Summary
Qui, descriviamo un metodo di microaspirazione a singola cellula per la separazione delle amebe infette. Al fine di separare le sottopopolazioni virali in Vermamoeba vermiformis infettate da Faustovirus e virus giganti sconosciuti, abbiamo sviluppato il protocollo descritto di seguito e dimostrato la sua capacità di separare due nuovi virus giganti a bassa abbondanza.
Abstract
Durante il processo di co-coltura dell'ameba, più di un virus può essere isolato in un unico pozzo. In precedenza abbiamo risolto questo problema per diluizione all'estremità e/o la fluorescenza, applicato alla popolazione virale per la diluizione e/o la fluorescenza. Tuttavia, quando i virus nella miscela hanno proprietà morfologiche simili e uno dei virus si moltiplica lentamente, la presenza di due virus viene scoperta nello stadio di assemblaggio del genoma e i virus non possono essere separati per un'ulteriore caratterizzazione. Per risolvere questo problema, abbiamo sviluppato una procedura di microaspirazione a singola cellula che consente la separazione e la clonazione di virus altamente simili. Nel presente lavoro, presentiamo come questa strategia alternativa ci ha permesso di separare le piccole sottopopolazioni virali del Clandestinovirus ST1 e Usurpativirus LCD7, virus giganti che crescono lentamente e non portano a lisi ameaka rispetto alla litetica e in rapida crescita Faustovirus. Il controllo della purezza è stato valutato da specifici virus e amplificazione genica per un'ulteriore caratterizzazione.
Introduction
I virus del DNA di grandi dimensioni nucleocitoplasmatici (NCLDV) sono estremamente diversi, definiti da quattro famiglie che infettano gli eucarioti1. I primi virus descritti con genomi superiori a 300 kbp sono stati Phydcodnaviridae, tra cui il virus paramecium bursaria Chlorella 1 PBCV12. L'isolamento e la prima descrizione di Mimivirus, ha mostrato che la dimensione dei virus è raddoppiata sia in termini di dimensioni della particella (450 nm) che di lunghezza del genoma (1,2 Mb)3. Da allora, sono stati descritti molti virus giganti, di solito isolati utilizzando una procedura di co-coltura ameba. Diversi virus giganti con diverse morfologie e contenuti genetici possono essere isolati dalle cellule di Acanthamoeba sp., tra cui Marseillevirus, Pandoravirus, Pithovirus, Mollivirus, Cedratvirus, Pacmanvirus, Tupanvirus, e recentemente Medusavirus4,5,6,7,8,9,10,11,12, 13,14,15,16,17. Parallelamente, l'isolamento di Vermamoeba vermiformis ha permesso l'isolamento e la descrizione dei virus giganti Faustovirus, Kaumoebavirus e Orpheovirus18,19,20. Altri virus giganti sono stati isolati con i loro protisti ospiti, come Cafeteria roenbergensis21, Aureococcus anophagefferens22, Chrysochromulina ericina23, e Bodo saltans 24. Tutti questi isolati sono il risultato di un numero crescente di team che lavorano sull'isolamento e dell'introduzione di aggiornamenti della strategia ad alta velocità effettiva25,26,27,28, come il miglioramento del sistema di cocoltura con l'uso della citometria di flusso.
Nel 2016 abbiamo utilizzato una strategia che associa la cocultura e la citometria di flusso per isolare i virus giganti27. Questa strategia è stata sviluppata per aumentare il numero di campioni inoculati, per diversificare i protisti usati come supporti cellulari e per rilevare rapidamente la lisi del supporto cellulare. Il sistema è stato aggiornato aggiungendo un passo supplementare per evitare l'identificazione preliminare della biologia molecolare e la rapida individuazione di una popolazione virale sconosciuta come nel caso del Pacmanvirus29. La citometria del flusso di accoppiamento allo smistamento cellulare ha permesso la separazione di una miscela di Mimivirus e Cedratvirus A1130. Tuttavia, in seguito abbiamo incontrato i limiti della separazione e del rilevamento di queste sottopopolazioni virali per citometria di flusso. Dopo il sequenziamento, quando abbiamo assemblato i genomi di Faustovirus ST125 e Faustovirus LCD7 (dati inediti), abbiamo sorprendentemente trovato in ogni assemblaggio due genomi supplementari di due nuovi virus non identificati nei database pubblici del genoma. Tuttavia, né la citometria di flusso né la microscopia elettronica di trasmissione (TEM) hanno mostrato che le amebe sono state infettate da due virus diversi, Clandestinovirus ST1 e Usurpativirus LCD7. Abbiamo progettato sistemi PCR specifici per amplificare i marcatori Faustovirus, Usurpativirus e Clandestinovirus rispettivamente in base ai loro genomi; il nostro scopo era quello di avere sistemi pcR-based che consentono la verifica della purezza dei virus separati. Tuttavia, la diluizione dell'estremità puntino e la citometria di flusso non sono riusciti a separarli. L'isolamento di questa singola popolazione virale è stato difficile perché non sono stati caratterizzati né la morfologia né gli elementi replicativi delle popolazioni di Clandestino virus e Usurpativirus. Abbiamo rilevato una sola popolazione virale per citometria di flusso a causa della sovrapposizione delle due popolazioni (testata dopo l'effettiva separazione). Abbiamo cercato di separarli usando lo smistamento di singole particelle su piastre di 96 pozzi, ma non abbiamo osservato alcun effetto citopatico, e abbiamo rilevato né Il Clandestinovirus né l'Usurpativirus dall'amplificazione PCR. Infine, è stata solo la combinazione di diluizione del punto finale seguita da una singola micro-aspirazione di ameba che ha permesso la separazione di questi due virus giganti a bassa abbondanza dai Faustovirus. Questo metodo di separazione è l'oggetto di questo articolo.
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Protocol
1. Cultura di Amoeba
- Utilizzare Vermamoeba vermiformis (strain CDC19) come supporto cellulare.
- Aggiungere 30 mL di proteasi-peptone-lievito medio di estratto-glucosio (PYG) (Tabella 1) e 3 mL di amebe ad una concentrazione di 1 x 106 cellule/mL in un fiascheta di coltura cellulare 75 cm2.
- Mantenere la coltura a 28 gradi centigradi.
- Dopo 48 h, quantificare le amebe utilizzando vetrine di conteggio.
- Per sciacquare, raccogliere le cellule ad una concentrazione di 1 x 106 cellule/mL e pellet l'amebae da centrifugazione a 720 x g per 10 min. Rimuovere il supernatante e ripagare il pellet nel volume appropriato del mezzo di fame per ottenere 1 x 106 cells/mL (Tabella 1).
2. Propagazione del virus di riserva in Amebae
NOT: Prima della diluizione, è importante coltura il campione di stock per ottenere abbastanza cultura fresca, quindi procedere alla filtrazione.
- Utilizzare 1 x 106 della coltura ameba nel mezzo di fame.
- Inoculare la miscela di virus emessi dalla soluzione di stock (Faustovirus/Usurpativirus LCD7 o Faustovirus/Clandestinovirus ST1) dopo il processo di co-coltura sul supporto cellulare a una molteplicità di infezione (MOI) di 0,01.
NOT: Il MOI è importante per ridurre l'abbondanza della popolazione virale maggiore e il numero di cellule infette. - Incubare a 30 gradi centigradi fino a quando gli effetti citopatici (CPE) sono indotti, come l'arrotondamento ameato o il lisi, circa 10 a 14 h dopo l'infezione.
- Raccogliere il supporto e filtrare attraverso un filtro di 5 m per rimuovere i detriti cellulari.
3. Diluizione del punto finale
- Eseguire una diluizione seriale (da 10-1 a 10-11) del campione virale in mezzo di fame (Tabella 1).
- Inoculare 2 mL di 1 x 106 Vermiformis Di Vermamoeba contenuta in ogni piatto Petri con 100 l dell'inoculo della miscela.
- Mettere i piatti Petri in un sacchetto di plastica sigillabile a 30 gradi centigradi.
- Iniziare ad osservare i piatti Petri con microscopia ottica invertita a 6 h di post-infezione e controllare la morfologia cellulare ogni 4 a 8 h.
- All'aspetto dell'effetto citopatico caratterizzato da arrotondamento delle cellule, iniziare il processo di microaspirazione a singola cellula.
4. Microaspirazione a cella singola
-
Preparare l'host.
NOTA: Questa preparazione è fatta per il rilascio di singole cellule infette a un supporto cellulare fresco.- Trattare l'amebae nella coltura con un agente antimicrobico che contiene 10 g/mL di vancomycin, 10 g/mL di imipenem, 20 g/mL di ciprofloxacin, 20 g/mL di doxycycline e 20 g/mL di voriconazolo. Questa miscela viene utilizzata per evitare la contaminazione batterica e fungina.
NOT: La procedura si svolge su un banco al di fuori della stazione di sicurezza microbiologica. Aggiungere 2 mL di amebe concentrate a 1 x 106 celle / mL ciascuna in 15 piatti Petri. Per l'aderenza all'ameba, incubare la coltura a 30 gradi centigradi per 30 min.
- Trattare l'amebae nella coltura con un agente antimicrobico che contiene 10 g/mL di vancomycin, 10 g/mL di imipenem, 20 g/mL di ciprofloxacin, 20 g/mL di doxycycline e 20 g/mL di voriconazolo. Questa miscela viene utilizzata per evitare la contaminazione batterica e fungina.
- Selezionare il piatto Petri utilizzato per la microaspirazione dalla diluizione limite secondo i seguenti criteri: 1) assenza di qualsiasi contaminazione visibile da parte di agenti fungini e batterici, 2) prova di effetto citopatico delle amebe a causa dei virus, e 3) prelysis e la fase di arrotondamento delle amebe (per evitare l'aspirazione di particelle virali).
-
Impostare una workstation con i seguenti materiali (vedere la figura 1A,B):
Micromanipolatore, che consente il posizionamento microcapillare;
Dispositivo di pressione di controllo manuale, utilizzato per aspirare e rilasciare le cellule nel microcapillare;
Microscopio invertito;
Collegare e riprodurre i moduli motore;
Fotocamera;
Modulo computer per visualizzare la manipolazione e scattare foto. - Scegliere un microcapillare (vedere Figura 1C).
NOT: La dimensione delle cellule, la deformazione e l'adesione delle loro membrane alle superfici e la motilità cellulare possono influenzare il progresso regolare della micro-aspirazione. Il diametro microcapillare può essere scelto con precisione e adattato a specifici tipi di cellule a seconda delle loro dimensioni e dei loro metodi di aspirazione. Un microcapillare di 20 m di diametro interno è stato utilizzato per aspirare un'ameba di arrotondamento (diametro di 10 m). Ciò consente la manutenzione di una posizione interna e un facile rilascio della cella. -
Montare il sistema.
- Fissare l'angolo di funzionamento del sistema di presa sul modulo motorizzato a 45 gradi.
- Eseguire una doppia installazione, prima sul sistema di presa, e poi sul microcapillare.
- Concentrarsi sulle cellule dopo aver eseguito alcune gocce di olio attraverso il microcapillare.
NOT: L'olio minerale con compatibilità biologica è fornito dal dispositivo. - Montaggio completo seguendo le raccomandazioni del produttore.
-
Clonare le celle (vedere Figura 2A,B).
NOTA: Questa procedura è simile a quella descritta da Frahlich e K'nig31.- Mettere al microscopio la parabola Petri contenente 2 mL di amebe infette.
- Concentrarsi prima sulle cellule e poi sul microcapillare immerso nella coltura.
- Scegli una singola cellula arrotondata e avvicina il microcapillare al micromanipolatore.
- Esercitare aspirazione morbida con controllo manuale della pressione sulla cellula, prendendo all'interno del microcapillare. Rimuovere la singola cella dal primo campione e rilasciarlo nel supporto cellulare, quindi incubarla a 30 gradi centigradi.
- Condurre osservazioni quotidiane con un microscopio ottico invertito per osservare la comparsa delle cellule e per monitorare l'emergere dell'effetto citopatico.
5. Screening PCR
NOT: Dopo la fase 4, uno screening sistematico da parte della PCR è fondamentale per confermare la separazione. Sia in Usurpativirus/Faustovirus che in Clandestinovirus/Faustovirus, la progettazione e l'applicazione dei sistemi specifici di primer e sonda sono stati effettuati utilizzando Primer-BLAST online32 (Tabella 2).
- Estrarre il DNA da una parte dei campioni di coltura positiva (cioè, dove si osserva un effetto citopatico), utilizzando un sistema di estrazione automatizzato secondo il protocollo del produttore.
- Utilizzare primer progettati in modo appropriato.
NOT: Qui abbiamo progettato primer per amplificare i geni del nucleo annotati come RpB2 (Faustovirus), proteina capsid principale LCD7 (Usurpatvirus) e proteina capside minore (Clanvirus) -
Eseguire pcR standard utilizzando un termociclore.
- Eseguire 20 reazioni PCR l con 50 M di ogni primer (Tabella 2), 1x Master Mix e RNase acqua libera.
- Attivare la polimerasi del DNA Taq per 5 minuti a 95 gradi centigradi, quindi seguire con 45 cicli di 10 s denaturazione a 95 gradi C, annealing dei primer per 30 s a 58 gradi C, ed estensione per 30 s a 72 .
- Eseguire i prodotti PCR su un gel di agarose 1.5%, macchia con macchia di gel di DNA (Tabella dei materiali) e visualizzare con UV.
6. Produzione e purificazione di virus
- Rimettere il resto della cultura del piatto Petri in una piccola fiaschetta.
- Per la produzione di virus, preparare 15 flaconi di 145 cm2, contenenti 40 mL di vermiformis Vermamoeba in mezzo di fame e 5 mL del virus isolato già trasferito dalla piastra Petri a piccoli flaconi.
- Trattare con la stessa miscela antibiotica e antifungina utilizzata al punto 4.1.
- Incubare a 30 gradi centigradi. Osservare ogni giorno con microscopia ottica invertita.
- Dopo l'infezione completa, piscina tutti i flaconi. Utilizzare un filtro da 0,45 m per eliminare i detriti.
- Ultracentrifuga tutti i supernatanti a 50.000 x g per 45 min.
- Dopo la centrifugazione, rimuovere il supernatante da ogni tubo per aspirazione e rispendere il pellet in 1 mL di fosfato buffers salino (PBS).
- Purificare il virus prodotto utilizzando il saccarosio 25% (27,5 g di saccarosio in 100 mL di PBS, sterilizzato dalla filtrazione).
- Centrifuga 8 mL di saccarosio e 2 mL della sospensione virale a 80.000 x g per 30 min. Risospendere il pellet virale in 1 mL di PBS. Conservarlo a -80 gradi centigradi.
7. Microscopia elettronica di colorazione e trasmissione negativa
NOT: Bou Khalil ealtri pubblicato in precedenza questo protocollo27.
- Depositare 5 l del supernatante lisi sulla griglia scaricata dal bagliore. Lasciare agire per circa 20 min a temperatura ambiente.
NOT: La scarica di bagliori ci permette di ottenere una rete idrofila dall'applicazione al plasma. - Asciugare accuratamente la griglia e depositare una piccola goccia di 1% di molybdate di ammonio su di esso per 10 s. Lasciare asciugare la griglia per 5 min.
- Procedere con le osservazioni di microscopia elettronica a 200 keV.
8. Caratterizzazione del Clandestino virus ST1 e Usurpativirus LCD7
- Caratterizzare le popolazioni pure di Clandestinovirus ST1 e Usurpativirus LCD7 utilizzando il sequenziamento del genoma, l'assemblaggio del genoma, le analisi bioinformatiche e lo studio del loro ciclo replicativo come abbiamo fatto per altri virus10,20, 29.
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Representative Results
La micro-aspirazione a cella singola è un processo di micromanipolazione ottimizzato in questo manoscritto (Figura 1). Questa tecnica consente l'acquisizione di un'ameba arrotondata e infettata (Figura 2A) e la sua uscita in una nuova lastra contenente amebe non infette (Figura 2). Si tratta di un prototipo funzionale che si applica al sistema di co-cultura e ha isolato con successo virus giganti non litici. Questo approccio è stato utilizzato per la prima volta nel campo dei virus giganti e ha permesso di isolare due nuovi virus giganti a bassa abbondanza. Abbiamo chiamato i nuovi virus Clandestinovirus ST1 e Usurpativirus LCD7, che erano in bassa abbondanza rispetto all'alta abbondanza Faustovirus. Al fine di analizzare la presenza virale in ogni piastra dopo la procedura di micro-aspirazione, abbiamo applicato la PCR sulle 15 microaspirazioni. Abbiamo osservato Usurpativirus puro (presenza di Usurpativirus LCD7 e assenza di Faustovirus [–]) solo nel clone 7 (Figura 3). La purezza del clone è stata confermata dalla PCR con protocolli specifici mirati a Clandestinovirus ST1 e Usurpativirus LCD7 (Tabella 2). La microscopia elettronica ha rivelato l'aspetto di Clanvirus ST1 e Usurpativirus LCD7(Figura 4), che hanno una tipica morfologia icosaedrica senza fibrille e un capside icosaedrio di circa 250 nm, rispettivamente. Dopo la conferma della purezza di produzione, il virus clonale è stato prodotto e purificato per il sequenziamento dell'intero genoma e per un'ulteriore caratterizzazione, in particolare la microscopia elettronica di trasmissione (TEM) per gli studi del ciclo di moltiplicazione. Abbiamo confermato la sovrapposizione delle popolazioni (Faustovirus/nuovo virus) per citometria di flusso (Figura 5).
Figura 1: Materiali per la micromanipolazione. (A) Configurazione effettiva della workstation. (B) Illustrazione schematica dei componenti della stazione di lavoro. (C) Illustrazione schematica del microcapillare. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Passi di micro-aspirazione. (A) Procedura di isolamento a cella singola (zoom x40). (B) Illustrazione schematica dei diversi passaggi dell'aspirazione a cella singola: 1) Localizzazione della cellula. 2) Aspirazione della cellula. 3) Fase di rilascio. Le frecce nere mostrano il microcapillare e quelle bianche mostrano la singola cellula. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Screening e conferma PCR. Screening della PCR delle microaspirazioni effettuata per Usurpativirus LCD7 e Faustovirus. Presenza di DNA LCD7 Usurpativirus e assenza di DNA Faustovirus (–) osservato per clone 7 dopo la procedura di micro-aspirazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Micrografo di colorazione negativa. Colorazione negativa della sospensione virale, che mostra puro Clandestinovirus ST1 (A) e Usurpativirus LCD7 (B). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Grafici di cancelli rappresentativi. (A) Superimposizione di ogni singola popolazione virale precedentemente macchiata con sonde molecolari fluorescenti per l'etichettatura del DNA del virus (in seguito precedentemente descritto protocollo26,30). La parte sinistra dell'immagine mostra la sovrapposizione di cinque ceppi di Faustovirus (verde scuro, verde chiaro, arancione, rosso e blu). Sulla destra, è visibile la sovrapposizione di Faustovirus ST1 e Clandestinovirus ST1 (viola chiaro e viola scuro). (B) La presenza di due popolazioni virali di Faustovirus e Usurpativirus nella stessa porta del Faustovirus (a sinistra). Un grafico a punti di Usurpativirus puro mostra lo stesso cancello definito in precedenza per Faustovirus (a destra). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Composizione PYG | Quantità |
| Peptone proteoso | 20 g |
| Estratto di lievito | 20 g |
| MgSO4X7O2O | 0,980 g |
| CaCl2 | 0,059 g |
| Sodio al citrato. Diidrato | 1 g |
| Fe (NH4) 2(SO4) 2 x 6H2O | 0,02 g |
| glucosio | 18 g |
| Acqua distillata | 1 L |
| Regolare il pH a 6,8 con HCl o KOH | |
| Autoclave 15 min a 121 gradi centigradi | |
| Mezzo di fame | quantifica |
| Estratto di lievito | 2 g |
| glucosio | 18 g |
| Fe (NH4) 2(SO4) 2 x 6H2O | 0,02 g |
| PAS (dettagliato di seguito) | 1 L |
| Soluzione PAS A | quantifica |
| KH2PO4 | 0,136 g |
| Na2HPO4 | 0,142 g |
| Soluzione PAS B | quantifica |
| MgSO4X7O2O | 4,0 mg |
| CaCl2o 2H2O | 4,0 mg |
| Nacl | 0,120 g |
| 10 mL ciascuna delle soluzioni A e B vengono aggiunte in 1 L di acqua distillata. |
Tabella 1: Composizione dei mezzi di coltura.
| Bersaglio di virus | Gene bersaglio | Primer Foward (5->3) | Primer inverso (5->3) |
| Faustovirus RpB2 | Numero di giri | CWCAATCHGCYGATACHGGTGA | TGATTWGCYAATGGNGCYGC |
| Usurpatvirus LCD7 Gene di capside maggiore | Gene del capside maggiore | GGGCAAGAGACTCCAAGCTA | GGGTTGAGGAGGAGAGTCAACG |
| Clandestinovirus ST1 Gene di capside minore | Gene del capside minore | AAAATGAACGCGTTGGAGGC | ACCGGCGAATGTGGGG |
Tabella 2: Sequenze Primmer utilizzate per la PCR.
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Discussion
La durata della gestione della microaspirazione a cella singola e il suo buon funzionamento dipendono dall'operatore. Le diverse fasi dell'esperimento richiedono precisione. L'uso dei componenti di micromanipolazione della postazione di lavoro deve essere sotto costante controllo osservando il processo di microaspirazione e il rilascio della cellula. Il follow-up per osservazione microscopica è necessario per la cattura e il trasferimento di una cellula. Un operatore esperto può prendere da 1 a 2 h per isolare 10 cellule e ritrasferirle una per una a seconda dell'abbondanza di virus da isolare. Il numero di manipolazioni può variare. Consigliamo di iniziare con 10 manipolazioni. Per definizione, non conosciamo le caratteristiche intrinseche del virus sconosciuto. Così, l'uso e lo sviluppo di diverse strategie per l'isolamento sono necessari per ottimizzare il successo della separazione di questi virus.
Il processo di microaspirazione viene eseguito in condizioni non sterili (su un banco al di fuori della stazione di sicurezza microbiologica) e quindi ne limita l'utilizzo e ne impedisce l'applicazione per lo studio di patogeni umani. Pertanto, l'uso di una miscela di antibiotici e antifungini per limitare i contaminanti è obbligatorio. Un'altra limitazione del metodo è che può essere eseguito solo su microrganismi osservabili mediante microscopia leggera su cui sono stati montati i componenti della micromanipolazione, eliminando così concettualmente qualsiasi lavoro su microrganismi non osservabili dalla luce Microscopia. Tuttavia, siamo stati in grado di separare virus giganti di circa 200 nm che rimangono invisibili al microscopio luminoso utilizzando una strategia indiretta che consiste nel separare e clonare gli ospiti infetti.
Lo sviluppo della microaspirazione a singola cellula per la cattura amebala è una parte dello sviluppo di metodi di selezione della popolazione. La micro-aspirazione a cellule singole ci ha permesso di isolare due nuovi virus giganti, Clandestinovirus ST1 e Usurpativirus LCD7, con caratteristiche distintive dai Faustovirus. Le proprietà morfologiche molto simili di Clanvirus ST1 e Usurpativirus LCD7 a Faustovirus LCD7 e la loro differenza di replicazione mostra il limite di FACS, che di solito viene utilizzato nello smistamento di virus giganti. È rappresentato dalla sovrapposizione di due popolazioni virali, Clandestinovirus ST1 e Faustovirus ST1 (Figura 5A) e anche dal rilevamento per Usupartivirus LCD7 e Faustovirus LCD7. Tuttavia, con questo nuovo metodo, l'intera manipolazione è sotto controllo visivo con un attento monitoraggio della cella e della sua integrità anche dopo il suo rilascio. L'uso della citometria di flusso per ordinare direttamente le amebe infette potrebbe essere una soluzione alternativa per ordinare indirettamente nuovi virus. Questo metodo è di solito seguito dallo screening della piastra al fine di rilevare effetti citopatici o lisi. La presenza di virus non litici nella miscela potrebbe rappresentare un limite allo smistamento amebo. Tuttavia, questo non è stato esplorato nella creazione di questo protocollo e per questi due nuovi isolati.
Oltre all'applicazione della micromanipolazione nel posizionamento e nella detenzione delle cellule in generale e degli ovociti per l'iniezione intracitoplasmatica (ICSI)33, la micro-aspirazione a cellule singole si è dimostrata un metodo pratico per l'isolamento del singolo cellule procyotiche osservabili al microscopio ottico31. Altre applicazioni potrebbero essere testate, tra cui lo smistamento delle cellule su base morfologica per avere diversi campioni puri da un campione misto di microrganismi. La separazione osservabile dei microrganismi può essere concepita utilizzando la strategia descritta sopra.
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Disclosures
Tutti gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare sia Jean-Pierre Baudoin che Olivier Mbarek per i loro consigli e Claire Andréani per il suo aiuto nelle correzioni e nelle modifiche inglesi. Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione dello Stato francese gestita dall'Agenzia nazionale di ricerca nell'ambito del programma "Investissements d'avenir (Investments for the Future)" con il riferimento ANR-10-IAHU-03 (Méditerranée Infection) e dal Région Provence Alpes Costa Azzurra e finanziamento europeo FEDER PRIMI.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose Standard | Euromedex | Unkown | Standard PCR |
| AmpliTaq Gold 360 Master Mix | Applied Biosystems | 4398876 | Standard PCR |
| CellTram 4r Oil | Eppendorf | 5196000030 | Control the cells during the microaspiration process |
| Corning cell culture flasks 150 cm2 | Sigma-aldrich | CLS430825 | Culture |
| Corning cell culture flasks 25 cm2 | Sigma-aldrich | CLS430639 | Culture |
| Corning cell culture flasks 75 cm2 | Sigma-aldrich | CLS430641 | Culture |
| DFC 425C camera | LEICA | Unkown | Observation/Monitoring |
| Eclipse TE2000-S Inverted Microscope | Nikon | Unkown | Observation/Monitoring |
| EZ1 advanced XL | Quiagen | 9001874 | DNA extraction |
| Glasstic Slide 10 with Counting Grids | Kova International | 87144E | Cell count |
| Mastercycler nexus | Eppendorf | 6331000017 | Standard PCR |
| Microcapillary 20 µm | Eppendorf | 5175 107.004 | Microaspiration and release of cells |
| Micromanipulator InjectMan NI2 | Eppendorf | 631-0210 | Microcapillary positioning |
| Nuclease-Free Water | ThermoFischer | AM9920 | Standard PCR |
| Optima XPN Ultracentrifuge | BECKMAN COULTER | A94469 | Virus purification |
| Petri dish 35 mm | Ibidi | 81158 | Culture/observation |
| Sterile syringe filters 5 µm | Sigma-aldrich | SLSV025LS | Filtration |
| SYBR green Type I | Invitrogen | unknown | Fluorescent molecular probes/flow cytometry |
| SYBR Safe | Invitrogen | S33102 | Standard PCR; DNA gel stain |
| Tecnai G20 | FEI | Unkown | Electron microscopy |
| Type 70 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor | BECKMAN COULTER | 337922 | Virus purification |
| Ultra-Clear Tube, 25 x 89 mm2 | BECKMAN COULTER | 344058 | Virus purification |
References
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