Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

En fluorescens-baseret assay til karakterisering og kvantificering af lipid-Dråbedannelse i humane tarm Organoider

Published: October 13, 2019 doi: 10.3791/60150
Automatic Translation
1,2,3, 1,2, 1,2
1Division of Pediatrics, Department of Pediatric Gastroenterology, Wilhelmina Children's Hospital, University Medical Center Utrecht, Utrecht University, 2Regenerative Medicine Center, University Medical Center Utrecht, Utrecht University, 3Science for Life Laboratory, Department of Medical Biochemistry and Microbiology, Uppsala University

Summary

Denne protokol beskriver en analyse til karakterisering af lipid dråbe (LD) dannelse i humane intestinale organoider ved stimulation med fedtsyrer. Vi diskuterer, hvordan denne analyse bruges til kvantificering af LD dannelse, og hvordan det kan bruges til høj gennemløbs screening for lægemidler, der påvirker LD dannelse.

Abstract

Kosten lipider er taget op som frie fedtsyrer (FAs) af tarm epitelet. Disse FAs er intracellulært omdannet til triglycerid (TG) molekyler, før de er pakket ind i chylomikroner til transport til lymfeknuder eller i cytosolisk lipid dråber (LDs) til intracellulære opbevaring. Et afgørende skridt for dannelsen af LDs er den katalytiske aktivitet af vegetabilsk diacylglycerololie acyltransferaser (DGAT) i det sidste trin af TG-syntesen. LDs er vigtigt at buffer giftige lipidarter og regulere cellulære metabolisme i forskellige celletyper. Da det humane tarm epitelet jævnligt konfronteres med høje koncentrationer af lipider, er LD formation af stor betydning for at regulere homøostase. Her beskriver vi en simpel assay til karakterisering og kvantificering af LD formation (LDF) ved stimulation med den mest almindelige umættede fedtsyrer, oliesyre, i humane intestinale organoider. LDF-analysen er baseret på det LD-specifikke fluorescerende farvestof LD540, som giver mulighed for kvantificering af LDs ved Konfokal mikroskopi, fluorescerende plade læser eller flowcytometri. LDF-analysen kan anvendes til at karakterisere LD dannelse i humane tarm epiteliale celler eller til at studere humane (genetiske) lidelser, der påvirker LD metabolisme, såsom DGAT1 mangel. Desuden kan denne analyse også anvendes i en høj-gennemløb rørledning til at teste nye terapeutiske forbindelser, som genoprette defekter i LD dannelse i tarm eller andre typer af organoider.

Introduction

Lipider er en afgørende bestanddel af den menneskelige kost og spiller en vigtig rolle i systemisk energilagring og metabolisme. Når indtages, kosten lipider nedbrydes til frie fedtsyrer (FFAs) og monoglycerider (MGs) af bugspytkirtlen lipases. Disse substrater tages derefter op af enterocytterne i tarm Epitelet, hvor de først re-esterificeret til diglycerider (DG) ved i acyltransferaser (mgat) enzymer og efterfølgende til triglycerider (TG) af vegetabilsk diacylglycerololie acyltransferase 1 (DGAT1)1. Endelig, disse TGS er integreret i enten chylomikroner til eksport til lymfesystemet eller cytosolisk lipid dråber (LDs) for intracellulære opbevaring2,3. Selvom chylomikroner er nødvendige for at distribuere lipider med kosten til andre organer, er betydningen af intracellulær fedt oplagring i LDs ikke helt klar. Men LDs har vist sig at udføre en regulerende funktion i tarmen, da de langsomt frigiver lipider i cirkulation op til 16 timer efter et måltid4. Desuden har LDs vist sig at beskytte mod giftige fedtsyrer koncentrationer, såsom i mus adipocytter under lipolytiske betingelser5.

DGAT1-proteinet er placeret på endoplasmatiske reticulum (er) membranen og spiller en afgørende rolle i ld dannelse i tarm epitelet. Homozygot mutationer i DGAT1 føre til tidlig debut svær diarré og/eller opkastning, hypoalbuminæmi, og/eller (fatal) protein-tabende enteropati med tarm svigt på fedt indtag, illustrerer betydningen af DGAT1 i lipid homøostase af den menneskelige tarm epitelet6,7,8,9,10. Da forekomsten af DGAT1-mangel hos mennesker er sjælden, har adgang til primære patient-afledte celler været knappe. Endvidere, den langsigtede kultur af tarm epiteliale celler har længe været begrænset til tumor-afledte cellelinjer, som repræsenterer den normale fysiologi kun til en begrænset udvidelse. Derfor er DGAT1-medieret ld formation for det meste blevet undersøgt i fibroblaster eller dyr-afledte cellelinjer7,10,11,12. Som sådan, det blev for nylig påvist, at DGAT1-mangelfuld patient-afledte fibroblaster akkumulere mindre LDs sammenlignet med raske kontrol celler efter stimulation med oliesyre (OA)8.

Tidligere blev der etableret protokoller til kultur epiteliale stamceller fra alle gastrointestinale organer i form af tredimensionale (3D) organoider13. Disse intestinale organoider kan holdes i kultur i en lang periode af tid13, og tillade funktionelle undersøgelse af patient-og tarm placering-specifikke epiteliale karakteristika14. De er genetisk og fænotypisk stabile og kan lagres, tillader langsigtet ekspansion og biobanking13.

Vi har for nylig påvist, at LD dannelse let kan måles i humane intestinale organoider i en LD formation (LDF) assay6. Når de udsættes for OA for 16 timer, genererer organoider LDs for at beskytte cellerne mod lipid-induceret toksicitet. Når OA koncentrationer er for høje, cellerne dør af caspase-medieret apoptose6. LDF-analysen blev tidligere påvist at være stort set afhængig af DGAT1 som angivet af organoider afledt af DGAT1-mutant patienter og ved anvendelse af DGAT1-specifikke hæmmere6.

For ldf-analysen, der er beskrevet i detaljer her, dyrkes 3D-organoider fra intestinale biopsier og er urerne ugentligt ved afbrydelse i enkeltceller, der nemt danner nye organoider. For at køre LDF-analysen er ~ 7.500 organoid-afledte enkeltceller belagt i hver brønd af en 24-brønd plade. Organoider dannes over flere dage, inkuberet natten over med 1 mM OA og farves med LD540, en fluorescerende celle-permeable LD-specifikke farvestof, der letter billeddannelse. LD-dannelsen kvantificeres derefter ved Konfokal mikroskopi, fluorescerende plade læser eller strømnings cytometri.

Ved at skalere denne LD formation assay til en 96-brønd format, kan analysen også anvendes til high-gennemløb analyse af LD dannelse til skærmen for nye lægemidler, som påvirker LD dannelse i humane tarm organoid kulturer, eller at studere (menneskelige genetiske) lidelser, der påvirker LD metabolisme.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle forsøg med humane væv beskrevet heri blev godkendt af det etiske udvalg på University Medical Center Utrecht (UMCU). Informeret samtykke til vævs indsamling, produktion, oplagring og brug af organoider blev indhentet fra patienter på Wilhelmina children's Hospital (WKZ)-UMCU.

1. forberedelse af kultur medier

Bemærk: Denne protokol skal udføres i et biosikkerheds kabinet. Organoider bør håndteres i henhold til standard cellekultur retningslinjer.

  1. Forbered basal kulturmedium.
    Bemærk:     kulturmedium uden vækstfaktorer omtales som basal medium (BM).
    1. Der tilsættes 5 mL HEPES (1 M), 5 mL L-glutamin (100x) og 5 mL penicillin-streptomycin (5.000 e/mL) til 500 mL fremskreden Dulbecco's modificerede Eagle medium med skinke nærings blanding F-12 for at tilberede BM medium.
    2. Det tilberedte BM-medium opbevares ved 4 °C og anvendes i højst 2 måneder.
  2. Forbered R-spondin og Noggin konditioneret medium (CM) i henhold til producentens protokol.
    1. Kortvarigt, vokse op cellerne til den ønskede mængde i hyperflasks med 5 x 107 celler i 555 ml medium uden selektiv antibiotikum pr. kolbe.
    2. Udvid cellerne i 4 dage, indtil de er flydende.
    3. Udskift mediet med BM og kultur i yderligere 8 dage.
    4. Efter 8 dages kultur ved 37 °C, opsamles dyrkningsmediet og centrifugeres i 5 minutter ved 450 x g for at pille eventuelle resterende celler.
    5. Filter Steriliser supernatanten, og opbevar aliquoter af R-spondin eller Noggin CM ved-20 °C i højst 6 måneder.
  3. Forbered Wnt3A CM ifølge BOJ et al.15.
    1. Kortvarigt, vokse op cellerne til den ønskede mængde i 145 mm retter med 2 x 106 celler i 20 ml medium uden selektiv antibiotikum per skål. Pak hver skål med plastikfolie for at undgå fordampning af dyrkningsmediet.
    2. Efter 8 dages kultur ved 37 °C, opsamles dyrkningsmediet og centrifugeres i 5 minutter ved 450 x g for at pille eventuelle resterende celler.
    3. Filter Steriliser supernatanten, og opbevar aliquoter af Wnt3A-CM ved 4 °C i højst 2 måneder.
  4. Forbered organoid ekspansion medium.
    Bemærk:     humant lille tarm organoid ekspansions medium (Se opskriften i supplerende tabel 1) kaldes HSI-EM. Følgende trin vil producere en endelig volumen på 1 L hSI-EM, og kan skaleres op eller ned efter behov.
    1. 1,46 g nicotinamid opløses i 12 mL cellekultur kvalitet fosfat-bufferet saltvand (PBS) for at skabe en endelig fortynding på 1 M.
    2. 245 mg n-acetyl cystein opløses i 3 mL cellekultur klasse PBS for at skabe en endelig fortynding på 500 mM.
      Bemærk: For at fremskynde dannelsen af en opløsning kan nicotinamid og n-acetyl cystein inkuberet i et vandbad ved 37 °C. Begge opløsninger kan tilberedes i batch, aliciteres og opbevares ved-20 °C til fremtidig brug.
    3. Filter Steriliser begge opløsninger gennem et 0,22 μm filter til et sterilt 15 mL rør.
    4. Der tilsættes 167 mL BM til en steril 500 mL kulturmedium kolbe. Der tilsættes 200 mL R-Spondin-CM, 100 mL Noggin-CM og 100 μL rekombinant mEGF (500 μg/mL) til en endelig koncentration på 50 ng/mL.
    5. Tilsæt 10 mL steriliseret nicotinamid opløsning og 2,5 mL steriliseret n-acetyl cystein opløsning. Tilsæt 20 mL B27 supplement (50x).
      Bemærk: På dette stadium, er mediet omtales som hSI-EM uden var (Wnt3A-CM, A83-01, og SB202190), og kan være aliciteret og opbevares ved-20 °C. Hvis mediet er aliciteret i mindre volumener, skal du justere koncentrationerne af følgende trin i overensstemmelse hermed.
    6. Til 500 mL hSI-EM uden var, tilsættes 10 mL Wnt3A-CM af den sidste frisk fremstillede parti og 10 mL Wnt3A-CM af den anden sidste batch for at minimere variabilitet ændringer i Wnt3A-CM betingelser.
    7. Der tilsættes A83-01 til en endelig koncentration på 500 nM og SB202190 til en endelig koncentration på 10 μM.
    8. Den forberedte hSI-EM (med WAS) opbevares ved 4 °C og anvendes i højst 2 uger.
      Bemærk: Tilføj yderligere Y-27632 til en endelig koncentration på 10 μM (kaldet hSI-EM + Y), når Krypter eller enkelte celler dyrkes, eller organoider startes fra Kryopreservation.
  5. Forbered fluorescerende aktiveret celle sortering (FACS) buffer.
    1. Der tilsættes 10 mL føtal kalv serum (FCS) til 40 mL PBS uden ca2 +/mg2 + for en endelig koncentration på 10% FCS.
      Bemærk: FCS forhindrer celler i at overholde labware.

2. kultur procedurer for humane små intestinale Organoider

Bemærk: Denne protokol skal udføres i et biosikkerheds kabinet. Organoider bør håndteres i henhold til standard cellekultur retningslinjer. Ved håndtering af organoider eller organoid-afledte celler, bør cellerne holdes på is, når det er muligt. Cellerne vil forblive levedygtige i et par timer efter høst, når dette er sikret. Organoider skal dyrkes i en standard cellekultur inkubator ved 37 °C med 5% CO2. Disse betingelser gælder for alle inkubations trin med organoider indlejret i kælderen membran matrix (BMM; dvs., Matrigel) i hele denne protokol. Forfatterne har brugt duodenum-afledte organoider til disse assays.

  1. Passaging organoids
    Bemærk    : Hver organoid kultur har sin egen fordoblings tiden. Normalt kan små intestinale organoider være urerne 1:3 − 1:5 hver 7 − 10 dage. Når urerne som enkeltceller, kan passaging effektivitet være op til 1:20, afhængigt af celletæthed. For etablering og vedligeholdelse dyrkes organoider i 24-brønd plader; til LDF-analysen i enten 24-eller 96-brønd plader.
    1. Under forberedelse
      1. Præ-varm udpakket 24-brønd vævskultur plader i en inkubator ved 37 °C, 5% CO2 mindst natten over og helst 5 dage i forvejen.
        Bemærk: Præ-opvarmning af vævskultur pladerne i cellekultur inkubator sikrer korrekt dannelse og fastgørelse af organoid-holdige dråber af GMM.
      2. For at reducere antallet af fryse-tø-cyklusser skal du tilberede 1 mL aliquoter af BMM og opbevare ved-20 °C. Tø et hætteglas med BMM på is mindst 30 minutter før påbegyndelse af organoid-passaging-proceduren.
      3. Hold et 50 mL rør af BM på is som vaskemiddel.
      4. Forbered hSI-EM som beskrevet i afsnit 1,4, og Forbered en passende mængde hSI-EM + Y, for eksempel 15 mL for en fuld 24-brønd plade.
    2. Saml organoider.
      1. Aspirer forsigtigt kulturmediet uden at forstyrre BMM'S dråber.
      2. Tilsæt 500 μL kold BM til den første brønd af organoider, og forstyrre BMM-dråberne med organoider ved pipettering forsigtigt op og ned med et P1000-pipet.
      3. Gentag denne procedure med det samme medium i den næste brønd som krævet, men høst ikke mere end 2 brønde pr. 500 μL BM.
      4. Organoiderne opsamles i et 1,5 mL mikrocentrifuge glas med lav binding, og der centrifugeres ned i en mini bordplade centrifuge til 15 − 20 s (maks. 2.000 x g). Aspirer supernatanten helt og fjern den sidste smule medium med et P200 pipet.
        Bemærk: Når organoidernes kulturer ser rene ud under et mikroskop og ikke indeholder døde celler eller andet snavs, kan BMM-dråberne høstes direkte i trypsin i stedet for BM i trin 2.1.2.2. Efter trin 2.1.2.3 skal du gå direkte til inkubation i trin 2.1.3.1.
    3. Afdissociere organoiderne i enkeltceller.
      1. Tilsæt 400 μL trypsin til spundet ned organoider. Organoiderne inkubates ved 37 °C i 5 minutter i et vandbad.
      2. Forstyrre de resterende aggregater af celler ved pipettering op og ned forsigtigt med en P200 pipet. Igen Inkuber organoiderne ved 37 °C i 5 minutter i et vandbad.
      3. Kontroller status for celle dissociation under et mikroskop ved hjælp af 4X forstørrelse. Gentag manuel afbrydelse og inkubation, når store klumper af celler forbliver.
      4. Når der kun er enkelte celler tilbage, tilsættes 1 mL BM, og cellerne centrifugeres ned i en mini bordplade centrifuge til 15 − 20 s.
      5. Aspirer supernatanten helt. Resuspendere de enkelte celler i 200 μL frisk hSI-EM ved hjælp af en P200 pipet. Tilsæt yderligere 800 μL hSI-EM.
      6. Tæl antallet af celler i suspension.
        Bemærk: I forfatternes laboratorium giver manuel optælling af dissocierede organoide celler mere pålidelige resultater end en automatiseret celle tæller. Når der anvendes en automatiseret celle tæller, skal celletætheden for downstream-applikationer testes internt og justeres, hvis for lidt eller for mange organoider vokser ud.
    4. Frø organoider til vedligeholdelse eller lipid dråbedannelse assay.
      1. Beregn mængden af celler, der er nødvendige for den endelige celletæthed.
        Bemærk: Ca. 250 celler/μL er en passende tæthed. I en 24-brønd plade, er 30 μL seedet ind i hver brønd, mens 5 μL er seedet i hver brønd af en 96-brønd plade.
      2. Tag det passende volumen af suspensionen og Juster tætheden til 750 celler/μL (eller spin ned og resuspension, når tætheden er for lav).
      3. Tilsæt BMM til cellesuspensionen i et forhold på 2:1. Den endelige celletæthed i denne blanding er 250 celler/μL. Bland forsigtigt suspensionen ved pipettering, og undgå eventuelle bobler.
      4. I en præ-opvarmet vævskultur plade, frø ud 3 10 μL dråber pr brønd i en 24-brønd plade eller en enkelt 5 μL dråbe pr brønd i en 96-brønd plade.
      5. Pladen placeres i en inkubator ved 37 °C, 5% CO2 for 10 − 15 min. for at STØRKNE VMM-dråberne. I mellemtiden, præ-varme en passende mængde af hSI-EM + Y i et vandbad ved 37 °C.
      6. Tilsæt forsigtigt 500 μL forvarmet hSI-EM + Y til hver brønd af en 24-brønd plade eller 100 μL til hver brønd af en 96-brønd plade. Inkubér cellerne i en inkubator ved 37 °C, 5% CO2 og efter 2 − 3 dage Skift mediet til HSI-EM (uden Y) og Genopfrisk 2 − 3 gange om ugen.
        Bemærk: Efter 7 − 10 dage skal en vedligeholdelses kultur af organoider være urerne igen.

3. bestemmelse af lipid-Dråbedannelse

  1. Tilberedning af oliesyre konjugat
    Bemærk:     da oliesyre (OA) er hydrofobe og ikke opløseligt i vand, er det konjugeret til bovint serumalbumin (BSA). BSA kan binde flere fedtsyre molekyler og er i dette tilfælde brugt i et 1:8 forhold til at gøre oliesyre tilgængelig for tarmcellerne. Frie fedtsyrer og BSA kan både binde sig til plastik labware. For at sikre en korrekt slutkoncentration skal du bruge hætteglas og glas pipetter, når det er muligt.
    1. Vejer 0,2 g flydende oliesyre ved stuetemperatur. Tilsæt 1,5 mL steril PBS i kultur kvalitet, og Opvarm blandingen til 70 °C i 1 h. vortex med jævne mellemrum.
    2. 5,89 g fedtsyrefri BSA afvejes og opløses i 33,9 mL PBS. Varm blandingen i et vandbad ved 37 °C, indtil BSA er helt opløst.
    3. Vortex OA blandingen igen for at skabe en emulsion af fine dråber og straks tilføje det til BSA løsning ved hjælp af et glas pipet. Hold den endelige løsning tæt på 37 °C efter tilsætning af OA. Den endelige blanding består af 20 mM OA i 2,5 mM BSA.
    4. Blandingen opbevares ved 37 °C i 30 minutter, indtil der stadig er en klar gullig opløsning.
    5. Den OA-BSA konjugat kan aliciteres og fryses ved-20 °C i mindst 6 måneder. Ved optøning af en alikvot inkubaterer den ved 37 °c, indtil uklarhed opløses, og blandingen er klar igen.
      Bemærk: På grund af den endelige opløsnings høje protein-og lipid-indhold kan blandingen ikke filtreres steriliseres eller autoklave. Når komponenterne blev håndteret med omhu, i en laminar flow hætte, når det er muligt og ved hjælp af sterile PBS, forfatterne oplevede ikke mikrobielle infektioner.
  2. LDF-Konfokal analyse
    1. Forberedelse af prøver
      1. Passage organoider som beskrevet i afsnit 2,1. Frø ud de organoid-afledte enkeltceller i en sort klar-bund 96-brønd plade.
      2. På dag 6 i kulturen på hSI-EM, Udskift kulturmediet med hSI-EM indeholdende 1 mM OA-BSA konjugat.
      3. Cellerne inkubates i 16 − 17 timer (overnight) ved 37 °C ved tilstedeværelse eller fravær af 0,1 μM DGAT1-hæmmer. Omfatte en køretøjskontrol på 2,5 mM BSA.
      4. Efter 16 − 17 timer aspirerer mediet uden at forstyrre BMM-dråberne. Fikseret organoider ved at tilsætte 100 μL 4% neutral Buffered formaldehyd til brøndene i 30 minutter ved stuetemperatur.
        Bemærk: Formaldehyd vil delvist opløse BMM, mens organoider synke til bunden og holde sig til bunden af pladen.
      5. Fjern formaldehyd forsigtigt, og vask forsigtigt brøndene med 150 μL PBS pr. brønd.
      6. Plette cellerne for LDs med 0,025 mg/mL LD540 og 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) i PBS i 15 minutter ved stuetemperatur i mørket.
      7. Vask brøndene omhyggeligt med PBS.
        Bemærk: Protokollen kan sættes på pause her, når det er nødvendigt. Prøverne, som er dækket af PBS, opbevares i mørke ved 4 °C. Den LD540 farvning vil forblive stabil i op til en uge. Denne analyse kan også udføres med levende celler, at overvåge LD dannelse over en periode. Til dette skal optagelsen udelades fra protokollen, og DAPI bør erstattes med Hoechsts farvning. LD540 kan plette LDs i levende celler i samme koncentration som beskrevet.
    2. Confocal Imaging
      Bemærk: Billeddannelse kan udføres på forberedte organoid prøver i den sorte klare bund 96-brønd plade.
      1. For oversigt billeder af hele organoider, brug en 40x objektiv egnet til konfokale fluorescerende Imaging.
      2. Indstil mikroskopet til at afbilde DAPI-kanalen ved 405 nm excitation og ca. 410 − 535 nm-bølgelængde. For LD540 farvestof vælge en excitation laser på 540 nm (543 nm er optimal) og sæt emissionerne filtre til 545 − 700 nm.
        Bemærk: I denne protokol, et laser-scanning konfokale system med en hvid lys laser, Acousto-optisk stråle splitter (aobs), 10x/20x objektiv, og spektral detekteringssystem blev anvendt. Dette giver mulighed for præcis tuning til de specifikke bølgelængder. Hvis et sammenligneligt system ikke er tilgængeligt, skal du vælge laserlinjer og kort-/Long-pass-filtre tæt på specifikationerne ovenfor. For helorganoid billeddannelse er en opløsning på 512 x 512 eller 1024 x 1024 tilstrækkelig til downstream-billedanalyse.
      3. Indstil pinhulstørrelsen til 1 luftig enhed (AU) for tilstrækkelig z-akse opløsning.
      4. Hvis du vil afbilde halvdelen af et sfærisk organoid, skal du indstille en z-stak til ca. 85 μm.
    3. Billedanalyse
      Bemærk: For billedanalyse, Fiji/ImageJ16,17 blev brugt til at generere maksimale fremskrivninger. Analysen kan udføres med enhver billedanalyse softwarepakke, som giver mulighed for maksimal projektion, manuel thresholding, og partikel analyse.
      1. Ved hjælp af Fiji/ImageJ, omdanne z-stakken af hver organoid til en maksimal projektion: billede | Stakke | Z-projektet.
      2. Indstil tærsklen for den maksimale projektion til et niveau, hvor der ikke er noget LD540 signal synligt i prøven af BSA-køretøjets kontrol: billede | Juster | Tærskel. Brug disse indstillinger til at spærre hvert billede.
      3. Mål det totale fluorescens område for hver maksimal projektion ved hjælp af funktionen Analysér | Analysér partikler.
        Bemærk: Selv om analysen opløsning er bedre at bruge en confokal mikroskop, denne analyse kan også analyseres ved hjælp af en fluorescerende plade læser med lignende filtre. For at normalisere for organoid-optællingen pr. brønd skal LD540-signalet divideres med DAPI-signalet. Endelig skal signalet fra BSA køretøjets kontrol trækkes fra for at normalisere målingerne. Denne fremgangsmåde gør det muligt for analysen at blive skaleret i retning af en 96-brønd plade format.
  3. LDF-flow cytometrisk analyse
    1. Forberedelse af prøver
      1. Passage organoider som beskrevet i afsnit 2,1. Frø ud de organoid-afledte enkeltceller i en 24-brønd vævskultur plade. To brønde pr. tilstand er tilstrækkelig til strømnings cytometri.
      2. På dag 10 i kulturen på hSI-EM, Udskift kulturmediet med hSI-EM indeholdende 1 mM OA-BSA konjugat.
        Bemærk: I modsætning til den konfokale analyse blev 10 dages vækst i EM valgt for flowcytometri-analysen i stedet for 6 dage. De ekstra 4 dages ekspansion vil resultere i optisk overlappende organoider, som ville komplicere den mikroskopi-baserede analyse. Det større antal celler letter imidlertid flow cytometri-analysen.
      3. Cellerne inkubates i 16 − 17 timer (overnight) ved 37 °C ved tilstedeværelse eller fravær af 0,1 μM DGAT1-hæmmer. Omfatte en køretøjskontrol på 2,5 mM BSA.
      4. Efter 16 − 17 timer opsamles organoiderne som beskrevet i afsnit 2.1.2.
      5. Organoiderne udskilles i enkeltceller som beskrevet i pkt. 2.1.3.
        Bemærk: Selvom det ikke er strengt nødvendigt, anbefales det at kontrollere celletal i hver prøve. Et samlet antal på 10.000 celler pr. prøve er det absolutte minimum, der kræves for tilstrækkelig opløsning. For optimale resultater brug ca. 50000 − 100000 celler.
      6. Spin ned cellerne i en mini bordplade centrifuge til 15 − 20 s.
      7. Hver prøve med 500 μL af 0,025 mg/mL LD540 og 1 μg/mL Hoechst i PBS i 15 minutter ved stuetemperatur i mørke.
      8. Spin ned cellerne i en mini bordplade centrifuge til 15 − 20 s og vask 3x med PBS.
      9. Fikseret cellerne ved at resuspendere dem i 500 μL 4% neutral buffer formaldehyd i 15 minutter ved stuetemperatur.
      10. Spin ned i cellerne og vask 3x med FACS buffer.
      11. Forskyl FACS rør med FACS buffer for at forhindre celler klæber til rørvæggen.
      12. Cellerne opslæmmes i 200 μL af FACS-bufferen, og cellesuspensionen overføres til de forskyllede FACS-rør.
    2. Flow cytometrisk analyse
      1. Angiv gating-parametrene for at udelukke døde celler og klumper af celler (Se afsnittet om repræsentative resultater).
      2. I den endelige gated population, måle mindst 10.000 celler for pålidelige resultater.
        Bemærk: Fra denne population, den gennemsnitlige fluorescerende intensitet (MFI) af LD540 og den gennemsnitlige SSC-et signal tilsammen giver et mål for den samlede volumen af LD dannelse per celle.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For korrekt analyse af LD dannelse, organoider bør ikke seedet for tæt før stimulation med OA og efterfølgende farvning. Dette er især af betydning for Konfokal og plade læser udlæsning, da overlappende organoider kan forstyrre fluorescens. Et eksempel på korrekt organoid såning tæthed (figur 1A) og en kultur med overlappende organoider er vist (figur 1B). For at minimere variabiliteten i prøve stimulation med OA bør organoid-størrelsen og sånings tætheden være sammenlignelig mellem prøverne inden for ét eksperiment. Dette styres bedst ved at udsået lige antal enkeltceller. Dog kan nogle justeringer være nødvendige, hvis visse organoid linjer konsekvent viser en højere rekonstitution effektivitet og dermed en konsekvent højere organoid Count.

Efter stimulation med 1 mm OA natten, LD dannelse kan visualiseres med en inverteret lysfelt mikroskop. Ophobning af LDs scatters transmitteres lys, og derfor organoider synes mørkere, hvorimod ikke-stimulerede organoider har et gennemsigtigt udseende (figur 1C). Et eksempel på ld dannelse som set under et lysfelt mikroskop er vist i figur 1D. Dette fænomen kan anvendes til at vurdere de eksperimentelle betingelser forud for fluorescerende analyse udlæningen. Hvis den positive kontrolprøve ikke er visuelt mørkere end den negative kontrolprøve, eller hvis omfattende celledød er tydelig, skal forsøget kasseres. Som FFAs er giftige for celler i højere koncentrationer, og den dødelige koncentration varierer mellem arter af FFAs, den optimale subletale koncentration, der inducerer LD dannelse bør titreres for hver ansøgning.

Når de OA-stimulerede organoider er faste og farvede i henhold til protokollen, kan LDF visualiseres ved hjælp af en confokal mikroskop. Som organoider er 3D-strukturer, en regelmæssig epifluorescerende mikroskop er ikke egnet på grund af out-of-fokus baggrunds signalet. Derfor brugte vi en (maksimal projektion af a) konfokale z-stack til at karakterisere ldf i organoider. Figur 2a viser et repræsentativt resultat af ld-farvning i raske kontrol organoider, der blev behandlet med eller uden en DGAT1-hæmmer. Selv om kvantificering af disse billeder er omstændelig, tjener confokal analysen primært som et visualiseringsværktøj til at kontrollere for unormal LD dannelse. Kvantificering af Konfokal mikroskopi prøver kan også udføres ved hjælp af en fluorescerende plade læser (figur 2B), normaliseret til det fluorescerende Hoechst-signal. Plade læser analysen indikerer et signifikant fald i LD540-signalet i organoids-celler behandlet med DGAT1-hæmmer (D1i) sammenlignet med ubehandlede organoider.

Kvantificering af LD dannelse i individuelle celler kan opnås ved hjælp af flow cytometer. Den gating-strategi, der anvendes til dissocierede humane intestinale organoider, er vist i figur 3A. Det første skridt i gating i FSC-A/SSC-en plot er et første valg af ' live ' (når fast), enkeltceller. For yderligere at udelukke doublets, trillinger eller større celle klumper, inkluderede vi to yderligere gating-trin på FSC-W/FSC-H og SSC-W/SSC-H. Endelig sikrer den gating på FSC-A/Hoechst udelukkelse af alle celler, der var døde eller døende før fiksering. Figur 3B, C viser histogrammer af både SSC-A og LD540 signal af den endelige levende cellepopulation. LDF vil resultere i en stigning i SSC-A på grund af dannelsen af intracellulære lipid dråber. Desuden, LD540 pletter for lipider, som er lagret i LDs og dette signal vil også stige ved LDF induktion. Som sådan måles LD dannelse som et skift i MFI af både SSC-A og LD540 (figur 3D, E). MFI kan afbildes og bruges til at udføre statistisk analyse.

Figure 1
Figur 1: organoid kulturer visualiseret af lysfelt mikroskopi. (A, B) For Konfokal og fluorescerende plade læser metoder, er det vigtigt, at organoider ikke seedet i for høj densitet i BMM dråbe. A) organoider seedet i en passende tæthed på 250 celler/ΜL.B) organoider blev seedet i en for høj densitet, hvilket medførte overlapning af organoider og celledød. (C, D) Efter natten stimulation med OA, LD dannelse kan vurderes visuelt. (C) organoider blev inkuberet natten over med 12% BSA køretøjets kontrol. (D) organoider blev inkuberet natten over med 1 mm OA konjugeret til BSA, hvilket resulterede i et mørkt udseende. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: repræsentative resultater af ldf-karakterisering ved hjælp af konfokale Imaging og en fluorescerende plade læser. Sunde kontrol-afledte-organoider blev stimuleret natten over med BSA, 1 mM OA, eller 1 mM OA + D1i. (A) maksimal projektion af 85 μm konfokale stakke farves for dapi (cyan) og LD540 (gul). Denne subfigur er tilpasset fra van Rijn et al.6. B) relativ fluorescens INTENSITET på LD540 normaliseret til det nukleare dapi-signal målt ved hjælp af en fluorescerende plade læser. Gennemsnitlig ± SD afbildes for to biologiske replikater. Statistisk signifikans blev fastlagt ved hjælp af en envejs-ANOVA uden gentagne foranstaltninger med en Tukey's post-hoc. *, S < 0,05. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: repræsentative resultater af LDF-kvantificering ved hjælp af flowcytometri. Sunde kontrol-afledte-organoider blev stimuleret natten over med BSA, 1 mM OA, eller 1 mM OA + D1i. (A) gating strategi for at vælge for organoid-afledte enkeltceller. Fra venstre mod højre skal du først udelukke snavs ved at gating for FSC-A/SSC-A. Derefter Gate på FSC-W/FSC-H og SSC-W/SSC-H at udelukke doublets, trillinger, eller større klumper af celler. Endelig Gate for FSC-A/Hoechst til at vælge for levende celler. Både SSC-A og LD540 kanalerne bruges til at kvantificere LD dannelse. Histogrammer af disse parametre viser et skift i gennemsnitlig fluorescens intensitet (MFI) af (B) SSC-a og (C) LD540 ved stimulation med OA. (D, E) MFI pr. prøve kan afbildes i en graf og bruges til at udføre statistisk analyse. Gennemsnitlig ± SD afbildes for tre biologiske replikater. Statistisk signifikans blev fastlagt ved hjælp af en envejs-ANOVA uden gentagne foranstaltninger med en Tukey's post-hoc. *, S < 0,05; * *, S < 0,01; , S < 0,001. Dette tal er tilpasset fra van Rijn et al.6. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Kemiske Opløsningsmiddel Bestand koncentration Endelig koncentration
Wnt3a CM - 100% 50%
R-spondin-1 CM - 100% 20
Noggin CM - 100% 10
A83-01 (TGFβ-Inh) Dmso 50 mM 500 nM
B27 - 50x 1x
mEGF PBS/0,1% BSA 500 μg/mL 50 ng/mL
N-acetyl Vand 500 mM 1,25 mM
Nicotinamid Pbs 1 M 10 mM
Primocin
(brug indtil MCB er i fryser)		 - 50 mg/mL 100 μg/mL
SB202190 (P38 Inh) Dmso 30 mM 10 μM

Supplerende tabel 1: opskrift på organoid-udvidelses medium.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her giver vi en protokol til bestemmelse af LD dannelse i humane intestinale organoider ved inkubation med oliesyre. Denne metode er baseret på LD-specifikke fluorescerende farvestof LD54018, som giver mulighed for karakterisering og kvantificering af den samlede mængde af lipid dråber i en organoid kultur. Procedurerne for at etablere og vedligeholde humane tarm organoide kulturer er blevet offentliggjort før13, og en visuel vejledning af denne protokol er tilgængelig samt15.

De afgørende skridt i denne protokol er kulturen af humane intestinale organoider, og den korrekte konjugering af OA til BSA. Kulturen af organoider kræver en korrekt formulering af kulturmediet, da opretholdelsen af en stamcelle population er meget afhængig af funktionel Wnt3A-CM. Når Wnt3A-CM er lavet in-House, anbefaler vi en meget standardiseret arbejdsgang og den månedlige produktion af konditioneret medium på grund af udløbet tid på omkring 2 måneder. Desuden resulterer 1:1 blanding af sammenhængende Wnt3A-CM partier i en mere konstant langsigtet kultur, da det sikrer, at en lidt suboptimal batch ikke vil have en stor indvirkning på organoid vækst.

Derudover består vores BM af Advanced DMEM/F12 medium, som indeholder lipid-rige BSA. Da vores køretøjskontrol (12% BSA/BM) ikke inducerer LD dannelse i organoider, konkluderer vi, at mængden eller typen af FFA i BM ikke er tilstrækkelig til at påvirke LDF-analysen.

Konjugering af OA til BSA er en delikat proces, som kan kræve nogle optimering. Vi oplevede, at den protokol, der er beskrevet her, er mest optimal, når alle temperaturændringer følges omhyggeligt, og når de udføres ved hjælp af glas labware.

I tidligere forskning, LD formation assays er blevet brugt til at karakterisere ld størrelse og tal med høj forstørrelse8,12. Disse assays blev for det meste udført ved hjælp af Boron-dipyrromethene (BODIPY) 493/503, som giver en fremragende farvning for LDs med høj signal-støj-forhold. Men, den emission spektrum af BODIPY er ganske bred, og i vid udstrækning overlapper med fluorescerende spektrum af grønne fluorescerende protein (GFP)-afledte farvestoffer. Selv om vi forventer, at den nuværende anvendelse af LDF-analysen ville arbejde med BODIPY samt, valget for LD540 giver mulighed for en bredere vifte af flerfarvede billeder, herunder Co-farvning med GFP etiketter18. Vi har også udført denne analyse ved hjælp af lipid Stain Nilen rød (data ikke vist). Men da Nilen har tendens til at plette ikke kun LDs, men også lipid-bilayers, fandt vi, at den højere baggrunds signal af Nile Red sænker kapaciteten af vores analyse til at skelne små forskelle i LD dannelse. Af disse grunde foretrækker vi at bruge LD540 i en organoid-baseret LDF-analyse.

Sammenlignet med tidligere undersøgelser med høj forstørrelse LDF assays, den analyse, vi beskriver her giver mulighed for høj gennemløb kvantitation af total LD volumen i en stor population af celler. Derfor kan især den fluorescerende plade læser kvantitation, og potentielt flow cytometrisk analyse, skaleres til at teste virkningen af lægemidler på LD dannelse. Da vi har påvist, at LD-dannelsen i vidt omfang er DGAT1 afhængig, udgør DGAT1 mangelfulde patient afledte eller D1i behandlede organoider en klar mulighed for at anvende en sådan screening. Især for sådanne sjældne forekommende sygdomme kan LDF-analysen kombineret med patient afledte organoider udgøre en platform for patientspecifik screening for nye terapeutiske lægemidler.

En konsekvens af en tilgang med høj gennemløb er imidlertid, at kraften til at karakterisere de enkelte LDs går tabt. Selv om høj-forstørrelse elektron mikroskopisk eller fluorescerende visualisering af LDs kan bruges til at studere dynamikken i ld størrelse og nummer12,19, den høje gennemløb tilgang skelner ikke mellem flere små eller færre store LDs og kan derfor ikke bruges til at kvantificere forskelle i LD-metabolisme, hvor det totale volumen af LDs forbliver konstant. Derfor, i applikationer, hvor antallet eller størrelsen af LDs er mistænkt for at være af interesse, dette bør behandles med en lavere gennemløb, højere forstørrelse teknik. Desuden får organoider i den nuværende analyse basolaterale lipid stimulation mens kosten lipider typisk tages op på den apikale membran. Der kræves derfor en vis forsigtighed, hvis resultaterne skal oversættes til den fysiologiske situation.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi takker B. Spee for generøst at give LD540. Dette arbejde blev støttet af en nederlandsk organisation for videnskabeligt forskningstilskud (NWO-ZonMW; VIDI 016.146.353) til S.M.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Advanced DMEM/F12 Gibco 12634-028
B27 supplement  Gibco 17504-044
Basement membrane matrix (matrigel) BD Biosciences 356231
DAPI Sigma-Aldrich D9542-1MG
DGAT1 inhibitor (AZD 3988) Tocris Bioscience 4837/10
Fatty acid free BSA Sigma-Aldrich A7030
Formaldehyde Klinipath 4078-9001
Glutamin (GlutaMAX, 100x) Gibco 15630-056
HEPES (1 M) Gibco 15630-080
Laser scanning confocal microscope Leica SP8X
LD540 kindly provided by Dr. B. Spee, Utrecht University
mEGF Peprotech 315-09_500ug
N-acetyl cysteine Sigma-Aldrich A9165-100G
Nicotinamide Sigma-Aldrich N0636-500G
Noggin producing cells (HEK293-mNoggin-Fc cells) MTA with J. den Hertog, Hubrecht Institute
Oleic acid Sigma-Aldrich O1008-5G
p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190) Sigma-Aldrich S7067-25MG
PBS Sigma-Aldrich D8662-500ML
PBS without Ca2+/Mg2+ Sigma-Aldrich D8537-500ML
Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL) Gibco 15070-063
R-spondin producing cells (Cultrex HA-R-Spondin1-Fc 293T Cells) R&D systems 3710-001-01
TC-treated 24 well plates Greiner-One 662160
TC-treated black clear-bottom 96 well plates Corning Life Sciences 353219
TGFb type I receptor inhibitor (A83-01)  Tocris Bioscience 2939/10
Trypsin (TrypLE Express) Life Technologies 12604021
WNT-3A producing cells (L-Wnt-3A cells) MTA with J. den Hertog, Hubrecht Institute
Y-27632 dihydrochloride (Rho kinase inhibitor) Abcam ab120129-10

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yen, C. L. E., Nelson, D. W., Yen, M. I. Intestinal triacylglycerol synthesis in fat absorption and systemic energy metabolism. Journal of Lipid Research. 56 (3), 489-501 (2015).
  2. Yen, C. L. E., Stone, S. J., Koliwad, S., Harris, C., Farese, R. V. Thematic review series: glycerolipids. DGAT enzymes and triacylglycerol biosynthesis. Journal of Lipid Research. 49 (11), 2283-2301 (2008).
  3. D'Aquila, T., Hung, Y. H., Carreiro, A., Buhman, K. K. Recent discoveries on absorption of dietary fat: Presence, synthesis, and metabolism of cytoplasmic lipid droplets within enterocytes. Biochimica et Biophysica Acta. 1861 (8 Pt A), 730-747 (2016).
  4. Chavez-Jauregui, R. N., Mattes, R. D., Parks, E. J. Dynamics of fat absorption and effect of sham feeding on postprandial lipema. Gastroenterology. 139 (5), 1538-1548 (2010).
  5. Chitraju, C., et al. Triglyceride Synthesis by DGAT1 Protects Adipocytes from Lipid-Induced ER Stress during Lipolysis. Cell Metabolism. 26 (2), 407-418 (2017).
  6. van Rijn, J. M., et al. Intestinal failure and aberrant lipid metabolism in patients with DGAT1 deficiency. Gastroenterology. 1, 130-143 (2018).
  7. Haas, J. T., et al. DGAT1 mutation is linked to a congenital diarrheal disorder. Journal of Clinical Investigation. 122 (12), 4680-4684 (2012).
  8. Gluchowski, N. L., et al. Identification and characterization of a novel DGAT1 missense mutation associated with congenital diarrhea. Journal of Lipid Research. 58 (6), 1230-1237 (2017).
  9. Ratchford, T. L., Kirby, A. J., Pinz, H., Patel, D. R. Congenital Diarrhea From DGAT1 Mutation Leading to Electrolyte Derangements, Protein-losing Enteropathy, and Rickets. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 66 (3), e82-e83 (2018).
  10. Stephen, J., et al. Congenital protein losing enteropathy: an inborn error of lipid metabolism due to DGAT1 mutations. European Journal of Human Genetics. 24 (9), 1268-1273 (2016).
  11. Schlegel, C., et al. Reversible deficits in apical transporter trafficking associated with deficiency in diacylglycerol acyltransferase. Traffic (Copenhagen, Denmark). 19 (11), 879-892 (2018).
  12. Wilfling, F., et al. Triacylglycerol synthesis enzymes mediate lipid droplet growth by relocalizing from the ER to lipid droplets. Developmental Cell. 24 (4), 384-399 (2013).
  13. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  14. Middendorp, S., et al. Adult stem cells in the small intestine are intrinsically programmed with their location-specific function. Stem Cells. 32 (5), 1083-1091 (2014).
  15. Boj, S. F., et al. Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients. Journal of Visualized Experiments. (120), e55159 (2017).
  16. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  17. Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
  18. Spandl, J., White, D. J., Peychl, J., Thiele, C. Live cell multicolor imaging of lipid droplets with a new dye, LD540. Traffic. 10 (11), 1579-1584 (2009).
  19. Hung, Y. H., Carreiro, A. L., Buhman, K. K. Dgat1 and Dgat2 regulate enterocyte triacylglycerol distribution and alter proteins associated with cytoplasmic lipid droplets in response to dietary fat. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (6), 600-614 (2017).

Tags

Medicin humane intestinale organoider primær cellekultur biopsi lipid dråber DGAT1 Konfokal mikroskopi
En fluorescens-baseret assay til karakterisering og kvantificering af lipid-Dråbedannelse i humane tarm Organoider
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

van Rijn, J. M., van Hoesel, M.,… More

van Rijn, J. M., van Hoesel, M., Middendorp, S. A Fluorescence-based Assay for Characterization and Quantification of Lipid Droplet Formation in Human Intestinal Organoids. J. Vis. Exp. (152), e60150, doi:10.3791/60150 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter