Summary
提出了一种配方无血的人工饮食，以喂养圈养的蚊子的协议。这种饮食具有与脊椎动物血液类似的性能，并触发卵子生成和卵子成熟，并产生可行的成年后代。
Abstract
疟疾研究需要大规模繁殖和生产条件，为圈养的蚊子（疟原虫）提供。目前，由于供应新鲜脊椎动物血液，蚊子的可持续和可靠生产受到抑制。需要替代血液，以促进对疟疾和其他由供血昆虫传播的病媒传播疾病的有效控制战略。考虑到这一点，人工液体饮食被配制为新鲜脊椎动物血液的替代品。在这里，我们报告无血的人工液体饮食，提供与血液相似的喂养速率，并模仿新鲜脊椎动物血粉的生理效应。饮食诱导卵巢和卵子成熟，对蚊虫进行繁殖，对功能性成人产生良好的幼虫生存发育。配制的无血液体饮食是向圈养的蚊子可持续繁殖迈进的重要一项，将降低蚊虫群落的维持成本，消除对新鲜脊椎动物血液的需求。
Introduction
病媒传播的疾病影响全世界数百万人，每年造成数百万人死亡。它们由感染产生疾病的微生物（原生动物、病毒）的昆虫传播，这些微生物在以受感染宿主的血液为食时获得。随后，受感染的病媒在下一次血餐期间将病原体传染给新的宿主。疟疾是最致命的病媒传播的疾病，由几种不同种类的阿诺菲勒蚊子传播，影响世界人口的40%。疟疾原虫寄生虫每年造成40多万人死亡，其中大多数是5岁以下的儿童（世界卫生组织）。雌性疟原虫在以脊椎动物血液为食时，在人类和其他动物之间传播疟原虫，这是卵子生产发育的必要步骤。
目前消灭疟疾和其他新出现的致命蚊媒传播疾病的策略，有赖于制定创新的蚊虫控制策略3、4、5，其中包括将大量在昆虫中繁殖的蚊子释放到野外。然而，一个关键的限制因素是依赖新鲜血液供应，以便有效地饲养和繁殖蚊子。脊椎动物血液的可变成分会对蚊子的生育能力和后代健康产生负面影响，并可能限制圈养繁殖地的可靠性和可持续性。蚊子的释放和控制计划需要大规模的蚊子生产系统和定期供应大量的脊椎动物血液。这是蚊子生产的主要障碍，并引发了一系列与使用活体动物相关的道德问题，以及相关要求苛刻的安全法规造成的后勤限制。这使得蚊子群落的维持和安全费用很高，对目前蚊子饲养做法的可持续性提出了挑战，特别是在疟疾威胁大得多的低收入国家。
最近研究的重点是开发模仿脊椎动物血粉的血液替代品，但到目前为止，只有有限的成功取得了6，7，8，9。成功的人工饮食需要 （1） 引发全雌性蚊虫的侵放，（2） 触发维特洛根宁生产，（3） 生产大批量的活卵，（4） 产生热的后代10。此外，人工饮食具有标准成分，因此对于用于研究和控制目的的蚊子生产更可靠。已经为伊蚊开发了成功的无血饮食（由冈萨雷斯和汉森11审查），但不包括阿诺菲尔斯，现有的人工饮食含有一种噬菌体（例如ATP10），一种蛋白质来源，用于卵子成熟6，12，碳水化合物作为能量来源，氨基酸（aa）13是卵子生产的基础，是蚊子生育能力的主要限制因素。人工无血饮食也需要提供胆固醇15，从而改善卵子的产生。在这里，我们描述了一种针对雌性阿诺菲斯蚊子的人工无血饮食，并证明它具有与高品质脊椎动物血粉一致且同等的性能。
Protocol
老鼠是从IHMT动物馆获得的。动物实验严格按照葡萄牙法律和实验室动物使用准则进行。葡萄牙德森沃尔维门托农村省农业综合研究所批准了所有研究协议（批准：023351和023355）。
注：在+26°C下执行所有进料测定。
1. 蚊子
- 保持阿诺菲莱斯科鲁齐（前阿诺菲莱斯冈比亚M形式）雅温得应变蚊子在26°C，75%湿度下12小时：黑暗周期。使用标准昆虫条件来保证交配的蚊子。
- 将蚊虫放入一个小水容器中。将容器放在蚊子笼内，让成年蚊子出现并交配。提供10%葡萄糖喂养溶液。出现三天后，使用吸气器从库笼中收集所需数量的蚊子。
- 在喂食试验前一天，去除10%的葡萄糖喂养溶液。
注：在整个实验中使用了3天大的蚊子。
2. 蚊子喂食
- 人工液体饮食的制备
- 在层流柜中无菌条件下准备人工液体饮食。通过在初始液体饮食（i-liq_diet中添加以下内容，准备丰富的液体饮食（r-liq_diet）;Dulbeco 的改性 Eagle 的中度 [高葡萄糖与 L-谷氨酰胺]，见表 1： 0.55 g/L ATP，1 g/L 胆固醇和 200 g/L 牛血清白蛋白 （BSA）。彻底混合所有成分，并使用 0.45 μm 微过滤器过滤。
注意：不要储存饮食;准备饮食新鲜从股票解决方案为每个实验，因为他们失去质量时存储。表1描述了饮食的组成部分。
- 在层流柜中无菌条件下准备人工液体饮食。通过在初始液体饮食（i-liq_diet中添加以下内容，准备丰富的液体饮食（r-liq_diet）;Dulbeco 的改性 Eagle 的中度 [高葡萄糖与 L-谷氨酰胺]，见表 1： 0.55 g/L ATP，1 g/L 胆固醇和 200 g/L 牛血清白蛋白 （BSA）。彻底混合所有成分，并使用 0.45 μm 微过滤器过滤。
- 小鼠采血
- 使用腹膜内途径用氯胺酮（120毫克/千克）和木兰辛（16毫克/千克）麻醉6-8周大CD1雌性小鼠（肌肉）。
- 当小鼠对不同的物理刺激（例如脚趾和尾部捏合）没有反应时，执行心脏穿刺（图1）。
- 使用含有100μL1mg/mL肝素（钠盐）的无菌1mL注射器（0.4 x 12 mm2）针收集血液，以防止血栓的形成。使用水浴在37°C下保持血液。
- 人工喂养
- 使用吸气器从笼子收集大约 30 只雌性蚊子。
- 将雌性蚊子转移到500 mL纸杯中，用细蚊网网覆盖，这样它们就无法逃脱。应用连接到塑料管的玻璃进纸器，以保持恒定的水流到每个杯的顶部（图2）。向圆柱形油管和进料器提供恒定的水流，使温度保持在约 37.5 °C。
注：标准玻璃钟人工喂食装置16用于向雌性蚊子提供配制饮食。 - 将石蜡薄膜膜拉伸到玻璃喂食器的口中，以包含膳食。
- 使用水浴在37°C下预热i-liq_diet和r-liq_diet。将 1 mL 涂抹在玻璃进纸器中。用i-liq_diet、r-liq_diet或新鲜的小鼠血液在黑暗中给蚊子喂食60分钟。在26°C下进行检测。
- 喂养速率的评估。
- 人工喂食后，在-20°C下对蚊子进行30s的冷麻醉。将蚊子放入冷藏的培养皿中。
- 记录完全被叮咬的雌性蚊子的数量（图3）
注：喂食的蚊子的百分比被用作喂养成功的代理。
3. 生活历史特征
- 鸡蛋产量和生育能力
- 用刷子将完全灌注的雌性转移到单独的笼子（20 厘米 x 20 厘米 x 20 厘米）。
- 将蚊子保持在26~1°C、75%湿度和12小时12小时光：暗循环，10%葡萄糖。
- 喂食后48小时，在底部加入加湿滤纸，用于产卵（图4）。使用手持式放大镜添加产卵纸后，在 48 小时和 72 h 处计数鸡蛋。用蒸馏水浇过滤纸收集鸡蛋。
- 幼虫死亡率
- 将鸡蛋收集到装满蒸馏水的托盘（23 厘米 x 15 厘米 x 6 厘米）中（图 5）。在实验期间保持托盘中的水位恒定。
- 每天用每盘约13毫克的地面鱼食物喂养幼虫。对所有复制托盘应用类似的进料系统。
- 每天清除死虫和幼虫。完成实验时，所有pupae已经发展成成人，并计算成年男性和女性的数量。
- 登记孵化和死亡日期，并计算死亡率。
- 长寿
- 从每个饮食组的F1代收集15名成年男性和15名成年女性。把雄性与雌性放在同一个笼子里。
- 用10%葡萄糖溶液为成人喂食。每天清除死去的成年人。
- 保持蚊子在相同的温度，湿度，光循环条件和糖喂养制度，如上文所述。
- 登记死亡日期并计算寿命。
- 翼长测量
- 从每个饮食组在-20°C下对5天大的F1成年蚊子（男性和女性）进行90度冷麻醉。
- 在立体镜下，用钳子轻轻抓住每只蚊子的胸腔，并把它们放在腹腔上。
- 使用手术刀收集两个翅膀，并将其放在包含安装介质干燥滴的干净的显微镜幻灯片上。借助 20 G 针，在盖玻片的边界上添加额外的安装介质，然后慢慢将盖玻片降低到机翼上。
- 使用千分尺使用立体镜测量机翼长度（图6）。
Representative Results
下面描述的结果比较了雌性阿诺菲勒蚊子与配方丰富的人工餐（r-liq_diet）和以初始液体饮食（i-liq_diet）或新鲜血液粉喂养的蚊子的表现。饮食按照图7所示的原理图协议进行测试。此处描述的r-liq_diet是专利（PCT/IB2019/052967）的一部分。
完全被包围的女性百分比
用r-liq_diet喂养的雌性蚊子数量（89%）明显高于用血喂养的雌性（56%）（图8）
生育力和生育力
第一个淋病周期的女性生育力和生育能力用于评估i-liq_diet和r-liq_diet的营养质量。雌性以新鲜脊椎动物血液喂养，平均产下24~11个卵子，而以r-liq_diet喂养的雌性平均产下25~5个卵子（表2）。在i-liq_diet喂养的雌性没有观察到产卵。
F1 死亡率
F1蚊子的适应性在以脊椎动物血液或r-liq_diet喂养的菌落之间被评估。有记录到幼虫、幼虫和成人死亡率。与喂食r-liq_diet的蚊子相比，用血喂养的蚊子的变异性（平均[SEM]的标准误差）较高（图9和表2）。以血液或r-liq_diet喂养的F1代蚊子的死亡率和存活率相当。
F1 预期寿命
据美国疾病控制和预防中心估计，野生成年雌性蚊子活一个月，但存活时间可能超过1⁄2周，雄性蚊子活一周左右，只靠花蜜和其他糖源进食。值得注意的是，父母食物摄入量的差异可能会影响蚊子后代17的生存。在我们的实验中，成年女性和男性血液（女性24.5~6.8;男性18.5~6.9）和r-liq_diet（女性：22.5~8.1;男性：11.9~6.9）组平均预期寿命平均值（表3），女性预期寿命与男性相比增加。
F1 车身尺寸
翼长被用作成人体型的指标。与其他物种相比，阿诺菲勒成年蚊子是中小型蚊子，翅膀长度在2.8至4.4毫米之间，翼长18。喂食r-liq_diet的F1厌食蚊子的成年体型在预期范围内，与用血喂养的昆虫蚊子相似（图10）。
统计分析
提供的数据代表至少三个独立实验的平均值（除非另有说明）。错误条表示 SEM。当数据跟随高斯分布时，使用学生 t 测试对独立组进行比较，否则应用曼-惠特尼测试。使用费舍尔的精确测试对人工饮食喂养组之间的差异进行了分析，在P = 0.05下被认为是显著的。
图1：CD1小鼠血液通过心内穿刺采集。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：标准人工喂食装置。玻璃喂食器含有r-liq_diet，被喂给雌性阿诺菲斯蚊子。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：人工喂养后蚊虫。从左至右：提供r-liq_diet，非灌注女性，提供r-liq_diet，男性，和完全灌注的女性，提供小鼠血液。请点击此处查看此图的较大版本。
图4：用r-liq_diet在雌性喂养后产卵48小时。请点击此处查看此图的较大版本。
图5：从鸡蛋中发育的L2幼虫阶段，收集在滤纸上，放入含有蒸馏水的托盘中。请点击此处查看此图的较大版本。
图6：右翼从F1一代的阿诺菲莱斯科鲁齐雌性蚊子。请点击此处查看此图的较大版本。
图7：人工饮食检测的原理方案。请点击此处查看此图的较大版本。
图8：雌性蚊子喂食人工饮食或供血的喂养率。星号表明喂食r-Liquid和i-液体饮食的蚊子与血液喂养对照组之间存在显著差异。双面费舍尔的精确测试： =P = 0.0001 （相对风险： 0.4828， 95% 置有信心水平 [CL]： 0.3776 到 0.6194） 用于 r-液体饮食与血液， *P = 0.0335 （相对风险： 1.379， 95% CL： 1.044 到 1.836） 用于血液与 i-液体饮食。蓝色：未喂养;红色：喂食。请点击此处查看此图的较大版本。
图9：配制的无血膳食对F1异种蚊的死亡率和男女比例的影响。 进行了三个独立的实验，每个实验每只使用30只蚊子。未配对的t-测试显示，血液喂养组和r-liq_diet喂养组（P值从0.5047到0.8491）之间没有显著差异。请点击此处查看此图的较大版本。
图10：翼长。从轴向切口到 R4+5 静脉（不包括边缘 seta）的距离用于确定翼距长度。对来自每个饮食组的 5 名女性和 5 名男性（均值 = SEM）的大小进行了评估。值表示为平均值 = SEM. 鲑鱼：r-liq_diet;红色：脊椎动物血液。未配对的 t 检验;雌性左翼：t = 1.300，df = 8，P = 0.2298;雄左翼：t = 2.400，df = 8，P = 0.0432;女性右翼：t = 1.300，df = 8，P = 0.2298;男性右翼：t = 2.277，df = 7，P = 0.0569。请点击此处查看此图的较大版本。
| 组件 | 克/升 |
| ・三磷酸腺苷 | 0.55 |
| *牛血清白蛋白 | 200 |
| *胆固醇 | 1 |
| 氯化钙无水 | 0.2 |
| 胆碱氯化物 | 0.004 |
| D-钙泛酸酯（维生素B5） | 0.004 |
| D-葡萄糖无水 | 4.5 |
| 硝酸铁非水合物 | 0.0001 |
| 叶酸 | 0.004 |
| 甘 氨 酸 | 0.03 |
| 伊奥西托 | 0.007 |
| L-精氨酸单盐 | 0.084 |
| L-半胱氨酸二盐 | 0.063 |
| L-谷氨酰胺 | 0.584 |
| L-组氨酸单盐单水合物 | 0.042 |
| L-isoleucine | 0.105 |
| L-莱辛 | 0.105 |
| L-利氨酸单盐 | 0.146 |
| L-美西宁 | 0.03 |
| L-苯丙氨酸 | 0.066 |
| L-丝氨酸 | 0.042 |
| L-threonine | 0.095 |
| L-锥顶 | 0.016 |
| L-酪氨酸二钠二分氰酸盐二水合物 | 0.104 |
| L-Valine | 0.094 |
| 硫酸镁无水 | 0.098 |
| 烟酰胺（烟酰胺） | 0.004 |
| 苯酚红色 | 0.015 |
| 氯化钾 | 0.4 |
| 单盐的苯二恶烷 | 0.004 |
| 皮鲁维奇酸钠盐 | 0.011 |
| 核黄素（维生素B2） | 0.0004 |
| 碳酸氢钠 | 3.7 |
| 氯化钠 | 6.4 |
| 磷酸钠单基无水 | 0.109 |
| 盐酸盐胺（维生素B1） | 0.004 |
| *仅在 r-liq_diet | |
表1：i-液体饮食和r-液体饮食的组成。
| 鸡蛋总数（= SEM） | 鸡蛋/雌性 （= SEM） | |
| 血 | 733 × 330 | 24 × 11 |
| r-liq_diet | 763 × 164 | 25 × 5 |
| i-liq_diet | 0 | 0 |
表2：由阿诺菲莱斯·科鲁齐女性生产的鸡蛋批次。对每种实验饮食进行了三次独立的实验，每个实验饮食中分别使用30只雌性蚊子。
| 女性（天 = SEM） | 男性（天 = SEM） | |
| 血 | 24.5 × 6.8 | 18.5 × 6.9 |
| r-liq_diet | 22.5 × 8.1 | 11.9 × 6.9 |
表3：F1异种蚊子的预期寿命。通过记录来自同一饮食组的每只蚊子的出生日期和死亡日期（15只雌性蚊子和15只雄性蚊子）来评估人工喂养F0的F1蚊子的寿命。结果表示为每个饮食组蚊子的平均寿命。
Discussion
我们配制的无血饮食的成功可能是添加到i-liq_diet（富含糖、氨基酸、维生素和微量元素）的所有成分的协同生理作用的结果：BSA（蛋白质来源）、ATP（磷酸激有关人士）和胆固醇（脂源）。仅用单个成分补充r-liq_diet并不能有效刺激卵子生产（未显示数据）。该协议的一个缺点是某些组件的成本，如胆固醇。即便如此，它的存在是根本的，因为昆虫无法合成它19，这个分子是调节蛋黄合成和蛋成熟节肢动物20的蛋黄合成和卵子成熟前体。应测试较低的胆固醇含量，以优化所需数量，以降低成本和增加人工饮食的好处。
该方法的另一个限制是，人工饮食必须从库存溶液中新鲜制备，因为一旦以最终液体形式制备，储存后就会失去质量。将来，我们配制的饮食可以准备作为干的力量，类似于SkitoSnackt，一种人工血粉替代伊蚊21。
除了提供必要的营养外，人工餐还需要吸引和刺激雌性蚊子以与脊椎动物新鲜血液为食的方式进食。本文描述的人工无血饮食，与脊椎动物血液喂养组相比，完全感染雌性蚊子的繁殖率增加了20%。这种间接的吸引力测量可以通过使用人工测量仪来进一步澄清，以确认人工饮食比新鲜血液更有吸引力，对蚊子更有吸引力。
观察到饮食对幼虫死亡率的影响最大，来自以血液喂养的蚊子的幼虫，这表明与新鲜血液相比，稳定成分的人工饮食有助于降低死亡率，提高蚊子繁殖的成功。血粉的较不可预测的结果可能来自成分17的宿主变异和血液中可能干扰蚊子生理22的分子的存在。上述事实强调了高质量蚊子饲养新鲜无血饮食的优点。
总体而言，我们研究中产卵的平均数量与一些昆虫中报告的卵子数量相比较低，但卵子的平均数量与以人类血液为食的A.gambiae实验室培育的菌株（22.6 ~ 5.5卵/母）23相当。以新鲜血液或人工膳食为食的实验组之间没有观察到显著的统计差异（表2），表明采用我们配制饮食的人工膜喂养系统足以维持和繁殖圈养的阿诺菲蚊菌群。
人工无血膳食可维持艾蚊菌群22，但当应用于阿诺菲斯蚊子时，它们有限或没有成功11。最近，一种以血浆为基础的人工餐为阿诺菲勒蚊子描述了24，但喂养率和繁殖潜力很低。我们的研究结果代表了最先进的（由冈萨雷斯和汉森11审查）的实质性进步，因为我们的配方r-liq_diet有类似或更好的性能比标准的脊椎动物血粉。进一步改进存储稳定性和成本应扩大其应用范围。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们要感谢迪诺拉·洛佩斯（IHMT-NOVA动物设施）的技术支持，乔安娜·戈麦斯和阿纳·卡塔琳娜·阿尔维斯（IHMT-NOVA昆虫设施）为维持阿诺菲斯蚊子群落。由比尔和梅林达·盖茨基金会（OPP1138841）资助，国际发展基金（UID/04413/201、UID/04326/2013、SFRH/BPD/89811/2012、CEECIND/00450/2017）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenosine 5'-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate | Sigma Aldrich | A2383 | |
| BSA-Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A790G | |
| Cholesterol | MP Biomedicals | 199342 | |
| Dulbecco's modified Eagle's medium (high glucose with L-glutamine) | Lonza Bioscience | BE12-604F | |
| Entellan mounting medium | Merck | 1079610100 | |
| Glassfeeder | Local glazier | by design | |
| Heparin Sodium Salt | Pan Reac AppliChem | A3004,0001 | |
| Imalgène 1000 | Merial, Portugal | 01MER122 | |
| Needle 20 G x 1" 0.9 x 25 mm needle | Terumo Europe | NN-2025R | |
| Parafilm | Sigma Aldrich | P6543-1EA | |
| Rompun | Bayer, Portugal | 7427831 | |
| Sterilization Millex-HV 0,45 | Millipore | SLHVR25KS | |
| Syringe, 1ml, 27 G x ½" 0.4 x 12 mm needle | Terumo Europe | BS-NIN2713 | |
| Teich Mix Astra Pond | Astra | 4030733100957 | |
| Tetra Goldfish Flakes | Tetra | 4004218742642 |
References
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