Summary
Ett protokoll presenteras för formulering av en blodfri konstgjord kost för att mata Anopheles myggor i fångenskap. Denna kost har en liknande prestanda för att ryggradsdjur blod och utlöser oogenesis och ägg mognad och producerar livskraftig vuxen avkomma.
Abstract
Malariaforskning kräver storskaliga avels- och produktionsvillkor för myggor (Anopheles spp.) i fångenskap. Den hållbara och tillförlitliga produktionen av myggor hämmas för närvarande av tillgången på färskt ryggradsdjur. Alternativ till blod krävs för att främja effektiva kontrollstrategier för malaria och andra vektorburna sjukdomar som överförs av blodmatningsinsekter. Med detta i åtanke formulerades konstgjordflytande dieter som substitut för färskt ryggradsdjur. Häri rapporterar vi en blodfri konstgjord flytande kost som ger utfodring priser som liknar blod och härmar de fysiologiska effekterna av en färsk ryggradsdjur blod måltid. Kosten inducerar äggstocks- och äggmognad av Anopheles myggor och producerar också god larvöverlevnad och utveckling av funktionella vuxna. Den formulerade blodfria flytande kosten är ett viktigt framsteg mot hållbar myggavel i fångenskap och kommer att minska underhållskostnaderna för myggkolonier och eliminera behovet av färskt ryggradsdjur.
Introduction
Vektorburna sjukdomar drabbar flera miljoner människor över hela världen och orsakar miljontals dödsfall varje år. De överförs av insekter infekterade med sjukdomsproducerande mikroorganismer (protozoer, virus) som förvärvats när de matar på blod från en smittad värd. Därefter kommer den infekterade vektorn att överföra patogenen till en ny värd under nästa blodmåltid. Malaria är den dödligaste vektorburna sjukdom som överförs av flera olika arter av Anopheles mygga och påverkar 40% av världens befolkning1. Malariaprotistparasiten är ansvarig för mer än 400 000 dödsfall varje år, varav de flesta är barn under 5 år (Världshälsoorganisationen). Den kvinnliga Anopheles myggan överför malaria parasiten av Plasmodium släktet mellan människor och andra djur när den livnär sig på ryggradsdjur blod, ett nödvändigt steg för äggproduktion och utveckling2.
Nuvarande strategier för utrotning av malaria och andra framväxande dödliga mygga vektorburna sjukdomar förlitar sig på utvecklingen av innovativa myggbekämpning strategier3,4,5, som omfattar utsläpp i naturen av ett stort antal myggor uppfödda i insektsmedel. En avgörande begränsande faktor är dock beroendet av en tillförsel av färskt blod för effektiv mygguppfödning och avel. Den varierande sammansättningen av ryggradsdjur blod kan negativt påverka mygga fertilitet och avkomma fitness och kan begränsa tillförlitligheten och hållbarheten hos fångenskap häckningskolonier. Myggutsläpp och kontrollprogram kräver storskaliga myggproduktionssystem och en regelbunden leverans av stora mängder ryggradsdjur. Detta är ett stort hinder för myggproduktion och väcker en rad etiska frågor i samband med användning av levande djur och logistiska begränsningar som orsakas av de tillhörande krävande säkerhetsföreskrifterna. Detta gör kostnaderna för underhåll och säkerhet för myggkolonier höga och utmanar hållbarheten i nuvarande mygguppfödningsmetoder, särskilt i låginkomstländer där hotet om malaria är mycket större.
Nyligen har forskning fokuserats på utvecklingen av blodsubstitut som efterliknar en ryggradsdjur blodmåltid men hittills har endast begränsad framgång uppnåtts6,7,8,9. En framgångsrik konstgjord kost måste (1) provocera full kvinnlig mygga engorgement, (2) utlösa vitellogenin produktion, (3) producera stora partier av livskraftiga ägg, och (4) generera hedande avkomma10. Dessutom har konstgjordkost en standardsammansättning och är därför mer tillförlitliga för produktion av myggor för forsknings- och kontrolländamål. Framgångsrika blodfria dieter har utvecklats för Aedes myggor (granskas av Gonzales och Hansen11) men inte för Anopheles spp. Befintliga konstgjorda dieter innehåller en phagostimulant (t.ex. ATP10), en proteinkälla för äggmognad6,12, kolhydrater som en energikälla, och aminosyror (aa)13 som är grundläggande för äggproduktion och är en viktig begränsande faktor för mygga fertilitet14. En konstgjord blodfri kost måste också ge kolesterol15, vilket förbättrar äggproduktionen. Här beskriver vi en konstgjord blodfri kost för kvinnliga Anopheles myggor och visar att den har en konsekvent och likvärdig prestanda till en högkvalitativ ryggradsdjur blodmåltid.
Protocol
Möss erhölls från IHMT djurhuset. Djurförsök utfördes i strikt överensstämmelse med portugisisk lag och riktlinjer för användning av försöksdjur. Direção-Geral de Veterinária, Ministério da Agricultura do Desenvolvimento Rural e das Pescas, Portugal godkände alla studieprotokoll (id-godkännanden: 023351 och 023355).
Obs!
1. Myggor
- Underhåll Anopheles coluzzii (tidigare Anopheles gambiae M form) Yaoundé stam myggor vid 26 °C, 75% luftfuktighet under en 12 h:12 h ljus: mörk cykel. Husmyggor som använder standardinsektsförhållanden för att garantera parning.
- Samla mygga puppor i en liten vattenbehållare. Placera behållaren i en myggbur för att låta vuxna myggor växa fram och para sig. Ge 10% glukosmatningslösning. Tre dagar efter uppkomstsamla det nödvändiga antalet myggor från lagerburen med hjälp av en aspirator.
- En dag före utfodringsförsöken, ta bort 10% glukosmatningslösning.
OBS: 3 dagsgamla myggor användes under hela experimenten.
2. Myggmatning
- Beredning av konstgjordflytande dieter
- Förbered den konstgjorda flytande dieter under sterila förhållanden i ett laminärt flödeskåp. Förbered den rika flytande kosten (r-liq_diet) genom att lägga till följande till den ursprungliga flytande kosten (i-liq_diet; Dulbeccos modifierade Örns medium [högt glukos med L-glutamin], se tabell 1): 0,55 g/L ATP, 1 g/L-kolesterol och 200 g/L bovint serumalbumin (BSA). Blanda alla ingredienser noggrant och filtrera med ett mikrofilter på 0,45 μm.
Obs! Förvara inte kosten; förbereda dieter nyligen från lagerlösningar för varje experiment som de förlorar kvalitet när de lagras. Beståndsdelar i dieter beskrivs i tabell 1.
- Förbered den konstgjorda flytande dieter under sterila förhållanden i ett laminärt flödeskåp. Förbered den rika flytande kosten (r-liq_diet) genom att lägga till följande till den ursprungliga flytande kosten (i-liq_diet; Dulbeccos modifierade Örns medium [högt glukos med L-glutamin], se tabell 1): 0,55 g/L ATP, 1 g/L-kolesterol och 200 g/L bovint serumalbumin (BSA). Blanda alla ingredienser noggrant och filtrera med ett mikrofilter på 0,45 μm.
- Insamling av musblod
- Anestesi 6−8 veckor gamla CD1 honmöss (Mus musculus) med ketamin (120 mg/kg) och xylazin (16 mg/kg) med hjälp av intraperitoneal vägen.
- Utför hjärtpunktering (figur 1) när musen inte visar någon muskelreaktion som svar på olika fysiska stimuli (t.ex. tå- och svansklämmor).
- Samla blod med en steril 1 ml spruta med en 27 G x 1/2 '(0,4 x 12 mm2) nål som innehåller 100 μl 1 mg/ml heparin (natriumsalt) för att förhindra bildning av blodproppar. Håll blod vid 37 °C med hjälp av ett vattenbad.
- Artificiell utfodring
- Samla in cirka 30 kvinnliga myggor från lagerburen med hjälp av en aspirator.
- Överför de kvinnliga myggorna till 500 ml pappersmuggar och täck med ett fint myggnätsnät så att de inte kan fly. Applicera en glasmatare som är ansluten till plaströr för att bibehålla ett konstant vattenflöde till toppen av varje kopp (figur 2). Ge ett konstant vattenflöde till cylindriska slangar och mataren så att temperaturen inom hålls vid cirka 37,5 °C.
OBS: En standard glasklocka konstgjord utfodring apparat16 användes för att leverera den formulerade kostvanor till kvinnliga myggor. - Sträck paraffinfilmmembran över glasmatarens mun för att innehålla måltiden.
- Förvärm i-liq_diet och r-liq_diet vid 37 °C med hjälp av ett vattenbad. Applicera 1 ml i glasmataren. Mata myggorna i 60 min i mörkret med antingen i-liq_diet, r-liq_diet eller färskt musblod. Utför analyser vid 26 °C.
- Utvärdering av matningsgraden.
- Efter artificiell utfodring, kall-anestesiisera myggorna vid -20 °C i 30 s. Placera myggorna i en kyld petriskål.
- Spela in antalet helt engorged (figur 3) kvinnliga myggor.
OBS: Andelen fed myggor används som en proxy för utfodring framgång.
3. Egenskaper för livshistoria
- Äggproduktion och fertilitet
- Överför de helt engorged honorna med hjälp av en borste till enskilda burar (20 cm x 20 cm x 20 cm).
- Håll myggorna vid 26 ± 1 °C, 75% luftfuktighet och en 12 h:12 h ljus:mörk cykel med 10% glukos ad libitum.
- Fyrtioåtta timmar efter utfodring, tillsätt ett befuktat filterpapper längst ner för äggläggning (figur 4). Räkna äggen på 48 h och 72 h efter tillsats av ägget om papper med hjälp av en handhållen förstoringsglas. Översvämma filterpapperet med destillerat vatten för att samla äggen.
- Dödlighet i larver
- Samla äggen i brickor (23 cm x 15 cm x 6 cm) fyllda med destillerat vatten(figur 5). Håll vattennivån i brickorna konstant under experimenten.
- Mata larverna dagligen med ca 13 mg mald fiskmat per bricka. Applicera en liknande matningsregim på alla replikatbrickor.
- Ta bort döda puppa e och larver dagligen. Slutföra experimenten när alla pupae har utvecklats till vuxna och räkna antalet vuxna män och kvinnor.
- Registrera datumen för kläckning och död och beräkna dödligheten.
- Livslängd
- Samla 15 vuxna män och 15 vuxna kvinnor från F1 generation av varje diet grupp. Håll män och kvinnor i samma bur.
- Mata vuxna med en 10% glukoslösning ad libitum. Ta bort de döda vuxna dagligen.
- Håll myggorna vid samma temperatur, luftfuktighet, lätta cykelförhållanden och sockermatningssystem enligt beskrivningen ovan.
- Registrera dödsdatum och beräkna livslängden.
- Mätning av vinglängd
- Kallnarsatisera fem dagar gamla F1 vuxna myggor (manliga och kvinnliga) från varje dietgrupp vid -20 °C i 90 s.
- Under ett stereoscope, försiktigt greppa bröstkorgen av varje mygga med pincett och placera dem ventrala sidan upp.
- Samla båda vingarna med hjälp av en skalpell och placera dem på en ren mikroskoprutschbana som innehåller en torkad droppe monteringsmedium. Med hjälp av en 20 G nål tillsätt extra monteringsmedia till gränserna för täckslipen och sakta sänka täckslipen på vingarna.
- Mät vinglängden (figur 6) med ett stereoskop med en mikrometer.
Representative Results
De resultat som beskrivs nedan jämföra prestanda kvinnliga Anopheles myggor matas med den formulerade rika konstgjorda måltid (r-liq_diet) och myggor matas på den ursprungliga flytande kosten (i-liq_diet) eller en färsk blodmåltid. Kosten testades efter det schematiska protokoll som avbildas i figur 7. R-liq_diet som beskrivs häri är en del av ett patent (PCT/IB2019/052967).
Andel helt svullna kvinnor
Antalet engorged kvinnliga myggor matas med r-liq_diet (89%) signifikant högre än antalet svullna honor som utfodrats med blod (56 %) (figur8).
Fruktbarhet och fertilitet
Kvinnlig fecundity och fertilitet för den första gonotrophic cykeln användes för att utvärdera näringskvaliteten hos i-liq_diet och r-liq_diet. I genomsnitt lades 24 ± 11 ägg av kvinnor som utfodrats med färskt ryggradsdjur, medan kvinnor som utfodrats på r-liq_diet lade i genomsnitt 25 ± 5 ägg(tabell 2). Inga ägg läggning observerades av kvinnor matas på i-liq_diet.
F1 dödlighet
Lämpligheten av F1 myggor utvärderades mellan kolonier som matades på ryggradsdjur eller r-liq_diet. Larver, puppa och vuxendödlighet registrerades. Variabilitet (standardfel av medelvärdet [SEM]) var högre i de blodmatade myggorna(figur 9 och tabell 2) i förhållande till myggor som matade r-liq_diet. F1-generationen av myggor som matades på antingen blodet eller r-liq_diet hade jämförbar dödlighet och överlevnad.
F1 förväntad livslängd
Det uppskattas av Center for Disease Control and Prevention att vilda vuxna kvinnliga myggor lever i upp till en månad men förmodligen inte överlever i mer än 1−2 veckor och att män lever i ungefär en vecka och livnär sig uteslutande på nektar och andra sockerkällor. Det noteras att skillnader i föräldrarnas födointag kan påverka överlevnaden för mygga avkomma17. I vårt experiment hade vuxna kvinnor och män i blodet (24,5 ± 6,8; manliga 18,5 ± 6,9) och r-liq_diet (hona: 22,5 ± 8,1; manliga: 11,9 ± 6,9) grupper i genomsnitt sett till medellivslängden (tabell 3) och kvinnor visade en ökad livslängd i förhållande till män.
F1 kroppsstorlek
Vinglängd användes som en indikator på vuxen kroppsstorlek. Jämfört med andra arter är anopheles vuxna små till medelstora myggor med en vinglängd på mellan 2,8 till 4,4 mm vinglängd18. Vuxna kroppsstorlek f1 Anopheles myggor matas r-liq_diet var inom det förväntade intervallet och liknade blodmatade insektsmyggor(figur 10).
Statistisk analys
De uppgifter som presenteras representerar medelvärdet av minst tre oberoende experiment (om inget annat anges). Felstaplar representerar SEM. När data följde en Gaussisk distribution jämfördes oberoende grupper med hjälp av Elevens t-test, annars tillämpades Mann-Whitney-testet. Skillnaderna mellan de konstgjorda kostmatade grupperna analyserades med hjälp av Fishers exakta test och ansågs vara betydande vid P ≤ 0,05.
Figur 1: CD1-musblodsamling genom intracardiacpunktering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Standardutrustning för artificiell matning. Glasmataren innehåller r-liq_diet som matas till kvinnliga Anopheles myggor. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Anopheles myggor efter artificiell utfodring. Från vänster till höger: en helt engorged kvinna som erbjöds r-liq_diet, icke-engorged kvinna som erbjöds r-liq_diet, hane och helt engorged kvinna som erbjöds musblod. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Anopheles ägg som 48 h efter utfodring av kvinnor med r-liq_diet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: L2 larver stadier som utvecklats från äggen och samlades på filterpapper och placeras i brickor som innehåller destillerat vatten. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Högerkanten från en F1-generation av en Anopheles coluzzii kvinnlig mygga. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: Schematisk protokoll för artificiell kost testning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8: Utfodringsfrekvensen för de kvinnliga myggorna utfodras antingen den konstgjorda kosten eller blod. Asterisker indikerar betydande skillnader mellan myggorna matade r-vätska och i-flytande dieter och blodmatad kontrollgrupp. Dubbelsidig Fishers exakta test: ****P ≤ 0,0001 (relativ risk: 0,4828, 95% säker nivå [CL]: 0,3776 till 0,6194) för r-flytande kost kontra blod, *P = 0,0335 (relativ risk: 1,379, 95% CL: 1,044 till 1,836) för blod kontra i-flytande kost. Blå: unfed; röd: matad. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 9: Effekten av den formulerade blodfria måltiden på dödligheten och förhållandet mellan män och kvinnor av F1 Anopheles coluzzii myggor. Tre oberoende experiment utfördes, var och en med hjälp av 30 myggor per diet. Ett oparat t-test visade inga signifikanta skillnader mellan den blodmatade gruppen och den r-liq_diet matade gruppen (P-värdena varierade från 0,5047 till 0,8491). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 10: Vinglängd. Avståndet från axialsnittet till R4+5-venen exklusive franssetan användes för att bestämma vinglängden. Storleken utvärderades för 5 kvinnor och 5 hanar från varje kostgrupp (medelvärde ± SEM). Värden representeras som medelvärdet ± SEM. Lax: r-liq_diet; röd: ryggradsdjur. Oparade t-test; kvinnlig vänster vinge: t = 1,300, df = 8, P = 0,2298; hane vänster vinge: t = 2,400, df = 8, P = 0,0432; kvinnlig högervinge: t = 1,300, df = 8, P = 0,2298; manlig högervinge: t = 2,277, df = 7, P = 0,0569. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Komponenter | g/L (på 1960-) |
| *Adenosin trifosfat | 0.55 |
| *Bovin Serum Albumin | 200 |
| * Kolesterol | 1 |
| Vattenfri kalciumklorid | 0.2 |
| Kolinklorid | 0.004 |
| D-kalciumpantotenat (vitamin B5) | 0.004 |
| D-glukos vattenfri | 4.5 |
| Ferric nitrat nonahydrate | 0.0001 |
| Folsyra | 0.004 |
| Glycin | 0.03 |
| I-inositol | 0.007 |
| L-arginin monohydroklorid | 0.084 |
| L-cystindihydroklorid | 0.063 |
| L-glutamin | 0.584 |
| L-histidin monohydrokloridmonohydrat | 0.042 |
| L-isolucin | 0.105 |
| L-lucin | 0.105 |
| L-lysinmonohydroklorid | 0.146 |
| L-metionin | 0.03 |
| L-fenylalanin | 0.066 |
| L-serin | 0.042 |
| L-threonine (på 1960-talet) | 0.095 |
| L-tryptofan | 0.016 |
| L-tyrosin dinatriumsaltdihydrat | 0.104 |
| L-valin | 0.094 |
| Vattenfri magnesiumsulfat | 0.098 |
| Niacinamid (nikotinamid) | 0.004 |
| Fenol röd | 0.015 |
| Kaliumklorid | 0.4 |
| Pyridoxinmonohydroklorid | 0.004 |
| Natriumsalt för pyruvicsyra | 0.011 |
| Riboflavin (vitamin B2) | 0.0004 |
| Natriumbikarbonat | 3.7 |
| Natriumklorid | 6.4 |
| Natriumfosfat monobasfritt vattenfritt | 0.109 |
| Tiamin amonohydroklorid (vitamin B1) | 0.004 |
| *Endast i r-liq_diet | |
Tabell 1: Sammansättningen av i-flytande kost och r-flytande kost.
| Totalt äggnummer (± SEM) | Ägg/hona (± SEM) | |
| Blod | 733 ± 330 | 24 ± 11 |
| r-liq_diet | 763 ± 164 | 25 ± 5 |
| i-liq_diet | 0 | 0 |
Tabell 2: Äggpartier som produceras av Anopheles coluzzii-honor. Tre oberoende experiment utfördes för varje experimentell kost med hjälp av 30 kvinnliga myggor i varje.
| Kvinnor (dagar ± SEM) | Hanar (dagar ± SEM) | |
| Blod | 24.5 ± 6,8 | 18,5 ± 6,9 |
| r-liq_diet | 22.5 ± 8,1 | 11.9 ± 6,9 |
Tabell 3: Förväntad livslängd för F1 Anopheles myggor. Livslängden på F1 myggor från artificiellt utfodradeS F0 bedömdes genom att registrera födelsedatum och död för varje mygga som kommer från samma kostgrupp (15 kvinnor och 15 män följdes). Resultaten representeras som den genomsnittliga mygglivslängden per dietgrupp.
Discussion
Framgången för vår formulerade blodfria kost är sannolikt resultatet av den synergistiska fysiologiska effekten av alla komponenter som läggs till i-liq_diet (rik på socker, aminosyror, vitaminer och mikroelement): BSA (proteinkälla), ATP (phagostimulant) och kolesterol (lipidkälla). Tillskott av r-liq_diet med de enskilda komponenterna ensamt var inte effektivt för att stimulera äggproduktion (data som inte visas). En nackdel med protokollet kan vara kostnaden för några av komponenterna, såsom kolesterol. Trots detta är dess närvaro grundläggande, eftersom insekter inte kan syntetisera det19 och denna molekyl är föregångaren till ecdysteroid hormoner som reglerar äggula syntes och ägg mognad i leddjur20. Lägre mängder kolesterol bör testas för att optimera den mängd som behövs i syfte att minska kostnaderna och öka fördelarna med den konstgjorda kosten.
En annan begränsning av metoden är att den konstgjorda kosten måste vara nyberedd från lagerlösningar, som en gång utarbetats i sin slutliga flytande form förlorar den kvalitet efter lagring. I framtiden vår formulerade kost kan förberedas som en torkad makt, liknande SkitoSnackt, en konstgjord blod måltid ersättning för Aedes aegypti myggor21.
Förutom att leverera nödvändiga näringsämnen, en konstgjord måltid måste locka och stimulera kvinnliga myggor att mata på samma sätt som när de livnär sig på ryggradsdjur färskt blod. Den konstgjorda blodfria kosten häri beskrivs resulterade i en 20% ökning av helt engorged kvinnliga myggor jämfört med ryggradsdjur blod matas grupp. Detta indirekta mått på attraktion skulle kunna förtydligas ytterligare genom att använda olfactometrar för att bekräfta att den konstgjorda kosten är mer attraktiv och mer tilltalande för myggor än färskt blod.
Den högsta effekten av kosten på larvdödlighet observerades för larver som härrör från myggor som utfodrats på blod, vilket tyder på att en konstgjord kost av stabil sammansättning kan bidra till att minska dödligheten och förbättra mygga avel framgång jämfört med färskt blod. Det mindre förutsägbara resultatet av en blodmåltid kan uppstå från värdvariationer i sammansättning17 och närvaron i blodet av molekyler som kan störa myggfysiologi22. De föregående fakta betonar fördelarna för högkvalitativa myggor uppfödning av färsk-blodfri kost.
Totalt sett var det genomsnittliga antalet ägg som lades i vår studie lågt i förhållande till dem som rapporterades i vissa insektsmedel, men det genomsnittliga antalet oviposited ägg var jämförbart med A. gambiae laboratorium-uppfödda stam matas på humant blod (22,6 ± 5,5 ägg/ hona)23. Inga signifikanta statistiska skillnader observerades mellan våra experimentella grupper som utfodrats på antingen färskt blod eller på de konstgjorda måltiderna (tabell 2), vilket tyder på att genomförandet av ett artificiellt membranmatningssystem med vår formulerade kost är tillräcklig för att upprätthålla och sprida anofheles myggkolonier i fångenskap.
Konstgjorda blodfria måltider kan upprätthålla Aedes kolonier22, men när de appliceras på Anopheles myggor de är av begränsad eller ingen framgång11. Nyligen beskrevs en plasmabaserad konstgjord måltid för Anopheles myggor24 men utfodringsfrekvensen och reproduktionspotentialen var låg. Våra resultat utgör ett betydande framsteg i toppmodern (granskas av Gonzales och Hansen11)som vår formulerade r-liq_diet hade en liknande eller bättre prestanda än standard ryggradsdjur blod måltid. Ytterligare förbättringar av lagringsstabilitet och lagringskostnader bör utvidga tillämpningsområdets omfattning.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi vill tacka Dinora Lopes (IHMT-NOVA Animal Facility) för teknisk support, Joana Gomes och Ana Catarina Alves (IHMT-NOVA Insectary Facility) för att upprätthålla Anopheles myggkolonier. Finansierat av Bill and Melinda Gates Foundation (OPP1138841), Fundação para a Ciência e Tecnologia (UID/Multi/04413/201, UID/Multi/04326/2013, SFRH/BPD/89811/2012, CEECIND/00450/2017).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine 5'-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate | Sigma Aldrich | A2383 | |
| BSA-Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A790G | |
| Cholesterol | MP Biomedicals | 199342 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (high glucose with L-glutamine) | Lonza Bioscience | BE12-604F | |
| Entellan mounting medium | Merck | 1079610100 | |
| Glassfeeder | Local glazier | by design | |
| Heparin Sodium Salt | Pan Reac AppliChem | A3004,0001 | |
| Imalgène 1000 | Merial, Portugal | 01MER122 | |
| Needle 20 G x 1" 0.9 x 25 mm needle | Terumo Europe | NN-2025R | |
| Parafilm | Sigma Aldrich | P6543-1EA | |
| Rompun | Bayer, Portugal | 7427831 | |
| Sterilization Millex-HV 0,45 | Millipore | SLHVR25KS | |
| Syringe, 1ml, 27 G x ½" 0.4 x 12 mm needle | Terumo Europe | BS-NIN2713 | |
| Teich Mix Astra Pond | Astra | 4030733100957 | |
| Tetra Goldfish Flakes | Tetra | 4004218742642 |
References
- WHO. World Malaria Report. , World Health Organization. (2016).
- Hansen, I. A., Attardo, G. M., Rodriguez, S. D., Drake, L. L. Four-way regulation of mosquito yolk protein precursor genes by juvenile hormone-, ecdysone-, nutrient-, and insulin-like peptide signaling pathways. Frontiers in Physiology. 5, 103 (2014).
- Catteruccia, F., Crisanti, A., Wimmer, E. A. Transgenic technologies to induce sterility. Malaria Journal. 8, Suppl 2 7 (2009).
- Dame, D. A., Curtis, C. F., Benedict, M. Q., Robinson, A. S., Knols, B. G. J. Historical applications of induced sterilisation in field populations of mosquitoes. Malaria Journal. 8, Suppl 2 2 (2009).
- Lacroix, R., et al. Open Field Release of Genetically Engineered Sterile Male Aedes aegypti in Malaysia. PLoS One. 7, 42771 (2012).
- Lea, A. O., Knierim, J. A., Dimond, J. B., Delong, D. M. A Preliminary Note on Egg Production from Milk-Fed Mosquitoes. The Ohio Journal of Science. 55, 1-21 (1955).
- Kogan, P. H. Substitute blood meal for investigating and maintaining Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 27, 709-712 (1990).
- Griffith, J. S., Turner, G. D. Culturing Culex quinquefasciatus mosquitoes with a blood substitute diet for the females. Medical and Veterinary Entomology. 10, 265-268 (1996).
- Jason Pitts, R. A blood-free protein meal supporting oogenesis in the Asian tiger mosquito, Aedes albopictus (Skuse). Journal of Insect Physiology. 64, 1-6 (2014).
- Gonzales, K. K., Tsujimoto, H., Hansen, I. A. Blood serum and BSA, but neither red blood cells nor hemoglobin can support vitellogenesis and egg production in the dengue vector Aedes aegypti. PeerJ. 3, 938 (2015).
- Gonzales, K. K., Hansen, I. A. Artificial Diets for Mosquitoes. International Journal of Environmental Research and Public Health. 13 (12), 1267 (2016).
- Cosgrove, J. B., Wood, R. J. Effects of variations in a formulated protein meal on the fecundity and fertility of female mosquitoes. Medical and Veterinary Entomology. 10, 260-264 (1996).
- Attardo, G. M., Hansen, I. A., Shiao, S. -H., Raikhel, A. S. Identification of two cationic amino acid transporters required for nutritional signalling during mosquito reproduction. Journal of Experimental Biology. 209, 3071-3078 (2006).
- Clements, A. N. The biology of mosquitoes: Development, nutrition, and reproduction. , Chapman & Hall. New York, NY. (1992).
- Talyuli, O. A., et al. The use of a chemically defined artificial diet as a tool to study Aedes aegypti physiology. Journal of Insect Physiology. 83, 1-7 (2015).
- Lopes, L. F., Abrantes, P., Silva, A. P., Dorosario, V. E., Silveira, H. Plasmodium yoelii: The effect of second blood meal and anti-sporozoite antibodies on development and gene expression in the mosquito vector, Anopheles stephensi. Experimental Parasitology. 115, 259-269 (2007).
- Phasomkusolsil, S., et al. Maintenance of mosquito vectors: effects of blood source on feeding, survival, fecundity, and egg hatching rates. Journal of Vector Ecology. 38, 38-45 (2013).
- Gillies, M. T., De Meillon, B. The Anophelinae of Africa South of the Sahara (Ethiopian zoogeographical region). Publications of the South African Institute for Medical Research. 54, 1 (1968).
- Canavoso, L. E., Jouni, Z. E., Karnas, K. J., Pennington, J. E., Wells, M. A. Fat metabolism in insects. Annual Review of Nutrition. 21, 23-46 (2001).
- Clifton, M. E., Noriega, F. G. The fate of follicles after a blood meal is dependent on previtellogenic nutrition and juvenile hormone in Aedes aegypti. Journal of Insect Physiology. 58, 1007-1019 (2012).
- Gonzales, K. K., et al. The Effect of SkitoSnack, an Artificial Blood Meal Replacement on Aedes aegypti Life History Traits and Gut Microbiota. Scientific Reports. 8, 11023 (2018).
- Vodovotz, Y., Zamora, R., Lieber, M. J., Luckhart, S. Cross-talk between nitric oxide and transforming growth factor-beta1 in malaria. Current Molecular Medicine. 4, 787-797 (2004).
- Sumba, L. A., et al. Daily oviposition patterns of the African malaria mosquito Anopheles gambiae Giles (Diptera: Culicidae) on different types of aqueous substrates. Journal of Circadian Rhythms. 2, 6 (2004).
- Baughman, T., et al. A highly stable blood meal alternative for rearing Aedes and Anopheles mosquitoes. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11, 0006142 (2017).
