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Biochemistry

कड़ाई से एनारोबिक/

doi: 10.3791/60155 Published: August 15, 2019
* These authors contributed equally

Summary

के रूप में अवायवीय जीव ऑक्सीजन जोखिम पर विकसित करने में असमर्थ हैं, अवायवीय culturing तकनीकों का उपयोग अपरिहार्य है. यहाँ, हम एक मिश्रित एक बायोगैस संयंत्र से गैस और अस्थिर फैटी एसिड परिमाणीकरण के लिए तैयार करने के लिए एक बायोगैस संयंत्र से व्युत्पन्न संस्कृति खेती करने के लिए एक सरल और प्रभावी विधि का प्रदर्शन.

Abstract

एरोबिक जीवों के विपरीत, सख्ती से अवायवीय सूक्ष्मजीवों ऑक्सीजन की अनुपस्थिति की आवश्यकता होती है और आमतौर पर विकास आरंभ करने के लिए एक कम redox क्षमता. के रूप में ऑक्सीजन हवा में सर्वव्यापी है, खेती के सभी चरणों के दौरान ओ2मुक्त शर्तों को बनाए रखना चुनौतीपूर्ण है, लेकिन अवायवीय खेती के लिए एक शर्त है. यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक अवायवीय मिश्रित एक बायोगैस संयंत्र से प्राप्त संस्कृति के सफल खेती को दर्शाता है एक सरल और सस्ती विधि का उपयोग कर. पूरे anoxic culturing प्रक्रिया का एक सटीक विवरण मीडिया की तैयारी सहित दिया जाता है, खेती फ्लास्क भरने, redox सूचक के साथ पूरकता और एजेंटों को कम करने के लिए कम redox क्षमता प्रदान करने के साथ ही headspace का आदान प्रदान रखने के लिए मीडिया ऑक्सीजन से मुक्त. इसके अलावा, asptically inoculating गैस तंग सीरम फ्लास्क का एक विस्तृत अवलोकन (बंध्य सिरिंजों और सुइयों का उपयोग करके) और उपयुक्त ऊष्मायन स्थितियों प्रदान की जाती है। वर्तमान प्रोटोकॉल गैस संरचना और अस्थिर फैटी एसिड सांद्रता गैस क्रोमैटोग्राफी (जीसी) और उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (HPLC) का उपयोग कर के बारे में बाद के विश्लेषण के लिए गैस और तरल नमूने के साथ आगे सौदों, और बायोगैस और मीथेन की गणना आदर्श गैस कानून पर विचार.

Introduction

उल्लेखनीय सांद्रता में पृथ्वी आणविक ऑक्सीजन पर वातावरण के साथ सीधे संपर्क वाले क्षेत्रों में या ऑक्सीजनी प्रकाशपोषी की उपस्थिति में उपलब्ध है। वातावरण जिसमें ऑक्सीजन अनुपस्थित है अवायवीय कहा जाता है. तथापि, ऊर्जा रूपांतरण अभी भी दो अलग चयापचय प्रक्रियाओं, किण्वन और अवायवीय श्वसन1के माध्यम से अवायवीय परिस्थितियों में संभव है।

