Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

Medium forberedelse til dyrkning af mikroorganismer under strengt anaerobe/anoxiske forhold

doi: 10.3791/60155 Published: August 15, 2019
* These authors contributed equally

Summary

Da forpligte anaerobe organismer ikke er i stand til at vokse ved ilteksponering, er brugen af anaerobe dyrkning teknikker uundværlig. Her viser vi en enkel og effektiv metode til at dyrke en blandet kultur, der stammer fra et biogasanlæg fra medie fremstilling til gas og kvantificering af flygtige fedtsyrer.

Abstract

I modsætning til aerobe organismer, strengt anaerobe mikroorganismer kræver fravær af ilt og normalt et lavt redox potentiale til at indlede vækst. Da ilt er allestedsnærværende i luft, er det udfordrende at fastholde O2-frie forhold under alle dyrknings trin, men en forudsætning for anaerob dyrkning. Den protokol, der præsenteres her, viser den vellykkede dyrkning af en anaerob blandet kultur afledt af et biogasanlæg ved hjælp af en enkel og billig metode. Der gives en præcis beskrivelse af hele anoxiske-dyrknings processen, herunder medie fremstilling, påfyldning af dyrkningskolber, tilskud med redox-indikator og reduktionsmidler til at give lave redox potentialer samt udskiftning af headspace for at holde medier fri for ilt. Desuden gives en detaljeret oversigt over aseptiske pode gas stramme serum kolber (ved hjælp af sterile sprøjter og nåle) og passende inkubations betingelser. Denne protokol omhandler yderligere gas-og væske prøvetagning med henblik på efterfølgende analyser vedrørende gassammensætning og flygtige fedtsyre koncentrationer ved anvendelse af henholdsvis gaskromatografi (GC) og højeffektiv væskekromatografi (HPLC) og beregning af biogas og metan udbytte i betragtning af den ideelle gas lov.

Introduction

På jorden er Molekylær ilt i bemærkelsesværdige koncentrationer tilgængelig i områder med direkte kontakt med atmosfæren eller i tilstedeværelse af iltdannende fototroffer. Miljøer, hvor ilt er fraværende kaldes anaerob. Energiomdannelse er dog stadig mulig under anaerobe forhold via to forskellige metaboliske processer, gæring og anaerob respiration1.

Mens organismer gennemgår aerob respiration bruger ilt som en Terminal elektron acceptor, anaerob respiration kræver alternative elektron acceptorer som nitrat eller sulfat2. I det såkaldte "elektron tårn" er Redox-par organiseret efter deres redox-potentiale, og de mest negative er placeret øverst (elektron donorer) og stærkeste oxidationsmidler med positivt redox-potentiale i bunden (elektron acceptorer). Elektron overførslen mellem donorer og acceptorer fører til energibesparelse via den såkaldte åndedræts kæde, og elektroner kan fanges af elektron acceptorer-for at blive i billedet-i forskellige etager af tårnet. Derved, jo højere fald af elektroner gennem elektron tårnet, jo mere energi kan bevares ved den respektive reaktion. Derfor er respiration også muligt i anaerobe habitater, for eksempel med redox-par, herunder No3-/No2-, Fumarsyre/succininsyre, så32-/h2s, S °/h2s, MN (IV)/MN (II ), Fe (III)/FE (II)2,3. For det første, den resulterende energi bevares som membran potentiale, som efterfølgende anvendes af elektron transport fosforylering for adenosin-trifosfat (ATP) syntese af membran-bundne ATP-synthaser. I modsætning til aerob respiration kan den mængde energi, der kan bevares ved anaerob respiration, reduceres drastisk. imidlertid er energiproduktionen af de fleste anaerobe respirationer stadig højere i forhold til gæring, en anaerob energibevarings kurve i habitater, der mangler ilt og andre terminal elektron acceptorer2.

Under gæring nedbrydes energirige, organiske substrater til forskellige gæringsprodukter, der ofte definerer navnet på den samlede proces, for eksempel alkoholisk gæring. I modsætning til respirations processer er ATP-generering under fermentering begrænset til phosphorylering på substrat niveau, hvor en fosfatgruppe overføres til adenosin-di-fosfat (ADP) fra et energirigt phosphoryleret substrat2. Fermentering af mikroorganismer spiller en central rolle i den anaerobe nedbrydning af organisk materiale, da de er nøglespillere i substrat opdeling. De primære gæringsprodukter, såsom organiske syrer, alkoholer, CO2og h2, kan efterfølgende anvendes af sekundære fermenterende mikroorganismer til fremstilling af eddikesyre, co2og h2. Eksempler på gæringsprodukter omfatter mælkesyre, forskellige flygtige fedtsyrer (myre-, eddike-, propionsyre-, butyric-, valeric Acid), n-butanol, 2, 3-butandiol, acetone og ethanol.

Dyrkning af mikroorganismer under strengt anaerobe forhold kræver helt forskellige metoder og udstyr sammenlignet med dyrkning af aerobe organismer. Mens ilt-tolerante organismer ofte dyrkes på agar retter, såkaldte overflade kulturer, dette er-med et par undtagelser-næppe muligt for strengt anaerobe mikroorganismer. Derfor er berigende kulturer af strengt anaerobe mikroorganismer hovedsageligt etableret i flydende medier, der anvender kultur beholdere forseglet med gastæt septa, som sikrer en iltfri atmosfære på hovedrummet4,6, 7.

Den nuværende protokol beskrivelse vil give passende dyrkningsmetoder for målmikroorganismer fra en blandet population, der er afledt af et anaerob biogasanlæg. Isolation og dyrkning af rene kulturer er endnu mere udfordrende, men ikke en del af dette arbejde.

Her viser vi proceduren for dyrkning af et anaerob mikrobiel samfund baseret på en undersøgelse vedrørende dannelsen af phenyl syrer under anaerob nedbrydning af proteinholdige substrater8. Det mikrobielle samfund bestod af medlemmer fra alle fire faser af anaerob nedbrydning: hydrolyse, acidogenesis, acetogenesen og methanogenesis. Et mineral salt medium suppleret med en kulstofkilde, redox-indikator, vitamin og sporstof opløsning, og reduktionsmiddel blev anvendt9. Mediet blev ændret med de respektive substrater af fenylsyreprækursorer i protein8.

Protocol

1. forberedelse af medium

  1. Forbered redox-indikator stamopløsning (0,1 g resazurin/100 mL vandig opløsning).
  2. Forbered vitamin opløsning (tabel 1).
  3. Forbered løsning af sporingselementer (tabel 2).
    Bemærk: rækkefølgen af tilføjelse er vigtig; Se venligst tabel 2 og de respektive protokoller.
  4. Forbered reduktionsmiddel stamopløsning (60 g na2S/L vandig opløsning).
  5. Mellem ingredienserne (mineral salt medium, tabel 3) vejes i en passende kolbe (f. eks. 1 L skruelåg).
    Bemærk: afhængigt af den eksperimentelle opsætning kan det være nødvendigt at tilsætte en separat kulstofkilde.
  6. Tilsæt halv volumen destilleret vand (tabel 3) og Opløs ingredienserne.
  7. Tilsæt 1 mL redox-indikatoropløsning i henhold til tabel 3.
  8. Tilsæt vitamin-og sporstof opløsning i henhold til tabel 3.
  9. PH justeres efter medium/organismens krav i tabel 3.
    Bemærk: farven på redox-indikatoren er pH-afhængig og kan kræve lidt tid til at justere.
  10. Der bringes et endeligt rumfang på 1 L med destilleret vand.
    Bemærk: vitamin-og sporstof opløsninger kan også tilsættes efter autoklavering ved aseptisk tilsætning af en filter steriliseret alikvot (fortyndede opløsninger, filter porestørrelse < 0,2 μm) til tidligere lukkede og autoklave serum kolber. Denne fremgangsmåde indebærer imidlertid en forhøjet risiko for kontaminering.

2. påfyldning af dyrknings kolber

  1. Rengør og tør 120 mL serum kolber grundigt.
    Bemærk: serum kolber fås i forskellige volumen kapaciteter (f. eks. 20, 60, 120, 250 mL).
  2. Rengør og tør butylgummi septa grundigt.
  3. Veje yderligere medium komponenter (f. eks, phenyl syre prækursorer substrater) i dyrknings kolberne.
    Bemærk: yderligere komponenter afhænger af eksperimentel opsætning og hypotese.
  4. Fyld serum kolberne med 50 mL medium.

3. reduktion/fjernelse af ilt i den flydende fase

  1. Forbered en ~ 100 ° C vandbad.
  2. Sæt fyldte serum kolber i vandbad og inkubatér i ca. 20-30 min for at reducere opløseligheden af O2 i væskefasen.
  3. Skyl straks headspace med N2 gas eller alternativt med andre gas-eller gasblandinger som n2/Co2.
    Forsigtig: pas på passende ventilation i rummet.
  4. Luk kolberne med butylgummisepta, og fastgør dem med aluminiums hætter.
    Bemærk: gummi septa kan ofte passe bedre på kolbens hals ved at tilføje en dråbe vand/medium, mens den bores i.
  5. 0,1 mL reduktionsmiddel (stamopløsning) tilsættes til hver kolbe fyldt med 50 mL medium for yderligere at reducere redox-potentialet (0,1 mL reduktionsmiddel pr. 50 mL medium).
  6. Autoklave i 20 min ved 121 °C.
    Forsigtig: der skal anvendes en autoklave, som er certificeret til sterilisering af lukkede beholdere. Ellers kan overtryk afledt af temperaturstigning medføre, at serum kolber eksploderer.

4. inokulering af mediet

  1. Forbered inokulum fra anaerob digester.
    1. Tilsæt 400 mL destilleret vand til en kolbe, og Bring det i kog.
    2. Afkøl den (< 30 °C), mens du permanent skyller headspace med N2.
    3. Tilsæt ca. 100 g slam afledt af en anaerob digester.
      Bemærk: undgå overdreven kontakt af slam med ilt.
    4. Den nøjagtige masse af tilsat slam registreres med henblik på den nøjagtige bestemmelse af fortynding.
    5. Kolbens headspace omveksles med N2 og lukkes med et butylgummiseptum.
    6. Kolben rystes i 30 minutter ved 120 rpm.
  2. 5 mL inokulum fjernes ved hjælp af sprøjte + kanyle og indsprøjtes i forberedte serum kolber som beskrevet i trin 1-3.

5. inkubation, prøvetagning og analyse

  1. Inkuber inokulerede serum beholdere ved en temperatur, der passer til det pågældende eksperiment.
    Bemærk: inkubations temperaturen afhænger af eksperimentel opsætning og anvendes inoculum.
    1. Dræn overtrykket som følge af temperaturstigningen ved hjælp af sprøjte + kanyle, når væsken i serum kolberne er blevet ækvibreret til inkubations temperaturen (ca. 15 – 30 min. afhængigt af inkubations temperaturen).
      Forsigtig: afhængigt af det anvendte substrat, dens koncentration, temperatur, inkubationstid, inokulum type og koncentration, overtryk i kolber kan stige med op til > 2 bar tryk og kan forårsage serum flaks at eksplodere. Det er derfor obligatorisk at kontrollere overtrykket ved hjælp af et manometer og efterfølgende dræne overtrykket med en kanyle.
  2. Evaluere biogasproduktion og-sammensætning under inkubationstiden.
    Bemærk: inkubationstiden kan strække sig over et par dage til flere uger.
    1. Optag det aktuelle atmosfæriske tryk.
    2. Der fremstilles et manometer og evalueres trykket i kolberne afledt af mikrobiel aktivitet.
    3. Ryst kolberne.
    4. 1 mL headspace-gas fjernes ved hjælp af en sprøjte + kanyle, og måling af H2-, O2-, ch4-og/eller co2 -koncentrationerne via gaskromatografi.
      Bemærk: ved kvalifikation og kvantificering af H2, O2, ch4og co2 blev der anvendt en gaskromatograf, som anvendte driftstemperaturer på 160 °c (kolonne ovnen), 100 °C (injektor) og 180 °C (termisk ledningsevne-detektor, TCD ). N2 blev brugt som bære benzin. Yderligere oplysninger findes i tidligere undersøgelser10.
  3. Overvåge koncentrationerne af flygtige fedtsyrer (VFA) og phenyl syrer. For VFA og phenyl syre analyse, brug et HPLC-system udstyret med en UV-detektor (ved 220 nm) kører med 5 mM H24 som en mobil fase. For metodens detaljer og yderligere oplysninger om prøve opbevaring, se venligst tidligere undersøgelser11.
    Bemærk: analysen af VFA er eksemplarisk for mange andre fysisk-kemiske analyser eller mikroskopiske evalueringer. Desuden kan molekylære biologiske metoder, der er rettet mod den overflod af specifikke mikroorganismer og/eller sammensætningen af det mikrobielle samfund på et bestemt tidspunkt i forsøget, anvendes ved hjælp af den beskrevne procedure.
    1. Der fjernes 1 mL væske med sprøjte + kanyle.
      Bemærk: prøverne kan fryses (-20 °C) umiddelbart efter udtagning og analyseres ved afslutningen af eksperimentet11.
    2. Centrifuge på 15000-20000 x g og passere gennem 0,2 μm RC (regenereret cellulose) filtre.
    3. Injicer 5-20 μL på et HPLC-system og analysér for VFA sammensætning og koncentration af phenyl syrer.
  4. Afløbs kolbens overtryk ved hjælp af en kanyle.
    Bemærk: efter bestemmelse af tryk-og Gassammensætningen samt udtagning af den nødvendige prøve anbringes dyrknings kolben tilbage på den respektive temperatur, og der dræne ikke overtrykket, før væsken har opnået inkubations temperaturen.
  5. Beregn biogas og metanproduktion VCH4N i betragtning af den ideelle gaslov ved hjælp af ligning 1-3. Se også tabel 4.
    Ligning 1:Equation 1
    Hvor
    Ligning 2:Equation 2
    Og
    Ligning 3:Equation 3
    Bemærk: ved beregning af den samlede biogasproduktion skal mængden af CH4% og CH4% X i ligning 2 og 3 indstilles til 100. NmL: normaliseret gasvolumen under standardiserede betingelser (0 °C, 1 ATM), hvorunder molær gasvolumen er 22,414 NmL/mmol.

Representative Results

Dyrknings kolber blev fyldt med medium under anaerobe forhold i henhold til den ovenfor beskrevne protokol, kontrolleret for den relevante farve (figur 1), og anvendes som miniature batch bioreaktorer, der udfører anaerob nedbrydning. Disse er blevet ændret med substrater, der potentielt forårsager phenyl syredannelse og inkuberet ved hjælp af anaerob fordester slam som inokulum (figur 2). Tryptophan, tyrosin, og phenylalanin, samt den komplekse proteinholdige forløber kødekstrakt og kasein blev anvendt i to og tre forskellige koncentrationer, hhv. Kontrol blev forberedt uden yderligere substrat tilskud. Forskellige substrat koncentrationer rettet mod simulering af forskellige stadier af overbelastning. Kolberne inkuberet ved 37 °C (mesofile) i 4 uger.

Biogas produktion og-sammensætning (H2, ch4, co2) blev regelmæssigt overvåget via gaskromatografi (GC TCD)10 og vurdering af headspace Pressure. Figur 3 viser forskelle i den kumulative metanproduktion afledt af fordøjelsen af de anvendte substrater i varierede koncentrationer under 4 ugers anaerob inkubation. Udover, methanogens blev visualiseret ved bestråling af coenzym F420, en elektron bærer i methanogenesis, udstiller en blågrøn fluorescens med en absorption maksimum ved 420 nm (figur 4).

Samtidig med gasanalysen blev prøverne for VFA-og phenylsyrekoncentrations målinger via HPLC11 trukket tilbage og opbevaret frosset indtil videre forarbejdning. Figur 5 viser virkningen af forskellige stadier af overbelastning, som afspejles af en ophobning i meget overbelastede prøver eksemplarisk afbildet for acetat. Figur 6 viser dynamikken i phenylacetat koncentrationerne i inkubationsperioden.

Figure 1
Figur 1: redox-indikator. Det korrekte redox-potentiale i dyrknings kolberne kan styres ved at tilføje en redox-indikator. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: miniature batch bioreaktorer. Miniature batch bioreaktorer fremstillet i 120 mL dyrknings kolber til anaerob nedbrydningsforsøg. Kolberne blev fyldt med medium og inokuleret med fortyndet fermentat slam. Reaktorerne var gas-tæt forseglet med butylgummipropper og aluminiums hætter. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: metanproduktion. Kumulativ metanproduktion i løbet af 28 dage med mesofile inkubation fra reaktorer, som afspejler forskellige overbelastningsforhold (lav, medium, høj). CONT: kontrol; Tryp: tryptophan; Tyr: tyrosin; Phe: phenylalanin; MIG: kødekstrakt; CAS: kasein. Dette er et modificeret tal, der stammer fra et tidligere studie8. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: fluorescerende methanogener. Methanogens udsender et blålig lys, når det er spændt med UV-lys. Her er methanogens knyttet til plante partikler (lysegrøn). Prøver blev taget fra en batch-reaktor, fortyndet til mikroskopi, og straks analyseret. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: acetat koncentration. Acetat koncentration i 28 dage med mesofile inkubation i reaktorer, som afspejler forskellige overbelastningsforhold (lav, medium, høj). CONT: kontrol; Tryp: tryptophan; Tyr: tyrosin; Phe: phenylalanin; MIG: kødekstrakt; CAS: kasein. Dette er et modificeret tal, der stammer fra et tidligere studie8. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: koncentrationen af Phenylacetat. Koncentrationen af phenylacetat i 28 dage med mesofile inkubation i reaktorer, som afspejler forskellige overbelastningsforhold (lav, medium, høj). CONT: kontrol; Tryp: tryptophan; Tyr: tyrosin; Phe: phenylalanin; MIG: kødekstrakt; CAS: kasein. Dette er et modificeret tal, der stammer fra et tidligere studie8. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: Resazurin-reaktion. Blå farvet resazurin undergår en irreversibel reduktion til resorufin (lyserød) og en yderligere reversibel reduktion til den farveløse dihydroresorufin ifølge Uzarski et al.12. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Cyanocobalamin 0,050 g
4-aminobenzoinsyre 0,050 g
D-biotin 0,010 g
Nicotinsyre 0,100 g
Pyridoxin 0,250 g
D-pantothensyre 0,025 g
Thiaminiumchlorid HCl 0,18 g
Destilleret vand 1000 mL

Tabel 1: vitamin opløsning.

25% (w/v) HCl 10,0 mL
Fæl2 x 4 H2O 1,50 g
ZnCl2 0,070 g
MnCl2 x 4 H2O 0,100 g
H3bo3 0,006 g
CoCl2 x 6 H2O 0,190 g
CuCl2 x 2 H2O 0,002 g
NiCl2 x 6 H2O 0,024 g
Na2Moo4 x 2 H2O 0,036 g
Destilleret vand 990,0 mL
Anbefaling om forberedelse Tilsæt HCl, og afløs fæl2, Tilsæt 100 ml destilleret vand, Opløs de øvrige indholdsstoffer, og lav op til 1000 ml.

Tabel 2: løsning af sporingselementer.

Nacl 1,0 g
MgCl2 x 6 H2O 0,4 g
KH2po4 0,2 g
KCl 0,5 g
CaCl2 x 2 H2O 0,15 g
L-Cystein 0,5 g
Gær ekstrakt 1,0 g
Resazurin-opløsning 1 mL
Vitamin opløsning 1 mL
Løsning af sporings element 1 mL
Destilleret vand 1000 mL
Ph 7,2

Tabel 3: minimal salt medium.

Variabel Enhed Beskrivelse
tY d Tidspunkt for måling
tX d Tidspunkt for foregående måling
pM mbar Målt overtryk ved tY
pA mbar Omgivende tryk ved tY
pAX mbar Omgivende tryk ved tX
ps mbar Standard tryk, 1013, 25 mbar Acc. DIN 1343
Tjeg K Inkubationstemperatur
TS K Standard temperatur, 273, 15 K (svarer til 0 ° C) Acc. DIN 1343
VH ml Headspace Volume på tY
VHX ml Headspace Volume ved tX
CH4% [vol%] Metankoncentrationen i henhold til GC-måling ved tY
CH4% X [vol%] Metankoncentrationen i henhold til GC-måling ved tX
VCH4T Nml Samlet methanmængde i serum flasken ved tY
VCH4R Nml Rest metanmængde i headspace ved tX
VCH4N Nml Nyproduceret methan fra tX til tY

Tabel 4: Beskrivelse af variabler i ligning 1-3.

Discussion

Det vigtigste og mest kritiske skridt i dyrkning af anaerobe mikroorganismer er at sikre iltfrie forhold i dyrkningsmedier og kolber ' headspace. En indikator som resazurin kan anvendes til indirekte at kontrollere den korrekte anaerobe påfyldning af kolberne. Resazurin er et almindeligt anvendt redox-farvestof, da det er billigt, giftfri og allerede effektivt i lave doser og korte inkubationstider 12. Når den er inkorporeret i medierne, gennemgår den blå farvede resazurin først et irreversibelt reduktions trin til resorufin, som er lyserød ved neutrale pH-værdier. Denne første reaktion kan opstå, når medierne er opvarmet 13. Derefter reduceres resorufin til farveløs dihydroresorufin i en reversibel sekundær reaktion (figur 7)12. Resorufin/dihydroresorufin redox-systemet bliver fuldstændigt farveløs ved et standard oxidations reduktionspotentiale på ca. Eh =-110 mv og bliver lyserød over et redox-potentiale på-51 mv 13.

For yderligere at reducere redox potentiale, for eksempel, for at lette væksten af methanogen mikroorganismer, der vides at kræve mindre end-200 mV14, en na2S opløsning kan tilsættes. Alternativt, cystein-HCl, natriumthioglycolat, eller natriumdithionit er almindeligt anvendt. Men, som reduktionsmiddel er hensigtsmæssigt at bruge, afhænger af den respektive eksperimentelle opsætning og kan kræve særlig opmærksomhed. For eksempel, natriumthioglycolat behov temperatur aktivering (f. eks, ved autoklave).

Et velafbalanceret mikrobielt konsortium bestående af forskellige Slater af bakterier og archaea og en effektivt fungerende anaerob nedbrydnings kaskade kan yderligere evalueres ved at bestemme headspace-Gassammensætningen i kultur flaskerne via gas Kromatografi. Ved håndtering af forbindelser som phenyl syrer afledt af forskellige prækursorer, vurderingen af headspace er en hurtig måde at kontrollere methanogenesis proces8. En headspace CH4 -koncentration på ca. 50-60% i kontrollerne ved slutningen af inkubationstiden indikerer en vellykket udnyttelse af de anvendte næringsstoffer og dermed en mineralisering af organisk materiale under anaerobe forhold. Den teoretiske metanproduktion og den forventede metankoncentration under fordøjelsesprocessen kan bestemmes ex ante i henhold til Buswell-Boyle ligningen efter elementær analyse af substratet eller ved at anslå indholdet af kulhydrater, proteiner og fedtstoffer i substratet. Ifølge VDI 4630 15, kulhydrater kan føre til en teoretisk biogasproduktion af 750 L kg-1 VSS (50% ch4 og 50% CO2), proteiner til 800 l kg-1 VSS (72% ch4 og 28% Co2), og fedtstoffer til 1.390 l kg -1 VSS (60% CH4 og 40% Co2).

Desuden blev dannelse og eventuel efterfølgende nedbrydning af VFAs og phenyl syrer overvåget. Nedbrydningsprocessen kan evalueres ved at analysere VFA-koncentrationerne (f. eks. acetat, propionat) på forskellige tidspunkter. Ophobning af kortkædede fedtsyrer som acetat og/eller propionat kan pege på forstyrrelser i methanogen Fællesskabet sammensætning og til en samlet reaktor overbelastning. Men en velafbalanceret mikrobiel nedbrydning kaskade kan endda klare meget høje VFA og acetat koncentrationer9. Desuden kan acetat/propionat forholdet yderligere give oplysninger om den samlede reaktor tilstand16. Der er dog mange parametre, som egner sig til procesovervågning, og som skal udvælges i henhold til de foreslåede eksperimentelle hypoteser. I det foreliggende eksempel var målvariablerne phenylsyrekoncentrationer (figur 6).

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Denne forskning blev finansieret af den østrigske videnskabs fond (FWF): projektnummer P 29360 og P 29143. Publikationen blev støttet af Publikationsfonds der Universität Innsbruck. Vi anerkender i høj grad EIG.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
culture flasks (120 mL, N20) Ochs, Germany 102046
buty rubber septa (N20) Ochs, Germany 102049
aluminium caps (N20) Ochs, Germany 102050
N2 gas Messer, Austria purity 5.0
syringes + cannulae various
crimper Ochs, Germany 102051
de-crimper Ochs, Germany 102052
GC2010 Shimadzu
Shin-carbon GC column Restek chromatographic separation of H2, O2, CH4, and CO2
HPLC Prominence Shimadzu
Fast Fruit HPLC Column Phenomenex chromatographic separation of VFAs, phenyl acids, etc.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wiebe, W. J., et al. Anaerobic Respiration and Fermentation. The Ecology of a Salt Marsh. Pomeroy, L. R., Wiegert, R. G. Springer New York. New York, NY. 137-159 (1981).
  2. Kim, B. H., Gadd, G. M. Anaerobic fermentation. Bacterial physiology and metabolism. Kim, B. H., Gadd, G. M. Cambridge University Press. Cambridge. 252-297 (2008).
  3. Stolz, J. F., Oremland, R. S. Bacterial respiration of arsenic and selenium). FEMS Microbiology Reviews. 23, (5), 615-627 (1999).
  4. Lackner, N., Hintersonnleitner, A., Wagner, A. O., Illmer, P. Hydrogenotrophic Methanogenesis and Autotrophic Growth of Methanosarcina thermophila. Archaea. 2018, (5), 1-7 (2018).
  5. Mutschlechner, M., Praeg, N., Illmer, P. The ecological importance of grazing to methane fluxes and engaged microbial communities in alpine forest soils. FEMS Microbiology Ecology. (2018).
  6. Prem, E. M., Reitschuler, C., Illmer, P. Livestock grazing on alpine soils causes changes in abiotic and biotic soil properties and thus in abundance and activity of microorganisms engaged in the methane cycle. European Journal of Soil Biology. 62, 22-29 (2014).
  7. Praeg, N., Wagner, A. O., Illmer, P. Effects of fertilisation, temperature and water content on microbial properties and methane production and methane oxidation in subalpine soils. European Journal of Soil Biology. 65, 96-106 (2014).
  8. Wagner, A. O., Prem, E. M., Markt, R., Kaufmann, R., Illmer, P. Formation of phenylacetic acid and phenylpropionic acid under different overload conditions during mesophilic and thermophilic anaerobic digestion. Biotechnology for Biofuels. 12, (1), 359 (2019).
  9. Lins, P., Malin, C., Wagner, A. O., Illmer, P. Reduction of accumulated volatile fatty acids by an acetate-degrading enrichment culture. FEMS Microbiology Ecology. 71, (3), 469-478 (2010).
  10. Wagner, A. O., Hohlbrugger, P., Lins, P., Illmer, P. Effects of different nitrogen sources on the biogas production - a lab-scale investigation. Microbiological research. 167, (10), 630-636 (2012).
  11. Wagner, A. O., et al. Sample preparation, preservation, and storage for volatile fatty acid quantification in biogas plants. Engineering in Life Sciences. 17, (2), 132-139 (2017).
  12. Uzarski, J. S., DiVito, M. D., Wertheim, J. A., Miller, W. M. Essential design considerations for the resazurin reduction assay to noninvasively quantify cell expansion within perfused extracellular matrix scaffolds. Biomaterials. 129, 163-175 (2017).
  13. Costilow, R. N., Breznak, J. A., et al. Physicochemical Factors in Growth. Methods for General and Molecular Microbiology. Marzluf, G. A. Third Edition, 309-329 (2007).
  14. Le Mer, J., Roger, P. Production, oxidation, emission and consumption of methane by soils: a review. European Journal of Soil Biology. 37, (1), 25-50 (2001).
  15. Verein deutscher Ingenieure VDI 4630: Fermentation of organic material. VDI Richtlinien. (2006).
  16. Wagner, A. O., Reitschuler, C., Illmer, P. Effect of different acetate: Propionate ratios on the methanogenic community during thermophilic anaerobic digestion in batch experiments. Biochemical Engineering Journal. 90, 154-161 (2014).
Medium forberedelse til dyrkning af mikroorganismer under strengt anaerobe/anoxiske forhold
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wagner, A. O., Markt, R., Mutschlechner, M., Lackner, N., Prem, E. M., Praeg, N., Illmer, P. Medium Preparation for the Cultivation of Microorganisms under Strictly Anaerobic/Anoxic Conditions. J. Vis. Exp. (150), e60155, doi:10.3791/60155 (2019).More

Wagner, A. O., Markt, R., Mutschlechner, M., Lackner, N., Prem, E. M., Praeg, N., Illmer, P. Medium Preparation for the Cultivation of Microorganisms under Strictly Anaerobic/Anoxic Conditions. J. Vis. Exp. (150), e60155, doi:10.3791/60155 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter