Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biochemistry

Medellång förberedelse för odling av mikroorganismer under strängt anaeroba/syrefria förhållanden

doi: 10.3791/60155 Published: August 15, 2019
* These authors contributed equally

Summary

Eftersom obligate anaeroba organismer inte kan växa på syre exponering, användning av anaerob odlingstekniker är oumbärlig. Här visar vi en enkel och effektiv metod för att odla en blandad kultur som härstammar från en biogasanläggning från media beredning till gas och flyktiga fettsyror kvantifiering.

Abstract

I motsats till aeroba organismer, strikt anaeroba mikroorganismer kräver frånvaro av syre och oftast en låg redox potential att initiera tillväxt. Eftersom syre är allmänt förekommande i luften, behålla O2-fria förhållanden under alla odlings steg är utmanande men en förutsättning för anaerob odling. Det protokoll som presenteras här visar på en lyckad odling av en anaerob blandad kultur som härstammar från en biogasanläggning med en enkel och billig metod. En exakt beskrivning av hela anoxiska odlingsprocessen ges inklusive media beredning, fyllning av odlingsflaskor, tillskott med redox indikator och reducerande medel för att ge låga redoxpotentialer samt utbyte av headspace att hålla medier fria från syre. Dessutom ges en detaljerad översikt över aseptiskt inokulerande gas täta serum flaskor (med användning av sterila sprutor och nålar) och lämpliga inkubationsförhållanden. I detta protokoll behandlar man även gas-och vätske provtagning för efterföljande analyser avseende gassammansättning och flyktiga fett syrgaskoncentrationer med gaskromatografi (GC) och vätskekromatografi (HPLC) med hög prestanda respektive beräkning av biogas-och metanavkastning med tanke på den ideala gas lagstiftningen.

Introduction

På jorden molekyl syre i betydande koncentrationer finns i områden som har direkt kontakt med atmosfären eller i närvaro av syrerik phototrophs. Miljöer där syre är frånvarande kallas anaerob. Dock är energiomvandling fortfarande möjligt under anaeroba förhållanden via två olika metaboliska processer, jäsning och anaerob andning1.

Medan organismer som genomgår aerob andning använder syre som terminalelektronacceptor, kräver anaerob andning alternativa elektron acceptorer som nitrat eller sulfat2. I den så kallade "Electron Tower", redox par är organiserade enligt deras redoxpotential, med de mest negativa som ligger på toppen (elektron givare) och starkaste oxidationsmedel med positiva redoxpotential längst ner (elektron acceptorer). Elektron överföringen mellan givare och acceptorer leder till energisparande via den så kallade andningskedjan och elektroner kan fångas upp av elektron acceptorer-för att stanna i bilden-i olika våningar i tornet. Därmed, ju högre nedgången av elektroner genom elektron tornet, desto mer energi kan bevaras av respektive reaktion. Därför är andning också möjlig i anaeroba livsmiljöer, till exempel med redoxpar inklusive nr3-/No2-, fumarsyra/bärnstenssyra, så32-/h2s, s °/h2s, mn (IV)/mn (II ), Fe (III)/Fe (II)2,3. För det första är den resulterande energin bevaras som membran potential, som därefter används av elektrontransport fosforylering för adenosintrifosfat (ATP) syntes av membranbundna ATP-synthases. Till skillnad från aerob andning, kan mängden energi som kan bevaras genom anaerob andning minskas dramatiskt; emellertid, energiproduktionen av de flesta anaeroba respirationer är fortfarande högre jämfört med jäsning, en anaerob energibevarande väg i livsmiljöer som saknar syre och andra terminala elektron acceptorer2.

Under jäsning, energirika, organiska substrat bryts ned till olika fermenterings produkter som ofta definierar namnet på den övergripande processen, till exempel, alkoholjäsning. Till skillnad från andnings processer är ATP-generationen under jäsningen begränsad till fosforylering på substrat nivå under vilken en fosfatgrupp överförs till adenosindifosfat (ADP) från ett energirikt fosforylerat substrat2. Fermenterande mikroorganismer spelar en central roll i den anaeroba nedbrytningen av organiskt material eftersom de är nyckelspelare i substrat nedbrytning. De primära fermenterings produkterna, som organiska syror, alkoholer, CO2och h2, kan därefter användas av sekundära fermenterande mikroorganismer för att producera ättiksyra, Co2och h2. Exempel på fermenterings produkter är mjölksyra, olika flyktiga fettsyror (myrsyra-, ättiksyra-, propionsyra-, butyric-, valerisk), n-butanol, 2, 3-Butandiol, aceton och etanol.

Odling av mikroorganismer under strängt anaeroba förhållanden kräver helt olika metoder och utrustning jämfört med odling av aeroba organismer. Även syre-toleranta organismer odlas ofta på agar rätter, så kallade ytkulturer, detta är-med några få undantag-knappast möjligt för strikt anaeroba mikroorganismer. Därför är berikande kulturer av strängt anaeroba mikroorganismer huvudsakligen etablerade i flytande medier som tillämpar odlings fartyg förseglade med gas-tight septa som garanterar en syrefri headspace atmosfär4,6, 7.

Den nuvarande protokoll beskrivningen kommer att ge lämpliga odlingsmetoder för mål mikroorganismer av en blandad population som härrör från en anaerob biogas anläggning. Isolering och odling av rena kulturer är ännu mer utmanande men inte en del av detta arbete.

Här visar vi proceduren för odling av en anaerob mikrobiell gemenskap baserad på en studie om bildandet av fenylsyror vid rötning av proteanhaltiga substrat8. Den mikrobiella gemenskapen bestod av medlemmar från alla fyra faser av rötning: hydrolys, sur Genes, acetogenes och methanogenes. Ett mineralsalt medium kompletterat med en kolkälla, redox-indikator, vitamin-och spårelement lösning, och reduktionsmedel applicerades9. Mediet ändrades med respektive proteinhaltiga fenylsyriprekursor substrat8.

Protocol

1. beredning av medel

  1. Förbered redoxindikatorns stamlösning (0,1 g resazurin/100 mL vattenlösning).
  2. Bered vitamin lösning (tabell 1).
  3. Förbered spår elementets lösning (tabell 2).
    Notera: beställa av tillägget är viktigt; Se tabell 2 och respektive protokoll.
  4. Förbered reducerande medel stamlösning (60 g na2S/L vattenlösning).
  5. Väga medelstora ingredienser (mineralsalt medium, tabell 3) i en lämplig kolv (t. ex. 1 L skruvlock Lab kolv).
    Observera: beroende på den experimentella installationen kan det vara nödvändigt att lägga till en separat kol källa.
  6. Tillsätt halva volymen destillerat vatten (tabell 3) och lös upp ingredienserna.
  7. Tillsätt 1 mL av redox-indikatorlösningen enligt tabell 3.
  8. Tillsätt vitamin-och spårelement lösning enligt tabell 3.
  9. Justera pH-värdet enligt medel-/organismens krav i tabell 3.
    Obs: färg på redox indikatorn är pH-beroende och kan kräva lite tid att justera.
  10. Ta med destillerat vatten till en slutlig volym på 1 liter.
    Anmärkning: vitamin-och spårelement lösningar kan också tillsättas efter autoklavering genom aseptiskt tillsats av filtersteriliserad alikvot (utspädda lösningar, filter porstorlek < 0,2 μm) till tidigare slutna och autoklaverade serum flaskor. Detta tillvägagångssätt har dock en förhöjd risk för kontaminering.

2. fyllning av odlingsflaskor

  1. Rengör och torka 120 mL av serum kolvar.
    Obs: serum kolvar finns i olika volym kapaciteter (t. ex. 20, 60, 120, 250 mL).
  2. Grundligt ren och torr butylgummisepta.
  3. Väg in ytterligare medelstora komponenter (t. ex. substrat för fenylsyriprekursorer) i odlings kolvar.
    Obs: ytterligare komponenter beror på experimentell installation och hypotes.
  4. Fyll i serum kolvar med 50 mL medium.

3. reduktion/avlägsnande av syre i vätskefasen

  1. Förbered en ~ 100 ° C vattenbad.
  2. Ställ fyllda serum flaskor i vattenbadet och inkubera i ca. 20-30 min för att reducera lösligheten hos O2 i vätskefasen.
  3. Spola headspace omedelbart med N2 gas eller alternativt med andra gas-eller gasblandningar som n2/Co2.
    FÖRSIKTIGHET: ta hand om lämplig ventilation i rummet.
  4. Stäng flaskarna med butylgummisepta och fixera med aluminiumkapsyler.
    Obs: gummi septa kan ofta passa bättre på halsen av kolven genom att tillsätta en droppe vatten/medium under borrning i.
  5. Tillsätt 0,1 mL reduktionsmedel (stamlösning) till varje kolv fylld med 50 mL medium för att ytterligare reducera redoxpotentialen (0,1 mL reduktionsmedel per 50 mL medium).
  6. Autoklav i 20 min vid 121 ° c.
    FÖRSIKTIGHET: en autoklav certifierad för sterilisering av slutna fartyg måste användas. Annars kan övertryck som härrör från temperaturhöjning orsaka att serum kolvar exploderar.

4. inokulering av mediet

  1. Förbered inokulum från anaerob rötkammare.
    1. Tillsätt 400 mL destillerat vatten i en kolv och koka upp det.
    2. Kyla ner den (< 30 ° c) medan du permanent spolar headspace med N2.
    3. Tillsätt ca 100 g slam från en anaerob rötkammare.
      Obs: Undvik överdriven kontakt med slam med syre.
    4. Anteckna den exakta massan av tillsatt slam för exakt bestämning av utspädning.
    5. Växla Flask headspace med N2 och Stäng den med en butylgummiseptum.
    6. Skaka kolven i 30 min vid 120 RPM.
  2. Ta bort 5 ml inokulum med hjälp av spruta + kanyl och injicera det i beredda serum flaskor enligt beskrivningen i steg 1-3.

5. inkubering, provtagning och analys

  1. Inkubera inokulerade serum flaskor vid en temperatur som är lämplig för respektive experiment.
    Obs: inkubations temperaturen är beroende av experimentell inställning och använt inoculum.
    1. Dränera övertryck till följd av temperaturhöjningen med hjälp av spruta + kanyl, när vätskan i serum kolvar har Ekat till inkubations temperaturen (ca 15 – 30 min, beroende på inkubations temperatur).
      Försiktighet: beroende på tillämpad substrat, dess koncentration, temperatur, inkubationstid, inokulum typ och koncentration, övertryck i kolvar kan stiga med upp till > 2 bar tryck och kan orsaka serum flaks att explodera. Det är därför obligatoriskt att övervaka övertrycket med hjälp av en manometer och därefter dränera övertryck med en kanyl.
  2. Utvärdera biogasproduktion och-sammansättning under inkubationstiden.
    Obs: inkubationstiden kan spänna över några dagar till flera veckor.
    1. Registrera aktuellt atmosfärstryck.
    2. Bered en manometer och utvärdera trycket i de kolvar som härrör från mikrobiell aktivitet.
    3. Skaka kolvar.
    4. Ta bort 1 mL headspace-gas med hjälp av en spruta + kanyl och mät koncentrationerna av H2, O2, CH4och/eller co2 via gaskromatografi.
      Anmärkning: för kvalificering och kvantifiering av H2, O2, CH4och co2 användes en gaskromatograf med användning av drifttemperaturer på 160 ° c (kolonnugn), 100 ° c (injektor) och 180 ° c (värmeledningsförmåga, TCD ). N2 användes som bärgas. För mer information, se tidigare studier10.
  3. Övervaka koncentrationerna av flyktiga fettsyror (VFA) och fenylsyror. För VFA och fenylsyra analys, Använd ett HPLC-system utrustat med en UV-detektor (vid 220 nm) som löper med 5 mM H2so4 som en mobil fas. För metodens detaljer och ytterligare information om PROVFÖRVARING hänvisas till tidigare studier11.
    Anmärkning: analysen av VFA är exemplarisk för många andra fysikalisk-kemiska analyser eller mikroskopiska utvärderingar. Dessutom kan molekylära biologiska metoder som riktar sig mot förekomsten av specifika mikroorganismer och/eller sammansättningen av den mikrobiella gemenskapen vid en viss punkt i experimentet appliceras med hjälp av den beskrivna proceduren.
    1. Ta bort 1 mL vätska med spruta + kanyl.
      Anmärkning: prover kan frysas (-20 ° c) omedelbart efter uttag och analyseras i slutet av experimentet11.
    2. Centrifugera vid 15000 – 20000 x g och passera genom 0,2 μm RC (regenererad cellulosa) filter.
    3. Injicera 5-20 μL på ett HPLC-system och analysera VFA-sammansättningen och koncentrationen av fenylsyror.
  4. Dränera Flask övertryck med en kanyl.
    Anmärkning: när du har fastställt tryck-och gas sammansättningen samt tagit ett nödvändigt prov ska du placera odlings kolven tillbaka på respektive temperatur och dränera inte övertryck innan vätskan har uppnått inkubations temperaturen.
  5. Beräkna biogas-och metanproduktion VCH4N med tanke på den idealiska gas lag med hjälp av ekvation 1-3. Se även tabell 4.
    Ekvation 1:Equation 1
    Whereby
    Ekvation 2:Equation 2
    Och
    Ekvation 3:Equation 3
    Anmärkning: för beräkningen av den totala biogasproduktionen måste mängden4% och4% X i ekvation 2 och 3 ställas in på 100. NmL: normaliserad gas volym under standardiserade förhållanden (0 ° c, 1 ATM), under vilken molar gasvolymen är 22,414 NmL/mmol.

