Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

דיאטה ללא דם ליתושים Anopheline אחוריים

doi: 10.3791/60144 Published: January 31, 2020

Summary

פרוטוקול מוצג לניסוח של דיאטה מלאכותית ללא דם כדי להאכיל אנופלס יתושים בשבי. דיאטה זו יש ביצועים דומים דם בעלי חוליות ומפעיל oogenesis והתבגרות ביצה ומייצרת צאצאי מבוגרים קיימא.

Abstract

מחקר מלריה דורש גידול בקנה מידה גדול ותנאי ייצור עבור יתושים (אנופלס spp.) בשבי. הייצור האמין והבר-קיימא של היתושים מעוכב כיום על ידי אספקת דם טרי בעלי חוליות. חלופות לדם נדרשות לקדם אסטרטגיות בקרה יעילות למלריה ומחלות וקטוריות אחרות המועברות על ידי חרקים מזינים בדם. עם זאת, תזונה נוזלית מלאכותית גובשה כתחליף לדם של בעלי חוליות טרי. כאן אנו מדווחים על דיאטה נוזלית מלאכותית נטולת דם המספקת שיעורי האכלה דומים לדם ומחקה את ההשפעות הפיזיולוגיות של ארוחה טרייה בעלי חוליות דם. הדיאטה גורמת התבגרות השחלות הביצית של יתושים אנופלס וגם מייצרת זחל הישרדות טוב ופיתוח של מבוגרים פונקציונליים. דיאטה נוזלית ללא דם הוא מקדמה חשובה לקראת גידול יתושים בר קיימא בשבי, תפחית את עלויות תחזוקה של מושבות יתושים ולחסל את הצורך בדם בעלי חוליות טריים.

Introduction

מחלות וקטוריות המועברות להשפיע על כמה מיליוני בני אדם ברחבי העולם ולגרום למיליוני מקרי מוות מדי שנה. הם מועברים על ידי חרקים נגועים במחלות המייצרות מחלות (פרוטוזוזה, וירוסים) רכשה כאשר הם ניזונים מדם מארח נגוע. לאחר מכן, וקטור נגוע יעביר את הפתוגן לפונדקאי חדש במהלך הארוחה הדם הבאה. מלריה היא המחלה הקטלנית המועברות וקטור המועבר על ידי מינים שונים של אנופלס יתוש ומשפיע על 40% של אוכלוסיית העולם1. הטפיל הפרוטיסטים של המלריה אחראי על יותר מ-400,000 מקרי מוות מדי שנה, שרובם ילדים מתחת לגיל 5 (ארגון הבריאות העולמי). היתוש אנופלס נקבה מעביר את הטפיל מלריה של סוג פלסטלינה בין בני אדם ובעלי חיים אחרים כאשר הוא ניזון דם בעלי חוליות, צעד הכרחי לייצור ביצים ופיתוח2.

האסטרטגיות הנוכחיות למיגור מלריה ועוד מחלות קטלניות המתעוררים וקטור קטלני להסתמך על פיתוח אסטרטגיות בקרת יתושים חדשניים3,4,5, אשר כוללים את השחרור לתוך פראי של מספר גדול של יתושים שנולדו insectaries. עם זאת, גורם מגביל הכרחי הוא התלות על אספקת דם טרי לגידול יתושים יעיל ורבייה. הרכב משתנה של דם בעלי חוליות יכול להשפיע לרעה פוריות היתושים וכושר צאצאני יכול להגביל את האמינות ואת הקיימות של מושבות רבייה בשבי. שחרור נגד יתושים ותוכניות בקרה דורשים מערכות ייצור יתושים גדולות ואספקה קבועה של כמויות גדולות של דם בעלי חוליות. זהו מכשול גדול לייצור יתושים ומעלה סדרה של סוגיות אתיות הקשורות לשימוש בבעלי חיים חיים ומגבלות לוגיסטיות הנגרמות על ידי תקנות הבטיחות התובעניות הקשורות. זה הופך את העלויות של תחזוקה וביטחון של מושבות יתושים גבוה ואתגרים את הקיימות של שיטות גידול יתושים הנוכחי במיוחד במדינות הכנסה נמוכה שבה האיום של מלריה הוא הרבה יותר גדול.

מחקר לאחרונה התמקד בפיתוח תחליפי דם המחקים ארוחה דם בעלי חוליות אבל עד כה, רק הצלחה מוגבלת הושגה6,7,8,9. תזונה מלאכותית מוצלחת צריך (1) לעורר מלאה יתוש הנקבה engorgement שחתה, (2) ההדק vitellogenin הייצור, (3) לייצר אצוות גדולות של ביצים קיימא, ו (4) ליצור הראש שלך10. בנוסף, דיאטות מלאכותיות יש הרכב רגיל, ולכן הם אמינים יותר לייצור של יתושים למטרות מחקר ובקרה. דיאטות מוצלחות ללא דם פותחו עבור יתושים aedes (נבדקו על ידי גונזלס והנסן11) אבל לא עבור אנופלס spp. דיאטות מלאכותיות קיימות מכילות phagostimulant מריצים (לדוגמה, ATP10), מקור חלבון להבשלה ביצים6,12, פחמימות כמקור אנרגיה, וחומצות אמינו (aa)13 הבסיסיות לייצור ביצים ומהוות גורם מגביל גדול לפוריות היתושים14. דיאטה מלאכותית ללא תשלום גם צריך לספק כולסטרול15, אשר משפר את ייצור ביצים. כאן אנו מתארים דיאטה מלאכותית ללא דם עבור יתושים אנופלס הנשי ולהדגים כי יש לו ביצועים עקביים ושווי ערך לארוחת דם באיכות גבוהה בעלי חוליות.

Protocol

התקבלו עכברים מבית החיות של IHMT. ניסויים בבעלי חיים נערכו בהתאמה קפדנית עם החוק הפורטוגלי והנחיות לשימוש בבעלי חיים מעבדתיים. מדריך-Geral דה Veterinária, Ministério da יוחדים do Desenvolvimento כפרי e das פסאס, פורטוגל אישרה את כל פרוטוקולי המחקר (מזהה אישורים: 023351 ו 023355).

הערה: בצע את כל מספר ההאכלה ב-~ 26 ° c.

1. יתושים

  1. לשמור אנופלס coluzzii (לשעבר בצורת אנופלס gambiae ) להתאמץ לאמץ יתושים ב 26 ° c, 75% לחות תחת 12 h:12 h אור: מחזור כהה. יתושים הבית באמצעות תנאי החרבית רגיל כדי להבטיח ההזדווגות.
  2. לאסוף גלמים יתושים לתוך מיכל מים קטן. מניחים את המיכל בתוך כלוב יתוש לתת יתושים למבוגרים לצוץ ולהזדווג. ספק 10% גלוקוז פתרון האכלה. שלושה ימים לאחר הופעתה לאסוף את המספר הדרוש של יתושים מהכלוב המניות באמצעות מייבש.
  3. יום אחד לפני ניסויים האכלה, להסיר את 10% האכלה גלוקוז פתרון.
    הערה: 3 ביום יתושים שימשו לאורך כל הניסויים.

2. האכלה נגד יתושים

  1. הכנת דיאטות נוזלים מלאכותיים
    1. הכינו את דיאטות הנוזלים המלאכותי בתנאים סטריליים בארון זרימה למינארי. הכינו את הדיאטה הנוזלית העשירה (r-liq_diet) על ידי הוספת הבאים לדיאטה הנוזלית הראשונית (i-liq_diet; בינונית של הנשר שונה של dulbecco [גלוקוז גבוה עם L-גלוטמין], לראות את הטבלה 1: 0.55 g/l ATP, 1 g/l כולסטרול, ו 200 g/l סרום פרה אלבומין (bsa). מערבבים את כל החומרים ביסודיות ומסננים באמצעות מיקרופילטר 0.45 יקרומטר.
      הערה: אל תאחסן את הדיאטות; להכין דיאטות טרי מפתרונות המניה עבור כל ניסוי כפי שהם מאבדים איכות כאשר מאוחסנים. רכיבי הדיאטות מתוארים בטבלה 1.
  2. אוסף דם עכברים
    1. הCD1 הנשי 6-8 שבוע (Mus מוסקולוס) עם קטמין (120 מ"ג/ק"ג) ו-xylazine (16 מ"ג/ק"ג) באמצעות תוואי הצפק.
    2. בצע ניקוב לב (איור 1) כאשר העכבר אינו מציג תגובת שרירים בתגובה לגירויים פיזיים שונים (למשל, הבוהן והזנב pinches).
    3. לאסוף דם באמצעות מזרק סטרילי 1 mL עם 27 G x 1/2͂ (0.4 x 12 מ"מ2) מחט המכילה 100 μl של 1 מ"ג/mL הפארין (נתרן מלח) כדי למנוע היווצרות קרישי דם. שמרו על דם ב37 מעלות צלזיוס באמצעות אמבט מים.
  3. הזנה מלאכותית
    1. לאסוף כ 30 יתושים נקבה מכלוב המניות באמצעות מייבש.
    2. להעביר את היתושים נקבה כדי 500 mL כוסות נייר ולכסות עם רשת היתוש משובח נטו כך שהם לא יכולים לברוח. החילו ממזין זכוכית המחובר לצינורות פלסטיק כדי לשמור על זרימת מים קבועה לחלק העליון של כל ספל (איור 2). מספקים זרימת מים מתמדת לצינורות ולמזין הגלילי כך שהטמפרטורה שבתוך השטח נשמרת בכ-37.5 ° c.
      הערה: פעמון זכוכית רגיל מנגנון האכלה מלאכותי16 שימש כדי לספק את הדיאטות ניסח ליתושים נקבה.
    3. מתיחה קרום הפרפין על פני הפה של מאכיל הזכוכית כדי להכיל את הארוחה.
    4. לחמם מראש את ה-i-liq_diet ו-r-liq_diet ב 37 ° c באמצעות אמבט מים. החלת 1 מ"ל במזין הזכוכית. להאכיל את היתושים עבור 60 דקות בחושך עם או i-liq_diet, r-liq_diet או דם העכבר הטרי. המשך ביצוע ב -26 ° c.
  4. הערכת שיעור ההזנה.
    1. לאחר האכלה מלאכותית, קר להרדמה היתושים ב-20 ° c עבור 30 s. מניחים את היתושים בצלחת פטרי בקירור.
    2. להקליט את מספר המלא (איור 3) יתושים נקבה.
      הערה: אחוז היתושים הניזונים משמש כפרוקסי להצלחת האכלה.

3. היסטוריה החיים תכונות

  1. ייצור ביצים ופריון
    1. להעביר את הנקבות הנפוחים במלואו, באמצעות מברשת, לכלובים בודדים (20 ס"מ x 20 ס"מ x 20 ס מ).
    2. לשמור את היתושים ב 26 ± 1 ° צ', 75% לחות ו 12 h:12 h אור: מחזור כהה עם 10% גלוקוז libitum המודעה.
    3. 48 h לאחר האכלה, להוסיף נייר מחולל לחות בחלק התחתון עבור הנחת ביצים (איור 4). לספור את הביצים ב 48 h ו 72 h לאחר תוספת של הביצה הנחת נייר באמצעות זכוכית מגדלת כף יד. המבול נייר סינון עם מים מזוקקים כדי לאסוף את הביצים.
  2. תמותת הזחלים
    1. לאסוף את הביצים לתוך מגשים (23 ס"מ x 15 ס"מ x 6 ס מ) מלא מים מזוקקים (איור 5). שמרו על רמת המים במגשים קבועים במהלך הניסויים.
    2. להאכיל את הזחלים מדי יום עם כ 13 מ ג מזון הקרקע דגים לכל מגש. להחיל משטר האכלה דומה לכל המגשים שכפול.
    3. מסירים גלמים וזחלים מתים מדי יום. להשלים את הניסויים כאשר כל הגלמים התפתחו למבוגרים ולספור את מספר זכרים בוגרים ונקבות.
    4. רשום את תאריכי הבקיעה והמוות וחשב את שיעורי התמותה.
  3. אריכות ימים
    1. לאסוף 15 זכרים בוגרים ו 15 נקבות למבוגרים מדור F1 של כל קבוצת דיאטה. לשמור על זכרים ונקבות. באותו כלוב
    2. להאכיל מבוגרים עם 10% גלוקוז פתרון לlibitum. . הוציאו את המבוגרים המתים מדי יום
    3. שמרו על היתושים באותה טמפרטורה, לחות, תנאי מחזור אור ומשטר האכלה לסוכר כמתואר לעיל.
    4. רשום את תאריכי הפטירה וחשב את תוחלת החיים.
  4. מדידת אורך כנף
    1. היתושים הקרים של היום חמישה-ימים של F1 מבוגרים (זכר ונקבה) מכל קבוצה דיאטה ב-20 ° c עבור 90 s.
    2. תחת סטריאוסקופ, לתפוס בעדינות את בית החזה של כל יתוש עם מלקחיים ולמקם אותם בצד למעלה.
    3. לאסוף את שני כנפיים באמצעות אזמל ולמקם אותם על שקופית מיקרוסקופ נקי המכיל טיפה מיובש של בינוני גובר. בעזרת מחט של 20 גרם להוסיף מדיה הרכבה נוספת לגבולות של coverslip ולהוריד לאט את שמיכות על הכנפיים.
    4. למדוד את אורך הכנף (איור 6) עם סטריאוסקופ באמצעות מיקרומטר.

Representative Results

התוצאות המתוארות להלן להשוות את הביצועים של אנופלס הנשי יתושים ניזון עם ארוחה מלאכותית עשירה שגובשה (r-liq_diet) ויתושים הניזונים על תזונה נוזלית הראשונית (אני-liq_diet) או ארוחה דם טרי. הדיאטה נבדקה בעקבות הפרוטוקול הסכימטי המתואר באיור 7. R-liq_diet תיאר בזאת הוא חלק פטנט (PCT/IB2019/052967).

אחוז הנקבות המוצבה המלאה

מספר היתושים הנשי האכיל את ה-r-liq_diet (89%) היה גבוה באופן משמעותי ממספר הנקבות הנפוחים שניזונו מדם (56%) (איור 8).

פוריות ופריון

פוריות נשית ופריון למחזור הgonotrophic הראשון שימש להערכת האיכות התזונתית של ה-i-liq_diet ו-r-liq_diet. ממוצע של 24 ± 11 ביצים הונחה על ידי הנקבות על דם טרי בעלי חוליות, בעוד נקבות האכילו ב-r-liq_diet הניחו ממוצע של 25 ± 5 ביצים (שולחן 2). לא נצפתה הטלת ביציות על ידי נקבות שניזונו מliq_diet.

תמותת F1

הכושר של יתושים F1 הוערך בין מושבות הניזונים דם בעלי חוליות או r-liq_diet. הזחלים, הגלמים ותמותת המבוגרים נרשמו. שינויים (שגיאה סטנדרטית של הממוצע [SEM]) היה גבוה יותר ביתושים הניזונים מדם (איור 9 ושולחן 2) ביחס יתושים האכילו את r-liq_diet. הדור F1 של יתושים הניזונים מהדם או הliq_diet היה בעל תמותה דומה ושיעורי הישרדות.

תוחלת החיים של F1

זה מוערך על ידי המרכז לבקרת מחלות ומניעה כי יתושים בוגרים הנשי לחיות עד חודש, אבל כנראה לא לשרוד יותר מ 1-2 שבועות והזכרים חיים במשך כשבוע ולהאכיל באופן בלעדי על צוף ומקורות סוכר אחרים. הוא ציין כי הבדלים צריכת מזון הורי עלולה להשפיע על ההישרדות של צאצאי היתוש17. בניסוי שלנו, נשים למבוגרים וזכרים בדם (נקבה 24.5 ± 6.8; זכר 18.5 ± 6.9) ו-r-liq_diet (נקבה: 22.5 ± 8.1; זכר: 11.9 ± 6.9) קבוצות היו ממוצע החיים ממוצע דומה (שולחן 3) ונקבות הראו תוחלת חיים מוגברת יחסית לזכרים.

גודל הגוף F1

אורך הכנף שימש כאינדיקטור לגודל הגוף המבוגר. בהשוואה למינים אחרים, אנופלס מבוגרים הם קטנים-עד בינוני יתושים עם אורך כנף של בין 2.8 כדי 4.4 mm באורך הכנף18. גודל הגוף למבוגרים של אנופלס היתושים F1 האכיל את r-liq_diet היה בטווח הצפוי והיה דומה ליתושים האכלה דם חרקים (איור 10).

אנליזה סטטיסטית

הנתונים המוצגים מייצגים את הממוצע של לפחות שלושה ניסויים עצמאיים (אלא אם נכתב אחרת). קווי שגיאה מייצגים את ה-SEM. כאשר נתונים לאחר התפלגות גאוסיאנית, הושוו קבוצות עצמאיות באמצעות מבחן t של הסטודנט, אחרת הוחל מבחן מאן-ויטני. הבדלים בין הקבוצות המלאכותית תזונה מלאכותית נותחו באמצעות המבחן המדויק של פישר נחשבו להיות משמעותיים ב P ≤ 0.05.

Figure 1
איור 1: CD1 העכבר איסוף דם על ידי ניקוב תאיים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: מנגנון האכלה מלאכותי סטנדרטי. מאכיל הזכוכית מכיל r-liq_diet כי הוא ניזון אנופלס יתושים נקבה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: יתושים אנופלס לאחר האכלה מלאכותית. משמאל לימין: נקבה שהייתה מלאה, שהציעה r-liq_diet, נקבה לא מרוצה שהציעה r-liq_diet, זכר, ו מלאה הנשי שהוצע דם העכבר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: אנופלס ביצים הניח 48 h לאחר האכלה של נקבות עם r-liq_diet. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: הזחלים L2 השלבים שפותחו מן הביצים נאספו על נייר סינון והניח במגשים המכילים מים מזוקקים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: האגף הימני מדור F1 של יתוש של נקבה אנופלס coluzzii . אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 7
איור 7: פרוטוקול סכמטי של בדיקות תזונה מלאכותית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 8
איור 8: שיעורי האכלה של היתושים הנקביים האכילו את הדיאטות או הדם המלאכותי. כוכביות לציין הבדלים משמעותיים בין היתושים האכילו את התזונה r-נוזלי ו-i-נוזלי ואת קבוצת השליטה בדם. דו צדדי של פישר בדיקה מדויקת: * * * *P ≤ 0.0001 (סיכון יחסי: 0.4828, 95% ביטחון רמת [CL]: 0.3776 עד 0.6194) עבור דיאטה r-נוזלי לעומת דם, *P = 0.0335 (סיכון יחסי: 1.379, 95% CL: 1.044 to 1.836) עבור דם לעומת i-הדיאטה נוזל. כחול: לא מוזן; אדום: מוזן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 9
איור 9: השפעת הארוחה הגובשה ללא דם על התמותה והיחס זכר/נקבה של יתושים אנופלס coluzzii . שלושה ניסויים עצמאיים בוצעו, כל אחד באמצעות 30 יתושים לכל דיאטה. מבחן t לא מזווג הראה הבדלים משמעותיים בין הקבוצה הניזונה בדם לבין הקבוצה r-liq_diet הפד (הערכיםP מגוונת מ 0.5047 אל 0.8491). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 10
איור 10: אורך כנף. המרחק מן החתך הצירי לתוך ה-4 + 5 וריד למעט השוליים שימשו כדי לקבוע את אורך הכנף. גודל הוערך עבור 5 נקבות ו 5 זכרים מכל קבוצה תזונתיים (פירושו ± SEM). ערכים מיוצגים כממוצע ± SEM. סלמון: r-liq_diet; אדום: דם בעלי חוליות. מבחן t שאינו משויך; נקבה שמאל האגף: t = 1.300, df = 8, P = 0.2298; האגף השמאלי זכר: t = 2.400, df = 8, P = 0.0432; נקבה ימין באגף: t = 1.300, df = 8, P = 0.2298; זכר האגף הימני: t = 2.277, df = 7, P = 0.0569. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

רכיבים g/L
* אדנוזין טריפוספט 0.55
* סרום של שור 200
* כולסטרול 1
סידן כלוריד 0.2
כולין כלוריד 0.004
D-סידן פנטהאטה (ויטמין B5) 0.004
הידרוזות D-גלוקוז 4.5
פרריק חנקתי 0.0001
חומצה פולית 0.004
גליצין 0.03
אני-אינוזיטול 0.007
L-ארגינין מונוהידרוכללוריד 0.084
א-ציסטינה דהידרוכללוריד 0.063
ל-גלוטמין 0.584
L-היסטידין מונוהידרוכללוריד 0.042
א-איזולסין 0.105
ל-לאוצין 0.105
ל-ליזין מונוהידרוכלוריד 0.146
מתייונין 0.03
ל-פנילאלנין 0.066
א-סרין 0.042
א-טראונין 0.095
ל-טריפטופן 0.016
א-טירולך דינתרן מלחים 0.104
ל-ולין 0.094
מגנזיום סולפט והידרואוס 0.098
Niacinamide (ניטינאמיד) 0.004
פנול אדום 0.015
אשלגן כלורי 0.4
Pyridoxine מונוהידרוכלוריד 0.004
פירובט חומצה נתרן מלח 0.011
ריבופלאווין (ויטמין B2) 0.0004
נתרן ביקרבונט 3.7
נתרן כלוריד 6.4
סודיום פוספט מונובייסיק 0.109
תיאמין אמונוהידרוכלוריד (ויטמין B1) 0.004
* רק ב-liq_diet

טבלה 1: הרכב הדיאטה i-נוזלים ו-r-נוזלי דיאטה.

מספר ביצה כולל (± SEM) ביצים/נשים (± SEM)
דם 733 ± 330 24 ± 11
r-liq_diet 763 ± 164 25 ± 5
liq_diet 0 0

שולחן 2: אצוות ביצים המיוצר על ידי הנקבות אנופלס coluzzii . שלושה ניסויים עצמאיים בוצעו עבור כל דיאטה ניסיונית באמצעות 30 יתושים נקבה בכל אחד.

נקבות (ימים ± SEM) זכרים (ימים ± SEM)
דם 24.5 ± 6.8 18.5 ± 6.9
r-liq_diet 22.5 ± 8.1 11.9 ± 6.9

שולחן 3: תוחלת החיים של יתושים אנופלס F1 . תוחלת החיים של היתושים F1 מן האכיל מלאכותי F0 הוערך על ידי הקלטת תאריכי הלידה והמוות של כל יתוש מגיע מאותה קבוצת תזונה (15 נקבות ו 15 גברים היו בעקבותיהם). התוצאות מיוצגות כממוצע החיים היתוש תוחלת לכל קבוצת דיאטה.

Discussion

ההצלחה של דיאטה ללא דם שלנו היא כנראה תוצאה של ההשפעה הפיזיולוגית הסינרגיה של כל הרכיבים שנוספו ל-i-liq_diet (עשיר בסוכר, חומצות אמינו, ויטמינים מיקרואלמנטים): BSA (מקור החלבון), ATP (phagostimulant) ו כולסטרול (מקור השומנים). תוספי ה-r-liq_diet עם הרכיבים הבודדים בלבד לא היו יעילים בעירור ייצור ביצים (נתונים לא מוצגים). חיסרון אחד של הפרוטוקול עשוי להיות העלות של חלק מהרכיבים, כגון כולסטרול. למרות זאת, נוכחותו היא בסיסית, כמו חרקים אינם מסוגלים לסנתז את זה19 ומולקולה זו היא המקודמת של ההורמונים ecdysteroid לווסת סינתזה החלמון והתבגרות ביצהפרוקי רגליים. כמויות נמוכות יותר של כולסטרול צריך להיבדק על מנת לייעל את הכמות הדרושה במטרה לצמצם עלויות ולהגדיל את היתרונות של הדיאטה המלאכותית.

מגבלה נוספת של השיטה היא כי הדיאטה המלאכותית צריך להיות טרי מוכן מפתרונות מניות, כפי שהוכן פעם בצורתו האחרונה נוזל היא מאבדת איכות לאחר האחסון. בעתיד הדיאטה הגובשה שלנו יכול להיות מוכן ככוח מיובש, בדומה לצ, החלפת ארוחה מלאכותית לארוחת דם עבור יתושים Ades איג'אגיפטti 21.

לצד אספקת החומרים המזינים הדרושים, ארוחה מלאכותית צריך למשוך ולעורר יתושים נקבה להאכיל באותו אופן כמו כאשר הם ניזונים בעלי חוליות דם טרי. דיאטה נטולת דם מלאכותית במסמך זה תיאר הביא לעלייה 20% היתושים הנשי המלא כאשר לעומת הקבוצה דם המזון בעלי החוליות. זה מדידה עקיפה של האטרקציה יכול להיות מובהר עוד יותר באמצעות olfactomטומטריים כדי לאשר את הדיאטה המלאכותית הוא אטרקטיבי יותר ומושך יותר יתושים מאשר דם טרי.

ההשפעה הגבוהה ביותר של הדיאטה על תמותת הזחל נצפתה עבור הזחלים הנובעים יתושים הניזונים מדם, הרומז כי תזונה מלאכותית של הרכב יציב יכול לתרום כדי להפחית את התמותה ולשפר את ההצלחה רבייה היתושים בהשוואה לדם טרי. התוצאה הצפויה פחות של ארוחה דם עשויה לנבוע וריאציות מארחים בקומפוזיציה17 והנוכחות בדם של מולקולות שעלולות להפריע לפיזיולוגיה של היתושים22. העובדות הקודמות מדגישות את היתרונות לגידול יתושים באיכות גבוהה של דיאטות טריות מהדם.

באופן כללי המספר הממוצע של ביצים הניח במחקר שלנו היה נמוך יחסית לאלה שדווחו כמה insectaries, אבל מספר ממוצע של ביצי ההטלה היה דומה מאמץ מעבדה -גדל המורק האכיל על דם אנושי (22.6 ± 5.5 ביצים/נקבה)23. לא נצפו הבדלים סטטיסטיים משמעותיים בין הקבוצות הנסיוניות שלנו שהואכלו על דם טרי או על הארוחות המלאכותי (שולחן 2), הטוענת כי היישום של מערכות האכלה מלאכותית של ממברנה עם הדיאטה שלנו ניסח מספיק כדי לשמור ולהפיץ אנופלס מושבות יתוש בשבי.

ארוחות מלאכותיות ללא דם יכול לשמור על המושבות Aedes 22, אבל כאשר מוחל על יתושים אנופלס הם מוגבלים או לא הצלחה11. לאחרונה, ארוחה מלאכותית מבוססת פלזמה עבור יתושים אנופלס תוארה24 אבל שיעורי האכלה ופוטנציאל הרבייה היה נמוך. התוצאות שלנו מייצגות מקדמה משמעותית במדינה-of-art (שנבדקו על ידי גונזלס ו האנסן11) כמו שלנו ניסח r-liq_diet היה ביצועים דומים או טובים יותר מאשר הארוחה הסטנדרטית בעלי חוליות דם. שיפורים נוספים על יציבות האחסון והעלות צריכים להרחיב את היקף יישומו.

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgments

היינו רוצים להודות Dinora Lopes (IHMT-נובה מתקן בעלי חיים) לתמיכה טכנית, Joana גומז ואנה קתרינה Alves (IHMT-נובה מתקן הקברות) לשמירה על מושבות יתוש אנופלס . ממומן על ידי בסיס ביל ומלינדה גייטס (OPP1138841), הנופש בסדר היום הטוב ביותר (UID/רב/04413/201, UID/רב/04326/2013, SFRH/BPD/89811/2012, CEECIND/00450/2017).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adenosine 5'-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate Sigma Aldrich A2383
BSA-Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A790G
Cholesterol MP Biomedicals 199342
Dulbecco's modified Eagle's medium (high glucose with L-glutamine) Lonza Bioscience BE12-604F
Entellan mounting medium Merck 1079610100
Glassfeeder Local glazier by design
Heparin Sodium Salt Pan Reac AppliChem A3004,0001
Imalgène 1000 Merial, Portugal 01MER122
Needle 20 G x 1" 0.9 x 25 mm needle Terumo Europe NN-2025R
Parafilm Sigma Aldrich P6543-1EA
Rompun Bayer, Portugal 7427831
Sterilization Millex-HV 0,45 Millipore SLHVR25KS
Syringe, 1ml, 27 G x ½" 0.4 x 12 mm needle Terumo Europe BS-NIN2713
Teich Mix Astra Pond Astra 4030733100957
Tetra Goldfish Flakes Tetra 4004218742642

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. WHO. World Malaria Report. World Health Organization. (2016).
  2. Hansen, I. A., Attardo, G. M., Rodriguez, S. D., Drake, L. L. Four-way regulation of mosquito yolk protein precursor genes by juvenile hormone-, ecdysone-, nutrient-, and insulin-like peptide signaling pathways. Frontiers in Physiology. 5, 103 (2014).
  3. Catteruccia, F., Crisanti, A., Wimmer, E. A. Transgenic technologies to induce sterility. Malaria Journal. 8, Suppl 2 7 (2009).
  4. Dame, D. A., Curtis, C. F., Benedict, M. Q., Robinson, A. S., Knols, B. G. J. Historical applications of induced sterilisation in field populations of mosquitoes. Malaria Journal. 8, Suppl 2 2 (2009).
  5. Lacroix, R., et al. Open Field Release of Genetically Engineered Sterile Male Aedes aegypti in Malaysia. PLoS One. 7, 42771 (2012).
  6. Lea, A. O., Knierim, J. A., Dimond, J. B., Delong, D. M. A Preliminary Note on Egg Production from Milk-Fed Mosquitoes. The Ohio Journal of Science. 55, 1-21 (1955).
  7. Kogan, P. H. Substitute blood meal for investigating and maintaining Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). Journal of Medical Entomology. 27, 709-712 (1990).
  8. Griffith, J. S., Turner, G. D. Culturing Culex quinquefasciatus mosquitoes with a blood substitute diet for the females. Medical and Veterinary Entomology. 10, 265-268 (1996).
  9. Jason Pitts, R. A blood-free protein meal supporting oogenesis in the Asian tiger mosquito, Aedes albopictus (Skuse). Journal of Insect Physiology. 64, 1-6 (2014).
  10. Gonzales, K. K., Tsujimoto, H., Hansen, I. A. Blood serum and BSA, but neither red blood cells nor hemoglobin can support vitellogenesis and egg production in the dengue vector Aedes aegypti. PeerJ. 3, 938 (2015).
  11. Gonzales, K. K., Hansen, I. A. Artificial Diets for Mosquitoes. International Journal of Environmental Research and Public Health. 13, (12), 1267 (2016).
  12. Cosgrove, J. B., Wood, R. J. Effects of variations in a formulated protein meal on the fecundity and fertility of female mosquitoes. Medical and Veterinary Entomology. 10, 260-264 (1996).
  13. Attardo, G. M., Hansen, I. A., Shiao, S. -H., Raikhel, A. S. Identification of two cationic amino acid transporters required for nutritional signalling during mosquito reproduction. Journal of Experimental Biology. 209, 3071-3078 (2006).
  14. Clements, A. N. The biology of mosquitoes: Development, nutrition, and reproduction. Chapman & Hall. New York, NY. (1992).
  15. Talyuli, O. A., et al. The use of a chemically defined artificial diet as a tool to study Aedes aegypti physiology. Journal of Insect Physiology. 83, 1-7 (2015).
  16. Lopes, L. F., Abrantes, P., Silva, A. P., Dorosario, V. E., Silveira, H. Plasmodium yoelii: The effect of second blood meal and anti-sporozoite antibodies on development and gene expression in the mosquito vector, Anopheles stephensi. Experimental Parasitology. 115, 259-269 (2007).
  17. Phasomkusolsil, S., et al. Maintenance of mosquito vectors: effects of blood source on feeding, survival, fecundity, and egg hatching rates. Journal of Vector Ecology. 38, 38-45 (2013).
  18. Gillies, M. T., De Meillon, B. The Anophelinae of Africa South of the Sahara (Ethiopian zoogeographical region). Publications of the South African Institute for Medical Research. 54, 1 (1968).
  19. Canavoso, L. E., Jouni, Z. E., Karnas, K. J., Pennington, J. E., Wells, M. A. Fat metabolism in insects. Annual Review of Nutrition. 21, 23-46 (2001).
  20. Clifton, M. E., Noriega, F. G. The fate of follicles after a blood meal is dependent on previtellogenic nutrition and juvenile hormone in Aedes aegypti. Journal of Insect Physiology. 58, 1007-1019 (2012).
  21. Gonzales, K. K., et al. The Effect of SkitoSnack, an Artificial Blood Meal Replacement on Aedes aegypti Life History Traits and Gut Microbiota. Scientific Reports. 8, 11023 (2018).
  22. Vodovotz, Y., Zamora, R., Lieber, M. J., Luckhart, S. Cross-talk between nitric oxide and transforming growth factor-beta1 in malaria. Current Molecular Medicine. 4, 787-797 (2004).
  23. Sumba, L. A., et al. Daily oviposition patterns of the African malaria mosquito Anopheles gambiae Giles (Diptera: Culicidae) on different types of aqueous substrates. Journal of Circadian Rhythms. 2, 6 (2004).
  24. Baughman, T., et al. A highly stable blood meal alternative for rearing Aedes and Anopheles mosquitoes. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11, 0006142 (2017).
דיאטה ללא דם ליתושים Anopheline אחוריים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Marques, J., Cardoso, J. C. R., Félix, R. C., Power, D. M., Silveira, H. A Blood-Free Diet to Rear Anopheline Mosquitoes. J. Vis. Exp. (155), e60144, doi:10.3791/60144 (2020).More

Marques, J., Cardoso, J. C. R., Félix, R. C., Power, D. M., Silveira, H. A Blood-Free Diet to Rear Anopheline Mosquitoes. J. Vis. Exp. (155), e60144, doi:10.3791/60144 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter