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Biology

アノフェリン蚊を後ろにする無血ダイエット

doi: 10.3791/60144 Published: January 31, 2020

Summary

捕虜のアノフェレス蚊に餌を与えるために、血液のない人工食餌の処方のためのプロトコルが提示される。この食事は脊椎動物の血液と同様のパフォーマンスを有し、卵形成および卵の成熟を引き起こし、実行可能な成人の子孫を生み出す。

Abstract

マラリアの研究は、捕虜の蚊(アノフェレスspp.)のための大規模な繁殖と生産条件を必要とします。蚊の持続可能で信頼性の高い生産は、現在、新鮮な脊椎動物の血液の供給によって阻害されています。血液の代替は、マラリアや血液を与える昆虫によって伝染する他のベクター媒介性疾患の効率的な制御戦略を促進するために必要とされる。このことを念頭に置いて、人工液体食は新鮮な脊椎動物の血液の代用品として処方された。ここでは、血液に似た摂食率を提供し、新鮮な脊椎動物の血液食事の生理学的効果を模倣する無血人工流動食を報告します。食事は、アノフェレス蚊の卵巣および卵の成熟を誘発し、また、良好な幼虫の生存と機能的な成人の発達を生み出す。定式化された無血流動食は、捕獲中の持続可能な蚊の繁殖に向けた重要な進歩であり、蚊のコロニーの維持コストを削減し、新鮮な脊椎動物の血液の必要性を排除します。

Introduction

ベクター媒介性疾患は世界中で数百万人の人間に影響を及ぼし、毎年何百万人もの死者を出しています。感染宿主から血液を食べるときに取得した病気を生み出す微生物(原虫、ウイルス)に感染した昆虫によって伝染する。その後、感染したベクターは、次の血液中に病原体を新しい宿主に伝える。マラリアは、アノフェレス蚊のいくつかの異なる種によって伝染し、世界の人口の40%に影響を与える最も致命的なベクター媒介性疾患ですマラリア原虫の寄生虫は毎年40万人以上の死亡を引き起こしており、そのほとんどが5歳未満の子供(世界保健機関)です。雌のアノフェレス蚊は、脊椎動物の血液を食べるときにヒトと他の動物との間でマラリア原虫を伝染させる、卵の生産および発生に必要なステップ2。

マラリアやその他の新興の致命的な蚊媒介性病の根絶のための現在の戦略は、昆虫で飼育された多数の蚊の野生への放出を含む革新的な蚊対策戦略3、4、5の開発に依存しています。しかし、重要な制限要因は、効果的な蚊の飼育と繁殖のための新鮮な血液の供給への依存である。脊椎動物の血液の可変組成は、蚊の生殖能力と子孫のフィットネスに悪影響を及ぼし、捕虜繁殖コロニーの信頼性と持続可能性を制限することができます。蚊の放出および制御プログラムは、大規模な蚊の生産システムと脊椎動物の大量の血液の定期的な供給を必要とします。これは蚊の生産の大きな障害であり、関連する厳しい安全規制によって引き起こされる生きている動物の使用と物流上の制限に関連する一連の倫理的問題を提起する。これにより、蚊のコロニーの維持とセキュリティのコストが高くなり、マラリアの脅威がはるかに大きい低所得国では、現在の蚊の飼育慣行の持続可能性に課題があります。

最近の研究は、脊椎動物の血液食事を模倣する血液代替物の開発に焦点を当てていますが、これまでのところ、限られた成功は6、7、8、9を達成しました。成功した人工食は、(1)完全な女性の蚊のうろこしを引き起こし、(2)ビテロゲニン産生を引き起こし、(3)生存可能な卵の大きなバッチを産生し、(4)ヒース子孫10を生成する必要がある。さらに、人工食は標準的な組成を有し、したがって、研究および制御目的のための蚊の生産のためのより信頼性が高い。成功した無血食は、Aedes蚊(ゴンザレスとハンセン11によってレビューされた)のために開発されましたが、アノフェレスのスップのためには開発されていません。既存の人工食には、卵成熟6,12のタンパク質源である貪食剤(例えば、ATP10)が含まれています。人工血液のない食事はまた、卵の生産を改善するコレステロール15を提供する必要があります。ここでは、女性のアノフェレス蚊のための人工無血食事を説明し、それが高品質の脊椎動物の血液食事に一貫した同等の性能を有することを実証する。

Protocol

マウスをIHMT動物家から得た。動物実験は、実験動物の使用に関するポルトガルの法律とガイドラインに厳密に従って行われました。ディレソン・ジェラル・デ・ヴェテリナリア、ミニステリオ・ダ・アグリカルトゥラ・ド・デセンボルビメント・ルーラル・エ・ダス・ペスカス、ポルトガルは、すべての研究プロトコルを承認しました(ID承認:023351と023355)。

注:すべての給餌アッセイを~26°Cで行ってください。

1. 蚊

  1. アノフェレス・コルッツィー(アノフェレス・ガンビアMフォーム)ヤウンデ株蚊を26°Cで保ち、湿度75%を12 h:12 hの光:暗いサイクルの下で維持する。標準的な昆虫条件を使用して蚊を収容し、交配を保証します。
  2. 小さな水の容器に蚊の子犬を収集します。蚊のケージの中に容器を入れて、成虫の蚊が出現して交尾させます。10%のグルコース供給溶液を提供する。出現の3日後、吸引器を使用してストックケージから必要な数の蚊を集めます。
  3. 摂食試験の1日前に、10%グルコース供給液を除去する。
    注:実験中は3種類の蚊が使用されました。

2. 蚊の摂食

  1. 人工流動食の準備
    1. 層流キャビネットで無菌条件下で人工液体食を準備します。初期の流動食(i-liq_dietに以下を加えることによって、豊かな流動食(r-liq_diet)を準備します。ダルベッコの改良されたイーグル培地[L-グルタミンを有する高グルコース]、表1を参照してください:0.55 g/L ATP、1 g/Lコレステロール、および200 g/Lウシ血清アルブミン(BSA)。すべての材料を十分に混ぜ、0.45 μm マイクロフィルターを使用してフィルターします。
      注:食事を保存しないでください。彼らは保存されたときに品質を失うように、各実験のためのストックソリューションから新鮮な食事を準備します。食事の成分は表1に記載されています。
  2. マウス採血
    1. 腹腔内経路を用いて、ケタミン(120mg/kg)およびキシラジン(16mg/kg)を用いて、生齢6~8週齢のCD1雌マウス(Mus musculus)を麻酔する。
    2. マウスが異なる物理的刺激(例えば、つま先と尾のピンチ)に応答して筋肉反応を示さない場合に心穿刺(図1)を行う。
    3. 血栓の形成を防ぐために、100 μLの1mg/mLヘパリン(ナトリウム塩)を含む27 G x 1/2の針(0.4 x 12 mm2)の無菌1 mL注射器を使用して血液を採取します。水槽を使用して37°Cで血液を維持します。
  3. 人工給餌
    1. 吸引器を使用してストックケージから約30匹のメスの蚊を集めます。
    2. メスの蚊を500mL紙コップに移し、逃げられないように細かい蚊帳網で覆う。プラスチックチューブに接続されたガラスフィーダーを塗布して、各カップの上部に一定の水の流れを維持します(図2)。円筒形のチューブとフィーダーに一定の水の流れを提供し、温度が約37.5 °Cに保たれます。
      注:標準的なガラスベル人工給餌装置16を使用して、雌の蚊に処方された食事を供給した。
    3. ガラスフィーダーの口を横切ってパラフィン膜を伸ばし、食事を含む。
    4. 水槽を使用して37°Cでi-liq_dietとr-liq_dietを予温します。ガラスフィーダーに1 mLを塗布します。暗闇の中で60分間蚊にi-liq_diet、r-liq_dietまたは新鮮なマウスの血液を与えます。26°Cでアッセイを行います。
  4. 供給速度の評価。
    1. 人工給餌後、-20°Cで30°Cで蚊を冷や麻酔し、冷蔵ペトリ皿に蚊を入れます。
    2. メスの蚊の数を記録します(図3)。
      注:餌を与えられた蚊の割合は、餌の成功のためのプロキシとして使用されます。

3. 生命史の特徴

  1. 卵の生産と生殖能力
    1. ブラシを使用して完全に魅了された女性を個々のケージ(20 cm x 20 cm x 20 cm)に移します。
    2. 蚊を26±1°C、湿度75%、12h:12 hの光:10%グルコースアドリビタムの暗いサイクルに保ちます。
    3. 給餌後48時間、産卵用下部に加湿濾紙を加える(図4)。卵を48時間と72時間で数え、卵を産む紙を手持ちの虫眼鏡で加えた後に数えます。卵を集めるために蒸留水でろ紙をあふれさせます。
  2. 幼虫の死亡率
    1. 卵を蒸留水で満たしたトレイ(23 cm x 15 cm x 6 cm)に集めます(図5)。実験中にトレイの水位を一定に保ちます。
    2. トレイごとに約13mgの魚の食べ物で毎日幼虫を養います。すべての複製トレイに同様の給餌体制を適用します。
    3. 死んだ子犬と幼虫を毎日取り除く。すべての子犬が成人に発展し、成人男性と女性の数を数えたときに実験を確定します。
    4. ハッチングと死亡の日付を登録し、死亡率を計算します。
  3. 長寿
    1. 各ダイエットグループのF1世代から15人の成人男性と15人の成人女性を集めます。男性と女性を同じケージに入れておきます。
    2. 10%グルコース溶液アドリビタムで成人にフィード。毎日死んだ大人を削除します。
    3. 蚊を上記と同じ温度、湿度、光サイクル条件、糖供給体制に保ちます。
    4. 死亡日を登録し、寿命を計算します。
  4. 翼長測定
    1. 90sの-20°Cで各ダイエット群から5日齢のF1成体蚊(雄と雌)を冷間麻酔する。
    2. ステレオスコープの下で、各蚊の胸郭を鉗子で静かにつかみ、腹側を上に置きます。
    3. メスを使用して両翼を収集し、乾燥した取り付け媒体を含むきれいな顕微鏡スライドに置きます。20 G針の助けを借りてカバースリップの境界に余分な土台の媒体を加え、ゆっくり翼にカバースリップを下げる。
    4. マイクロメータを使用して、立体視で翼の長さ(図6)を測定します。

Representative Results

以下に説明する結果は、処方された豊富な人工食事(r-liq_diet)と最初の流動食(i-liq_diet)または新鮮な血液食事に与えられた蚊を与えられた雌のアノフェレス蚊のパフォーマンスを比較する。図7に示されている概略プロトコルに従って食事をテストしました。本明細書に記載されるr-liq_dietは特許の一部である(PCT/IB2019/052967)。

完全に魅了された女性の割合

r-liq_dietを与えられた雌の蚊の数(89%)血液に餌を与えられた女性の数よりも有意に高かった(56%)(図8)。

胎児性と生殖能力

最初のゴトロフィックサイクルの女性の胎児性および生殖能力は、i-liq_dietおよびr-liq_dietの栄養の質を評価するために使用された。平均24±11個の卵を新鮮な脊椎動物の血液に餌を与えた雌によって産出され、一方、r-liq_dietに供給された雌は平均25±5個の卵を産んだ(表2)。i-liq_dietに餌を与えられた雌によって産卵は観察されなかった。

F1死亡率

F1蚊の適性は、脊椎動物の血液またはr-liq_dietに供給されたコロニーの間で評価された。幼虫、子犬、成人の死亡率が記録された。血液を与えた蚊(図9および表2)の変動性(平均[SEM]の標準誤差)は、r-liq_dietを与えた蚊に対して高かった。血液またはr-liq_dietのいずれかに供給された蚊のF1世代は、同等の死亡率と生存率を持っていました。

F1の平均余命

野生の成体メスの蚊は1ヶ月まで生き続けるが、おそらく1〜2週間以上生き残ることはなく、男性は約1週間生きて、蜜やその他の糖源のみを食べていると疾病管理予防センターによって推定される。親の食物摂取の違いは、蚊の子孫17の生存に影響を与える可能性があります。我々の実験では、成人女性および男性(女性24.5±6.8;男性18.5±6.9)およびr-liq_diet(女性:22.5±8.1;男性:11.9±6.9)群は、平均平均平均平均(表3)と女性の平均寿命が同様であった。

F1ボディサイズ

翼長は、大人の体のサイズの指標として使用されました。他の種と比較すると、アノフェレスの成人は、翼の長さが2.8〜4.4mmの翼長18の間の小〜中型の蚊である。F1アノフェレス蚊の成人体サイズは、r-liq_dietを供給し、予想される範囲内であり、血液を与えられた昆虫蚊と同様であった(図10)。

統計分析

提示されたデータは、少なくとも3つの独立した実験の平均を表す(特に明記されていない限り)。エラー バーは SEM を表します。データがガウス分布に従った場合、独立したグループはスチューデントのt検定を使用して比較され、そうでなければマン・ホイットニーのテストが適用されました。人工食餌群間の差異は、フィッシャーの正確な試験を用いて分析され、P ≤ 0.05で有意であると考えられた。

Figure 1
図1:心臓内穿刺によるCD1マウスの採血。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図2:標準人工給餌装置ガラスフィーダーには、雌のアノフェレス蚊に供給されているr-liq_dietが含まれています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図3:人工摂食後の蚊のアノフェレス左から:r-liq_diet、r-liq_diet、男性、およびマウスの血液を提供された完全に魅了された女性を提供された完全に魅了された女性。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 4
図4:アノフェレス卵は、r-liq_dietで雌の餌後48時間を産んだ。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 5
図5:卵から発達し、濾紙に集め、蒸留水を含むトレイに入れたL2幼虫ステージ。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 6
図6:アノフェレス・コルッツィー雌の蚊のF1世代からの右翼。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 7
図7:人工食餌検査の模式プロトコルこの図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 8
図8:雌の蚊の摂食率は人工食餌または血液のどちらかを与えた。アスタリスクは、r液体およびi液状食を与えられた蚊と血液供給対照群との間に有意な差を示す。両面フィッシャーの正確なテスト: ****P ≤ 0.0001 (相対的リスク: 0.4828, 95% 自信のあるレベル [CL: 0.3776 から 0.6194): r-liquid diet 対 血液に対して, *P = 0.0335 (相対リスク: 1.379, 95% CL: 1.044 から 1.83- 1.83- 血液- 血液- 血液- 血液- 血液- 血液- 血液- 血液の場合)青:供給されていない。赤:供給。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 9
図9:F1アノフェレス・コルウツィー蚊の死亡率および男性/女性比に対する製剤化された無血食事の影響。3つの独立した実験を行い、それぞれ食事あたり30匹の蚊を使用した。不対のt検定では、血液供給群とr-liq_diet供給群との間に有意差は示さなかった(P値は0.5047から0.8491まで変化した)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 10
図10:翼の長さ。軸切開から、フリンジセタを除くR4+5静脈までの距離を使用して、翼長を決定した。サイズは、各食事群から5人の女性と5人の男性について評価した(平均±SEM)。値は平均 ± SEM. サーモン: r-liq_diet として表されます。赤: 脊椎動物の血液.対になっていない t 検定;女性の左翼: t = 1.300、 df = 8、P = 0.2298;男性の左翼: t = 2.400、df = 8、P = 0.0432;女性右翼: t = 1.300, df = 8, P = 0.2298;男性の右翼: t = 2.277、df = 7、P = 0.0569。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

コンポーネント g/L
*アデノシン三リン酸 0.55
*ウシ血清アルブミン 200
*コレステロール 1
塩化カルシウム無水 0.2
コリンクロリド 0.004
D-カルシウムパントテネート(ビタミンB5) 0.004
D-グルコース無水 4.5
硝酸非水和物鉄 0.0001
葉酸 0.004
グリシン 0.03
イノシトール 0.007
L-アルギニン一塩酸塩 0.084
L-シスチンジヒドロクロリド 0.063
L-グルタミン 0.584
L-ヒスチジン一塩一塩一水和物 0.042
L-イソロイシン 0.105
L-ロイシン 0.105
L-リジン一塩酸塩 0.146
Lメチオニン 0.03
L-フェニルアラニン 0.066
Lセリン 0.042
L-スレオニン 0.095
Lトリプトファン 0.016
L-チロシン二ナトリウム塩二水和物 0.104
L-ヴァリン 0.094
硫酸マグネシウム無水 0.098
ナイアシンアミド(ニコチンアミド) 0.004
フェノールレッド 0.015
塩化カリウム 0.4
ピリドキシン一塩酸塩 0.004
ピルビン酸ナトリウム塩 0.011
リボフラビン (ビタミン B2) 0.0004
重炭酸ナトリウム 3.7
塩化ナトリウム 6.4
リン酸ナトリウム一塩基無水 0.109
チアミンアモノ塩酸塩(ビタミンB1) 0.004
*r-liq_dietでのみ

表1:i液状食とr流動食の組成。

総卵数(±SEM) 卵/雌(±SEM)
血液 733 ± 330 24 ± 11
r-liq_diet 763 ± 164 25 ± 5
i-liq_diet 0 0

表2:アノフェレス・コルウツィイ雌によって製造された卵バッチ各々に30匹の雌の蚊を用いて、実験食ごとに3つの独立した実験を行った。

メス (日 ± SEM) オス (日 ± SEM)
血液 24.5 ± 6.8 18.5 ± 6.9
r-liq_diet 22.5 ± 8.1 11.9 ± 6.9

表3:F1アノフェレスの平均余命人工的に供給されたF0からのF1蚊の長寿は、同じ食事群から来る各蚊の生年月日と死亡の日付を記録することによって評価された(15人の女性と15人の男性が続いた)。結果は、食事群ごとの平均蚊の寿命として表されます。

Discussion

私たちの処方された無血食の成功は、i-liq_diet(糖、アミノ酸、ビタミンおよび微小元素が豊富)に添加されたすべての成分の相乗的な生理学的効果の結果である可能性が高い:BSA(タンパク質源)、ATP(ファゴ刺激性)およびコレステロール(脂質源)。個々の成分のみでのr-liq_dietの補充は、卵の生産を刺激するのには効果がなかった(データは示されていない)。プロトコルの欠点の 1 つは、コレステロールなどのコンポーネントの一部のコストです。それでも、昆虫はそれを合成することができないので、その存在は基本的であり、この分子は節足動物20の卵胞合成および卵の成熟を調節するエクジステロイドホルモンの前駆体である。コストを削減し、人工食餌の利点を高めることの目的で必要な量を最適化するためにコレステロールの低い量をテストする必要があります。.

この方法のもう一つの制限は、人工食餌がストック溶液から新鮮に調製されなければならないということです, 一度その最終的な液体の形で準備されるように、それは貯蔵後の品質を失います.将来的には、私たちの配合された食事は、SkitoSnackt、Aedes aegypti21の人工血液食事の代替品と同様に、乾燥した力として準備することができます。

必要な栄養素を供給するだけでなく、人工的な食事は、脊椎動物の新鮮な血液を食べるのと同じ方法で餌を与えるためにメスの蚊を引き付け、刺激する必要があります。本明細書に記載されている人工無血食事は、脊椎動物の血液供給群と比較して、完全に充満した雌の蚊の20%の増加をもたらした。この間接的な魅力の尺度は、オルファクトメーターを使用して、人工食が新鮮な血液よりも蚊にとってより魅力的で魅力的であることを確認することによって、さらに明確にすることができる。

血液に餌を与えた蚊に由来する幼虫に対する幼虫の死亡率に対する食事の最も高い影響が観察され、安定した組成の人工食が新鮮な血液と比較して死亡率を減らし、蚊の繁殖成功を改善するのに役立つ可能性があることを示唆した。血液食事の予測が少ない結果は、組成物17の宿主変動および蚊の生理学を妨げる可能性のある分子の血液中の存在から生じ得る22。上記の事実は、新鮮な無血食事の高品質の蚊の飼育の利点を強調しています。

我々の研究で産まれた卵の平均数は、いくつかの昆虫で報告されたものに比べて低かったが、卵卵の平均数は、ヒト血液(22.6 ±5.5卵/女性)に供給されるA.ガンビア実験室飼育株に匹敵した。新鮮な血液または人工食に供給される実験群の間に有意な統計的差は認められなかった(表2)、我々の調合された食事を用いた人工膜摂食システムの実施は、捕虜ののコロニーを維持し、伝播するのに十分であることを示唆した。

人工無血の食事は、Aedesコロニー22を維持することができますが、アノフェレス蚊に適用すると、それらは限られたまたは成功しない11です。最近、アノフェレス蚊のためのプラズマベースの人工食事が24と記載されたが、摂食率と生殖能力は低かった。我々の結果は、我々の式化されたr-liq_dietが標準的な脊椎動物の血液食事と同様またはより良い性能を有していたため、最先端の(ゴンザレスとハンセン11によってレビューされた)の大幅な進歩を表しています。ストレージの安定性とコストのさらなる改善は、そのアプリケーションの範囲を広げる必要があります。

Disclosures

著者たちは開示するものは何もない。

Acknowledgments

カノフェレス蚊のコロニーを維持するためのディノラ・ロペス(IHMT-NOVA動物施設)、ジョアナ・ゴメスとアナ・カタリナ・アウベス(IHMT-NOVA昆虫施設)に感謝します。ビル・アンド・メリンダ・ゲイツ財団(OPP1138841)が出資し、ファンダソン・パラ・ア・シエンシア・エ・テクノロジア(UID/Multi/04413/2011、UID/マルチ/04326/2013、SFRH/BPD/89811/2012、CEECIND/0045/20017)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adenosine 5'-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate Sigma Aldrich A2383
BSA-Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A790G
Cholesterol MP Biomedicals 199342
Dulbecco's modified Eagle's medium (high glucose with L-glutamine) Lonza Bioscience BE12-604F
Entellan mounting medium Merck 1079610100
Glassfeeder Local glazier by design
Heparin Sodium Salt Pan Reac AppliChem A3004,0001
Imalgène 1000 Merial, Portugal 01MER122
Needle 20 G x 1" 0.9 x 25 mm needle Terumo Europe NN-2025R
Parafilm Sigma Aldrich P6543-1EA
Rompun Bayer, Portugal 7427831
Sterilization Millex-HV 0,45 Millipore SLHVR25KS
Syringe, 1ml, 27 G x ½" 0.4 x 12 mm needle Terumo Europe BS-NIN2713
Teich Mix Astra Pond Astra 4030733100957
Tetra Goldfish Flakes Tetra 4004218742642

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Marques, J., Cardoso, J. C. R., Félix, R. C., Power, D. M., Silveira, H. A Blood-Free Diet to Rear Anopheline Mosquitoes. J. Vis. Exp. (155), e60144, doi:10.3791/60144 (2020).More

Marques, J., Cardoso, J. C. R., Félix, R. C., Power, D. M., Silveira, H. A Blood-Free Diet to Rear Anopheline Mosquitoes. J. Vis. Exp. (155), e60144, doi:10.3791/60144 (2020).

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