Representative Results

Odlingsflaskor fylldes med medium under anaeroba förhållanden enligt det protokoll som beskrivs ovan, kontrolleras för lämplig färg (figur 1), och används som miniatyr batch bioreaktorer som utför rötning. Dessa ändrades med substrat som potentiellt orsakar fenylsyras bildning och inkuberas med hjälp av anaerob rötslam som inokulum (figur 2). Tryptofan, tyrosin och fenylalanin, liksom det komplexa proteinhaltiga prekursorer köttextrakt och kasein tillämpades i två och tre olika koncentrationer, respektive. Kontroller bereddes utan ytterligare substrat tillskott. Olika substrat koncentrationer som syftar till simulering av olika stadier av överbelastning. Kolvar inkuberades vid 37 ° c (mesophilic) i 4 veckor.

Biogas produktion och-sammansättning (H2, CH4, Co2) övervakades regelbundet via gaskromatografi (GC TCD)10 och utvärdering av headspace-tryck. Figur 3 visar skillnader i den kumulativa metanproduktionen som härrör från nedbrytning av de applicerade substrat i varierande koncentrationer under 4 veckor av inaerob inkubering. Förutom, var methanogens visualiseras genom bestråling av coenzym F420, en elektron bärare i methanogenesis, uppvisar en blågrön fluorescens med en absorption maximum vid 420 nm (figur 4).

Parallellt med gasanalys drogs prover för mätningar av VFA-och fenylsyrekoncentrationer via HPLC11 ut och frystes upp tills vidare bearbetning. Figur 5 visar effekten av olika stadier av överbelastning som återspeglas av en ackumulering i mycket överbelastade prover exemplarily avbildas för acetat. Figur 6 visar dynamiken i koncentrationerna av fenylacetat under inkubationstiden.

Figure 1
Bild 1: redoxindikator. Rätt redoxpotential i odlings kolvar kan styras genom att lägga till en redox-indikator. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: miniatyr parti bioreaktorer. Miniatyr parti bioreaktorer beredda i 120 mL odlingsflaskor för anaerob nedbrytning experiment. Flaskor fylldes med medel och inokulerades med utspädd rötslam. Reaktorerna var gas tätt förseglade med butylgummiproppar och aluminiumlock. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: metanproduktion. Ackumulerad metanproduktion under 28 dagar av mesofil inkubation från reaktorer som återspeglar olika överbelastningsförhållanden (låg, medelhög, hög). CONT: kontroll; Tryp: tryptofan; Tyr: tyrosin; Phe: fenylalanin; MIG: köttextrakt; CAS: kasein. Detta är en modifierad siffra som härrör från en tidigare studie8. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: fluorescera i metanogener. Methanogens avger ett blåaktig ljus när de är glada med UV-ljus. Här, methanogens är knutna till växt partiklar (ljusgrön). Proverna togs från en parti reaktor, späddes för mikroskopi, och omedelbart analyseras. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: acetatkoncentration. Acetatkoncentrationen under 28 dagar av mesofil inkubering i reaktorer som återspeglar olika överbelastningsförhållanden (låg, medelhög, hög). CONT: kontroll; Tryp: tryptofan; Tyr: tyrosin; Phe: fenylalanin; MIG: köttextrakt; CAS: kasein. Detta är en modifierad siffra som härrör från en tidigare studie8. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: Fenylacetatkoncentration. Fenylacetatkoncentration under 28 dagar av mesofil inkubering i reaktorer som återspeglar olika överbelastningsförhållanden (låg, medelhög, hög). CONT: kontroll; Tryp: tryptofan; Tyr: tyrosin; Phe: fenylalanin; MIG: köttextrakt; CAS: kasein. Detta är en modifierad siffra som härrör från en tidigare studie8. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7: Resazurin-reaktion. Blå färgade resazurin genomgår en oåterkallelig reduktion till resorufin (rosa) och ytterligare reversibel reduktion till den färglös dihydroresorufin enligt Uzarski et al.12. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Cyanocobalamin 0,050 g
4-Aminobenzoic syra 0,050 g
D-biotin 0,010 g
Nikotinsyra 0,100 g
Pyridoxin 0,250 g
D-pantotensyra 0,025 g
Tiaminium klorid HCl 0,18 g
Destillerat vatten 1000 mL

Tabell 1: vitamin lösning.

25% (vikt/volym) HCl 10,0 mL
FeCl2 x 4 H2O 1,50 g
ZnCl2 0,070 g
MnCl2 x 4 H2O 0,100 g
H3bo3 0,006 g
CoCl2 x 6 H2O 0,190 g
CuCl2 x 2 H2O 0,002 g
NiCl2 x 6 H2O 0,024 g
Na2Moo4 x 2 H2O 0,036 g
Destillerat vatten 990,0 mL
Förberedelse rekommendation Tillsätt HCl och lös upp FeCl2, tillsätt 100 ml destillerat vatten, lös upp övriga ingredienser och gör upp till 1000 ml.

Tabell 2: lösning för spårelement.

Nacl 1,0 g
MgCl2 x 6 H2O 0,4 g
KH2Po4 0,2 g
KCl 0,5 g
CaCl2 x 2 H2O 0,15 g
L-cystein 0,5 g
Jästextrakt 1,0 g
Resazurin lösning 1 mL
Vitamin lösning 1 mL
Lösning för spårelement 1 mL
Destillerat vatten 1000 mL
Ph 7,2

Tabell 3: minimalt salt medium.

Variabel Enhet Beskrivning
tY d Tidspunkt för mätningen
tX d Timepoint för föregående mätning
(malm ) mbar Uppmätt övertryck vid tY
pen mbar Omgivningstryck vid tY
pAX mbar Omgivningstryck vid tX
(Nacka) mbar Standard tryck, 1013, 25 mbar ACC. DIN 1343
Tjag K Inkubations temperatur
() K Standard temperatur, 273, 15 K (motsvarar 0 ° C) ACC. DIN 1343
VH ml Headspace-volym vid tY
VHX ml Headspace-volym vid tX
CH4% [VOL%] Metankoncentrationen enligt GC-mätning vid tY
CH4% X [VOL%] Metankoncentrationen enligt GC-mätning vid tX
VCH4T NML Totala metanmängden i serum flaskan vid tY
VCH4R NML Restmetangas belopp i headspace vid tX
VCH4N NML Nyproducerad metan från tX till tY

Tabell 4: Beskrivning av variablerna i ekvation 1-3.

Discussion

Det viktigaste och mest kritiska steget i odling av anaeroba mikroorganismer är att säkerställa syrefria förhållanden i odlingsmedier och kolvar "headspace". En indikator som resazurin kan användas för att indirekt kontrollera korrekt anaerob fyllning av kolvar. Resazurin är en vanligt förekommande redoxfärg eftersom det är billigt, giftfri, och redan effektiv i låga doser och korta inkubationstider 12. Vid inkorporerad i media genomgår den blåfärgade resazurin först ett oåterkalleligt reduktions steg till resorufin, vilket är rosa vid neutrala pH-värden. Denna första reaktion kan inträffa när mediet värms 13. Därefter reduceras resorufin till färglös dihydroresorufin i en reversibel sekundär reaktion (figur 7)12. Resorufin/dihydroresorufin redox-systemet blir helt färglös vid en standardiserad oxidations reduktions potential på ca Eh =-110 MV och blir rosa över en redoxpotential på-51 MV 13.

För att ytterligare minska den redoxpotential, till exempel, för att underlätta tillväxten av metanbildande mikroorganismer kända för att kräva mindre än-200 MV14, en na2S lösning kan tillsättas. Alternativt, cystein-HCl, natrium-thioglycolate, eller natriumdithionite används ofta. Men som minskar agenten är lämpligt att använda beror på respektive experimentella installationen och kan kräva särskild uppmärksamhet. Till exempel, natrium thioglycolate behöver temperatur aktivering (t. ex., genom autoklavering).

En välbalanserad mikrobiell konsortium, bestående av olika släkten av bakterier och Archaea, och en effektivt arbetande anaerob nedbrytning kaskad kan ytterligare utvärderas genom att bestämma headspace gas sammansättningen i kulturen kolvar via gas Kromatografi. Vid hantering av föreningar som fenylsyror som härrör från olika prekursorer, är bedömningen av headspace ett snabbt sätt att kontrollera methanogenesis processen8. En headspace CH4 -koncentration på ca 50-60% i kontrollerna i slutet av inkubationstiden indikerar en lyckad användning av de applicerade näringsämnena och därmed en mineralisering av organiskt material under anaeroba förhållanden. Den teoretiska metanproduktionen och de uppsebara metankoncentrationerna under rötningsprocessen kan bestämmas i förväg enligt Buswell-Boyle-ekvationen efter elementär analys av substratet eller genom att uppskatta innehållet i kolhydrater, proteiner och fetter i underlaget. Enligt VDI 4630 15kan kolhydrater leda till en teoretisk biogasproduktion på 750 l kg-1 VSS (50% CH4 och 50% CO2), proteiner till 800 l kg-1 VSS (72% CH4 och 28% Co2) och fetter till 1 390 l kg -1- VSS (60% CH4 och 40% Co2).

Dessutom övervakades bildandet och eventuell efterföljande nedbrytning av VFAs och fenylsyror. Nedbrytningsprocessen kan utvärderas genom att analysera VFA-koncentrationerna (t. ex. acetat, propionat) vid olika tidpunkter. Ackumulering av kortkedjiga fettsyror som acetat och/eller propionat kan peka på störningar i den metanbildande gemenskapen sammansättning och till en total reaktor överbelastning. Emellertid, en väl avvägd mikrobiell nedbrytning kaskad kan även klara av mycket höga VFA och acetat koncentrationer9. Förutom, acetat/Propionate förhållandet kan ytterligare ge information om den totala reaktorn villkoret16. Det finns dock många parametrar som lämpar sig för processövervakning och som måste väljas enligt de föreslagna experimentella hypoteserna. I föreliggande exempel var målvariablerna fenylsyrikoncentrationer (figur 6).

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Denna forskning finansierades av österrikiska vetenskaps fonden (FWF): projektnummer P 29360 och P 29143. Publikationen stöddes av Publikationsfonds der Universität Innsbruck. Vi erkänner starkt EIG.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
culture flasks (120 mL, N20) Ochs, Germany 102046
buty rubber septa (N20) Ochs, Germany 102049
aluminium caps (N20) Ochs, Germany 102050
N2 gas Messer, Austria purity 5.0
syringes + cannulae various
crimper Ochs, Germany 102051
de-crimper Ochs, Germany 102052
GC2010 Shimadzu
Shin-carbon GC column Restek chromatographic separation of H2, O2, CH4, and CO2
HPLC Prominence Shimadzu
Fast Fruit HPLC Column Phenomenex chromatographic separation of VFAs, phenyl acids, etc.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wiebe, W. J., et al. Anaerobic Respiration and Fermentation. The Ecology of a Salt Marsh. Pomeroy, L. R., Wiegert, R. G. Springer New York. New York, NY. 137-159 (1981).
  2. Kim, B. H., Gadd, G. M. Anaerobic fermentation. Bacterial physiology and metabolism. Kim, B. H., Gadd, G. M. Cambridge University Press. Cambridge. 252-297 (2008).
  3. Stolz, J. F., Oremland, R. S. Bacterial respiration of arsenic and selenium). FEMS Microbiology Reviews. 23, (5), 615-627 (1999).
  4. Lackner, N., Hintersonnleitner, A., Wagner, A. O., Illmer, P. Hydrogenotrophic Methanogenesis and Autotrophic Growth of Methanosarcina thermophila. Archaea. 2018, (5), 1-7 (2018).
  5. Mutschlechner, M., Praeg, N., Illmer, P. The ecological importance of grazing to methane fluxes and engaged microbial communities in alpine forest soils. FEMS Microbiology Ecology. (2018).
  6. Prem, E. M., Reitschuler, C., Illmer, P. Livestock grazing on alpine soils causes changes in abiotic and biotic soil properties and thus in abundance and activity of microorganisms engaged in the methane cycle. European Journal of Soil Biology. 62, 22-29 (2014).
  7. Praeg, N., Wagner, A. O., Illmer, P. Effects of fertilisation, temperature and water content on microbial properties and methane production and methane oxidation in subalpine soils. European Journal of Soil Biology. 65, 96-106 (2014).
  8. Wagner, A. O., Prem, E. M., Markt, R., Kaufmann, R., Illmer, P. Formation of phenylacetic acid and phenylpropionic acid under different overload conditions during mesophilic and thermophilic anaerobic digestion. Biotechnology for Biofuels. 12, (1), 359 (2019).
  9. Lins, P., Malin, C., Wagner, A. O., Illmer, P. Reduction of accumulated volatile fatty acids by an acetate-degrading enrichment culture. FEMS Microbiology Ecology. 71, (3), 469-478 (2010).
  10. Wagner, A. O., Hohlbrugger, P., Lins, P., Illmer, P. Effects of different nitrogen sources on the biogas production - a lab-scale investigation. Microbiological research. 167, (10), 630-636 (2012).
  11. Wagner, A. O., et al. Sample preparation, preservation, and storage for volatile fatty acid quantification in biogas plants. Engineering in Life Sciences. 17, (2), 132-139 (2017).
  12. Uzarski, J. S., DiVito, M. D., Wertheim, J. A., Miller, W. M. Essential design considerations for the resazurin reduction assay to noninvasively quantify cell expansion within perfused extracellular matrix scaffolds. Biomaterials. 129, 163-175 (2017).
  13. Costilow, R. N., Breznak, J. A., et al. Physicochemical Factors in Growth. Methods for General and Molecular Microbiology. Marzluf, G. A. Third Edition, 309-329 (2007).
  14. Le Mer, J., Roger, P. Production, oxidation, emission and consumption of methane by soils: a review. European Journal of Soil Biology. 37, (1), 25-50 (2001).
  15. Verein deutscher Ingenieure VDI 4630: Fermentation of organic material. VDI Richtlinien. (2006).
  16. Wagner, A. O., Reitschuler, C., Illmer, P. Effect of different acetate: Propionate ratios on the methanogenic community during thermophilic anaerobic digestion in batch experiments. Biochemical Engineering Journal. 90, 154-161 (2014).
Medellång förberedelse för odling av mikroorganismer under strängt anaeroba/syrefria förhållanden
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wagner, A. O., Markt, R., Mutschlechner, M., Lackner, N., Prem, E. M., Praeg, N., Illmer, P. Medium Preparation for the Cultivation of Microorganisms under Strictly Anaerobic/Anoxic Conditions. J. Vis. Exp. (150), e60155, doi:10.3791/60155 (2019).More

Wagner, A. O., Markt, R., Mutschlechner, M., Lackner, N., Prem, E. M., Praeg, N., Illmer, P. Medium Preparation for the Cultivation of Microorganisms under Strictly Anaerobic/Anoxic Conditions. J. Vis. Exp. (150), e60155, doi:10.3791/60155 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter