Summary
このプロトコルは、脂肪酸による刺激時のヒト腸内オルガノイドにおける脂質液滴(LD)形成の特性評価に関するアッセイについて説明する。このアッセイがLD形成の定量にどのように使用され、LD形成に影響を与える薬剤の高スループットスクリーニングにどのように使用できるかについて議論する。
Abstract
食物脂質は、腸上皮によって遊離脂肪酸(FA)として取り上げられる。これらのFは、リンパへの輸送のためにキロミクロンに、または細胞内貯蔵のための細胞内貯蔵のための細胞内脂質液滴(LD)にパッケージ化される前に、細胞内トリグリセリド(TG)分子に変換されます。LDの形成のための重要なステップは、TG合成の最終ステップにおけるジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ(DGAT)の触媒活性である。LDは、有毒な脂質種をバッファーに入れ、異なる細胞タイプの細胞代謝を調節するために重要です。ヒト腸上皮は定期的に高濃度の脂質に直面しているので、LD形成は恒常性を調節することが非常に重要である。ここでは、ヒト腸内オルガノイドにおける最も一般的な不飽和脂肪酸、オレイン酸による刺激時のLD形成(LDF)の特徴付けと定量のための簡単なアッセイについて述べた。LDFアッセイはLD特異的蛍光色素LD540に基づいており、共焦点顕微鏡、蛍光板リーダー、またはフローサイトメトリーによるLDの定量を可能にします。LDFアッセイは、ヒト腸上皮細胞におけるLD形成を特徴付けたり、DGAT1欠乏症などのLD代謝に影響を与えるヒト(遺伝的)障害を研究するために使用することができる。さらに、このアッセイは、腸または他のタイプのオルガノイドにおけるLD形成の欠陥を復元する新規治療化合物を試験するためのハイスループットパイプラインで使用することもできる。
Introduction
脂質は、人間の食事の重要なコンポーネントであり、全身エネルギー貯蔵と代謝に重要な役割を果たしています。摂取すると、食物脂質は膵リパシスによって遊離脂肪酸(FFA)およびモノグリセリド(MG)に分解される。これらの基質は腸上皮の腸細胞によって取り込まれ、そこで最初にモノグリセリドアシルトランスフェラーゼ(MGAT)酵素によってジグリセリド(DG)に再エステル化され、次にジアシルグリセロールによってトリグリセリド(TG)に再エステル化される。アシルトランスフェラーゼ 1 (DGAT1)1.最後に、これらのTGは、リンパ系へのエクスポート用のチロミクロンまたは細胞内貯蔵用の細胞系脂質液滴(LD)のいずれかに統合され、細胞内貯蔵2、3。他の臓器に食物脂質を分配するにはチロミクロンが必要ですが、LDs中の細胞内脂肪貯蔵の重要性は完全には明らかではありません。しかし、腸内で調節機能を果たすように、腸内で調節機能を果たさなければ、食事4の後に脂質をゆっくりと16時間まで循環させることが示されている。さらに、LDは、脂肪分解条件5の間にマウス脂肪細胞のような有毒な脂肪酸濃度から保護することが示されている。
DGAT1タンパク質は、小プスミック網膜(ER)膜上に位置し、腸上皮におけるLD形成において重要な役割を果たしている。DGAT1におけるホモ接合突然変異は、早期発症の重度の下痢および/または嘔吐、低アルブミン血症、および/または(致命的な)脂肪摂取時の腸障害を伴うタンパク質失態性腸障害を引き起こし、ヒトの脂質恒常性におけるDGAT1の重要性を示す。腸上皮6,7,8,9,10.ヒトにおけるDGAT1欠乏症の発生はまれであるため、一次患者由来細胞へのアクセスは乏しい。さらに、腸上皮細胞の長期培養は、通常の生理学を表す腫瘍由来細胞株に限られた延長に限定されてきた。従って、DGAT1媒介性LD形成は、主に線維芽細胞または動物由来細胞株7、10、11、12で研究されている。このように、最近では、DGAT1欠損症患者由来線維芽細胞は、オレイン酸(OA)8による刺激後の健康な対照細胞と比較して、より少ないLDsを蓄積することが示された。
以前は、任意の消化器官から上皮幹細胞を3次元(3D)オルガノイド13の形で培養するプロトコルが確立されていた。これらの腸内オルガノイドは、長期間培養中に保たれ、患者および腸の位置特異的上皮特性14の機能的研究を可能にする。それらは遺伝的およびフェノ典型的に安定しており、保存することができ、長期的な拡張およびバイオバンキング13を可能にする。
我々は最近、LD形成(LDF)アッセイ6においてヒト腸オルガノイドにおいてLD形成を容易に測定できることを実証した。16時間OAにさらされると、オルガノイドは脂質誘発毒性から細胞を保護するためにLDを生成する。OA濃度が高すぎると、カスパーゼ媒介性アポトーシス6によって細胞が死ぬ。LDFアッセイは、DGAT1変異型患者に由来するオルガノイドおよびDGAT1特異的阻害剤6の使用によって示されるDGAT1に大きく依存することが以前に示された。
ここで詳しく説明するLDFアッセイでは、3Dオルガノイドは腸生検から培養され、新しいオルガノイドを容易に形成する単一細胞に破壊によって毎週通過する。LDFアッセイを実行するために、約7,500個のオルガノイド由来単一細胞を24ウェルプレートの各ウェルにめっきされる。オルガノイドは、数日間にわたって形成され、1mM OAで一晩インキュベートし、LD540、イメージングを容易にする蛍光細胞透過性LD特異的色素で染色する。次いで、LD形成は、共焦点顕微鏡、蛍光板リーダー、またはフローサイトメトリーによって定量される。
このLD形成アッセイを96ウェル形式にスケーリングすることにより、このアッセイは、ヒト腸内オルガノイド培養におけるLD形成に影響を与える新規薬物のスクリーニング、または影響を及ぼす(ヒト遺伝的)障害の研究にLD形成のハイスループット分析にも使用できます。LD代謝。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
本明細書に記載のヒト組織を用いる全ての実験は、ユトレヒト大学医療センター(UMCU)の倫理委員会によって承認された。組織の採取、生成、貯蔵、およびオルガノイドの使用に関するインフォームドコンセントは、ヴィルヘルミナ小児病院(WKZ)-UMCUの患者から得られた。
1. 文化メディアの準備
注:このプロトコルは、バイオセーフティキャビネット内で実行する必要があります。オルガノイドは、標準的な細胞培養ガイドラインに従って処理する必要があります。
- 基底培養培地を調調す。
注:成長因子のない培養培地は、基底培地(BM)と呼ばれる。- HePES(1M)、L-グルタミン(100x)の5mL、ペニシリン連鎖マイシン(5,000U/mL)の5mLをハムの栄養混合物F-12を用いて500mLの高度なダルベッコ修飾イーグル培地に加え、BMを調製します。
- 調製したBM培地を4°Cに保存し、最大2ヶ月間使用します。
- 製造元のプロトコルに従ってR-スポンドインおよびノギン条件付き媒体(CM)を調製する。
- 簡単に言えば、フラスコ当たりの選択的抗生物質を含まない555mL培地中の5 x 107細胞を有するハイパーフラスコ中の所望の量に細胞を成長させる。
- 細胞をコンフルエントになるまで4日間成長させる。
- メディアを BM とカルチャに置き換え、さらに 8 日間使用します。
- 37°Cで8日間培養した後、残りの細胞をペレットに450 x gで5分間培地および遠心分離機を採取する。
- フィルターは上清を殺菌し、R-スポンドまたはノギンCMのアリコートを-20°Cで最大6ヶ月間保存します。
- Bojら15に従ってWnt3A-CMを準備します。
- 簡単に言えば、1皿あたりの選択的な抗生物質なしで20 mL培地で2 x 106細胞を持つ145ミリメートルの皿で所望の量に細胞を成長させる。培養剤の蒸発を避けるために、プラスチック箔で各皿を包みます。
- 37°Cで8日間培養した後、残りの細胞をペレットに450 x gで5分間培地および遠心分離機を採取する。
- フィルターは上清を殺菌し、Wnt3A-CMのアリコートを最大2ヶ月間4°Cに保存します。
- オルガノイド膨張培地を調調す。
注:ヒト小腸オルガノイド膨張培地(補足表1のレシピ参照)はhSI-EMと呼ばれる。次の手順では、最終的なボリュームは 1 L hSI-EM で、必要に応じてスケールアップまたはスケールダウンできます。- 1.46gのニコチンアミドを12mLの細胞培養グレードリン酸緩衝生理食液(PBS)に溶解し、1Mの最終希釈を作成する。
- 細胞培養グレードPBSの3mLに245mgのn-アセチルシステインを溶解し、500mMの最終希釈を作成する。
注:溶液の形成を加速するために、ニコチンアミドおよびn-アセチルシステインを37°Cの水浴中でインキュベートすることができる。両方の解決はバッチで調製し、引用符で囲まれ、将来の使用のために-20 °Cで貯えることができる。 - フィルターは、0.22 μm フィルターを介して両方の溶液を滅菌 15 mL チューブに殺菌します。
- 無菌500mL培地フラスコにBMの167mLを添加する。R-スポンディン-CMの200 mL、ノギンCMの100 mL、組換えmEGFの100 μL(500 μg/mL)を50ng/mLの最終濃度に加えます。
- 殺菌されたニコチンアミド溶液の10 mLと殺菌されたn-アセチルシステイン溶液の2.5 mLを加える。B27サプリメント(50x)の20 mLを追加します。
注:この段階では、培地はWASなしのhSI-EM(Wnt3A-CM、A83-01、およびSB202190)と呼ばれ、-20°Cでアリクォートおよび保存することができる。培地が小さな体積に引用符で囲まれた場合は、それに応じて次のステップの濃度を調整します。 - WAS なしの hSI-EM の 500 mL に、最後に新たに作成されたバッチの Wnt3A-CM の 10 mL と、Wnt3A-CM 条件の変動変化を最小限に抑えるために、2 番目の最後のバッチの Wnt3A-CM の 10 mL を追加します。
- A83-01 を 500 nM の最終濃度に、SB202190 を 10 μM の最終濃度に加えます。
- 準備したhSI-EM(WAS付き)を4°Cに保管し、最大2週間使用してください。
注:凍結保存から培養またはオルガノイドが開始される場合は、10 μM(hSI-EM+Yと呼ばれる)の最終濃度にY-27632を追加します。
- 蛍光活性化細胞選別(FACS)バッファーを調記する。
- 10% FCSの最終的な濃度のためのCa2+/Mg2+なしでPBSの40 mLに胎児ふくらはぎ血清(FCS)の10 mLを加える。
注:FCS は、セルがラボウェアに付着するのを防ぎます。
- 10% FCSの最終的な濃度のためのCa2+/Mg2+なしでPBSの40 mLに胎児ふくらはぎ血清(FCS)の10 mLを加える。
2. ヒト小腸オルガノイドの培養手順
注:このプロトコルは、バイオセーフティキャビネット内で実行する必要があります。オルガノイドは、標準的な細胞培養ガイドラインに従って処理する必要があります。オルガノイドやオルガノイド由来細胞を取り扱う場合は、可能な限り氷の上に細胞を保持する必要があります。細胞は、これが保証されたときに収穫後数時間生存したままになります。オルガノイドは、5%CO2で37°Cで標準的な細胞培養インキュベーターで培養する必要があります。これらの条件は、このプロトコル全体を通じて地下膜マトリックス(BMM;すなわち、マトリゲル)に埋め込まれたオルガノイドを持つすべてのインキュベーションステップに適用されます。著者らは、これらのアッセイに十二指腸由来オルガノイドを使用している。
- パスエイジングオルガノイド
メモ:すべてのオルガノイド培養は、独自の倍増時間を持っています。通常、小腸オルガノイドは7−10日ごとに1:3−1:5を通過させることができる。単一細胞として通過した場合、通過効率は細胞密度に応じて最大1:20にすることができます。確立および維持のために、オルガノイドは24ウェルプレートで培養される;LDFアッセイの場合は、24ウェルまたは96ウェルプレートのいずれかです。- 準備
- 37°Cでインキュベーターで予め暖め開梱された24ウェル組織培養プレート、少なくとも一晩で5%CO2、好ましくは5日前に。
注:細胞培養インキュベーターにおける組織培養プレートを事前に温め、BMMのオルガノイド含有液滴の適切な形成および付着を保証する。 - 凍結解凍サイクルの数を減らすために、BMMの1 mLアリコートを準備し、-20 °Cで保存します。オルガノイド通過手順を開始する前に、少なくとも30分氷上のBMMのバイアルを解凍する。
- BMの50mLチューブを洗浄媒体として氷の上に保管してください。
- セクション1.4に記載されているhSI-EMを調製し、フル24ウェルプレート用に15mLなど、適切な量のhSI-EM+Yを調製する。
- 37°Cでインキュベーターで予め暖め開梱された24ウェル組織培養プレート、少なくとも一晩で5%CO2、好ましくは5日前に。
- オルガノイドを集める。
- BMMの液滴を邪魔することなく培養培地を注意深く吸引する。
- オルガノイドの最初の井戸に500 μLの冷たいBMを加え、P1000ピペでゆっくりと上下にピペでBMM液滴をオルガノイドで破壊する。
- この手順は、必要に応じて次の培地で同じ培地で繰り返しますが、BMの500 μLあたり2ウェル以上を収穫しないでください。
- 低結合1.5 mLマイクロ遠心分離管でオルガノイドを収集し、15−20秒(最大2,000 x g)のミニ卓上遠心分離機でスピンダウンします。上清を完全に吸引し、P200ピペで媒体の最後のビットを削除します。
注:オルガノイド培養物が顕微鏡下できれいに見え、死んだ細胞や他の破片が含まれていない場合、BMM滴はステップ2.1.2.2のBMの代わりにトリプシンで直接収穫することができる。ステップ 2.1.2.3 の後、ステップ 2.1.3.1 でインキュベーションに直接進みます。
- オルガノイドを単一細胞に解離する。
- スピンダウンオルガノイドに400 μLのトリプシンを加えます。水風呂で5分間37°Cでオルガノイドをインキュベートします。
- P200ピペでゆっくりと上下にピペを打ち上げて、セルの残りの凝集体を破壊します。繰り返しになりますが、水風呂で5分間37°Cでオルガノイドをインキュベートします。
- 4倍倍率で顕微鏡下での細胞解離の進行状況を確認します。細胞の大きな塊が残っている場合は、手動の破壊とインキュベーションを繰り返します。
- 単一の細胞だけが残っている場合は、BMの1 mLを追加し、15−20秒のミニ卓上遠心分離機で細胞をスピンダウンします。
- 上清を完全に吸引する。P200ピペを使用して、新鮮なhSI-EMの200 μLの単一細胞を再中断します。hSI-EM のさらに 800 μL を追加します。
- 懸濁液中のセル数をカウントします。
注:著者の研究室では、解離されたオルガノイド細胞の手動カウントは、自動化された細胞カウンターよりも信頼性の高い結果をもたらします。自動化された細胞カウンタを使用する場合、下流アプリケーションの細胞密度を社内でテストし、オルガノイドが少なすぎたり多すぎたりした場合に調整する必要があります。
- 維持または脂質液滴形成アッセイのための種子オルガノイド。
- 最終的なセル密度に必要なセルの体積を計算します。
注:約250セル/μLが適正な密度です。24ウェルプレートでは、30μLが各ウェルに播種され、5μLが96ウェルプレートの各ウェルに播種されます。 - 適切な懸濁液の体積を取り出し、密度を750セル/μLに調整します(または密度が低すぎる場合はスピンダウンして再懸濁します)。
- 2:1の比率で細胞懸濁液にBMMを追加します。この混合物の最終的な細胞密度は250細胞/μLである。
- あらかじめ温められた組織培養プレートで、24ウェルプレートまたは96ウェルプレートでウェル当たり10μL滴を1個3個、またはウェル当たり1μL滴を1個にシードします。
- プレートを37°Cのインキュベーターに入れ、5%CO2を10~15分間固め、BMM液滴を固める。一方、37°Cの水浴中に適量のhSI-EM+Yを予温めます。
- 24ウェルプレートの各ウェルに500 μLの予め温められたhSI-EM+Yを慎重に加え、96ウェルプレートの各ウェルに100 μLを加えます。37°C、5%CO2で細胞をインキュベートし、2−3日後に培地をhSI-EM(Yなし)に変更し、週に2−3回リフレッシュする。
注:7−10日後、オルガノイドの維持培養物を再び通過する必要があります。
- 最終的なセル密度に必要なセルの体積を計算します。
- 準備
3. 脂質滴形成アッセイ
- オレイン酸コンジュゲートの調製
注:オレイン酸(OA)は疎水性であり、水に溶けないため、ウシ血清アルブミン(BSA)に結合される。BSAは、複数の脂肪酸分子を結合することができ、この場合、腸細胞にオレイン酸をアクセス可能にするために1:8比で使用されます。遊離脂肪酸とBSAは、両方ともプラスチックラボウェアに結合することができます。適切な最終濃度を確保するには、可能な限りガラスバイアルとガラスピペを使用してください。- 室温で液体オレイン酸の0.2gの重量を量る。培養グレードの無菌PBSを1.5mL加え、混合物を70°Cに1時間断続的に加熱します。
- 脂肪酸フリーBSAの5.89gの重量を量り、PBSの33.9 mLに溶解する。BSAが完全に溶解するまで、37°Cで水浴中の混合物を温めます。
- OA混合物を再び渦にして微細な液滴のエマルションを作成し、すぐにガラスピペを使用してBSA溶液に追加します。OAを追加した後、最終的な溶液を37 °Cに近い状態にしておきます。最終的な混合物は2.5 mM BSAの20 mM OAから成っている。
- 透明な黄色がかった溶液が残るまで30分間37°Cで混合物を保ちます。
- OA-BSAコンジュゲートは、少なくとも6ヶ月間-20°Cでアリクォートおよび凍結することができる。アリコートを解凍した後、曇りが溶け、混合物が再び透明になるまで37°Cでインキュベートします。
注:最終溶液の高タンパク質および脂質含有量のために、混合物は殺菌またはオートクレーブを濾過することができない。成分を注意して取り扱った場合、可能な場合は層流フードで、無菌PBSを使用して、著者は微生物感染を経験しなかった。
- LDF共焦点アッセイ
- サンプル調製
- セクション2.1に記載されている通路オルガノイド。オルガノイド由来単細胞を黒いクリアボトム96ウェルプレートに種をまきます。
- hSI-EM上の培養物の6日目に、1mM OA-BSAコンジュゲートを含むhSI-EMで培養培地を置き換える。
- 0.1 μM DGAT1阻害剤の有無に37°Cで16~17h(一晩)の細胞をインキュベートします。2.5 mM BSA の車両制御を含めます。
- 16−17h後、BMM液滴を乱すことなく培地を吸引する。室温で30分間、ウェルに4%中性緩衝ホルムアルデヒドの100μLを加えてオルガノイドを固定します。
注:ホルムアルデヒドはBMMを部分的に溶解し、オルガノイドは底部に沈み、プレートの底部に付着する。 - ホルムアルデヒドをやさしく取り出し、150μLのPBSで井戸を注意深く洗います。
- 0.025 mg/mL LD540 および 4',6-diamidino-2-フェニリンドール (DAPI) を使用して LD の細胞を暗くし、暗闇の中で室温で 15 分間染色します。
- PBSで注意深く井戸を洗います。
注:プロトコルは、必要に応じてここで一時停止できます。PBSで覆われたサンプルを暗闇の中で4°Cに保ちます。LD540染色は1週間まで安定したままになります。このアッセイはまた、生細胞と共に行うことができ、一定期間にわたってLD形成を監視する。このためには、固定をプロトコルから省略する必要があり、DAPIを Hoechst 染色に置き換える必要があります。LD540は、記載と同じ濃度で生細胞中のLDを染色することができる。
- 共焦点イメージング
注:撮像は、黒いクリアボトム96ウェルプレートで調製されたオルガノイドサンプルに対して行うことができる。- オルガノイド全体の概要画像については、共焦点蛍光イメージングに適した40倍の目的を使用してください。
- 405 nm励起およびca.410−535 nm放射波長でDAPIチャネルをイメージするように顕微鏡を設定する。LD540色素の場合は、540nm(543nmが最適)の励起レーザーを選択し、発光フィルタを545−700nmに設定します。
注:このプロトコルでは、白色光レーザー、アオスト光ビームスプリッタ(AOBS)、10x/20x目的、およびスペクトル検出システムを用いてレーザー走査共焦点システムを使用した。これにより、特定の波長に正確にチューニングできます。同等のシステムが利用できない場合は、上記の仕様に近いレーザーラインとショート/ロングパスフィルタを選択します。オルガノイド全体イメージングでは、下流の画像解析には 512 x 512 または 1024 x 1024 の解像度で十分です。 - 十分な Z 軸解像度のために、ピンホール サイズを 1 風通しの良いユニット (AU) に設定します。
- 球状オルガノイドの半分を画像化するには、Zスタックを約85μmに設定します。
- 画像解析
注:画像解析では、フィジー/ImageJ16,17を使用して最大投影を生成しました。分析は、最大投影、手動しきい値、およびパーティクル解析を可能にする任意の画像解析ソフトウェアパッケージで実行できます。- フィジー/ImageJを使用して、各オルガノイドのZスタックを最大投影に変換する: Image |スタック|Z プロジェクト.
- BSA車両制御サンプルに表示されるLD540信号がないレベルに最大投影のしきい値を設定する: Image |調整|しきい値:各イメージをしきい値にするには、これらの設定を使用します。
- 機能分析を使用して、各最大投影の蛍光の総面積を測定 |パーティクルを分析します。
注:アッセイ分解能は共焦点顕微鏡を用いる方が良いが、このアッセイは同様のフィルターを用いて蛍光プレートリーダーを用いて分析することもできる。ウェル当たりのオルガノイド数を正規化するには、LD540信号をDAPI信号で割る必要があります。最後に、測定値を正規化するために、BSA車両制御の信号を減算する必要があります。このアプローチにより、アッセイを96ウェルプレートフォーマットに向かってスケーリングできます。
- サンプル調製
- LDFフローサイトメトリックアッセイ
- サンプル調製
- セクション2.1に記載されている通路オルガノイド。オルガノイド由来単一細胞を24ウェル組織培養プレートに種をまく。条件ごとに2つの井戸は流れ細胞メトリーのために十分である。
- hSI-EM上の培養物の10日目に、1mM OA-BSAコンジュゲートを含むhSI-EMで培養培地を置き換える。
注:共焦点分析とは対照的に、EMにおける10日間の成長は、6日間ではなくフローサイトメトリーアッセイに選択された。余分な4日間の拡張は、顕微鏡ベースのアッセイを複雑にする光学的に重複するオルガノイドをもたらす。しかし、細胞の数が多いほど、フローサイトメトリー分析が容易になります。 - 0.1 μM DGAT1阻害剤の有無に37°Cで16~17h(一晩)の細胞をインキュベートします。2.5 mM BSA の車両制御を含めます。
- 16−17 hの後、セクション2.1.2に記載されているオルガノイドを収集する。
- セクション2.1.3で説明されているように、オルガノイドを単一細胞に解離する。
注:厳密には必須ではありませんが、各サンプルのセル数を確認することをお勧めします。サンプルあたりの合計10,000セル数は、十分な分解能に必要な絶対最小値です。最適な結果を求めるには、ca. 50,000~100,000 セルを使用します。 - 15−20秒のミニ卓上遠心分離機でセルをスピンダウンします。
- 各サンプルを 0.025 mg/mL LD540 の 500 μL と 1 μg/mL の PBS で 15 分間、暗闇の室温で 15 分間染色します。
- 15−20秒のミニ卓上遠心分離機で細胞をスピンダウンし、PBSで3倍を洗浄します。
- 4%中性緩衝ホルムアルデヒドの500 μLで細胞を再定着させ、室温で15分間固定する。
- 細胞をスピンダウンし、FACSバッファで3倍を洗浄します。
- 細胞がチューブ壁に付着するのを防ぐためにFACSバッファーが付いている前すすりすりFACS管。
- 200 μLのFACSバッファーで細胞を再懸濁し、細胞懸濁液をリンス前のFACSチューブに移します。
- フローサイトメトリック解析
- ゲーティングパラメータを設定して、死んだセルとセルの束を除外します(代表的な結果セクションを参照)。
- 最終的なゲート集では、信頼性の高い結果を求めて少なくとも 10,000 個のセルを測定します。
注:この集団から、LD540の平均蛍光強度(MFI)と平均SSC-Aシグナルが共に、細胞当たりのLD形成の総体積の尺度を提供する。
- サンプル調製
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
LD形成の適切な分析のために、オルガノイドは、OAおよびその後の染色による刺激の前にあまりにも密に播種されるべきではない。オーバーラップオルガノイドが蛍光を妨げる可能性があるため、これは共焦点およびプレートリーダー読み出しにとって特に重要である。適切なオルガノイド播種密度(図1A)の一例と、オーバーラップオルガノイドを有する培養物を示す(図1B)。OAによるサンプル刺激の変動を最小限に抑えるために、オルガノイドサイズとシード密度は、1回の実験内のサンプル間で同等である必要があります。これは、同じ数の単一のセルをシードアウトすることによって最適です。しかし、特定のオルガノイドラインが一貫して高い再構成効率を示し、したがって一貫して高いオルガノイド数を示す場合、いくつかの調整が必要になる場合があります。
一晩1mM OAで刺激した後、LD形成は反転された明視野顕微鏡で視覚化することができる。LDの蓄積は光を散乱させ、したがってオルガノイドは暗く見えるのに対し、非刺激性オルガノイドは半透明の外観を持つ(図1C)。明視野顕微鏡下で見られるLD形成の一例を図1Dに示す。この現象は、蛍光アッセイ読出前の実験条件を評価するために使用することができる。陽性対照サンプルが陰性対照試料よりも視覚的に暗くない場合、または広範な細胞死が明らかな場合、実験は破棄されるべきである。FFAは、より高い濃度の細胞に有毒であり、致命的な濃度は、FFAの種間で異なるように、LD形成を誘導する最適な亜致死濃度は、各アプリケーションのために電化されるべきです。
OA刺激オルガノイドがプロトコルに従って固定され、染色されると、LDFは共焦点顕微鏡を使用して視覚化することができる。オルガノイドは3D構造であるため、通常のエピ蛍光顕微鏡は焦点が合っていない背景信号のために適していません。そこで、オルガノイド中のLDFを特徴付けるために(aの最大投影)共焦点Zスタックを用いた。図2Aは、DGAT1阻害剤の有無にかかわらず処置した健良な対照オルガノイドにおけるLD染色の代表的な結果を示す。これらの画像の定量化は面倒ですが、共焦点解析は主にLD形成の異常をチェックする可視化ツールとして機能します。共焦点顕微鏡試料の定量化は、蛍光板リーダー(図2B)を用いて行うことができ、蛍光ホーチストシグナルに正規化される。プレートリーダーアッセイは、未処理オルガノイドと比較してDGAT1阻害剤(D1i)で処理されたオルガノイド細胞におけるLD540シグナルの有意な減少を示す。
個々の細胞におけるLD形成の定量化は、フローサイトメーターを用いて達成することができる。解離されたヒト腸オルガノイドに使用されるゲーティング戦略を図3Aに示す。FSC-A/SSC-Aプロットにおけるゲーティングの最初のステップは、単一細胞の「ライブ」(固定時)の最初の選択です。さらにダブレット、トリプレット、またはより大きな細胞束を除外するために、FSC-W/FSC-HおよびSSC-W/SSC-Hに2つの追加ゲーティングステップが含まれていました。最後に、FSC-A/Hoechstのゲーティングは、固定前に死んでいたか死んでいた細胞の除外を保証します。図3B,Cは、SSC-AおよびLD540シグナルの両方のヒストグラムを示す。LDFは、細胞内脂質液滴の形成に起因するSSC-Aの増加をもたらす。さらに、LDに格納されている脂質のLD540汚れとこの信号もLDF誘導時に増加します。このように、LD形成は、SSC-AおよびLD540の両方のMFIにおけるシフトとして測定される(図3D,E)。MFI をプロットし、統計分析を実行するために使用できます。
図1:明視野顕微鏡で可視化されたオルガノイド培養(A, B)共焦点および蛍光プレートリーダー法の場合、オルガノイドがBMM液滴中にあまりにも高密度で播種しないことが重要である。(A)オルガノイドは、250細胞/μL.(B)の適切な密度で播種され、高密度で播種され、オルガノイドと細胞死の重複を引き起こす。(C, D)OAによる一晩の刺激の後、LD形成を視覚的に評価することができる。(C)オルガノイドを12%BSA車両制御で一晩インキュベートした。(D)オルガノイドを一晩インキュベートし、1mM OAをBSAに結合させ、暗い外観をもたらした。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:共焦点イメージングと蛍光板リーダーを用いてのLDF特性解析の代表的な結果。健康な対照由来オルガノイドは、BSA、1mM OA、または1mM OA+D1iで一晩刺激された。(A)DAPI(シアン)およびLD540(黄色)に染色された85μmの共焦点スタックの最大投影。このサブフィギュアは、van Rijn et al.6.(B)蛍光板リーダーを用いて測定した核DAPI信号に正規化されたLD540の相対蛍光強度。平均±SDは、2つの生物学的反復についてプロットされる。統計的有意性は、Tukeyのポストホックで繰り返し測定することなく、一方通行の分散分析を使用して決定された。*, P < 0.05.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:フローサイトメトリーを用いたLDF定量の代表的な結果健康な対照由来オルガノイドは、BSA、1mM OA、または1mM OA+D1iで一晩刺激された。(A)オルガノイド由来単一細胞に対して選択するゲーティング戦略。左から右へ、まずFSC-A/SSC-Aのゲーティングでデブリを除外します。次に、FSC-W/FSC-H および SSC-W/SSC-H のゲートをオンにして、二重子、トリプレット、またはより大きな細胞の塊を除外します。最後に、FSC-A/Hoechstのゲートを使用して生細胞を選択する。SSC-AおよびLD540チャネルの両方がLD形成を定量するために使用される。これらのパラメータのヒストグラムは、OAによる刺激時の(B)SSC-Aおよび(C)LD540の平均蛍光強度(MFI)のシフトを示す。(D,E)サンプルごとのMFIはグラフでプロットし、統計分析を実行するために使用することができます。平均±SDは、3つの生物学的反復についてプロットされる。統計的有意性は、Tukeyのポストホックで繰り返し測定することなく、一方通行の分散分析を使用して決定された。*, P < 0.05;**, P < 0.01;、P < 0.001。この図は、van Rijn et al.6.この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 化学 | 溶媒 | ストック濃度 | 最終濃度 |
| Wnt3a CM | - | 100% | 50% |
| R-スポンディン-1 CM | - | 100% | 20% |
| ノギン CM | - | 100% | 10% |
| A83-01 (TGFβ-inh) | Dmso | 50 mM | 500 nM |
| B27 | - | 50倍 | 1x |
| mEGF | PBS/0.1% BSA | 500 μg/mL | 50 ng/mL |
| N-アセチル | 水 | 500 mM | 1.25 メートル |
| ニコチンアミド | Pbs | 1 M | 10 mM |
| プリモシン (MCBが冷凍庫に入るまで使用) |
- | 50 mg/mL | 100 μg/mL |
| SB202190 (P38 inh) | Dmso | 30 mM | 10 μM |
補足表1:オルガノイド膨張培地のレシピ。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ここでは、オレイン酸をインキュベーションする際にヒト腸内オルガノイドにおけるLD形成を決定するプロトコルを提供する。この方法は、LD特異的蛍光色素LD54018に基づいており、オルガノイド培養内の脂質液滴の総体積の特徴付けおよび定量を可能にする。ヒト腸内臓器培養を確立し維持するための手順は13より前に公表されており、このプロトコルの視覚的ガイドも15まで利用可能である。
このプロトコルの重要なステップは、ヒト腸オルガノイドの培養、およびBSAへのOAの適切な結合である。オルガノイドの培養は、幹細胞集団の維持が機能的Wnt3A-CMに大きく依存するため、培養培地の正しい製剤を必要とする。Wnt3A-CMを自社製にする場合は、約2ヶ月の有効期限のため、高度に標準化されたワークフローと条件付き媒体の月次生産をお勧めします。さらに、連続するWnt3A-CMバッチの1:1混合は、わずかに最適でないバッチがオルガノイドの成長に大きな影響を与えないことを保証するため、より一定の長期培養をもたらす。
さらに、当社のBMは、脂質が豊富なBSAを含む高度なDMEM/F12培地で構成されています。当社の車両制御(12%BSA/BM)はオルガノイド中のLD形成を誘導しないため、BM中のFFAの量またはタイプはLDFアッセイに影響を与えるには不十分であると結論付けます。
BSA への OA の結合は、いくつかの最適化を必要とするデリケートなプロセスです。我々は、すべての温度変化が細心の注意を払って、ガラスラボウェアを使用して実行する場合、ここで説明するプロトコルが最も最適であることを経験しました。
以前の研究では、LD形成アッセイは、高倍率8、12でLDサイズと数を特徴付けるために使用されてきました。これらのアッセイは、主にホウ素ジピルロメテイン(BODIPY)493/503を用いて行われ、信号対雑音比の高いLDに優れた染色を提供します。しかし、BODIPYの発光スペクトルは非常に広く、緑色蛍光タンパク質(GFP)由来染料の蛍光スペクトルと大きく重なる。LDFアッセイの現在の適用はBODIPYでも動作すると予想されますが、LD540の選択により、GFPラベル18との共染色を含む、より広い範囲の多色画像が可能になります。また、脂質汚れをナイルレッド(データは示さない)を用いてこのアッセイを行った。しかし、ナイルレッドはLDだけでなく脂質二層層も染色する傾向があるため、ナイルレッドの背景信号が高いほど、LD形成の小さな違いを区別するためにアッセイの容量が低下することがわかりました。これらの理由から、我々はオルガノイドベースのLDFアッセイでLD540を使用することを好む。
高倍率LDFアッセイを用いた以前の研究と比較して、ここで説明するアッセイは、細胞の大規模な集団における総LD体積の高スループット定量を可能にする。したがって、特に蛍光板リーダー定量、および潜在的にフローサイトメトリック分析は、LD形成に対する薬物の効果を試験するためにスケーリングすることができる。我々は、LD形成が主にDGAT1依存性であることを示したように、DGAT1欠損患者由来またはD1i処理オルガノイドは、そのようなスクリーニングの適用のための明確な機会を表す。特にこのような稀な疾患の場合、患者由来のオルガノイドと組み合わせたLDFアッセイは、新しい治療薬に対する患者特異的スクリーニングのプラットフォームを提供できる。
ただし、ハイスループットアプローチの結果、個々の LD を特徴付ける力が失われます。LDの高倍率電子顕微鏡または蛍光可視化は、LDサイズと12番、19番のダイナミクスを研究するために使用できますが、ハイスループットアプローチは複数の小さいか以下を区別しません。したがって、LDの総体積が一定のままであるLD代謝の違いを定量化するために使用することはできません。したがって、LDの数またはサイズが関心があると思われるアプリケーションでは、これは低スループット、より高い倍率技術で対処する必要があります。さらに、現在のアッセイ中のオルガノイドは、食物脂質が通常頂点膜で取り込まれる間、側側側脂質刺激を受ける。したがって、結果を生理的状況に翻訳する場合は、いくつかの注意が必要です。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
LD540を惜しまなく提供してくださったB.Speeに感謝します。この研究は、オランダ科学研究機構(NWO-ZonMW;VIDI 016.146.353) から S.M.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-028 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
| Basement membrane matrix (matrigel) | BD Biosciences | 356231 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | |
| DGAT1 inhibitor (AZD 3988) | Tocris Bioscience | 4837/10 | |
| Fatty acid free BSA | Sigma-Aldrich | A7030 | |
| Formaldehyde | Klinipath | 4078-9001 | |
| Glutamin (GlutaMAX, 100x) | Gibco | 15630-056 | |
| HEPES (1 M) | Gibco | 15630-080 | |
| Laser scanning confocal microscope | Leica | SP8X | |
| LD540 | kindly provided by Dr. B. Spee, Utrecht University | ||
| mEGF | Peprotech | 315-09_500ug | |
| N-acetyl cysteine | Sigma-Aldrich | A9165-100G | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636-500G | |
| Noggin producing cells (HEK293-mNoggin-Fc cells) | MTA with J. den Hertog, Hubrecht Institute | ||
| Oleic acid | Sigma-Aldrich | O1008-5G | |
| p38 MAPK inhibitor (p38i) (SB202190) | Sigma-Aldrich | S7067-25MG | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8662-500ML | |
| PBS without Ca2+/Mg2+ | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
| Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL) | Gibco | 15070-063 | |
| R-spondin producing cells (Cultrex HA-R-Spondin1-Fc 293T Cells) | R&D systems | 3710-001-01 | |
| TC-treated 24 well plates | Greiner-One | 662160 | |
| TC-treated black clear-bottom 96 well plates | Corning Life Sciences | 353219 | |
| TGFb type I receptor inhibitor (A83-01) | Tocris Bioscience | 2939/10 | |
| Trypsin (TrypLE Express) | Life Technologies | 12604021 | |
| WNT-3A producing cells (L-Wnt-3A cells) | MTA with J. den Hertog, Hubrecht Institute | ||
| Y-27632 dihydrochloride (Rho kinase inhibitor) | Abcam | ab120129-10 |
References
- Yen, C. L. E., Nelson, D. W., Yen, M. I. Intestinal triacylglycerol synthesis in fat absorption and systemic energy metabolism. Journal of Lipid Research. 56 (3), 489-501 (2015).
- Yen, C. L. E., Stone, S. J., Koliwad, S., Harris, C., Farese, R. V. Thematic review series: glycerolipids. DGAT enzymes and triacylglycerol biosynthesis. Journal of Lipid Research. 49 (11), 2283-2301 (2008).
- D'Aquila, T., Hung, Y. H., Carreiro, A., Buhman, K. K. Recent discoveries on absorption of dietary fat: Presence, synthesis, and metabolism of cytoplasmic lipid droplets within enterocytes. Biochimica et Biophysica Acta. 1861 (8 Pt A), 730-747 (2016).
- Chavez-Jauregui, R. N., Mattes, R. D., Parks, E. J. Dynamics of fat absorption and effect of sham feeding on postprandial lipema. Gastroenterology. 139 (5), 1538-1548 (2010).
- Chitraju, C., et al. Triglyceride Synthesis by DGAT1 Protects Adipocytes from Lipid-Induced ER Stress during Lipolysis. Cell Metabolism. 26 (2), 407-418 (2017).
- van Rijn, J. M., et al. Intestinal failure and aberrant lipid metabolism in patients with DGAT1 deficiency. Gastroenterology. 1, 130-143 (2018).
- Haas, J. T., et al. DGAT1 mutation is linked to a congenital diarrheal disorder. Journal of Clinical Investigation. 122 (12), 4680-4684 (2012).
- Gluchowski, N. L., et al. Identification and characterization of a novel DGAT1 missense mutation associated with congenital diarrhea. Journal of Lipid Research. 58 (6), 1230-1237 (2017).
- Ratchford, T. L., Kirby, A. J., Pinz, H., Patel, D. R. Congenital Diarrhea From DGAT1 Mutation Leading to Electrolyte Derangements, Protein-losing Enteropathy, and Rickets. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 66 (3), e82-e83 (2018).
- Stephen, J., et al. Congenital protein losing enteropathy: an inborn error of lipid metabolism due to DGAT1 mutations. European Journal of Human Genetics. 24 (9), 1268-1273 (2016).
- Schlegel, C., et al. Reversible deficits in apical transporter trafficking associated with deficiency in diacylglycerol acyltransferase. Traffic (Copenhagen, Denmark). 19 (11), 879-892 (2018).
- Wilfling, F., et al. Triacylglycerol synthesis enzymes mediate lipid droplet growth by relocalizing from the ER to lipid droplets. Developmental Cell. 24 (4), 384-399 (2013).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Middendorp, S., et al. Adult stem cells in the small intestine are intrinsically programmed with their location-specific function. Stem Cells. 32 (5), 1083-1091 (2014).
- Boj, S. F., et al. Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients. Journal of Visualized Experiments. (120), e55159 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
- Spandl, J., White, D. J., Peychl, J., Thiele, C. Live cell multicolor imaging of lipid droplets with a new dye, LD540. Traffic. 10 (11), 1579-1584 (2009).
- Hung, Y. H., Carreiro, A. L., Buhman, K. K. Dgat1 and Dgat2 regulate enterocyte triacylglycerol distribution and alter proteins associated with cytoplasmic lipid droplets in response to dietary fat. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1862 (6), 600-614 (2017).
