kg) auf der intraperitonealen Route.
- Führen Sie eine Herzpunktion(Abbildung 1) durch, wenn die Maus keine Muskelreaktion als Reaktion auf verschiedene körperliche Reize (z. B. Zehen- und Schwanzkneifen) anzeigt.
- Sammeln Sie Blut mit einer sterilen 1 ml Spritze mit einer 27 G x 1/2 (0,4 x 12 mm2) Nadel, die 100 l 1 mg/ml Heparin (Natriumsalz) enthält, um die Bildung von Blutgerinnseln zu verhindern. Blut bei 37 °C in einem Wasserbad aufbewahren.
- Künstliche Fütterung
- Sammeln Sie etwa 30 weibliche Mücken aus dem Stockkäfig mit einem Aspirator.
- Übertragen Sie die weiblichen Mücken auf 500 ml Papierbecher und decken Sie sie mit einem feinen Moskitonetz, damit sie nicht entkommen können. Tragen Sie einen Glasförderer auf, der mit Kunststoffrohren verbunden ist, um einen konstanten Wasserfluss an der Oberseite jeder Tasse aufrechtzuerhalten (Abbildung 2). Stellen Sie einen konstanten Wasserfluss zum zylindrischen Schlauch und Feeder bereit, so dass die Temperatur im Inneren bei ca. 37,5 °C gehalten wird.
HINWEIS: Eine Standard-Glasglocke künstliche Fütterungsapparat16 wurde verwendet, um die formulierte Diäten an weibliche Mücken zu liefern. - Dehnen Sie Paraffin-Filmmembran über den Mund des Glasförderers, um die Mahlzeit zu enthalten.
- I-liq_diet und r-liq_diet bei 37 °C mit einem Wasserbad vorwärmen. 1 ml in den Glaszubringer auftragen. Füttern Sie die Mücken für 60 min im Dunkeln entweder mit i-liq_diet, r-liq_diet oder frischem Mausblut. Durchführung von Assays bei 26 °C.
- Bewertung der Fütterungsrate.
- Nach künstlicher Fütterung die Mücken bei -20 °C für 30 s kalt anieren. Die Mücken in eine gekühlte Petrischale geben.
- Erfassen Sie die Anzahl der vollständig engorged (Abbildung 3) weiblichen Mücken.
HINWEIS: Der Prozentsatz der gefütterten Mücken wird als Ersatz für den Fütterungserfolg verwendet.
3. Lebensgeschichte Eigenschaften
- Eierproduktion und Fruchtbarkeit
- Übertragen Sie die voll verschlungenen Weibchen mit einem Pinsel in einzelne Käfige (20 cm x 20 cm x 20 cm).
- Halten Sie die Mücken bei 26 °C, 75 % Luftfeuchtigkeit und einem 12 h:12 h hellen: dunklen Zyklus mit 10% Glukose ad libitum.
- Achtundvierzig H nach der Fütterung, fügen Sie ein befeuchtetes Filterpapier an der Unterseite für die Eiablage(Abbildung 4). Zählen Sie die Eier bei 48 h und 72 h nach zugabe des Eiablagepapiers mit einer Handlupe. Das Filterpapier mit destilliertem Wasser überfluten, um die Eier zu sammeln.
- Larvensterben
- Sammeln Sie die Eier in Schalen (23 cm x 15 cm x 6 cm) gefüllt mit destilliertem Wasser(Abbildung 5). Halten Sie den Wasserstand in den Schalen während der Experimente konstant.
- Füttern Sie die Larven täglich mit ca. 13 mg gemahlenem Fischfutter pro Tablett. Wenden Sie ein ähnliches Fütterungsregime auf alle Replizienschalen an.
- Entfernen Sie tote Pupae und Larven täglich. Schließen Sie die Experimente ab, wenn sich alle Welpen zu Erwachsenen entwickelt haben und zählen Sie die Anzahl der erwachsenen Männchen und Weibchen.
- Registrieren Sie die Daten von Schraffur und Tod und berechnen Sie die Sterblichkeitsraten.
- Langlebigkeit
- Sammeln Sie 15 erwachsene Männchen und 15 erwachsene Weibchen aus der F1-Generation jeder Diätgruppe. Halten Sie Männchen und Weibchen im selben Käfig.
- Füttern Sie Erwachsene mit einer 10% Glukoselösung ad libitum. Entfernen Sie die toten Erwachsenen täglich.
- Halten Sie die Mücken bei der gleichen Temperatur, Feuchtigkeit, Lichtzyklusbedingungen und Zuckerfütterung Regime wie oben beschrieben beschrieben.
- Registrieren Sie die Todesdaten und berechnen Sie die Langlebigkeit.
- Flügellängenmessung
- Kaltanästhestheisiert fünf Tage alte f1-s-s-Mücken (männlich und weiblich) aus jeder Diätgruppe bei -20 °C für 90 s.
- Unter einem Stereoskop, greifen Sie vorsichtig den Thorax jeder Mücke mit Zange und legen Sie sie ventrale Seite nach oben.
- Sammeln Sie beide Flügel mit einem Skalpell und legen Sie sie auf einem sauberen Mikroskopschlitten, der einen getrockneten Tropfen Montagemedium enthält. Mit Hilfe einer 20 G Nadel zusätzliche Montagemedien an die Ränder des Deckels hinzufügen und den Deckelrutsch langsam auf die Flügel senken.
- Messen Sie die Flügellänge(Abbildung 6) mit einem Stereoskop mit einem Mikrometer.
Representative Results
Die unten beschriebenen Ergebnisse vergleichen die Leistung von weiblichen Anopheles-Mücken, die mit der formulierten reichhaltigen künstlichen Mahlzeit (r-liq_diet) gefüttert werden, und Mücken, die mit der anfänglichen flüssigen Ernährung (i-liq_diet) oder einer frischen Blutmahlzeit gefüttert werden. Die Diät wurde nach dem in Abbildung 7dargestellten Schemaprotokoll getestet. Die hierbeschriebene r-liq_diet ist Teil eines Patents (PCT/IB2019/052967).
Prozentsatz der voll engorged Weibchen
Die Anzahl der mit dem r-liq_diet gefütterten weiblichen Mücken (89%) war deutlich höher als die Zahl der mit Blut ernährten Frauen (56%) (Abbildung 8).
Fruchtbarkeit und Fruchtbarkeit
Weibliche Fruchtbarkeit und Fruchtbarkeit für den ersten gonotrophen Zyklus wurde verwendet, um die Nährwertqualität der i-liq_diet und r-liq_diet zu bewerten. Durchschnittlich 24 bis 11 Eier legten Die Weibchen, die mit frischem Wirbeltierblut gefüttert wurden, während Weibchen, die sich mit r-liq_diet ernährten, durchschnittlich 25 bis 5 Eier legten(Tabelle 2). Keine Eiablage wurde von Weibchen beobachtet, die auf dem i-liq_diet gefüttert wurden.
F1-Sterblichkeit
Die Tauglichkeit von F1-Mücken wurde zwischen Kolonien, die mit Wirbeltierblut gefüttert wurden, oder dem r-liq_diet bewertet. Larven, Pupae und Erwachsenensterblichkeit wurden aufgezeichnet. Die Variabilität (Standardfehler des Mittelwerts [SEM]) war bei den blutgefütterten Mücken (Abbildung 9 und Tabelle 2) höher als bei Denkmücken, die mit dem r-liq_diet gefüttert wurden. Die F1-Generation von Mücken, die sich entweder mit dem Blut oder dem r-liq_diet ernährten, hatte vergleichbare Sterblichkeits- und Überlebensraten.
F1-Lebenserwartung
Es wird vom Center for Disease Control and Prevention geschätzt, dass wilde erwachsene weibliche Mücken bis zu einem Monat leben, aber wahrscheinlich nicht für mehr als 1 bis 2 Wochen überleben und dass Männchen etwa eine Woche leben und sich ausschließlich von Nektar und anderen Zuckerquellen ernähren. Es wird darauf hingewiesen, dass Unterschiede in der Nahrungsaufnahme der Eltern das Überleben der Mückennachkommen17beeinflussen können. In unserem Experiment hatten erwachsene Weibchen und Männchen im Blut (weiblich 24,5 x 6,8; männlich 18,5 x 6,9) und r-liq_diet (weiblich: 22,5 x 8,1; männlich: 11,9 x 6,9) ähnliche durchschnittliche Lebenserwartungen (Tabelle 3) und Frauen zeigten eine erhöhte Lebensdauer im Vergleich zu Männern.
F1 Körpergröße
Flügellänge wurde als Indikator für erwachsene Körpergröße verwendet. Im Vergleich zu anderen Arten sind Anopheles Erwachsene kleine bis mittelgroße Mücken mit einer Flügellänge zwischen 2,8 und 4,4 mm Flügellänge18. Erwachsene Körpergröße von F1 Anopheles Mücken gefüttert die r-liq_diet war innerhalb des erwarteten Bereichs und war ähnlich wie blutgefütterte Insektenmücken (Abbildung 10).
Statistische Auswertung
Die vorgelegten Daten stellen den Mittelwert von mindestens drei unabhängigen Experimenten dar (sofern nicht anders angegeben). Fehlerbalken stellen das SEM dar. Wenn die Daten einer Gaußschen Verteilung folgten, wurden unabhängige Gruppen mit dem Test des Studenten t verglichen, andernfalls wurde der Mann-Whitney-Test angewendet. Die Unterschiede zwischen den künstlichen, mit Diäten gefütterten Gruppen wurden mit dem genauen Test des Fishers analysiert und wurden bei P 0,05 als signifikant angesehen.
Abbildung 1: CD1-Mausblutentnahme durch intrakardiale Punktion. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Standard-Künstliche Seredern. Der Glasförderer enthält r-liq_diet, das an weibliche Anopheles-Mücken verfüttert wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Anopheles-Mücken nach künstlicher Fütterung. Von links nach rechts: ein voll verwurzeltes Weibchen, das r-liq_diet, nicht-engorged Weibchen angeboten wurde, das r-liq_diet, männlich und voll engorged Weibchen angeboten wurde, das Mausblut angeboten wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Anopheles-Eier legten 48 h nach der Fütterung von Weibchen mit dem r-liq_diet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: L2-Larvenstufen, die sich aus den Eiern entwickelten und auf Filterpapier gesammelt und in Schalen mit destilliertem Wasser gelegt wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Rechter Flügel aus einer F1-Generation einer Anopheles coluzzii-Frauenmücke. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 7: Schematisches Protokoll der künstlichen Diätprüfung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 8: Fütterungsraten der weiblichen Mücken, die entweder die künstliche Ernährung oder das Blut gefüttert haben. Sternchen weisen auf signifikante Unterschiede zwischen den Mücken, die mit der r-flüssigen und i-flüssigen Ernährung gefüttert werden, und der blutgefütterten Kontrollgruppe hin. Exakter Test von Fisher beidseitig: ****P bei 0,0001 (relatives Risiko: 0,4828, 95% zuversichtlich Level [CL]: 0,3776 bis 0,6194) für r-flüssige Ernährung versus Blut, *P = 0,0335 (relatives Risiko: 1,379, 95% CL: 1,044 bis 1,836) für Blut versus i-flüssige Ernährung. Blau: ungesund; rot: gefüttert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 9: Wirkung der formulierten blutfreien Mahlzeit auf die Sterblichkeit und das Verhältnis von Männern und Frauen bei F1 Anopheles coluzzii-Mücken. Es wurden drei unabhängige Experimente mit jeweils 30 Mücken pro Diät durchgeführt. Ein ungepaarter t-Test zeigte keine signifikanten Unterschiede zwischen der blutgefütterten Gruppe und der r-liq_diet-Fed-Gruppe(P-Werte schwankten zwischen 0,5047 und 0,8491). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 10: Flügellänge. Der Abstand vom axialen Schnitt zur R4+5-Ader ohne die Fransenseta wurde zur Bestimmung der Flügellänge verwendet. Die Größe wurde für 5 Frauen und 5 Männer aus jeder Diätgruppe (mittelwert- SEM) bewertet. Die Werte werden als Mittelwert dargestellt. Lachs: r-liq_diet; rot: Wirbeltierblut. Unpaired t-test; weiblicher linker Flügel: t = 1.300, df = 8, P = 0.2298; männlicher linker Flügel: t = 2.400, df = 8, P = 0.0432; weiblicher rechter Flügel: t = 1.300, df = 8, P = 0.2298; männlicher rechter Flügel: t = 2.277, df = 7, P = 0.0569. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Komponenten | g/L |
| *Adenosintriphosphat | 0.55 |
| *Bovine Serum Albumin | 200 |
| *Cholesterin | 1 |
| Calciumchlorid wasserfrei | 0.2 |
| Cholinchlorid | 0.004 |
| D-Calciumpantothenat (Vitamin B5) | 0.004 |
| D-Glucose wasserfrei | 4.5 |
| Ferrisches Nitrat-Nonahydrat | 0.0001 |
| Folsäure | 0.004 |
| Glycin | 0.03 |
| I-Inositol | 0.007 |
| L-Arginin-Monohydrochlorid | 0.084 |
| L-Cystin-Dihydrochlorid | 0.063 |
| L-Glutamin | 0.584 |
| L-Histidin-Monohydrochlorid-Monohydrat | 0.042 |
| L-Isoleucin | 0.105 |
| L-Leucin | 0.105 |
| L-Lysin-Monohydrochlorid | 0.146 |
| L-Methionin | 0.03 |
| L-Phenylalanin | 0.066 |
| L-Serin | 0.042 |
| L-Threonin | 0.095 |
| L-Tryptophan | 0.016 |
| L-Tyrosin-Dinatriumsalz-Dihydrat | 0.104 |
| L-Valine | 0.094 |
| Magnesiumsulfat wasserfrei | 0.098 |
| Niacinamid (Nicotinamid) | 0.004 |
| Phenol rot | 0.015 |
| Kaliumchlorid | 0.4 |
| Pyridoxin-Monohydrochlorid | 0.004 |
| Pyruvicsäure Natriumsalz | 0.011 |
| Riboflavin (vitamin B2) | 0.0004 |
| Natriumbicarbonat | 3.7 |
| Natriumchlorid | 6.4 |
| Natriumphosphat monobasic wasserfrei | 0.109 |
| Thiamin-Amonohydrochlorid (Vitamin B1) | 0.004 |
| *Nur in r-liq_diet | |
Tabelle 1: Zusammensetzung der i-flüssigen Und r-liquid endiäten Diät.
| Gesamt-Ei-Zahl (s. SEM) | Eier/weiblich (SEM) | |
| Blut | 733 bei 330 | 24 x 11 |
| r-liq_diet | 763 x 164 | 25 x 5 |
| i-liq_diet | 0 | 0 |
Tabelle 2: Eierchargen von Anopheles coluzzii Weibchen. Für jede experimentelle Ernährung wurden drei unabhängige Experimente mit jeweils 30 weiblichen Mücken durchgeführt.
| Weibchen (Tage - SEM) | Männchen (Tage - SEM) | |
| Blut | 24,5 x 6,8 | 18,5 x 6,9 |
| r-liq_diet | 22,5 x 8,1 | 11,9 x 6,9 |
Tabelle 3: Lebenserwartung von F1 Anopheles-Mücken. Die Langlebigkeit von F1-Mücken aus künstlich gefüttertem F0 wurde anhand der Geburts- und Sterbedaten jeder Mücke aus derselben Ernährungsgruppe ermittelt (15 Weibchen und 15 Männchen wurden befolgt). Die Ergebnisse werden als die durchschnittliche Mückenlebensdauer pro Diätgruppe dargestellt.
Discussion
Der Erfolg unserer formulierten blutfreien Ernährung ist wahrscheinlich das Ergebnis der synergistischen physiologischen Wirkung aller Komponenten, die dem i-liq_diet (reich an Zucker, Aminosäuren, Vitaminen und Mikroelementen) zugesetzt werden: BSA (Proteinquelle), ATP (Phagostimulans) und Cholesterin (Lipidquelle). Die Supplementierung der r-liq_diet mit den einzelnen Komponenten allein war bei der Stimulierung der Eiproduktion nicht wirksam (Daten nicht dargestellt). Ein Nachteil des Protokolls könnten die Kosten für einige der Komponenten sein, wie Cholesterin. Trotzdem ist seine Anwesenheit von grundlegender Bedeutung, da Insekten nicht in der Lage sind, es zu synthetisieren19 und dieses Molekül ist der Vorläufer der Ekdysteroidhormone, die die Eigelbsynthese und Eireifung in Arthropoden regulieren20. Niedrigere Mengen an Cholesterin sollten getestet werden, um die benötigte Menge zu optimieren, um kostenzusenken und den Nutzen der künstlichen Ernährung zu steigern.
Eine weitere Einschränkung der Methode ist, dass die künstliche Ernährung frisch aus Lagerlösungen zubereitet werden muss, da sie nach der Lagerung in ihrer endgültigen flüssigen Form an Qualität verliert. In Zukunft könnte unsere formulierte Ernährung als getrocknete Kraft zubereitet werden, ähnlich wie SkitoSnackt, ein künstlicher Blutmehlersatz für Aedes aegypti Mücken21.
Neben der Versorgung mit den notwendigen Nährstoffen muss eine künstliche Mahlzeit weibliche Mücken anziehen und anregen, sich auf die gleiche Weise zu ernähren, wie wenn sie sich von frischem Wirbeltierblut ernähren. Die beschriebene künstliche blutfreie Ernährung führte im Vergleich zur wirbelchen Blutfütterungsgruppe zu einem Anstieg der voll versunkenen weiblichen Mücken um 20 %. Diese indirekte Anziehungskraft könnte durch die Verwendung von Olfaktorometern weiter geklärt werden, um zu bestätigen, dass die künstliche Ernährung für Mücken attraktiver und attraktiver ist als frisches Blut.
Die höchsten Auswirkungen der Ernährung auf die Larvensterblichkeit wurden bei Larven beobachtet, die von mit Blut gefütterten Mücken stammen, was darauf hindeutet, dass eine künstliche Ernährung mit stabiler Zusammensetzung dazu beitragen kann, die Sterblichkeit zu senken und den Erfolg der Mückenzucht im Vergleich zu frischem Blut zu verbessern. Das weniger vorhersehbare Ergebnis einer Blutmahlzeit kann aus Wirtsvariationen in der Zusammensetzung17 und dem Vorhandensein von Molekülen im Blut entstehen, die die Mückenphysiologie stören können22. Die vorstehenden Fakten unterstreichen die Vorteile für hochwertige Mücken, die frischblutfreie Ernährung aufziehen.
Insgesamt war die durchschnittliche Anzahl der in unserer Studie gelegten Eier im Vergleich zu denen, die bei einigen Insekten berichtet wurden, gering, aber die durchschnittliche Anzahl der eiförmigen Eier war vergleichbar mit der A. gambiae Labor-Zuchtstamm mit menschlichem Blut gefüttert (22,6 x 5,5 Eier/weiblich)23. Es wurden keine signifikanten statistischen Unterschiede zwischen unseren Versuchsgruppen beobachtet, die entweder mit frischem Blut oder mit künstlichen Mahlzeiten gefüttert wurden (Tabelle 2), was darauf hindeutet, dass die Einführung eines künstlichen Membranfütterungssystems mit unserer formulierten Ernährung ausreicht, um Anopheles-Mückenkolonien in Gefangenschaft zu erhalten und zu vermehren.
Künstliche blutfreie Mahlzeiten können Aedes Kolonien22erhalten, aber wenn sie auf Anopheles Mücken angewendet werden, sind sie von begrenztoder oder kein Erfolg11. Kürzlich wurde eine künstliche Mahlzeit auf Plasmabasis für Anopheles-Mücken beschrieben24, aber die Fütterungsraten und das Fortpflanzungspotenzial waren gering. Unsere Ergebnisse stellen einen wesentlichen Fortschritt im Stand der Technik dar (rezensiert von Gonzales und Hansen11), da unsere formulierten r-liq_diet eine ähnliche oder bessere Leistung als die Standard-Wirbeltierblutmahlzeit hatten. Weitere Verbesserungen bei der Speicherstabilität und den Kosten dürften den Anwendungsbereich erweitern.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Wir danken Dinora Lopes (IHMT-NOVA Animal Facility) für die technische Unterstützung, Joana Gomes und Ana Catarina Alves (IHMT-NOVA Insectary Facility) für die Erhaltung der Anopheles-Mückenkolonien. Gefördert durch die Bill and Melinda Gates Foundation (OPP1138841), Fundaéo para a Ciéncia e Tecnologia (UID/Multi/04413/201, UID/Multi/04326/2013, SFRH/BPD/89811/2012, CEECIND/00450/2017).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine 5'-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate | Sigma Aldrich | A2383 | |
| BSA-Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A790G | |
| Cholesterol | MP Biomedicals | 199342 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (high glucose with L-glutamine) | Lonza Bioscience | BE12-604F | |
| Entellan mounting medium | Merck | 1079610100 | |
| Glassfeeder | Local glazier | by design | |
| Heparin Sodium Salt | Pan Reac AppliChem | A3004,0001 | |
| Imalgène 1000 | Merial, Portugal | 01MER122 | |
| Needle 20 G x 1" 0.9 x 25 mm needle | Terumo Europe | NN-2025R | |
| Parafilm | Sigma Aldrich | P6543-1EA | |
| Rompun | Bayer, Portugal | 7427831 | |
| Sterilization Millex-HV 0,45 | Millipore | SLHVR25KS | |
| Syringe, 1ml, 27 G x ½" 0.4 x 12 mm needle | Terumo Europe | BS-NIN2713 | |
| Teich Mix Astra Pond | Astra | 4030733100957 | |
| Tetra Goldfish Flakes | Tetra | 4004218742642 |
References
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