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Biology

Micro-aspiração de célula única como uma estratégia alternativa à classificação celular ativada por fluorescência para separação de mistura de vírus gigante

Published: October 27, 2019 doi: 10.3791/60148

Summary

Aqui, descrevemos um método de micro-aspiração de célula única para a separação de amebae infectada. A fim separar subpopulações virais no vermiformis de Vermamoeba contaminado por Faustoviruses e por vírus gigantes desconhecidos, nós desenvolvemos o protocolo detalhado abaixo e demonstramos sua habilidade de separar dois vírus gigantes novos low-abundance.

Abstract

Durante o processo de cocultura de ameba, mais de um vírus pode ser isolado em um único poço. Previamente resolvemos esse problema por diluição final e/ou fluorescência ativada de classificação celular (FACS) aplicada à população viral. No entanto, quando os vírus na mistura têm propriedades morfológicas semelhantes e um dos vírus se multiplica lentamente, a presença de dois vírus é descoberta na fase de montagem do genoma e os vírus não podem ser separados para maior caracterização. Para resolver este problema, desenvolvemos um procedimento de micro-aspiração de célula única que permite a separação e clonagem de vírus altamente semelhantes. No presente trabalho, apresentamos como essa estratégia alternativa nos permitiu separar as pequenas subpopulações virais de Clandestinovirus ST1 e Usurpativirus LCD7, vírus gigantes que crescem lentamente e não levam à lúse amebal em comparação com o lytic e o rápido crescimento Faustovírus. O controle da pureza foi avaliado pela amplificação específica do gene e os vírus foram produzidos para uma caracterização mais adicional.

Introduction

Os vírus nucleocitoplasmic do ADN grande (NCLDV) são extremamente diversos, definidos por quatro famílias que infectam eucariontes1. Os primeiros vírus descritos com genomas acima de 300 kbp foram Phydcodnaviridae,incluindo paramecium bursaria chlorella vírus 1 PBCV12. O isolamento e a primeira descrição do Mimivirus mostraram que o tamanho dos vírus dobrou em termos do tamanho da partícula (450 nm) quanto do comprimento do genoma (1,2 Mb)3. Desde então, muitos vírus gigantes foram descritos, geralmente isolados usando um procedimento de cocultura de ameba. Vários vírus gigantes com diferentes morfologias e conteúdos genéticos podem ser isolados das células acanthamoeba sp., incluindo Marseilleviruses, Pandoraviruses, Pithoviruses, Mollivirus, Cedratviruses, Pacmanvirus, Tupanvirus e recentemente Medusavirus4,5,6,7,8,9,10,11,12, 13,14,15,16,17. Paralelamente, o isolamento de Vermamoeba vermiformis permitiu o isolamento e descrição dos vírus gigantes Faustovirus, Kaumoebavirus e Orpheovirus18,19,20. Outros vírus gigantes foram isolados com seus protistas hospedeiros, como cafeteria roenbergensis21, Aureococcus anophagefferens22, Chrysochromulina ericina23,e bodo saltans 24. Todos esses isolamentos foram o resultado de um número crescente de equipes trabalhando no isolamento e na introdução de atualizações de estratégia de alta de supressão25,26,27,28,como a melhoria do sistema de co-cultura com o uso de citometria de fluxo.

Em 2016, usamos uma estratégia associando cocultura e citometria de fluxo para isolar vírus gigantes27. Esta estratégia foi desenvolvida para aumentar o número de amostras inoculadas, para diversificar os protistas usados como suportes celulares e detectar rapidamente a lise do suporte celular. O sistema foi atualizado adicionando um passo suplementar para evitar a identificação preliminar da biologia molecular e detecção rápida de uma população viral desconhecida como no caso do Pacmanvirus29. Acoplamento citometria fluxo para classificação celular permitido para a separação de uma mistura de Mimivirus e Cedratvirus A1130. No entanto, mais tarde encontramos as limitações da separação e detecção dessas subpopulações virais por citometria de fluxo. Após o sequenciamento, quando montamos os genomas do Faustovirus ST125 e Faustovirus LCD7 (dados inéditos), surpreendentemente encontramos em cada montagem dois genomas suplementares de dois novos vírus não identificados em bancos de dados do genoma público. No entanto, nem a citometria de fluxo nem a microscopia eletrônica de transmissão (TEM) mostraram que as amebaes foram infectadas por dois vírus diferentes, Clandestinovirus ST1 e Usurpativirus LCD7. Nós projetamos sistemas específicos de PCR para amplificar os marcadores faustovírus, usurpativírus e clandestinovírus, respectivamente, com base em seus genomas; nosso objetivo era ter sistemas baseados em PCR que permitissem a verificação da pureza dos vírus que estão sendo separados. No entanto, a diluição do ponto final e a citometria de fluxo não conseguiram separá-los. O isolamento dessa única população viral foi difícil porque nem a morfologia nem os elementos replicativos das populações de Clandestinovírus e Usurpativírus têm sido caracterizados. Detectamos apenas uma população viral por citometria de fluxo devido à sobreposição das duas populações (testadas após a separação efetiva). Tentamos separá-los usando uma única classificação de partículas em placas de 96 poços, mas não observamos quaisquer efeitos citopáticos, e não detectamos nem Clandestinovirus nem Usurpativirus por amplificação pcr. Finalmente, foi apenas a combinação de diluição do ponto final seguido por micro-aspiração única ameba que permitiu a separação desses dois vírus gigantes de baixa abundância de faustovírus. Este método de separação é o objeto deste artigo.

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Protocol

1. Cultura ameba

  1. Use vermiformis de Vermamoeba (tensão CDC19) como uma sustentação da pilha.
  2. Adicione 30 mL de protease-peptone-levedura extrato-glicose médio (PYG) (Tabela 1) e 3 mL da amebae em uma concentração de 1 x 106 células / mL em um frasco de cultura de 75 cm2 células.
  3. Mantenha a cultura a 28 °C.
  4. Após 48 h, quantificar a amebae usando lâminas de contagem.
  5. Para enxaguar, colher as células a uma concentração de 1 x 106 células/mL e pelota a amebae por centrífuga a 720 x g por 10 minutos. Retire o supernatant e resuspenda a pelota no volume apropriado de meio de fome para obter 1 x 106 células/mL (Tabela 1).

2. Propagação do vírus de estoque na amebae

Nota: Antes da diluição, é importante a cultura da amostra de estoque para obter bastante cultura fresca, a seguir prossiga à filtragem.

  1. Use 1 x 106 da cultura da ameba no meio da inanição.
  2. Inocular a mistura de vírus emitidos a partir da solução de estoque (Faustovirus / Usurpativirus LCD7 ou Faustovirus / Clandestinovirus ST1) após o processo de co-cultura sobre o suporte celular em uma multiplicidade de infecção (MOI) de 0,01.
    Nota: O MOI é importante para reduzir a abundância da população viral principal e o número de pilhas contaminadas.
  3. Incubada a 30 °C até que os efeitos citopáticos (CPE) sejam induzidos, como arredondamento de amebal ou lyse, aproximadamente 10 a 14 h após a infecção.
  4. Colete a mídia e filtrar através de um filtro de 5 μm para remover detritos celulares.

3. Diluição do ponto final

  1. Realizar uma diluição em série (10-1 a 10-11)da amostra viral em meio de fome (Tabela 1).
  2. Inoculate 2 mL de 1 x 106 Vermamoeba vermiformis contidos em cada placa de Petri com 100 μL do inoculum da mistura.
  3. Coloque as placas de Petri em um saco plástico selado a 30 °C.
  4. Comece a observar as placas de Petri com microscopia óptica invertida em 6 h pós-infecção e verifique a morfologia celular a cada 4 a 8 h.
  5. No aparecimento do efeito citopático caracterizado por células de arredondamento, iniciar o processo de micro-aspiração de célula única.

4. Micro-aspiração unicelular

  1. Prepare o anfitrião.
    NOTA:
    Esta preparação é feita para a liberação de células únicas infectadas para um suporte de células frescas.
    1. Trate a amebae na cultura com um agente antimicrobiano contendo 10 μg/mL de vancomycin, 10 μg/mL de imipenem, 20 μg/mL de ciprofloxacina, 20 μg/mL de doxiciclina e 20 μg/mL de voriconazole. Esta mistura é usada para evitar a contaminação bacteriana e fúngica.
      Nota: O procedimento ocorre em um banco fora da estação de segurança microbiológica. Adicione 2 mL de amebae concentrada em 1 x 106 células/mL cada uma em 15 placas de Petri. Para a adesão à ameba, incubar a cultura a 30 °C por 30 min.
  2. Selecione a placa de Petri usada para a micro-aspiração a partir da diluição limite de acordo com os seguintes critérios: 1) ausência de qualquer contaminação visível por agentes fúngicos e bacterianos, 2) evidência de efeito citopático de amebae devido aos vírus, e 3) prelíse e fase de arredondamento da amebae (para evitar a aspiração de partículas virais).
  3. Configure uma estação de trabalho com os seguintes materiais (ver Figura 1A,B):
    Micromanipulador, que permite o posicionamento microcapilar;
    Dispositivo manual da pressão do controle, usado para aspirar e liberar as pilhas no microcapillary;
    Microscópio invertido;
    Conecte e jogue módulos motores;
    Câmera;
    Módulo de computador para visualizar a manipulação e tirar fotos.
  4. Escolha um microcapilar (ver Figura 1C).
    Nota: O tamanho das células, a deformação e a adesão de suas membranas às superfícies, e a motilidade celular podem afetar o progresso suave da micro-aspiração. O diâmetro microcapilar pode ser escolhido e adaptado com precisão a tipos específicos de células, dependendo de seus tamanhos e métodos de aspiração. Um microcapilar de 20 μm de diâmetro interno foi usado para aspirar uma ameba de arredondamento (diâmetro ~10 μm). Isso permite a manutenção de uma posição interna e uma liberação fácil da célula.
  5. Monte o sistema.
    1. Corrija o ângulo operacional do sistema de aperto no módulo motorizado a 45°.
    2. Realize uma instalação dupla, primeiro no sistema emocionante, e depois no microcapilar.
    3. Concentre-se nas células depois de executar algumas gotas de óleo através do microcapilar.
      Nota: O óleo mineral com compatibilidade biológica é fornecido pelo dispositivo.
    4. Complete a montagem seguindo as recomendações do fabricante.
  6. Células clonadas (ver Figura 2A,B).
    NOTA:
    Este procedimento é semelhante ao descrito por Fröhlich e König31.
    1. Coloque a placa de Petri contendo 2 mL de amebae infectada o microscópio.
    2. Concentre-se primeiro nas células e, em seguida, no microcapilar imerso na cultura.
    3. Escolha uma única célula arredondada e aproxime o microcapilar do micromanipulador.
    4. Exerça a aspiração suave com controle manual de pressão sobre a célula, levando-o para dentro do microcapilar. Retire a única célula da primeira amostra e libere no suporte celular e, em seguida, incuba-a a 30 °C.
    5. Realizar observações diárias com um microscópio óptico invertido para observar o aparecimento das células e monitorar o surgimento do efeito citopático.

5. Triagem PCR

Nota: Após a etapa 4, uma triagem sistemática por PCR é crucial para confirmar a separação. Tanto no Usurpativirus/Faustovirus quanto no Clandestinovirus/Faustovirus, o projeto e a aplicação dos sistemas específicos de primer e sonda foram feitos usando primer-BLAST online32 (Tabela 2).

  1. Extrato DNA de uma parte das amostras de cultura positiva (ou seja, onde um efeito citopático é observado), usando um sistema de extração automatizado de acordo com o protocolo do fabricante.
  2. Use primers apropriadamente projetados.
    Nota: Aqui nós projetamos primers para amplificar genes do núcleo anotados como RpB2 (Faustovirus), proteína capsid principal lcd7 (usurpatvirus) e proteína capsid menor (Clandestinovirus)
  3. Executar PCR padrão usando um termociclor.
    1. Realize 20 reações μL PCR com 50 μM de cada primer (Tabela 2),1x Master Mix e RNase água livre.
    2. Ative o DNA Taq polymerase por 5 min a 95 °C, em seguida, siga com 45 ciclos de desnaturação de 10 s a 95 °C, annealing das primers para 30 s em 58 °C, e extensão para 30 s em 72 °C.
  4. Executar os produtos PCR em um gel agarose 1,5%, mancha com mancha de gel de DNA(Tabela de Materiais),e visualizar com UV.

6. Produção e purificação de vírus

  1. Coloque o resto da cultura da placa de Petri de volta em um pequeno frasco.
  2. Para a produção do vírus, prepare 15 frascos de 145 cm2,contendo 40 mL de vermiformese Vermamoeba em meio de fome e 5 mL do vírus isolado já transferido da placa de Petri para pequenos frascos.
  3. Trate com a mesma mistura antibiótica e antifúngica usada na etapa 4.1.
  4. Incubar a 30 °C. Observe todos os dias com microscopia óptica invertida.
  5. Após a infecção completa, piscina todos os frascos. Use um filtro de 0,45 μm para eliminar detritos.
  6. Ultracentrifuge todas as supernatantes a 50.000 x g por 45 min.
  7. Após a centrífugação, retire o supernatant de cada tubo por aspiração e resuspenda a pelota em 1 mL de soro fisiológico amortecida de fosfato (PBS).
  8. Purificar o vírus produzido com 25% de sacarose (27,5 g de sacarose em 100 mL de PBS, esterilizado por filtragem).
  9. Centrífuga 8 mL de sacarose e 2 mL da suspensão viral em 80.000 x g por 30 min. Resuspende a pelota viral em 1 mL de PBS. Guarde-o a -80 °C.

7. Microscopia eletrônica negativa da coloração e da transmissão

Nota: Bou Khalil et al. publicaram anteriormente este protocolo27.

  1. Deposite 5 μL da lysis supernatant na grade glow-discharged. Deixe por aproximadamente 20 min à temperatura ambiente.
    Nota: A descarga de brilho nos permite obter uma grade hidrofílica por aplicação de plasma.
  2. Seque a grade com cuidado e deposite uma pequena queda de 1% de molybdate de amônio por 10 s. Deixe a grade para secar por 5 min.
  3. Siga para observações de microscopia eletrônica a 200 keV.

8. Caracterização do Clandestinovirus ST1 e usurpativirus LCD7

  1. Caracterizar populações puras de Clandestinovirus ST1 e Usurpativirus LCD7 usando sequenciamento do genoma, montagem do genoma, análises de bioinformática e estudo de seu ciclo replicativo como fizemos para outros vírus10,20, 29.

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Representative Results

A micro-aspiração de célulaúnica é um processo de micromanipulação otimizado neste manuscrito (Figura 1). Esta técnica permite a captura de uma ameba arredondada e infectada (Figura 2A)e seu lançamento em uma placa nova contendo amebae não infectada (Figura 2). É um protótipo funcional que se aplica ao sistema de co-cultura e isolou com sucesso vírus gigantes não líticos. Esta abordagem foi usada pela primeira vez no campo de vírus gigantes e tornou possível isolar dois novos vírus gigantes de baixa abundância. Nós nomeamos os novos vírus Clandestinovirus ST1 e Usurpativirus LCD7, que estavam em baixa abundância em comparação com a alta abundância Faustoviruses. Para analisar a presença viral em cada placa após o procedimento de microaspiração, aplicamos PCR nas 15 microaspirações. Observamos usurpativírus puro (presença de Usurpativirus LCD7 [+] e ausência de Faustovirus [-]) apenas no clone 7(Figura 3). A pureza do clone foi confirmada pela PCR com protocolos específicos visando Clandestinovirus ST1 e Usurpativirus LCD7(Tabela 2). A microscopia eletrônica revelou o aparecimento do Clandestinovirus ST1 e usurpativirus LCD7 (Figura 4),que têm uma morfologia icosaédrica típica sem fibrilas e um capsid icosaédrico de cerca de 250 nm, respectivamente. Após a confirmação da pureza da produção, o vírus clonal foi produzido e purificado para sequenciamento do genoma inteiro e caracterização adicional, especialmente a transmissão de microscopia eletrônica (TEM) para estudos de ciclo de multiplicação. Confirmamos a sobreposição de populações (Faustovirus/vírus novo) por citometria de fluxo(Figura 5).

Figure 1
Figura 1:Materiais para micromanipulação. (A)Configuração real da estação de trabalho. (B)Ilustração esquemática dos componentes da estação de trabalho. C) Ilustração esquemática do microcapilar. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figure 2
Figura 2:Passos de micro-aspiração. (A)Procedimento de isolamento de célulaúnica (zoom x40). (B) Ilustração esquemática dos diferentes passos da aspiração de célula única: 1) Localização da célula. 2) Aspiração da célula. 3) Passo de liberação. As setas pretas mostram o microcapilar e as brancas mostram a única célula. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figure 3
Figura 3:Triagem e confirmação do PCR. Triagem pcr de micro-aspirações realizadas para usurpativirus LCD7 e Faustovirus. Presença de DNA do Usurpativirus LCD7 (+) e ausência de DNA do Faustovírus (-) observada para clone 7 após procedimento de micro-aspiração. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figure 4
Figura 4:Micrografia de coloração negativa. Coloração negativa da suspensão viral, mostrando puro Clandestinovirus ST1 (A)e Usurpativirus LCD7 (B). Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figure 5
Figura 5:Parcelas representativas da porta. (A) Superposição de cada população viral previamente manchada com sondas moleculares fluorescentes para rotulagem de DNA de vírus (seguindo o protocolo previamente descrito26,30). A parte esquerda da imagem mostra a superposição de cinco cepas de Faustovirus (verde escuro, verde claro, laranja, vermelho e azul). À direita, a superposição do Faustovirus ST1 e do Clandestinovirus ST1 (roxo claro e roxo escuro) é visível. (B) A presença de duas populações virais de Faustovirus e Usurpativirus no mesmo portão que Faustovirus (esquerda).  Um lote de pontos de usurpativírus puro mostra o mesmo portão definido anteriormente para Faustovirus (direita). Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Composição do PYG Quantidades
Peptone proteose 20 g
Extrato do fermento 20 g
MgSO 4 ·7H 2 O MgSO4·7H2O 0,980 g
CaCl 2 CaCl2 0,059 g
Citiculte sódio. Dihidratado 1 g
Fe (NH4) 2 (SO4) 2 x 6H2O 0,02 g
Glicose 18 g
Água destilada 1 L (L)
Ajuste o pH em 6,8 com HCl ou KOH
Autoclave 15 min em 121 °C
Meio de fome quantidades
Extrato do fermento 2 g
Glicose 18 g
Fe (NH4) 2 (SO4) 2 x 6H2O 0,02 g
PAS (detalhado abaixo) 1 L (L)
Solução PAS A quantidades
KH 2 PO 4 KH2PO4 0,136 g
Na 2 HPO 4 Na2HPO4 0,142 g
Solução PAS B quantidades
MgSO 4 ·7H 2 O MgSO4·7H2O 4,0 mg
Cacl 2 ·2H 2 O Cacl2·2H 2O 4,0 mg
Nacl 0,120 g
10 mL cada solução A e B são adicionados em 1 L de água destilada.

Tabela 1: Composição da Cultura Media.

Alvo do vírus Gene alvo Primer de Foward (5->3) Primer reverso (5->3)
Faustovirus RpB2 Faustovirus RpB2 RpB2 RpB2 CWCAATCHGCYGAGGTGA CWCAATCHGCYGAGGTGA TGATTWGCYAATGGNGCYGC TGATTWGCYAATGGNGCYGC
Usurpatvirus LCD7 Gene capsid major Gene capsid principal GGGCAAGAAGCTCCAAGCTA GGGCGCAGA GGGTTGAGGAGGAGTCAACG GGGTTGAGGAGGAGTCAACG
Clandestinovirus ST1 Gene capsid menor Gene capsid menor AAAATGAACGCGTTGGAGGC AAAATGAACGCGTTGGAGGC ACCGGCGAATGTTCCTATGG ACCGGCGAATTCCTATGG

Tabela 2: Sequências primmer usadas para o PCR.

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Discussion

A duração do manuseio de micro-aspiração de célula única e seu bom funcionamento é dependente do operador. As diferentes etapas do experimento requerem precisão. O uso dos componentes de micromanipulação da estação de trabalho deve estar controle constante observando o processo de micro-aspiração e a liberação da célula. O acompanhamento por observação microscópica é necessário para captura e transferência de uma célula. Um operador experiente pode levar de 1 a 2 h para isolar 10 células e retransferi-las uma a uma, dependendo da abundância de vírus a serem isolados. O número de manipulações pode variar. Aconselhamos a partir de 10 manipulações. Por definição, não sabemos as características intrínsecas do vírus desconhecido. Assim, o uso e o desenvolvimento de diferentes estratégias de isolamento são necessários para otimizar o sucesso da separação desses vírus.

O processo de micro-aspiração é realizado em condições não estéreis (em um banco fora da estação de segurança microbiológica) e, portanto, restringe seu uso e impede sua aplicação para o estudo de patógenos humanos. Portanto, o uso de uma mistura de antibióticos e antifúngicos para limitar contaminantes é obrigatório. Outra limitação do método é que ele só pode ser realizado em microorganismos observáveis por microscopia de luz em que os componentes de micromanipulação foram montados, eliminando conceitualmente qualquer trabalho em microorganismos não observáveis pela luz Microscopia. No entanto, fomos capazes de separar vírus gigantes de cerca de 200 nm que permanecem invisíveis o microscópio de luz usando uma estratégia indireta que consiste em separar e clonar os hospedeiros infectados.

O desenvolvimento da micro-aspiração celular única para a captura de amebal é uma parte do desenvolvimento de métodos de classificação populacional. A micro-aspiração de célulaúnica nos permitiu isolar dois novos vírus gigantes, Clandestinovirus ST1 e Usurpativirus LCD7, com características distintivas de faustovírus. As propriedades morfológicas altamente semelhantes do Clandestinovirus ST1 e usurpativirus LCD7 ao Faustovirus LCD7 e sua diferença de replicação mostram o limite da FACS, que geralmente é usada na classificação de vírus gigantes. É representada pela superposição de duas populações virais, Clandestinovirus ST1 e Faustovirus ST1(Figura 5A)e também pela detecção de Usupartivirus LCD7 e Faustovirus LCD7. No entanto, com este novo método, toda a manipulação está controle visual com monitoramento cuidadoso da célula e sua integridade, mesmo após seu lançamento. O uso da citometria do fluxo para classificar diretamente a ameba contaminada poderia ser uma solução alternativa para classificar indiretamente vírus novos. Este método é geralmente seguido pelo rastreamento da placa, a fim de detectar efeitos citopáticos ou linse. A presença de vírus não líticos na mistura pode representar um limite para a triagem de amebal. No entanto, isso não foi explorado na criação deste protocolo e para esses dois novos isolamentos.

Além da aplicação da micromanipulação no posicionamento e exploração de células em geral e oócitos para injeção intracitoplasmática de espermatozóides (ICSI)33, micro-aspiração de célulaúnica provou ser um método prático para o isolamento de células procarióticas observáveis um microscópio óptico31. Outras aplicações poderiam ser testadas, incluindo a classificação celular em uma base morfológica para ter diferentes amostras puras de uma amostra mista de microorganismos. A separação observável de microorganismos pode ser imaginada usando a estratégia descrita acima.

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Disclosures

Todos os autores não têm nada a divulgar.

Acknowledgments

Os autores gostariam de agradecer a Jean-Pierre Baudoin e Olivier Mbarek por seus conselhos e Claire Andréani por sua ajuda em correções e modificações em inglês. Este trabalho foi apoiado por uma subvenção do Estado francês gerida pela Agência Nacional de Investigação no âmbito do programa "Investissements d'avenir (Investimentos para o Futuro)" com a referência ANR-10-IAHU-03 (Infecção méditerranée) e por Région Provence Alpes Côte d'Azur e financiamento europeu FEDER PRIMI.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose Standard Euromedex Unkown Standard PCR
AmpliTaq Gold 360 Master Mix Applied Biosystems 4398876 Standard PCR
CellTram 4r Oil Eppendorf 5196000030 Control the cells during the microaspiration process
Corning cell culture flasks 150 cm2 Sigma-aldrich CLS430825 Culture
Corning cell culture flasks 25 cm2 Sigma-aldrich CLS430639 Culture
Corning cell culture flasks 75 cm2 Sigma-aldrich CLS430641 Culture
DFC 425C camera LEICA Unkown Observation/Monitoring
Eclipse TE2000-S Inverted Microscope Nikon Unkown Observation/Monitoring
EZ1 advanced XL Quiagen 9001874 DNA extraction
Glasstic Slide 10 with Counting Grids Kova International 87144E Cell count
Mastercycler nexus Eppendorf 6331000017 Standard PCR
Microcapillary 20 µm Eppendorf 5175 107.004 Microaspiration and release of cells
Micromanipulator InjectMan NI2 Eppendorf 631-0210 Microcapillary positioning
Nuclease-Free Water ThermoFischer AM9920 Standard PCR
Optima XPN Ultracentrifuge BECKMAN COULTER A94469 Virus purification
Petri dish 35 mm Ibidi 81158 Culture/observation
Sterile syringe filters 5 µm Sigma-aldrich SLSV025LS Filtration
SYBR green Type I Invitrogen unknown Fluorescent molecular probes/flow cytometry
SYBR Safe Invitrogen S33102 Standard PCR; DNA gel stain
Tecnai G20 FEI Unkown Electron microscopy
Type 70 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor BECKMAN COULTER 337922 Virus purification
Ultra-Clear Tube, 25 x 89 mm2 BECKMAN COULTER 344058 Virus purification

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Biologia Edição 152 micro-aspiração celular única clonagem vírus gigantes Faustovirus co-cultura Vermamoeba vermiforme,citometria de fluxo FACS
Micro-aspiração de célula única como uma estratégia alternativa à classificação celular ativada por fluorescência para separação de mistura de vírus gigante
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Sahmi-Bounsiar, D., Boratto, P. V.More

Sahmi-Bounsiar, D., Boratto, P. V. d. M., Oliveira, G. P., Bou Khalil, J. Y., La Scola, B., Andreani, J. Single Cell Micro-aspiration as an Alternative Strategy to Fluorescence-activated Cell Sorting for Giant Virus Mixture Separation. J. Vis. Exp. (152), e60148, doi:10.3791/60148 (2019).

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