Summary
Här beskriver vi en enda cell mikro-aspiration metod för separation av infekterade amoebae. För att separera viral subpopulationer i Vermamoeba vermiformis smittade av faustoviruses och okända jätte virus, utvecklade vi protokollet som beskrivs nedan och visat sin förmåga att separera två låg-överflöd roman Giant virus.
Abstract
Under amoeba Co-Culture processen, mer än ett virus kan isoleras i en enda brunn. Vi löste tidigare denna fråga genom slutpunkt utspädning och/eller fluorescens aktiverad cell sortering (FACS) tillämpas på virus populationen. Men när virusen i blandningen har liknande morfologiska egenskaper och ett av virusen multiplicerar långsamt, upptäcks närvaron av två virus i stadiet av arvsmassan och virusen kan inte separeras för ytterligare karakterisering. För att lösa detta problem, utvecklade vi en enda cell mikro-aspiration förfarande som möjliggör separation och kloning av mycket likartade virus. I det nuvarande arbetet presenterar vi hur denna alternativa strategi tillät oss att separera de små viral subpopulationer av Clandestinovirus ST1 och Usurpativirus LCD7, jätte virus som växer långsamt och inte leder till amoebal Lys jämfört med den lytiska och snabbväxande Faustovirus. Renhetskontroll bedömdes genom specifik genamplifiering och virus producerades för ytterligare karakterisering.
Introduction
Nukleocytoplasmic stora DNA-virus (ncldv) är extremt varierande, definieras av fyra familjer som infekterar Eukaryoter1. De första beskrivna virusen med genom över 300 KBP var Phydcodnaviridae, inklusive paramecium Bursaria Chlorella virus 1 PBCV12. Isoleringen och den första beskrivningen av Mimivirus visade att virusets storlek fördubblades både när det gäller partikelstorlek (450 nm) och genomets längd (1,2 MB)3. Sedan dess har många gigantiska virus beskrivits, vanligtvis isolerade med hjälp av en amoeba Co-Culture förfarande. Flera gigantiska virus med olika morfologier och genetiska innehåll kan isoleras från Acanthamoeba SP. celler, inklusive Marseilleviruses, Pandoraviruses, Pithovirusen, Mollivirus, Cedratviruses, Pacmanvirus, tupanvirus, och nyligen Medusavirus4,5,6,7,8,9,10,11,12, 13,14,15,16,17. Parallellt, isolering av vermamoeba vermiformis tillåts isolering och beskrivning av jätten virus faustovirus, kaumoebavirus, och orpheovirus18,19,20. Andra gigantiska virus isolerades med sina värdprotister, såsom cafeteria roenbergensis21, aureococcus ansiefferens22, chrysochromulina patentifolium23och Bodo saltans 24. Alla dessa isoleringar var resultatet av ett ökande antal team som arbetar på isolering och införandet av hög genomströmning strategi uppdateringar25,26,27,28, såsom förbättring av co-Culture-systemet med hjälp av flödescytometri.
I 2016, vi använde en strategi som associerar Co-kultur och flödescytometri att isolera Giant virus27. Denna strategi utvecklades för att öka antalet prover inokulerade, att diversifiera protister som används som cell stöd, och att snabbt upptäcka lys av cell stöd. Systemet uppdaterades genom att lägga till ett kompletterande steg för att undvika preliminär molekylär biologi identifiering och snabb upptäckt av en okänd virus population som i fallet med Pacmanvirus29. Kopplingflödescytometri till cell sortering tillåten för separation av en blandning av Mimivirus och Cedratvirus A1130. Emellertid, vi stötte senare begränsningarna av separation och detektion av dessa virala subpopulationer av flödescytometri. Efter sekvensering, när vi monterade genomen av Faustovirus ST125 och FAUSTOVIRUS LCD7 (opublicerade data), Vi hittade förvånansvärt i varje församling två kompletterande genom av två nya virus som inte identifierats i offentliga Genome databaser. Men varken flödescytometri eller transmission elektronisk mikroskopi (TEM) visade att amoebaes var smittade av två olika virus, Clandestinovirus ST1 och Usurpativirus LCD7. Vi har utformat specifika PCR-system för att förstärka markörer för Faustovirus, Usurpativirus och Clandestinovirus baserat på deras genom. vårt syfte var att ha PCR-baserade system som möjliggör verifiering av renheten hos de virus som separeras. Slutpunkts utspädning och flödescytometri kunde dock inte separera dem. Isoleringen av denna enda viral population var svår eftersom varken morfologin eller replikativa element av Clandestinovirus och Usurpativirus populationer har karakteriserats. Vi upptäckte endast en virus population genom flödescytometri på grund av överlappningen mellan de två populationerna (testad efter den effektiva separationen). Vi försökte separera dem med enkel partikel sortering på 96-bra tallrikar, men vi har inte observerat några cytopatiska effekter, och vi upptäckte varken Clandestinovirus eller Usurpativirus av PCR Amplification. Slutligen var det bara kombinationen av slutpunkt utspädning följt av en enda amoeba mikro-aspiration som möjliggjorde separation av dessa två låg-överflöd jätte virus från Faustoviruses. Denna separationsmetod är föremålet för denna artikel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. amoeba kultur
- Använd Vermamoeba vermiformis (stam CDC19) som en cell stöd.
- Tillsätt 30 mL proteas-Peptone-jästextrakt-glukos medium (PYG) (tabell 1) och 3 ml av amöbae vid en koncentration av 1 x 106 celler/ml i en 75 cm2 cell odlings kolv.
- Bevara kulturen vid 28 ° c.
- Efter 48 h, kvantifiera amöbor använda räkna diabilder.
- För att skölja, skörda cellerna vid en koncentration av 1 x 106 celler/ml och pelleten amöbor genom centrifugering vid 720 x g i 10 min. ta bort supernatanten och Omsuspendera pelleten i lämplig volym av svält medium för att få 1 x 106 celler/ml (tabell 1).
2. utbredning av beståndet virus i Amoebae
Anmärkning: Före utspädning, är det viktigt att kulturen beståndet provet för att få tillräckligt med färsk kultur, sedan gå vidare till filtrering.
- Använd 1 x 106 av amoeba kulturen i svält medium.
- Inokulera blandningen av virus som utfärdats från stamlösningen (Faustovirus/Usurpativirus LCD7 eller Faustovirus/Clandestinovirus ST1) efter Co-Culture processen på cell stöd vid en multiplicity av infektion (MOI) av 0,01.
Anmärkning: MOI är viktigt att minska överflödet av den stora virus populationen och antalet infekterade celler. - Inkubera vid 30 ° c tills cytopatiska effekter (CPE) induceras, såsom amoebal avrundning eller Lys, cirka 10 till 14 h efter infektion.
- Samla upp media och filtratet genom ett 5 μm filter för att ta bort cellulär skräp.
3. slutpunkts utspädning
- Utför en seriell utspädning (10-1 till 10-11) av virus provet i svält-medium (tabell 1).
- Inokulera 2 mL 1 x 106 vermamoeba vermiformis som finns i varje petriskål med 100 μl av blandningen inoculum.
- Placera Petriskålarna i en tätnings bar plastpåse vid 30 ° c.
- Börja Observera Petriskålarna med inverterad optisk mikroskopi vid 6 h angripen och kontrollera cellmorfologi var 4 till 8 h.
- Vid uppkomsten av cytopatisk effekt kännetecknas av avrundning celler, börja Single cell Micro-aspiration process.
4. Single cell Micro-aspiration
-
Förbered värden.
Anmärkning: denna beredning görs för frisättning av infekterade enskilda celler till en ny cell stöd.- Behandla amöbae i kulturen med ett antimikrobiellt medel innehållande 10 μg/mL vankomycin, 10 μg/mL imipenem, 20 μg/mL ciprofloxacin, 20 μg/mL doxycyklin och 20 μg/mL vorikonazol. Denna blandning används för att undvika bakterie-och svampangrepp.
Anmärkning: Förfarandet sker på en bänk utanför den mikrobiologiska säkerhets stationen. Tillsätt 2 mL amöbae koncentrerad till 1 x 106 celler/ml vardera i 15 petriskålar. För amoeba följsamhet, inkubera kulturen vid 30 ° c i 30 min.
- Behandla amöbae i kulturen med ett antimikrobiellt medel innehållande 10 μg/mL vankomycin, 10 μg/mL imipenem, 20 μg/mL ciprofloxacin, 20 μg/mL doxycyklin och 20 μg/mL vorikonazol. Denna blandning används för att undvika bakterie-och svampangrepp.
- Välj den petriskål som används för mikro-aspiration från gränsen utspädning enligt följande kriterier: 1) avsaknad av synlig kontaminering av svamp-och bakterie medel, 2) tecken på cytopatisk effekt av amöbor på grund av virusen, och 3) prelys och avrundnings fasen av amöbor (för att undvika aspiration av virala partiklar).
-
Ställ in en arbetsstation med följande material (se figur 1a, B):
Micromanipulator, som tillåter microcapillary positionering;
Manuell kontroll Tryck anordning, som används för att aspirera och frigöra cellerna i microcapillary;
Inverterat Mikroskop;
Plug and Play-motormoduler;
Kamera
Datormodul för att visualisera manipulation och ta bilder. - Välj en microcapillary (se figur 1C).
Anmärkning: Storleken på cellerna, deformationen och vidhäftning av deras membran till ytorna, och cellulära motilitet kan påverka den smidiga utvecklingen av mikro-aspiration. Den mikrokapillära diametern kan väljas exakt och anpassas till specifika celltyper beroende på deras storlek och metoder för aspiration. En microcapillary av 20 μm innerdiameter användes för att aspirera en avrundning amoeba (diameter ~ 10 μm). Detta möjliggör underhåll av en intern position och en lätt frisättning av cellen. -
Montera systemet.
- Fixera Arbetsvinkeln för gripsystemet på den motoriserade modulen vid 45 °.
- Utför en dubbelinstallation, först på gripsystemet, och sedan på microcapillary.
- Fokusera på cellerna efter att ha kört några droppar olja genom microcapillary.
Anmärkning: Den mineralolja med biologisk kompatibilitet levereras av enheten. - Komplett montering enligt tillverkarens rekommendationer.
-
Klon celler (se figur 2A, B).
Obs: denna procedur liknar den som beskrivs av Fröhlich och König31.- Placera petriskål som innehåller 2 ml infekterade amöbor under mikroskopet.
- Fokusera först på cellerna, och sedan på microcapillary nedsänkt i kulturen.
- Välj en rundad enda cell och föra microcapillary närmare micromanipulator.
- Utöva mjuk aspiration med manuell tryckkontroll på cellen, tar det inuti microcapillary. Ta bort den enda cellen från det första provet och släpp i det cellulära stödet och inkubera den vid 30 ° c.
- Utföra dagliga observationer med ett inverterat optiskt mikroskop för att observera utseendet på cellerna och för att övervaka uppkomsten av cytopatisk effekt.
5. PCR-screening
Anmärkning: Efter steg 4 är en systematisk screening av PCR avgörande för att bekräfta separationen. I både Usurpativirus/Faustovirus och Clandestinovirus/Faustovirus gjordes utformningen och tillämpningen av de specifika primer-och sond systemen med primer-BLAST online32 (tabell 2).
- Extrahera DNA från en del av de positiva kulturproverna (dvs. där en cytopatisk effekt observeras) med hjälp av ett automatiserat extraktionssystem enligt tillverkarens protokoll.
- Använd lämpligt utformade primers.
Anmärkning: Här har vi utformat primers att förstärka kärngener kommenterade som RpB2 (faustovirus), LCD7 Major kapsid protein (usurpatvirus) och mindre kapsid protein (clandestinovirus) -
Utför standard-PCR med en ThermoCycler.
- Utför 20 μL PCR-reaktioner med 50 μM av varje primer (tabell 2), 1x Master Mix och RNase fritt vatten.
- Aktivera Taq DNA polymeras i 5 min vid 95 ° c, följ sedan med 45 cykler av 10 s denaturering vid 95 ° c, glödgning av primers för 30 s vid 58 ° c, och förlängning för 30 s vid 72 ° c.
- Kör PCR-produkterna på en 1,5% aguppstod gel, fläcken med DNA gel fläck (tabell över material), och visualisera med UV.
6. framställning och rening av virus
- Sätt resten av petriskål kulturen tillbaka i en liten kolv.
- För virus produktion, Förbered 15 flaskor 145 cm2, innehållande 40 ml Vermamoeba vermiformis i svält medium och 5 ml av det isolerade viruset som redan överförts från petriskål till små kolvar.
- Behandla med samma antibiotikum och svampdödande blandning som används i steg 4,1.
- Inkubera vid 30 ° c. Observera varje dag med inverterad optisk mikroskopi.
- Efter den kompletta infektionen, pool alla kolvar. Använd ett 0,45 μm-filter för att eliminera skräp.
- Ultracentrifuge alla samman supernatanterna på 50 000 x g för 45 min.
- Efter centrifugering, avlägsna supernatanten från varje tub genom aspiration och Omsuspendera pelleten i 1 mL fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Rena viruset som produceras med 25% sackaros (27,5 g sackaros i 100 mL PBS, steriliserad genom filtrering).
- Centrifugera 8 mL sackaros och 2 mL av virus suspensionen vid 80 000 x g i 30 min. Omsuspendera den virala pelleten i 1 ml PBS. Förvara den vid-80 ° c.
7. negativ färgning och transmissionselektronmikroskopi
Anmärkning: Bou Khalil et al. tidigare publicerat detta protokoll27.
- Sätt in 5 μL av Lys-supernatanten på det glöda urladdade nätet. Låt verka i ca 20 minuter vid rumstemperatur.
Anmärkning: Glöd-urladdning tillåter oss att få en hydrofila rutnät genom plasma ansökan. - Torka av rutnätet noggrant och deponera en liten droppe 1% ammoniummolybdat på den för 10 s. Låt rutnätet torka i 5 min.
- Fortsätt till elektronmikroskopi observationer på 200 keV.
8. karakterisering av Clandestinovirus ST1 och Usurpativirus LCD7
- Karakterisera rena populationer av clandestinovirus ST1 och usurpativirus LCD7 med Genomsekvensering, genommontering, bioinformatikanalyser och studiet av deras replikativa kretslopp som vi har gjort för andra virus10,20, 29.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Single cell Micro-aspiration är en mikromanipulation process optimerad i detta manuskript (figur 1). Denna teknik gör det möjligt att fånga en rundad, infekterad amoeba (figur 2a) och dess frisättning i en ny platta som innehåller oinfekterade amöbor (figur 2). Det är en funktionell prototyp som gäller för co-Culture-systemet och har framgångsrikt isolerat icke-lytiska jätte virus. Denna metod användes för första gången på området för gigantiska virus och gjorde det möjligt att isolera två nya låg-överflöd jätte virus. Vi benämn den ny virusen Clandestinovirus ST1 och Usurpativirus LCD7, så pass var i låg överflöd jämförde med den hög överflöd Faustoviruses. För att analysera viral närvaro i varje platta efter mikro-aspiration förfarande, tillämpade vi PCR på 15 mikro-ambitioner. Vi observerade ren Usurpativirus (förekomst av Usurpativirus LCD7 [+] och frånvaro av Faustovirus [–]) endast i klon 7 (figur 3). Renheten av klon bekräftades av PCR med specifika protokoll som riktar sig till Clandestinovirus ST1 och Usurpativirus LCD7 (tabell 2). Elektronmikroskopi avslöjade uppkomsten av clandestinovirus ST1 och usurpativirus LCD7 (figur 4), som har en typisk ikosahedral morfologi utan fibriller och en ikosahedral kapsid av ca 250 nm, respektive. Efter bekräftelse av produktionen renhet, det klonala viruset producerades och renas för hela genomet sekvensering och ytterligare karakterisering, särskilt överföring elektronisk mikroskopi (TEM) för multiplikationscykel studier. Vi bekräftade sammanträffande av populationer (Faustovirus/Novel virus) med flödescytometri (figur 5).
Figur 1: material för mikromanipulering. (A) faktisk inställning av arbetsstationen. (B) Schematisk illustration av arbetsstationens komponenter. C) Schematisk illustration av mikrokapillärområdet. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: mikro-aspiration steg. (A) isolerings procedur för enstaka celler (zoom x40). (B) Schematisk illustration av de olika stegen i Single cell aspiration: 1) lokalisering av cellen. 2) aspiration av cellen. 3) Release steg. De svarta pilarna visar microcapillary och de vita visar den enda cellen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: PCR-screening och-bekräftelse. Screening PCR av mikro-ambitioner som utförs för Usurpativirus LCD7 och Faustovirus. Förekomst av Usurpativirus LCD7 DNA (+) och frånvaro av Faustovirus-DNA (–) som observerats för klon 7 efter förfarandet med mikroaspiration. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: negativ Färgnings Mikrograf. Negativ färgning av virus suspensionen, visar ren Clandestinovirus ST1 (a) och Usurpativirus LCD7 (B). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: representativa grind tomter. A) överlagring av varje enskild virus population som tidigare färgas med fluorescerande molekylära sonder för DNA-märkning av virus (enligt tidigare beskrivna protokoll26,30). Den vänstra delen av bilden visar superpositionen för fem stammar av Faustovirus (Mörkgrön, ljusgrön, orange, röd och blå). Till höger är superpositionen för Faustovirus ST1 och Clandestinovirus ST1 (ljuslila och mörklila) synlig. Bförekomst av två virus populationer av faustovirus och usurpativirus i samma grind som faustovirus (vänster). En punkt tomt av ren Usurpativirus visar den samma grind definierat tidigare för Faustovirus (rätt). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| PYG sammansättning | Kvantiteter |
| Proteose pepton | 20 g |
| Jästextrakt | 20 g |
| MgSO4· 7h2O | 0,980 g |
| CaCl2 | 0,059 g |
| Citrat natrium. Formoterolfumaratdihydrat | 1 g |
| Fe (NH4) 2 (so4) 2 x 6H2O | 0,02 g |
| Glukos | 18 g |
| Destillerat vatten | 1 L |
| Justera pH vid 6,8 med HCl eller KOH | |
| Autoklav 15 min vid 121 ° c | |
| Svält-medium | quantites |
| Jästextrakt | 2 g |
| Glukos | 18 g |
| Fe (NH4) 2 (so4) 2 x 6H2O | 0,02 g |
| PAS (beskrivs nedan) | 1 L |
| PAS-lösning A | quantites |
| KH2Po4 | 0,136 g |
| Na2HPO4 | 0,142 g |
| PAS lösning B | quantites |
| MgSO4· 7h2O | 4,0 mg |
| CaCl2· 2H2O | 4,0 mg |
| Nacl | 0,120 g |
| 10 mL vardera av lösning A och B tillsätts i 1 L destillerat vatten. |
Tabell 1: kultur mediernas sammansättning.
| Virus mål | Målgen | Foward primer (5-> 3) | Omvänd primer (5-> 3) |
| Faustovirus RpB2 | RpB2 | CWCAATCHGCYGATACHGGTGA | TGATTWGCYAATGGNGCYGC |
| Usurpatvirus LCD7 Major kapsid-genen | Major kapsid Gene | Mer från GGGCAAGAAGCTCCAAGCTA | KLITTAKASTRAGAMMAL och ung |
| Clandestinovirus ST1 mindre kapsid Gene | Mindre kapsid-genen | AAAATGAACGCGTTGGAGGC | ACCGGCGAATGTTCCTATGG |
Tabell 2: Primmersekvenser som används för PCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Varaktigheten av Single cell Micro-aspiration hantering och dess goda funktion är operatör-beroende. De olika stegen i experimentet kräver precision. Användningen av mikromanipuleringskomponenterna i arbetsstationen måste vara under ständig kontroll genom att observera processen för mikroaspiration och frisläppandet av cellen. Uppföljningen av mikroskopisk observation är nödvändig för avskiljning och överföring av en cell. En erfaren operatör kan ta 1 till 2 h för att isolera 10 celler och återöverföra dem en efter en beroende på överflödet av virus som ska isoleras. Antalet manipulationer kan variera. Vi rekommenderar att du börjar med 10 manipulationer. Definitionsmässiga, vi vet inte de inneboende egenskaperna hos det okända viruset. Således, användning och utveckling av olika strategier för isolering är nödvändiga för att optimera framgången för att separera dessa virus.
Mikro-aspiration processen utförs under osterila förhållanden (på en bänk utanför den mikrobiologiska säkerhets stationen) och därmed begränsar dess användning och förhindrar dess tillämpning för studier av mänskliga patogener. Därför är användningen av en blandning av antibiotika och antimykotika för att begränsa föroreningar obligatoriskt. En annan begränsning av metoden är att den endast kan utföras på mikroorganismer som är observerbara genom ljusmikroskopi på vilka mikromanipuleringskomponenterna monterats, och därmed begreppsmässigt eliminera allt arbete på mikroorganismer som inte är observerbara av ljus Mikroskopi. Vi kunde dock separera gigantiska virus på ca 200 nm som förblir osynliga under ljus mikroskopet genom att använda en indirekt strategi som består i att separera och klona de infekterade värdarna.
Utvecklingen av Single cell Micro-aspiration för amoebal Capture är en del av utvecklingen av populations-sortering metoder. Single cell Micro-aspiration tillät oss att isolera två nya gigantiska virus, Clandestinovirus ST1 och Usurpativirus LCD7, med egenskaper särskiljande från Faustoviruses. Den mycket likartade morfologiska egenskaperna hos både Clandestinovirus ST1 och Usurpativirus LCD7 till Faustovirus LCD7 och deras skillnad i replikering visar gränsen för FACS, som vanligtvis används i gigantiska virus sortering. Det representeras av superpositionen av två virus populationer, Clandestinovirus ST1 och Faustovirus ST1 (figur 5A) och även av upptäckten för usupartivirus LCD7 och faustovirus LCD7. Men med denna nya metod, är hela manipulation under visuell kontroll med noggrann övervakning av cellen och dess integritet även efter dess release. Användningen av flödescytometri att direkt sortera infekterade amöbor kan vara en alternativ lösning för att indirekt sortera nya virus. Denna metod följs vanligtvis av screening av plattan för att upptäcka cytopatisk effekter eller Lys. Närvaron av icke-lytiska virus i blandningen kan utgöra en gräns för amoebal sortering. Detta utforskades dock inte i skapandet av detta protokoll och för dessa två nya isoleringar.
Utöver tillämpningen av mikromanipulation i positionering och innehav av celler i allmänhet och oocyter för intracytoplasmatisk sperma injektion (ICSI)33, Single cell Micro-aspiration har visat sig vara en praktisk metod för isolering av enstaka prokaryotiska celler observerbara under ett optiskt mikroskop31. Andra tillämpningar kan testas, inklusive cell sortering på en morfologisk grund att ha olika rena prover från ett blandat urval av mikroorganismer. Den observerbara separationen av mikroorganismer kan vara tänkt med hjälp av den strategi som beskrivs ovan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alla författare har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill tacka både Jean-Pierre Baudoin och Olivier Mbarek för deras råd och Claire Andréani för hennes hjälp på engelska rättelser och modifieringar. Detta arbete stöddes av ett bidrag från den franska staten som förvaltas av den nationella forsknings byrån under "Investissements d' Avenir (investeringar för framtiden)" program med referensen ANR-10-IAHU-03 (Méditerranée infektion) och av Région Provence Alpes Côte d'Azur och EU-finansiering FEDER PRIMI.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose Standard | Euromedex | Unkown | Standard PCR |
| AmpliTaq Gold 360 Master Mix | Applied Biosystems | 4398876 | Standard PCR |
| CellTram 4r Oil | Eppendorf | 5196000030 | Control the cells during the microaspiration process |
| Corning cell culture flasks 150 cm2 | Sigma-aldrich | CLS430825 | Culture |
| Corning cell culture flasks 25 cm2 | Sigma-aldrich | CLS430639 | Culture |
| Corning cell culture flasks 75 cm2 | Sigma-aldrich | CLS430641 | Culture |
| DFC 425C camera | LEICA | Unkown | Observation/Monitoring |
| Eclipse TE2000-S Inverted Microscope | Nikon | Unkown | Observation/Monitoring |
| EZ1 advanced XL | Quiagen | 9001874 | DNA extraction |
| Glasstic Slide 10 with Counting Grids | Kova International | 87144E | Cell count |
| Mastercycler nexus | Eppendorf | 6331000017 | Standard PCR |
| Microcapillary 20 µm | Eppendorf | 5175 107.004 | Microaspiration and release of cells |
| Micromanipulator InjectMan NI2 | Eppendorf | 631-0210 | Microcapillary positioning |
| Nuclease-Free Water | ThermoFischer | AM9920 | Standard PCR |
| Optima XPN Ultracentrifuge | BECKMAN COULTER | A94469 | Virus purification |
| Petri dish 35 mm | Ibidi | 81158 | Culture/observation |
| Sterile syringe filters 5 µm | Sigma-aldrich | SLSV025LS | Filtration |
| SYBR green Type I | Invitrogen | unknown | Fluorescent molecular probes/flow cytometry |
| SYBR Safe | Invitrogen | S33102 | Standard PCR; DNA gel stain |
| Tecnai G20 | FEI | Unkown | Electron microscopy |
| Type 70 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor | BECKMAN COULTER | 337922 | Virus purification |
| Ultra-Clear Tube, 25 x 89 mm2 | BECKMAN COULTER | 344058 | Virus purification |
References
- Iyer, L. M., Aravind, L., Koonin, E. V. Common Origin of Four Diverse Families of Large Eukaryotic DNA Viruses. Journal of Virology. 75 (23), 11720-11734 (2001).
- Li, Y., et al. Analysis of 74 kb of DNA located at the right end of the 330-kb chlorella virus PBCV-1 genome. Virology. 237 (2), 360-377 (1997).
- Scola, B. L. A Giant Virus in Amoebae. Science. 299 (5615), 2033 (2003).
- Philippe, N., et al. Pandoraviruses: amoeba viruses with genomes up to 2.5 Mb reaching that of parasitic eukaryotes. Science. 341 (6143), 281-286 (2013).
- Antwerpen, M. H., et al. Whole-genome sequencing of a pandoravirus isolated from keratitis-inducing acanthamoeba. Genome Announcements. 3 (2), 00136-00215 (2015).
- Legendre, M., et al. Thirty-thousand-year-old distant relative of giant icosahedral DNA viruses with a pandoravirus morphology. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (11), 4274-4279 (2014).
- Legendre, M., et al. In-depth study of Mollivirus sibericum, a new 30,000-y-old giant virus infecting Acanthamoeba. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 5327-5335 (2015).
- Legendre, M., et al. Diversity and evolution of the emerging Pandoraviridae family. Nature Communications. 9 (1), 2285 (2018).
- Aherfi, S., et al. A Large Open Pangenome and a Small Core Genome for Giant Pandoraviruses. Frontiers in Microbiology. 9, 166 (2018).
- Andreani, J., et al. Cedratvirus, a Double-Cork Structured Giant Virus, is a Distant Relative of Pithoviruses. Viruses. 8 (11), 300 (2016).
- Rodrigues, R. A. L., et al. Morphologic and genomic analyses of new isolates reveal a second lineage of cedratviruses. Journal of Virology. , 00372 (2018).
- Bertelli, C., et al. Cedratvirus lausannensis- digging into Pithoviridaediversity. Environmental Microbiology. , (2017).
- Levasseur, A., et al. Comparison of a modern and fossil Pithovirus reveals its genetic conservation and evolution. Genome Biology and Evolution. , (2016).
- Dornas, F. P., et al. A Brazilian Marseillevirus Is the Founding Member of a Lineage in Family Marseilleviridae. Viruses. 8 (3), 76 (2016).
- Yoshikawa, G., Blanc-Mathieu, R., et al. Medusavirus, a novel large DNA virus discovered from hot spring water. Journal of Virology. , (2019).
- Legendre, M., et al. Pandoravirus Celtis Illustrates the Microevolution Processes at Work in the Giant Pandoraviridae Genomes. Frontiers in Microbiology. 10, 430 (2019).
- Abrahão, J., et al. Tailed giant Tupanvirus possesses the most complete translational apparatus of the known virosphere. Nature Communications. 9 (1), 749 (2018).
- Reteno, D. G., et al. Faustovirus, an asfarvirus-related new lineage of giant viruses infecting amoebae. Journal of Virology. 89 (13), 6585-6594 (2015).
- Bajrai, L., et al. Kaumoebavirus, a New Virus That Clusters with Faustoviruses and Asfarviridae. Viruses. 8 (12), 278 (2016).
- Andreani, J., et al. Orpheovirus IHUMI-LCC2: A New Virus among the Giant Viruses. Frontiers in Microbiology. 8, 779 (2018).
- Fischer, M. G., Allen, M. J., Wilson, W. H., Suttle, C. A. Giant virus with a remarkable complement of genes infects marine zooplankton. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (45), 19508-19513 (2010).
- Moniruzzaman, M., et al. Genome of brown tide virus (AaV), the little giant of the Megaviridae, elucidates NCLDV genome expansion and host-virus coevolution. Virology. 466-467, 60-70 (2014).
- Gallot-Lavallée, L., Blanc, G., Claverie, J. -M. Comparative genomics of Chrysochromulina Ericina Virus (CeV) and other microalgae-infecting large DNA viruses highlight their intricate evolutionary relationship with the established Mimiviridae family. Journal of Virology. , (2017).
- Deeg, C. M., Chow, C. -E. T., Suttle, C. A. The kinetoplastid-infecting Bodo saltans virus (BsV), a window into the most abundant giant viruses in the sea. eLife. 7, 235 (2018).
- Boughalmi, M., et al. High-throughput isolation of giant viruses of the Mimiviridae and Marseilleviridae families in the Tunisian environment. Environmental Microbiology. 15 (7), 2000-2007 (2013).
- Khalil, J. Y. B., et al. High-Throughput Isolation of Giant Viruses in Liquid Medium Using Automated Flow Cytometry and Fluorescence Staining. Frontiers in Microbiology. 7 (120), 26 (2016).
- Bou Khalil, J. Y., Andreani, J., Raoult, D., La Scola, B. A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (112), e54104 (2016).
- Khalil, J. Y. B., Andreani, J., La Scola, B. Updating strategies for isolating and discovering giant viruses. Current Opinion in Microbiology. 31, 80-87 (2016).
- Andreani, J., et al. Pacmanvirus, a new giant icosahedral virus at the crossroads between Asfarviridae and Faustoviruses. Journal of Virology. , (2017).
- Khalil, J. Y. B., et al. Flow Cytometry Sorting to Separate Viable Giant Viruses from Amoeba Co-culture Supernatants. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 6, 17722 (2017).
- Fröhlich, J., König, H. New techniques for isolation of single prokaryotic cells. FEMS Microbiology Reviews. 24 (5), 567-572 (2000).
- Ye, J., et al. Primer-BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinformatics. 13 (1), 134 (2012).
- Kimura, Y., Yanagimachi, R. Intracytoplasmic sperm injection in the mouse. Biology of Reproduction. 52 (4), 709-720 (1995).
