Summary
Dit protocol beschrijft een assay voor de karakterisering van lipide druppel (LD) vorming in humane intestinale organoïden bij stimulatie met vetzuren. We bespreken hoe deze assay wordt gebruikt voor de kwantificering van LD-vorming, en hoe het kan worden gebruikt voor screening met hoge doorvoer voor geneesmiddelen die de LD-vorming beïnvloeden.
Abstract
Dieet lipiden worden ingenomen als vrije vetzuren (FAs) door het intestinale epitheel. Deze FAS zijn intracellulair omgezet in triglyceriden (TG) moleculen, voordat ze worden verpakt in chylomicronen voor transport naar de lymfe of in cytosolische lipide druppels (LDS) voor intracellulaire opslag. Een cruciale stap voor de vorming van LDs is de katalytische werking van diacylglycerolacyltransferases (DGAT) in de laatste stap van TG-synthese. LDs zijn belangrijk voor de buffer van toxische lipiden soorten en reguleren van cellulaire metabolisme in verschillende celtypen. Omdat het menselijke darm epitheel regelmatig wordt geconfronteerd met hoge concentraties van lipiden, is LD-vorming van groot belang om homeostase te reguleren. Hier beschrijven we een eenvoudige assay voor de karakterisering en kwantificering van LD-vorming (LDF) bij stimulatie met het meest voorkomende onverzadigde vetzuren, oliezuur, in humane intestinale organoïden. De LDF-test is gebaseerd op de LD-specifieke fluorescerende kleurstof LD540, die het mogelijk maakt om LDs te kwantificeren met confocale microscopie, fluorescerende plaat lezer of flow-cytometrie. De LDF-test kan worden gebruikt om LD-vorming in menselijke intestinale epitheelcellen te karakteriseren, of om menselijke (genetische) aandoeningen te bestuderen die het LD-metabolisme beïnvloeden, zoals DGAT1-deficiëntie. Bovendien kan deze test ook worden gebruikt in een pijpleiding met hoge doorvoer om nieuwe therapeutische verbindingen te testen, die defecten in LD-vorming in intestinale of andere soorten organoïden herstellen.
Introduction
Lipiden zijn een cruciaal onderdeel van het menselijk dieet en spelen een belangrijke rol in de systemische energieopslag en metabolisme. Wanneer geconsumeerd, dieet lipiden worden afgebroken in vrije vetzuren (FFAS) en monoglyceriden (MGS) door alvleesklier lipases. Deze substraten worden vervolgens ingenomen door de enterocyten van het intestinale epitheel, waar ze voor het eerst opnieuw veresterd worden naar diglyceriden (DG) door monoglyceriden acyltransferases (MGAT)-enzymen en vervolgens naar triglyceriden (TG) door diacylglycerol acyltransferase 1 (DGAT1)1. Tot slot, deze TGS zijn geïntegreerd in ofwel chylomicronen voor export naar het lymfestelsel of cytosolische lipide druppeltjes (LDS) voor intracellulaire opslag2,3. Hoewel chylomicronen nodig zijn om voedings lipiden naar andere organen te verdelen, is het belang van intracellulaire vetopslag in LDS niet helemaal duidelijk. Echter, LDs is aangetoond dat het uitvoeren van een regelgevende functie in de darm, als ze langzaam vrijkomen lipiden in de circulatie tot 16 h na een maaltijd4. Bovendien heeft LDs aangetoond dat het beschermt tegen toxische vetzuur concentraties, zoals bij muizen met de lipolytische condities5.
Het DGAT1 eiwit bevindt zich op het endoplasmisch reticulum (ER) membraan en speelt een cruciale rol in de LD-formatie in het intestinale epitheel. Homozygoot mutaties in DGAT1 leiden tot vroegtijdige ernstige diarree en/of braken, hypoalbuminemie en/of (fatale) proteïne-verliezen enteropathie met intestinale insufficiëntie bij vetopslag, ter illustratie van het belang van DGAT1 in lipide homeostase van de menselijke intestinale epitheel6,7,8,9,10. Sinds het optreden van DGAT1-deficiëntie bij de mens is zeldzaam, toegang tot primaire patiënt-afgeleide cellen is schaars. Bovendien, de lange-termijn cultuur van intestinale epitheliale cellen is al lange tijd beperkt tot tumor-afgeleide cellijnen die de normale fysiologie alleen voor een beperkte uitbreiding vertegenwoordigen. Daarom is DGAT1-gemedieerde LD-formatie meestal bestudeerd in fibroblasten of dierlijke cellijnen7,10,11,12. Als zodanig werd onlangs aangetoond dat DGAT1-deficiënte door patiënten afgeleide fibroblasten minder LDs accumuleren in vergelijking met gezonde controle cellen na stimulatie met oliezuur (OA)8.
Voorheen werden protocollen vastgesteld voor de kweek van epitheliale stamcellen uit elk gastro-intestinaal orgaan in de vorm van driedimensionale (3D) organoïden13. Deze intestinale organoïden kunnen worden bewaard in cultuur voor een lange periode van tijd13, en laat de functionele studie van patiënt-en intestinale locatie-specifieke epitheliale kenmerken14. Ze zijn genetisch en fenotypisch stabiel en kunnen worden opgeslagen, waardoor lange termijn expansie en biobankingen13.
We hebben onlangs aangetoond dat LD-vorming gemakkelijk kan worden gemeten in humane intestinale organoïden in een LD-formatie (LDF)-assay6. Bij blootstelling aan OA voor 16 uur genereren organoïden LDs om de cellen te beschermen tegen lipide-geïnduceerde toxiciteit. Wanneer OA concentraties te hoog zijn, sterven de cellen door caspase-gemedieerde apoptosis6. De LDF-test werd eerder aangetoond grotendeels afhankelijk te zijn van DGAT1, zoals aangegeven door organoïden afgeleid van DGAT1-Mutant patiënten en door het gebruik van DGAT1-specifieke remmers6.
Voor de in detail beschreven LDF-assay worden 3D-organoïden gekweekt uit intestinale biopsieën en worden wekelijks door een verstoring in afzonderlijke cellen geprikt die gemakkelijk nieuwe organoïden vormen. Voor het uitvoeren van de LDF-assay worden ~ 7.500 organoid-afgeleide enkelvoudige cellen in elk goed van een 24-put plaat verguld. Organoïden worden gevormd gedurende meerdere dagen, gebroed met een nacht met 1 mM OA en gekleurd met LD540, een fluorescerende cel-permeabele LD-specifieke kleurstof die Imaging vergemakkelijkt. De LD-formatie wordt vervolgens gekwantificeerd door confocale microscopie, fluorescerende plaat lezer of flow-cytometrie.
Door deze LD-formatie test te schalen naar een 96-well-indeling, kan de assay ook worden gebruikt voor analyses met een hoge doorvoer van LD-vorming naar het scherm voor nieuwe geneesmiddelen die de LD-vorming beïnvloeden in humane intestinale organoïde culturen, of om (menselijke genetische) aandoeningen te bestuderen die invloed hebben op LD metabolisme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimenten met menselijke weefsels die hierin worden beschreven, zijn goedgekeurd door het ethisch comité van het Universitair Medisch Centrum Utrecht (UMCU). Geïnformeerde toestemming voor weefsel inzameling,-opwekking,-opslag en-gebruik van de organoïden werd verkregen van patiënten in het Wilhelmina Children's Hospital (WKZ)-UMCU.
1. voorbereiding van cultuur media
Opmerking: Dit protocol moet worden uitgevoerd in een bioveiligheidskast. De organoïden moeten worden behandeld volgens de standaard richtlijnen voor celcultuur.
- Basaal kweekmedium bereiden.
Opmerking: cultuurmedium zonder groeifactoren wordt aangeduid als basale medium (BM).- Voeg 5 ml HEPES (1 M), 5 mL L-glutamine (100x) en 5 mL penicillaire-streptomycine (5.000 U/mL) toe aan 500 mL gevorderd Dulbecco's gemodificeerde Eagle medium met ham van voedings mengsel F-12 om BM medium voor te bereiden.
- Bewaar het bereide BM-medium bij 4 °C en gebruik dit gedurende maximaal 2 maanden.
- Bereid R-spondin en Noggin geconditioneerd medium (CM) volgens het Protocol van de fabrikant.
- Laat de cellen kort opgroeien tot de gewenste hoeveelheid in hyperkolven met 5 x 107 cellen in 555 ml medium zonder selectief antibioticum per kolf.
- Kweek de cellen gedurende 4 dagen tot Confluent.
- Vervang het medium met BM en Culture voor 8 extra dagen.
- Na 8 dagen cultuur bij 37 °C, verzamel het kweekmedium en centrifugeer 5 min bij 450 x g om eventuele overgebleven cellen te pellet.
- Filter steriliseren de supernatant, en bewaar aliquots van de R-spondin of Noggin CM bij-20 °C gedurende maximaal 6 maanden.
- Bereid Wnt3A CM voor volgens de BOJ et al.15.
- Kort, opgroeien van de cellen tot de gewenste hoeveelheid in 145 mm gerechten met 2 x 106 cellen in 20 ml medium zonder selectieve antibioticum per gerecht. Wikkel elk gerecht met plastic folie om verdamping van het kweekmedium te voorkomen.
- Na 8 dagen cultuur bij 37 °C, verzamel het kweekmedium en centrifugeer 5 min bij 450 x g om eventuele overgebleven cellen te pellet.
- Filter steriliseren de supernatant en bewaar aliquots van de Wnt3A-CM bij 4 °C gedurende maximaal 2 maanden.
- Bereid organoïde expansie medium.
Opmerking: humaan klein intestinale organoïde expansie medium (zie recept in aanvullende tabel 1) wordt aangeduid als Hsi-em. De volgende stappen zullen een laatste volume van 1 L hSI-EM produceren en kunnen naar wens omhoog of omlaag worden geschaald.- Los 1,46 g Nicotinamide op in 12 mL celkweek kwaliteit fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) om een uiteindelijke verdunning van 1 M te creëren.
- Los 245 mg n-acetyl-cysteïne op in 3 mL celcultuurgraad PBS om een uiteindelijke verdunning van 500 mM te creëren.
Opmerking: Om de vorming van een oplossing te versnellen, kunnen de Nicotinamide-en n-acetyl-cysteïne worden geïnineerd in een waterbad van 37 °C. Beide oplossingen kunnen worden bereid in batch, aliciteerde, en opgeslagen bij-20 °C voor toekomstig gebruik. - Filter steriliseren beide oplossingen via een 0,22 μm filter in een steriele 15 mL buis.
- Voeg 167 mL BM toe aan een steriele 500 mL kweekmedium kolf. Voeg 200 mL R-Spondin-CM, 100 mL Noggin-CM en 100 μL recombinant mEGF (500 μg/mL) toe aan een eindconcentratie van 50 ng/mL.
- Voeg toe 10 mL van de gesteriliseerde Nicotinamide oplossing en 2,5 mL van de gesteriliseerde n-acetyl-cysteïne oplossing. Voeg 20 mL B27 supplement (50x) toe.
Opmerking: In dit stadium wordt het medium hSI-EM genoemd zonder WAS (Wnt3A-CM, A83-01, en SB202190), en kan worden alicgeciteerd en opgeslagen bij-20 °C. Als het medium wordt uitgedrukt in kleinere volumes, past u de concentraties van de volgende stappen dienovereenkomstig aan. - Tot 500 mL hSI-EM zonder WAS, voeg 10 mL van Wnt3A-CM van de laatste vers bereide partij en 10 mL Wnt3A-CM van de tweede laatste partij om variabiliteit veranderingen in Wnt3A-CM voorwaarden te minimaliseren.
- Voeg A83-01 toe aan een eindconcentratie van 500 nM en SB202190 tot een eindconcentratie van 10 μM.
- Bewaar de bereide hSI-EM (met WAS) bij 4 °C en gebruik deze gedurende maximaal 2 weken.
Opmerking: Voeg extra Y-27632 toe aan een uiteindelijke concentratie van 10 μM (aangeduid als hSI-EM + Y) wanneer crypten of enkelvoudige cellen worden gekweekt of organoïden worden gestart vanuit cryopreservation.
- Bereid de buffer van de fluorescerende cel sortering (FACS).
- Voeg 10 mL foetaal kalf serum (FCS) toe aan 40 mL PBS zonder CA2 +/mg2 + voor een uiteindelijke concentratie van 10% FCS.
Opmerking: De FCS voorkomt dat cellen zich aan labware hechten.
- Voeg 10 mL foetaal kalf serum (FCS) toe aan 40 mL PBS zonder CA2 +/mg2 + voor een uiteindelijke concentratie van 10% FCS.
2. cultuur procedures voor menselijke kleine intestinale Organoïden
Opmerking: Dit protocol moet worden uitgevoerd in een bioveiligheidskast. De organoïden moeten worden behandeld volgens de standaard richtlijnen voor celcultuur. Bij de omgang met organoïden of organoid-cellen moeten de cellen waar mogelijk op ijs worden gehouden. De cellen zullen een paar uur na het oogsten levensvatbaar blijven wanneer dit wordt gewaarborgd. Organoïden moeten worden gekweekt in een standaard celkweek incubator bij 37 °C met 5% CO2. Deze voorwaarden zijn van toepassing op alle incubatie stappen met organoïden die in de kelder membraan matrix (BMM; d.w.z. Matrigel) zijn ingebed in dit protocol. De auteurs hebben gebruikt duodenum-afgeleide organoïden voor deze assays.
- Het doorvoeren van organoïden
Opmerking: Elke organoïde cultuur heeft zijn eigen verdubbelingstijd. Normaalgesproken kunnen kleine intestinale organoïden worden doorgevoerd 1:3 − 1:5 elke 7 − 10 dagen. Bij doorgang als enkelvoudige cellen kan de doorgang efficiëntie tot 1:20 zijn, afhankelijk van de celdichtheid. Voor de inrichting en het onderhoud worden organoïden gekweekt in 24-put platen; voor de LDF-test, in beide 24-of 96-put-platen.- Voorbereiding
- Pre-warm uitgepakt 24-Well weefselkweek platen in een incubator bij 37 °C, 5% CO2 ten minste 's nachts en bij voorkeur 5 dagen van tevoren.
Opmerking: Het voorverwarmen van de weefselkweek platen in de celkweek incubator zorgt voor een goede vorming en bevestiging van organoid-bevattende druppeltjes van BMM. - Om het aantal vries-dooi cycli te verminderen, bereidt u 1 mL aliquots van BMM voor en bewaart u bij-20 °C. Een flacon BMM op ijs ontdooien ten minste 30 minuten voordat de organoïde-passage wordt gestart.
- Houd een 50 mL tube van BM op ijs als wasmiddel.
- Bereid hSI-EM zoals beschreven in paragraaf 1,4, en bereid een passende hoeveelheid hSI-EM + Y, bijvoorbeeld, 15 mL voor een volledige 24-goed plaat.
- Pre-warm uitgepakt 24-Well weefselkweek platen in een incubator bij 37 °C, 5% CO2 ten minste 's nachts en bij voorkeur 5 dagen van tevoren.
- Verzamel organoïden.
- Zuig het kweekmedium voorzichtig op zonder de druppeltjes van BMM te storen.
- Voeg 500 μL koude BM toe aan de eerste put van organoïden en breek de druppels BMM met organoïden door zachtjes op en neer te pipetteren met een P1000 pipet.
- Herhaal deze procedure met hetzelfde medium in de volgende put als nodig, maar oogst niet meer dan 2 putjes per 500 μL BM.
- Verzamel de organoïden in een low-binding 1,5 mL micro centrifugebuis en spin naar beneden in een mini tafelblad centrifuge voor 15 − 20 s (max. 2.000 x g). Aspireren de supernatant volledig en verwijder het laatste stukje medium met een P200 pipet.
Opmerking: Wanneer de organoïden culturen er onder een Microscoop schoon uitzien en geen dode cellen of ander vuil bevatten, kunnen de BMM druppels direct in trypsine worden geoogst in plaats van BM in stap 2.1.2.2. Ga na stap 2.1.2.3 direct verder met incubatie in stap 2.1.3.1.
- Dissociëren de organoïden in afzonderlijke cellen.
- Voeg 400 μL trypsine toe aan de gekrompen organoïden. Incuberen de organoïden gedurende 5 minuten bij 37 °C in een waterbad.
- Ontwer de resterende aggregaten van cellen door voorzichtig met een P200 pipet op en neer te pipetteren. Nogmaals, inbroed de organoïden bij 37 °C gedurende 5 minuten in een waterbad.
- Controleer de voortgang van de celdissociatie onder een microscoop met behulp van 4x vergroting. Herhaal handmatige verstoring en incubatie wanneer grote klontjes cellen blijven.
- Als er slechts enkele cellen achterblijven, voeg dan 1 mL BM toe en draai de cellen in een mini tafelblad centrifugeren voor 15 − 20 s.
- Aspireren het supernatant volledig. Breng de afzonderlijke cellen in 200 μL verse hSI-EM met behulp van een P200 pipet. Voeg een extra 800 μL hSI-EM toe.
- Tel het aantal cellen in suspensie.
Opmerking: In het lab van de auteurs levert het handmatig tellen van gezien organoïde cellen betrouwbaardere resultaten op dan een geautomatiseerd mobiele teller. Wanneer een geautomatiseerde celteller wordt gebruikt, moet de celdichtheid voor downstreamtoepassingen in eigen huis worden getest en worden aangepast als er te weinig of te veel organoïden groeien.
- Zaad organoïden voor onderhoud of lipide druppelvorming assay.
- Bereken het volume van de cellen die nodig zijn voor de uiteindelijke celdichtheid.
Opmerking: Ongeveer 250 cellen/μL is een geschikte dichtheid. In een 24-pits plaatje wordt 30 μL in elke put opgenomen, terwijl 5 μL in elke put van een 96-well plaat wordt geseeid. - Haal het juiste volume van de suspensie eruit en stel de dichtheid in op 750 cellen/μL (of spin omlaag en hervat de druk wanneer de dichtheid te laag is).
- Voeg BMM toe aan de celsuspensie in een verhouding van 2:1. De uiteindelijke celdichtheid in dit mengsel is 250 cellen/μL. Meng de suspensie voorzichtig door pipetteren, waarbij u voorzichtig alle bubbels vermijdt.
- In een voorverwarmde weefselkweek plaat, zaad uit 3 10 μL druppeltjes per put in een 24-goed plaat of een enkele druppel van 5 μL per put in een 96-well plaat.
- Plaats de plaat in een incubator bij 37 °C, 5% CO2 gedurende 10 − 15 minuten om de druppels BMM te stollen. Verwarm ondertussen een gepaste hoeveelheid hSI-EM + Y in een waterbad van 37 °C.
- Voeg voorzichtig 500 μL pre-warmed hSI-EM + Y toe aan elk goed van een 24-put of 100 μL tot elk goed van een 96-well plaat. Incuberen de cellen in een incubator bij 37 °C, 5% CO2 en na 2 − 3 dagen veranderen het medium in Hsi-em (zonder Y) en Verversen 2 − 3 keer per week.
Opmerking: Na 7 − 10 dagen moet een onderhouds cultuur van organoïden opnieuw worden door gevoerd.
- Bereken het volume van de cellen die nodig zijn voor de uiteindelijke celdichtheid.
- Voorbereiding
3. bepaling van de vetdruppel vorming
- Bereiding van oleïnezuur geconjugeerde
Opmerking: aangezien oliezuur (OA) hydrofoob is en niet oplosbaar in water, wordt het geconjugeerd met boviene serumalbumine (BSA). BSA kan meerdere vetzuur moleculen binden en wordt in dit geval gebruikt in een 1:8-verhouding om oleïnezuur toegankelijk te maken voor de intestinale cellen. Vrije vetzuren en BSA kunnen zowel aan kunststof labware binden. Gebruik, indien mogelijk, glazen flesjes en glazen pipets om een goede eindconcentratie te garanderen.- Weeg 0,2 g vloeibaar oleïnezuur af bij kamertemperatuur. Voeg 1,5 mL cultuur-grade steriele PBS toe en verwarm het mengsel tot 70 °C gedurende 1 h. Vortex met tussenpozen.
- Weeg 5,89 g vetzuur vrije BSA af en los op in 33,9 mL PBS. Verwarm het mengsel in een waterbad van 37 °C tot de BSA volledig is opgelost.
- Vortex het OA mengsel opnieuw om een emulsie van fijne druppels te maken en voeg het onmiddellijk toe aan de BSA-oplossing met behulp van een glazen pipet. Houd de eindoplossing dicht bij 37 °C na het toevoegen van de OA. Het uiteindelijke mengsel bestaat uit 20 mM OA in 2,5 mM BSA.
- Bewaar het mengsel gedurende 30 minuten bij 37 °C totdat er een heldere geelachtige oplossing overblijft.
- Het OA-BSA-geconjugeerde kan gedurende ten minste 6 maanden worden alicgeciteerd en bevroren bij-20 °C. Bij het ontdooien van een aliquot wordt het op 37 °C geïnfiltreerd totdat de troebelheid is opgelost en het mengsel weer helder is.
Opmerking: Vanwege het hoge eiwit-en lipide gehalte van de uiteindelijke oplossing kan het mengsel niet worden gesteriliseerd of autoclaved. Wanneer de componenten met zorg werden behandeld, in een laminaire stroom afzuigkap indien mogelijk en met behulp van steriele PBS, hebben de auteurs geen microbiële infecties ervaren.
- LDF confocale assay
- Monstervoorbereiding
- Passage organoïden zoals beschreven in punt 2,1. Zaad uit de organoïde-afgeleide enkelvoudige cellen in een zwarte Clear-bottom 96-well plate.
- Op dag 6 van cultuur op hSI-EM vervangt u het kweekmedium door hSI-EM met 1 mM OA-BSA-conjugaat.
- Inincuberen de cellen voor 16 − 17 uur ('s nachts) bij 37 °C in aanwezigheid of afwezigheid van 0,1 μM DGAT1 inhibitor. Neem een voertuig bediening van 2,5 mM BSA op.
- Na 16 − 17 h, aspireren het medium zonder verstoring van de druppels BMM. Fixeren van de organoïden door toevoeging van 100 μL van 4% neutraal gebufferd formaldehyde aan de putjes gedurende 30 min bij kamertemperatuur.
Opmerking: De formaldehyde zal de BMM gedeeltelijk ontbinden, terwijl de organoïden naar de bodem zinken en zich aan de onderkant van de plaat hechten. - Verwijder de formaldehyde voorzichtig en was de putjes voorzichtig met 150 μL PBS per putje.
- Vlek de cellen voor LDs met 0,025 mg/mL LD540 en 4 ′, 6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) in PBS gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
- Was de putjes voorzichtig met PBS.
Opmerking: Het protocol kan hier worden onderbroken wanneer dat nodig is. Houd de monsters bedekt met PBS in het donker bij 4 °C. De LD540 kleuring blijft tot een week stabiel. Deze test kan ook worden uitgevoerd met levende cellen, om de LD-formatie gedurende een bepaalde periode te bewaken. Hiervoor dient de fixatie te worden weggelaten uit het protocol en moet de DAPI worden vervangen door Hoechst-kleuring. LD540 kan LDs in levende cellen in dezelfde concentratie bevlekken als beschreven.
- Confocale beeldvorming
Opmerking: De beeldvorming kan worden uitgevoerd op voorbereide organoïde monsters in de zwarte Clear-bottom 96-well plate.- Voor overzichts beelden van hele organoïden gebruikt u een 40x-doelstelling die geschikt is voor confocale fluorescerende beeldvorming.
- Stel de Microscoop in op het beeld van het DAPI-kanaal bij 405 nm excitatie en ca. 410 − 535 nm emissie golflengte. Kies voor de LD540 Dye een excitatie laser bij 540 nm (543 nm is optimaal) en stel de emissie filters in op 545 − 700 nm.
Opmerking: In dit protocol werd een laser scanning-confocale systeem met een witte licht laser, acousto-optische straal splitter (AOBS), 10x/20x-objectief en spectrale detectiesysteem gebruikt. Dit zorgt voor exact afstemmen op de specifieke golflengten. Als er geen vergelijkbaar systeem beschikbaar is, kiest u laserlijnen en korte-/Long-doorlaatfilters in de buurt van de bovenstaande specificaties. Voor volledige organoid beeldvorming is een resolutie van 512 x 512 of 1024 x 1024 voldoende voor downstreambeeldanalyse. - Stel de pinhole grootte in op 1 luchtige eenheid (AU) voor voldoende z-as resolutie.
- Om de ene helft van een sferische organoid te afbeelen, stel een z-stack in op ongeveer 85 μm.
- Beeldanalyse
Opmerking: Voorbeeld analyse, Fiji/imagej16,17 werd gebruikt om maximale projecties te genereren. De analyse kan worden uitgevoerd met elk softwarepakket voorbeeld analyse dat maximale projectie, handmatige drempelwaarde en deeltjes analyse mogelijk maakt.- Gebruik Fiji/imagej om de z-stack van elke organoïde te transformeren naar een maximale projectie: afbeelding | Stapels | Z-project.
- Stel de drempelwaarde van de maximale projectie in op een niveau waarin geen LD540 signaal zichtbaar is in het voorbeeld van de BSA-voertuigbesturing: afbeelding | Aanpassen | Drempel. Gebruik deze instellingen om elke afbeelding te drempelwaarde.
- Meet de totale fluorescentie zone voor elke maximale projectie met behulp van de functie analyze | Analyseer deeltjes.
Opmerking: Hoewel de assay-resolutie beter is met behulp van een confocale Microscoop, kan deze test ook worden geanalyseerd met behulp van een fluorescerende plaat lezer met vergelijkbare filters. Om te normaliseren voor het organoïde aantal per put, moet het LD540-signaal worden gedeeld door het DAPI-signaal. Ten slotte moet het signaal van de BSA-voertuigcontrole worden afgetrokken om de metingen te normaliseren. Deze aanpak maakt het mogelijk om de assay te schalen naar een 96-well plate formaat.
- Monstervoorbereiding
- LDF Flow cytometrische assay
- Monstervoorbereiding
- Passage organoïden zoals beschreven in punt 2,1. Zaad uit de organoid-afgeleide enkelvoudige cellen in een 24-Well weefselcultuur plaat. Twee putten per aandoening is voldoende voor flow cytometrie.
- Op dag 10 van cultuur op hSI-EM, vervang het kweekmedium door hSI-EM met 1 mM OA-BSA conjugaat.
Opmerking: In tegenstelling tot de confocale analyse werd 10 dagen van groei in EM gekozen voor de Flowcytometrie assay in plaats van 6 dagen. De extra 4 dagen van expansie zal resulteren in optisch overlappende organoïden die de microscopie gebaseerde assay compliceren. Echter, het grotere aantal cellen vergemakkelijkt Flowcytometrie analyse. - Inincuberen de cellen voor 16 − 17 uur ('s nachts) bij 37 °C in aanwezigheid of afwezigheid van 0,1 μM DGAT1 inhibitor. Neem een voertuig bediening van 2,5 mM BSA op.
- Verzamel na 16 − 17 uur de organoïden zoals beschreven in punt 2.1.2.
- Dissociëren de organoïden in afzonderlijke cellen, zoals beschreven in punt 2.1.3.
Opmerking: Hoewel niet strikt vereist, is het raadzaam om het aantal cellen in elk voorbeeld te controleren. Een totaal aantal van 10.000 cellen per monster is het absolute minimum dat nodig is voor een voldoende resolutie. Voor optimale resultaten gebruikt u ca. 50000 − 100000 cellen. - Draai de cellen in een mini tafelblad Centrifugeer gedurende 15 − 20 sec.
- Beits elk monster met 500 μL van 0,025 mg/mL LD540 en 1 μg/mL Hoechst in PBS gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
- Draai de cellen in een mini tafelblad Centrifugeer voor 15 − 20 s en was 3x met PBS.
- Fixeren de cellen door ze opnieuw op te schorten in 500 μL van 4% neutraal gebufferd formaldehyde gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
- Draai de cellen om en was 3x met FACS buffer.
- Pre-rinse FACS buizen met FACS buffer om te voorkomen dat cellen vasthouden aan de buiswand.
- Respendeer de cellen in 200 μL FACS buffer en breng de celsuspensie over naar de voorgesposeerde FACS tubes.
- Flow-cytometrische analyse
- Stel de gating-parameters in om dode cellen en er klontjes van cellen uit te sluiten (Zie de sectie representatieve resultaten).
- In de uiteindelijke gated populatie, meet ten minste 10.000 cellen voor betrouwbare resultaten.
Opmerking: Uit deze populatie biedt de gemiddelde fluorescentie intensiteit (MFI) van LD540 en de gemiddelde SSC-een signaal samen een meting van het totale volume van LD-vorming per cel.
- Monstervoorbereiding
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Voor een juiste analyse van LD-vorming mogen de organoïden niet te dicht bij de stimulatie met OA en daaropvolgende vlekken worden geseeld. Dit is vooral van belang voor de confocale en plaat lezer uitlezen, omdat overlappende organoïden de fluorescentie kunnen verstoren. Er wordt een voorbeeld gegeven van de juiste organoïde-zaaien dichtheid (Figuur 1A) en een cultuur met overlappende organogeniden (Figuur 1B). Om de variabiliteit in de monster stimulatie met oa te minimaliseren, moeten de organoïde grootte en de zaaien dichtheid vergelijkbaar zijn tussen de monsters binnen één experiment. Dit wordt best gecontroleerd door het zaaien van een gelijk aantal afzonderlijke cellen. Sommige aanpassingen kunnen echter nodig zijn als bepaalde organoïde-lijnen consistent een hogere reconstitutie-efficiëntie vertonen en dus een consistent hoger aantal organoïden.
Na de stimulatie met 1 mM OA 's nachts, kan LD Formation worden gevisualiseerd met een omgekeerde brightfield-Microscoop. De accumulatie van LDs scatters licht uitgezonden, en daarom lijken de organoïden donkerder, terwijl niet-gestimuleerde organoïden een doorschijnend uiterlijk hebben (Figuur 1C). Een voorbeeld van LD-vorming zoals gezien onder een brightfield-Microscoop wordt weergegeven in Figuur 1D. Dit fenomeen kan worden gebruikt voor het beoordelen van de experimentele omstandigheden voorafgaand aan de fluorescentie test uitlezen. Wanneer het positieve controlemonster niet visueel donkerder is dan het negatieve controlemonster, of wanneer een uitgebreide celdood zichtbaar is, moet het experiment worden weggegooid. Aangezien FFAs giftig is voor cellen in hogere concentraties en de dodelijke concentratie verschilt tussen de soorten FFAs, moet de optimale subletale concentratie die LD-vorming induceert voor elke toepassing worden getitreerd.
Zodra de OA-gestimuleerde organoïden vast en gekleurd zijn volgens het Protocol, kan de LDF worden gevisualiseerd met behulp van een confocale Microscoop. Aangezien de organoïden 3D-structuren zijn, is een reguliere epifluorescerende Microscoop niet geschikt vanwege het out-of-focus achtergrond signaal. Daarom gebruikten we een (maximale projectie van een) confocale z-stack om LDF in organoïden te karakteriseren. Figuur 2a toont een representatief resultaat van ld-kleuring in gezonde controle organoïden die met of zonder een DGAT1-remmer werden behandeld. Hoewel de kwantificering van deze beelden bewerkelijk is, dient de confocale analyse voornamelijk als visualisatietool om te controleren op abnormale LD-vorming. Kwantificering van de confocale microscopie monsters kan ook worden uitgevoerd met behulp van een fluorescerende plaat lezer (Figuur 2B), genormaliseerd naar het fluorescerende Hoechst-signaal. De plaat lezer test duidt op een significante afname van het LD540 signaal in organoïden cellen behandeld met DGAT1 remmer (D1i) in vergelijking met onbehandelde organoïden.
Kwantificering van LD-vorming in individuele cellen kan worden bereikt met behulp van de flow-cytometer. De gating-strategie die wordt gebruikt voor gezien humane intestinale organoïden wordt weergegeven in Figuur 3A. De eerste stap van het gating in de FSC-A/SSC-A plot is een eerste selectie van ' live ' (indien vast), enkelvoudige cellen. Om dubbeltjes, drieling of grotere celklonters verder uit te sluiten, hebben we twee extra stappen op FSC-W/FSC-H en SSC-W/SSC-H opgenomen. Tot slot zorgt de gating op FSC-A/Hoechst voor de uitsluiting van cellen die dood zijn of sterven vóór de fixatie. Figuur 3B, C toont de HISTOGRAMMEN van zowel het SSC-A als het LD540 signaal van de uiteindelijke levende celpopulatie. LDF zal resulteren in een toename van SSC-A als gevolg van de vorming van intracellulaire lipide druppeltjes. Bovendien, LD540 vlekken voor lipiden die zijn opgeslagen in de LDs en dit signaal zal ook toenemen bij LDF inductie. Als zodanig wordt LD Formation gemeten als een verschuiving in de MFI van zowel SSC-A als LD540 (Figuur 3D, E). De MFI kan worden uitgezet en gebruikt om statistische analyses uit te voeren.
Figuur 1: Organoïde culturen gevisualiseerd door brightfield microscopie. (a, B) Voor de confocale en fluorescerende plaat lezer methoden is het belangrijk dat de organoïden niet in een te hoge dichtheid in de BMM druppel worden geseëid. A) organoïden worden in een geschikte dichtheid van 250 cellen/μL gescheiden.B) de organoïden werden in een te hoge dichtheid geseëid, waardoor de organoïden en de celdood elkaar overlappen. (C, D) Na nachtelijke stimulatie met OA, kan LD-formatie visueel worden beoordeeld. C) organoïden werden 's nachts geïnincubeerd met 12% BSA-voertuigcontrole. D) organoïden werden 's nachts geïnineerd met 1 mm OA, GECONJUGEERD met BSA, wat resulteerde in een donkere verschijning. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: representatieve resultaten van de LDF-karakterisering met behulp van confocale beeldvorming en een fluorescerende plaat lezer. Gezonde controle-afgeleide-organoïden werden 's nachts gestimuleerd met BSA, 1 mM OA of 1 mM OA + D1i. A) maximale projectie van 85 μm confocale stacks gekleurd voor DAPI (cyaan) en LD540 (geel). Deze subfiguur is aangepast van van Rijn et al.6. B) relatieve fluorescentie intensiteit van LD540 genormaliseerd naar het nucleaire DAPI-signaal, gemeten met behulp van een fluorescerende plaat lezer. Gemiddelde ± SD wordt uitgezet voor twee biologische replicaten. Statistische significantie werd bepaald met behulp van een one-way ANOVA zonder herhaalde maatregelen met een Tukey's post-hoc. *, P < 0,05. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: representatieve resultaten van de kwantificering van LDF met behulp van Flowcytometrie. Gezonde controle-afgeleide-organoïden werden 's nachts gestimuleerd met BSA, 1 mM OA of 1 mM OA + D1i. A) strategie voor de selectie van afzonderlijke cellen van organoid. Van links naar rechts, eerst uitsluiten puin door gating voor FSC-A/SSC-A. Vervolgens Gate on FSC-W/FSC-H en SSC-W/SSC-H om doublets, drieling of grotere klonters van cellen uit te sluiten. Tot slot, Gate voor FSC-A/Hoechst te selecteren voor levende cellen. Zowel de SSC-A-als de LD540-kanalen worden gebruikt om LD-vorming te kwantificeren. Histogrammen van deze parameters vertonen een verschuiving van de gemiddelde fluorescentie intensiteit (MFI) van (B) SSC-a en (C) LD540 bij stimulatie met oa. (D, E) De MFI per sample kan in een grafiek worden uitgezet en gebruikt om statistische analyses uit te voeren. Gemiddelde ± SD wordt uitgezet voor drie biologische replicaten. Statistische significantie werd bepaald met behulp van een one-way ANOVA zonder herhaalde maatregelen met een Tukey's post-hoc. *, P < 0,05; * *, P < 0,01; , P < 0,001. Dit cijfer is aangepast van van Rijn et al.6. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| Chemische | Oplosmiddel | Voorraad concentratie | Eindconcentratie |
| Wnt3a CM | - | 100% | 50% |
| R-spondin-1 CM | - | 100% | 20 |
| Noggin CM | - | 100% | 10 |
| A83-01 (TGFβ-INH) | Dmso | 50 mM | 500 nM |
| B27 | - | 50x | 1x |
| mEGF | PBS/0,1% BSA | 500 μg/mL | 50 ng/mL |
| N-acetyl | Water | 500 mM | 1,25 mM |
| Nicotinamide | Pbs | 1 M | 10 mM |
| Primocin (gebruik tot MCB in de vriezer) |
- | 50 mg/mL | 100 μg/mL |
| SB202190 (P38 INH) | Dmso | 30 mM | 10 μM |
Aanvullende tabel 1: recept voor organoïde expansie medium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier bieden we een protocol om LD-vorming in humane intestinale organoïden te bepalen bij incubatie met oliezuur. Deze methode is gebaseerd op de LD-specifieke fluorescerende kleurstof LD54018, die de karakterisering en kwantificering van het totale volume van lipide druppeltjes binnen een organoïde cultuur mogelijk maakt. De procedures voor het vaststellen en handhaven van humane intestinale organoïde culturen zijn gepubliceerd vóór13, en een visuele gids van dit protocol is ook beschikbaar15.
De cruciale stappen in dit protocol zijn de cultuur van menselijke intestinale organoïden, en de juiste conjugatie van OA aan BSA. De cultuur van organoïden vereist een correcte formulering van het kweekmedium, omdat het behoud van een stamcel populatie sterk afhankelijk is van de functionele Wnt3A-CM. Wanneer Wnt3A-CM in-House wordt gemaakt, raden we een zeer gestandaardiseerde workflow en de maandelijkse productie van geconditioneerd medium aan vanwege de verlooptijd van ongeveer 2 maanden. Bovendien resulteert 1:1 vermenging van opeenvolgende Wnt3A-CM batches in een meer constante lange termijn cultuur, omdat hierdoor een licht suboptimale batch geen grote invloed heeft op de organoïde groei.
Daarnaast bestaat onze BM uit Advanced DMEM/F12 medium, dat lipide-rijke BSA bevat. Aangezien onze voertuigcontrole (12% BSA/BM) geen LD-vorming in organoïden induceert, concluderen we dat de hoeveelheid of het type FFA in BM niet voldoende is om de LDF-test te beïnvloeden.
De conjugatie van OA aan BSA is een delicaat proces dat enige optimalisatie kan vereisen. We hebben ervaren dat het hier beschreven protocol het meest optimaal is wanneer alle temperatuurveranderingen nauwgezet en bij gebruik met glas labware worden opgevolgd.
In eerdere onderzoeken zijn LD Formation assays gebruikt om ld-grootte en-nummer te karakteriseren met een hoge vergroting van8,12. Deze assays werden meestal uitgevoerd met behulp van boor-dipyrrometheen (BODIPY) 493/503, die een uitstekende kleuring voor LDs met een hoge signaal-ruis verhouding biedt. Het emissiespectrum van BODIPY is echter vrij breed en overlapt grotendeels met het fluorescerende spectrum van groene fluorescerende eiwitten (GFP)-afgeleide kleurstoffen. Hoewel we verwachten dat de huidige toepassing van de LDF-assay ook met BODIPY zou werken, biedt de keuze voor LD540 een breder scala aan Multicolor afbeeldingen, waaronder co-kleuring met GFP-labels18. We hebben deze assay ook uitgevoerd met behulp van het lipide-rode Nijl rood (gegevens niet weergegeven). Echter, omdat Nile Red de neiging heeft om niet alleen LDs te vlekken, maar ook lipide-bilayers, ontdekten we dat het hogere achtergrond signaal van Nijl rood de capaciteit van onze assay verlaagt om kleine verschillen van LD-vorming te onderscheiden. Om deze redenen gebruiken we LD540 liever in een op organoïde gebaseerde LDF-test.
Vergeleken met eerdere studies met een hoge vergrotingsfactor LDF assays, maakt de assay die we hier beschrijven een hoge doorvoer kwantatie van het totale LD-volume in een grote populatie cellen mogelijk. Daarom, met name de fluorescerende plaat lezer kwantatie, en mogelijk de Flow cytometrische analyse, kan worden geschaald voor het testen van het effect van drugs op LD-vorming. Zoals we hebben laten zien dat LD-vorming grotendeels DGAT1 afhankelijk is, vormen DGAT1-deficiënte, met de patiënt afgeleide of D1i behandelde organoïden een duidelijke kans voor de toepassing van een dergelijke screening. Vooral voor dergelijke zeldzame voorkomende ziekten kan de LDF-test gecombineerd met patiënt-afgeleide organoïden een platform bieden voor patiëntspecifieke screening op nieuwe therapeutische geneesmiddelen.
Een gevolg van een aanpak met hoge doorvoer is echter dat de bevoegdheid om individuele LDs te karakteriseren, verloren gaat. Hoewel een hoge vergroting van elektronen microscopische of fluorescerende visualisatie van LDS kan worden gebruikt om de dynamiek in LD-formaat en nummer12,19te bestuderen, maakt de benadering met hoge doorvoer geen onderscheid tussen meerdere kleine of minder grote LDs en kan daarom niet worden gebruikt om de verschillen in LD-metabolisme te kwantificeren waar het totale volume van LDs constant blijft. In toepassingen waarbij het aantal of de grootte van de LDs vermoedelijk van belang is, moet dit daarom worden aangepakt met een lagere doorvoer, een hogere vergrotings methode. Bovendien krijgen de organoïden in de huidige assay basolaterale lipide stimulatie terwijl dieet lipiden meestal worden ingenomen bij het apicale membraan. Er is dus enige voorzichtigheid geboden als de resultaten moeten worden vertaald naar de fysiologische situatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken B. Spee voor het royaal verstrekken van LD540. Dit werk werd gesteund door een Nederlandse organisatie voor wetenschappelijk onderzoek subsidie (NWO-ZonMW; VIDI 016.146.353) naar S.M.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-028 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Basement membrane matrix (matrigel) | BD Biosciences | 356231 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | |
| DGAT1 inhibitor (AZD 3988) | Tocris Bioscience | 4837/10 | |
| Fatty acid free BSA | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| Formaldehyde | Klinipath | 4078-9001 | |
| Glutamin (GlutaMAX, 100x) | Gibco | 15630-056 | |
| HEPES (1 M) | Gibco | 15630-080 | |
| Laser scanning confocal microscope | Leica | SP8X | |
| LD540 | kindly provided by Dr. B. Spee, Utrecht University | ||
| mEGF | Peprotech | 315-09_500ug | |
| N-acetyl cysteine | Sigma-Aldrich | A9165-100G | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-500G | |
| Noggin producing cells (HEK293-mNoggin-Fc cells) | MTA with J. den Hertog, Hubrecht Institute | ||
| Oleic acid | Sigma-Aldrich | O1008-5G | |
| p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190) | Sigma-Aldrich | S7067-25MG | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8662-500ML | |
| PBS without Ca2+/Mg2+ | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
| Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL) | Gibco | 15070-063 | |
| R-spondin producing cells (Cultrex HA-R-Spondin1-Fc 293T Cells) | R&D systems | 3710-001-01 | |
| TC-treated 24 well plates | Greiner-One | 662160 | |
| TC-treated black clear-bottom 96 well plates | Corning Life Sciences | 353219 | |
| TGFb type I receptor inhibitor (A83-01) | Tocris Bioscience | 2939/10 | |
| Trypsin (TrypLE Express) | Life Technologies | 12604021 | |
| WNT-3A producing cells (L-Wnt-3A cells) | MTA with J. den Hertog, Hubrecht Institute | ||
| Y-27632 dihydrochloride (Rho kinase inhibitor) | Abcam | ab120129-10 |
References
- Yen, C. L. E., Nelson, D. W., Yen, M. I. Intestinal triacylglycerol synthesis in fat absorption and systemic energy metabolism. Journal of Lipid Research. 56 (3), 489-501 (2015).
- Yen, C. L. E., Stone, S. J., Koliwad, S., Harris, C., Farese, R. V. Thematic review series: glycerolipids. DGAT enzymes and triacylglycerol biosynthesis. Journal of Lipid Research. 49 (11), 2283-2301 (2008).
- D'Aquila, T., Hung, Y. H., Carreiro, A., Buhman, K. K. Recent discoveries on absorption of dietary fat: Presence, synthesis, and metabolism of cytoplasmic lipid droplets within enterocytes. Biochimica et Biophysica Acta. 1861 (8 Pt A), 730-747 (2016).
- Chavez-Jauregui, R. N., Mattes, R. D., Parks, E. J. Dynamics of fat absorption and effect of sham feeding on postprandial lipema. Gastroenterology. 139 (5), 1538-1548 (2010).
- Chitraju, C., et al. Triglyceride Synthesis by DGAT1 Protects Adipocytes from Lipid-Induced ER Stress during Lipolysis. Cell Metabolism. 26 (2), 407-418 (2017).
- van Rijn, J. M., et al. Intestinal failure and aberrant lipid metabolism in patients with DGAT1 deficiency. Gastroenterology. 1, 130-143 (2018).
- Haas, J. T., et al. DGAT1 mutation is linked to a congenital diarrheal disorder. Journal of Clinical Investigation. 122 (12), 4680-4684 (2012).
- Gluchowski, N. L., et al. Identification and characterization of a novel DGAT1 missense mutation associated with congenital diarrhea. Journal of Lipid Research. 58 (6), 1230-1237 (2017).
- Ratchford, T. L., Kirby, A. J., Pinz, H., Patel, D. R. Congenital Diarrhea From DGAT1 Mutation Leading to Electrolyte Derangements, Protein-losing Enteropathy, and Rickets. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 66 (3), e82-e83 (2018).
- Stephen, J., et al. Congenital protein losing enteropathy: an inborn error of lipid metabolism due to DGAT1 mutations. European Journal of Human Genetics. 24 (9), 1268-1273 (2016).
- Schlegel, C., et al. Reversible deficits in apical transporter trafficking associated with deficiency in diacylglycerol acyltransferase. Traffic (Copenhagen, Denmark). 19 (11), 879-892 (2018).
- Wilfling, F., et al. Triacylglycerol synthesis enzymes mediate lipid droplet growth by relocalizing from the ER to lipid droplets. Developmental Cell. 24 (4), 384-399 (2013).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Middendorp, S., et al. Adult stem cells in the small intestine are intrinsically programmed with their location-specific function. Stem Cells. 32 (5), 1083-1091 (2014).
- Boj, S. F., et al. Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients. Journal of Visualized Experiments. (120), e55159 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
- Spandl, J., White, D. J., Peychl, J., Thiele, C. Live cell multicolor imaging of lipid droplets with a new dye, LD540. Traffic. 10 (11), 1579-1584 (2009).
- Hung, Y. H., Carreiro, A. L., Buhman, K. K. Dgat1 and Dgat2 regulate enterocyte triacylglycerol distribution and alter proteins associated with cytoplasmic lipid droplets in response to dietary fat. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (6), 600-614 (2017).