जबकि एरोबिक श्वसन से गुजरने वाले जीव अंतक इलेक्ट्रॉन स्वीकारकर्ता के रूप में ऑक्सीजन का उपयोग कर रहे हैं, अवायवीय श्वसन के लिए नाइट्रेट या सल्फेट2जैसे वैकल्पिक इलेक्ट्रॉन स्वीकारकर्ताओं की आवश्यकता होती है। तथाकथित "इलेक्ट्रोन टॉवर" में, रेडॉक्स जोड़ों को उनकी रेडॉक्स क्षमता के अनुसार आयोजित किया जाता है, शीर्ष पर स्थित सबसे नकारात्मक वाले (इलेक्ट्रोन दाताओं) और सबसे मजबूत ऑक्सीकरण एजेंटों के साथ नीचे सकारात्मक रेडॉक्स क्षमता के साथ (इलेक्ट्रोन स्वीकारकर्ता)। दाताओं और स्वीकारकर्ताओं के बीच इलेक्ट्रॉन हस्तांतरण तथाकथित श्वसन श्रृंखला और इलेक्ट्रॉनों के माध्यम से ऊर्जा संरक्षण की ओर जाता है इलेक्ट्रॉन स्वीकारकर्ताओं द्वारा कब्जा कर लिया जा सकता है - चित्र में रहने के लिए - टॉवर के विभिन्न फर्श में. इस प्रकार इलेक्ट्रॉन ों के माध्यम से इलेक्ट्रॉनों की गिरावट जितनी अधिक होगी, संबंधित अभिक्रिया द्वारा अधिक ऊर्जा संरक्षित की जा सकती है। इसलिए, श्वसन अवायवीय आवासों में भी संभव है, उदाहरण के लिए, कोई3-/सं2- , फ्यूमेरिक एसिड/सुचिनिक अम्ल, SO32-/H2S, S]/H2S, Mn(IV)/Mn(II सहित रेडॉक्स जोड़े के साथ) ), फे(III)/Fe(II)2,3. सबसे पहले, परिणामस्वरूप ऊर्जा झिल्ली क्षमता है, जो बाद में झिल्ली से बाध्य एटीपी-सिन्थेसास द्वारा एडेनोसाइन-ट्राइफॉस्फेट (एटीपी) संश्लेषण के लिए इलेक्ट्रॉन परिवहन फॉस्फोरिलेशन द्वारा प्रयोग किया जाता है के रूप में संरक्षित है। एरोबिक श्वसन के विपरीत, ऊर्जा की मात्रा है कि अवायवीय श्वसन द्वारा संरक्षित किया जा सकता है नाटकीय रूप से कम किया जा सकता है; तथापि, अधिकांश अवायवीय श्वसनों का ऊर्जा निर्गत किण्वन की तुलना में अभी भी अधिक है, ऑक्सीजन तथा अन्य टर्मिनल इलेक्ट्रॉन स्वीकारकर्ताओं2की कमी वाले आवासों में अवायवीय ऊर्जा संरक्षण पथ।

किण्वन के दौरान, ऊर्जा समृद्ध, कार्बनिक substrates विभिन्न किण्वन उत्पादों है कि अक्सर समग्र प्रक्रिया के नाम को परिभाषित करने के लिए अपमानित कर रहे हैं, उदाहरण के लिए, शराबी किण्वन. श्वसन प्रक्रियाओं के विपरीत, किण्वन के दौरान एटीपी उत्पादन सब्सट्रेट स्तर फॉस्फोरिलेशन तक सीमित है जिसके दौरान एक फॉस्फेट समूह को ऊर्जा से भरपूर फॉस्फोरीलेट2से एडेनोसाइन-डी-फॉस्फेट (एडीपी) में स्थानांतरित किया जाता है। निषेचन सूक्ष्मजीवों कार्बनिक पदार्थ के अवायवीय गिरावट में एक केंद्रीय भूमिका निभाते हैं क्योंकि वे सब्सट्रेट टूटने में प्रमुख खिलाड़ी हैं। प्राथमिक किण्वन उत्पाद, जैसे कार्बनिक अम्ल , अल्कोहल , ब्व्2और एच2, बाद में एसिटिक एसिड, ब्व्2और एच2का उत्पादन करने के लिए द्वितीयक किण्वित सूक्ष्मजीवों द्वारा उपयोग किया जा सकता है। किण्वन उत्पादों के लिए उदाहरण लैक्टिक एसिड, विभिन्न अस्थिर फैटी एसिड (फॉर्मिक-, एसिटिक-, प्रोपिओनिक-, ब्यूटिक-, वैलेरिक एसिड), n-butanol, 2,3-butandiol, एसीटोन, और इथेनॉल शामिल हैं।

सख्ती से अवायवीय परिस्थितियों में सूक्ष्मजीवों की खेती एरोबिक जीवों की खेती के साथ तुलना में पूरी तरह से अलग तरीकों और उपकरणों की आवश्यकता है। जबकि ऑक्सीजन-सहिष्णु जीवों को अक्सर आगर व्यंजन, तथाकथित सतह संस्कृतियों पर खेती की जाती है, यह है - कुछ अपवादों के साथ - सख्ती से अवायवीय सूक्ष्मजीवों के लिए शायद ही संभव हो। इसलिए, कड़ाई से अवायवीय सूक्ष्मजीवों की संवर्धन संस्कृतियों को मुख्य रूप से तरल मीडिया में स्थापित किया जाता है जो गैस-टाइट सेप्टा के साथ सील किए गए संस्कृति जहाजों को लागू करता है जो ऑक्सीजन मुक्त हेडस्पेस वातावरण4,6, 7.

वर्तमान प्रोटोकॉल विवरण एक अवायवीय बायोगैस संयंत्र से व्युत्पन्न मिश्रित आबादी के लक्ष्य सूक्ष्मजीवों के लिए उपयुक्त खेती के तरीके प्रदान करेगा। अलगाव और शुद्ध संस्कृतियों की खेती और भी अधिक चुनौतीपूर्ण है, लेकिन इस काम का हिस्सा नहीं है.

यहाँ हम प्रोटीनकेश substrates के अवायवीय पाचन के दौरान फेनिल एसिड के गठन के बारेमें एक अध्ययन के आधार पर एक अवायवीय माइक्रोबियल समुदाय की खेती के लिए प्रक्रिया दिखाते हैं। माइक्रोबियल समुदाय में अवायवीय पाचन के सभी चार चरणों के सदस्य शामिल थे: हाइड्रोलिसिस, अम्लजनन, एसीटोजेनेसिस, और मेथेनोजेनेसिस। एक खनिज नमक मध्यम एक कार्बन स्रोत के साथ पूरक, redox सूचक, विटामिन और ट्रेस तत्व समाधान, और एजेंट को कम करने के लिए लागू किया गया था9. इस माध्यम को संबंधित प्रोटीनी फेनिल अम्ल पुरोगामी के साथ संशोधित किया गया था.

Protocol

1. माध्यम की तैयारी

  1. रेडॉक्स सूचक स्टॉक समाधान (0.1 ग्राम रेज़ज़ुरिन/100 एमएल जलीय विलयन) तैयार करें।
  2. विटामिन का घोल तैयार करें (सारणी 1)।
  3. ट्रेस तत्व समाधान तैयार करें (सारणी 2)।
    नोट: इसके अलावा के आदेश महत्वपूर्ण है; कृपया तालिका 2 और संबंधित प्रोटोकॉल देखें.
  4. कम करने वाले एजेंट स्टॉक समाधान (60 ग्राम ना2S/
  5. एक उपयुक्त फ्लास्क (उदा., 1 एल स्क्रू कैप लैब फ्लास्क) में मध्यम सामग्री (खनिज नमक मध्यम, सारणी 3) का वजन करें।
    नोट: प्रयोगात्मक सेटअप पर निर्भर करता है, एक अलग कार्बन स्रोत के अलावा आवश्यक हो सकता है.
  6. आसुत जल का आधा मात्रा (सारणी 3) डालकर सामग्री को भंग कीजिये।
  7. सारणी 3के अनुसार 1 एमएल रेडॉक्स सूचक विलयन जोड़ें।
  8. तालिका 3के अनुसार विटामिन तथा ट्रेस तत्व समाधान जोड़ें।
  9. सारणी 3में मध्यम/जीव आवश्यकताओं के अनुसार पीएच समायोजित करें।
    नोट: रेलॉक्स सूचक का रंग पीएच निर्भर है और समायोजित करने के लिए कुछ समय की आवश्यकता हो सकती है।
  10. आसुत जल के साथ 1 ल की अंतिम मात्रा में लाइए।
    नोट: विटामिन और ट्रेस तत्व समाधान भी astotically द्वारा autoclaving के बाद जोड़ा जा सकता है एक फिल्टर-स्टरिलीकृत alicot जोड़ने (धुंधला समाधान, फिल्टर pores आकार और 0.2 $m) पहले से बंद और autoclaved सीरम फ्लास्क में. हालांकि, इस दृष्टिकोण संदूषण का एक ऊंचा जोखिम भालू.

2. खेती फ्लास्क भरना

  1. अच्छी तरह से साफ और सूखी 120 एमएल सीरम फ्लास्क.
    नोट: सीरम फ्लास्क विभिन्न मात्रा क्षमताओं (उदा., 20, 60, 120, 250 एमएल) में उपलब्ध हैं।
  2. अच्छी तरह से साफ और सूखी butyl रबर सेप्टा.
  3. खेती फ्लास्क में अतिरिक्त मध्यम घटक (उदा., फ़ेनिल एसिड अग्रदूत substrates) वजन.
    नोट: अतिरिक्त घटक प्रयोगात्मक सेटअप और परिकल्पना पर निर्भर करते हैं।
  4. सीरम फ्लास्क को 50 एमएल मध्यम के साथ भरें।

3. तरल चरण में ऑक्सीजन की कमी/

  1. एक $ 100 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान तैयार करें.
  2. तरल चरण में ओ2 की घुलनशीलता को कम करने के लिए लगभग 20-30 मिनट के लिए पानी के स्नान और इनक्यूबेट में भरा सीरम फ्लास्क सेट करें।
  3. हेडस्पेस को तुरंत छ2 गैस अथवा वैकल्पिक रूप से अन्य गैस अथवा गैस मिश्रण जैसे छ2/व् 2 के साथ निकाल दें ।
    चेतावनी: उचित कमरे वेंटिलेशन का ख्याल रखना।
  4. butyl रबर सेप्टा के साथ फ्लास्क बंद करें और एल्यूमीनियम टोपी के साथ ठीक.
    नोट: रबड़ सेप्टा अक्सर पानी की एक बूंद जोड़कर फ्लास्क की गर्दन पर बेहतर फिट हो सकता है /
  5. आगे रेडॉक्स क्षमता को कम करने के लिए माध्यम के 50 एमएल से भरे प्रत्येक फ्लास्क में एजेंट (स्टॉक समाधान) को कम करने के लिए 0.1 एमएल जोड़ें (0.1 एमएल प्रति 50 एमएल मध्यम के एजेंट को कम करने के लिए)।
  6. 121 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए ऑटोक्लेव।
    चेतावनी: बंद जहाजों की नसबंदी के लिए प्रमाणित एक ऑटोक्लेव का उपयोग किया जाना चाहिए। अन्यथा, तापमान वृद्धि से प्राप्त अतिदाब सीरम फ्लास्क को विस्फोट करने का कारण बन सकता है।

4. माध्यम का टीका

  1. अवायवीय डाइजेस्टर से इनोकुलम तैयार करें।
    1. एक फ्लास्क में 400 एमएल आसुत जल डालकर उबालें।
    2. इसे शांत करें (और 30 डिग्री सेल्सियस) जबकि स्थायी रूप से एन2के साथ हेडस्पेस को फ्लश किया जाता है।
    3. एक अवायवीय डाइजेस्टर से प्राप्त लगभग 100 ग्राम कीचड़ जोड़ें।
      नोट: ऑक्सीजन के साथ कीचड़ के अत्यधिक संपर्क से बचें।
    4. कमजोर पड़ने का सही निर्धारण के लिए जोड़ा कीचड़ की सटीक द्रव्यमान रिकॉर्ड.
    5. एन2 के साथ फ्लास्क के हेडस्पेस को एक्सचेंज करें और इसे ब्यूटिल रबर पट के साथ बंद करें।
    6. 120 आरपीएम पर 30 मिनट के लिए फ्लास्क हिलाओ.
  2. सिरिंज + कैनुला का उपयोग करके 5 एमएल इनोकुलम निकालें और चरण 1-3 में वर्णित के रूप में तैयार सीरम फ्लास्क में इंजेक्ट करें।

5. ऊष्मायन, नमूना, और विश्लेषण

  1. एक तापमान है कि संबंधित प्रयोग के लिए उपयुक्त है पर इनक्यूबेट टीका सीरम फ्लास्क।
    नोट: इनक्यूबेशन तापमान प्रयोगात्मक सेटअप पर निर्भर है और इनोकुलम का उपयोग किया जाता है।
    1. सिरिंज + कैनुला का उपयोग करके तापमान में वृद्धि के परिणामस्वरूप अधिक दबाव को छानलें, जब सीरम फ्लास्क में तरल ऊष्मायन तापमान (लगभग 15 - 30 मिनट, ऊष्मायन तापमान के आधार पर) के लिए बराबर हो जाता है।
      चेतावनी: लागू सब्सट्रेट पर निर्भर करता है, इसकी एकाग्रता, तापमान, ऊष्मायन समय, inoculum प्रकार और एकाग्रता, फ्लास्क के भीतर overpressure तक बढ़ सकता है और ऊपर से बढ़ सकता है और सीरम flaks विस्फोट करने के लिए कारण हो सकता है. एक मैनोमीटर का उपयोग करके और बाद में एक कैनुला के साथ अधिक दबाव draining द्वारा overpressure की निगरानी इसलिए अनिवार्य है।
  2. ऊष्मायन समय के दौरान बायोगैस उत्पादन और संरचना का मूल्यांकन करें।
    नोट: इनक्यूबेशन अवधि कई दिनों के लिए कुछ दिनों का विस्तार कर सकते हैं।
    1. वर्तमान वायुमंडलीय दबाव रिकॉर्ड करें.
    2. एक मैनोमीटर तैयार करें और माइक्रोबियल गतिविधि से प्राप्त फ्लास्क के भीतर दबाव का मूल्यांकन करें।
    3. फ्लास्क हिलाओ.
    4. एक सिरिंज + cannula का उपयोग कर headspace गैस के 1 एमएल निकालें, और उपाय एच2, ओ2, सीएच4, और /
      नोट: एच2की योग्यता और परिमाणीकरण के लिए, ओ2, सीएच4, और सीओ2, एक गैस क्रोमैटोग्राफ का उपयोग 160 डिग्री सेल्सियस (स्तंभ ओवन), 100 डिग्री सेल्सियस (इंज्यूटर), और 180 डिग्री सेल्सियस (तापीय चालकता डिटेक्टर, टीसीडी) के संचालन तापमान को लागू करने के लिए किया गया था। ). N2 एक वाहक गैस के रूप में इस्तेमाल किया गया था. विवरण के लिए, पिछले अध्ययन10को देखें.
  3. अस्थिर फैटी एसिड (VFA) और फ़ेनिल एसिड की सांद्रता की निगरानी करें। VFA और फ़ेनिल एसिड विश्लेषण के लिए, एक HPLC एक यूवी-डिटेक्टर से लैस प्रणाली का उपयोग करें (220 एनएम पर) एक मोबाइल चरण के रूप में 5 एमएम एच2SO4 के साथ चल रहा है। विधि के विवरण और नमूना भंडारण पर अतिरिक्त जानकारी के लिए, कृपया पिछले अध्ययन11को देखें.
    नोट: VFA का विश्लेषण कई अन्य भौतिक रासायनिक विश्लेषण या सूक्ष्म मूल्यांकन के लिए अनुकरणीय है. इसके अलावा, प्रयोग के एक निश्चित बिंदु पर विशिष्ट सूक्ष्मजीवों की बहुतायत और/या संयोजन को लक्षित करने वाले आणविक जैविक तरीकों को वर्णित प्रक्रिया का उपयोग करके लागू किया जा सकता है।
    1. सिरिंज + कैनुला के साथ तरल के 1 एमएल निकालें।
      नोट: नमूने वापसी के तुरंत बाद (-20 डिग्री सेल्सियस) जमे हुए और प्रयोग11के अंत में विश्लेषण किया जा सकता है।
    2. 15,000-20,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज और 0.2 डिग्री सेल्सियस आर सी (पुनर्जनित सेलूलोज़) फिल्टर के माध्यम से गुजरती हैं।
    3. एक HPLC प्रणाली पर 5-20 डिग्री सेल्सियस इंजेक्शन और वीएफए संरचना और फेनिल एसिड की एकाग्रता के लिए विश्लेषण.
  4. एक कैनुला का उपयोग करके फ्लास्क का अतिदाब ड्रेन करें।
    नोट: दबाव और गैस संरचना का निर्धारण करने के साथ ही किसी भी आवश्यक नमूना लेने के बाद, खेती फ्लास्क को संबंधित तापमान पर वापस रखें और तरल ऊष्मायन तापमान हासिल करने से पहले ओवरप्रेशर को न छानें।
  5. समीकरण 1-3 का उपयोग कर आदर्श गैस कानून पर विचार बायोगैस और मीथेन उत्पादन VCH4N की गणना करें। कृपया तालिका 4का भी संदर्भ लें।
    समीकरण 1:Equation 1
    जिससे
    समीकरण 2:Equation 2
    और
    समीकरण 3:Equation 3
    नोट: कुल बायोगैस उत्पादन की गणना के लिए, समीकरण 2 और 3में CH4% X की राशि 100 पर सेट की जानी है। NmL: मानकीकृत शर्तों के तहत सामान्यीकृत गैस की मात्रा (0 डिग्री सेल्सियस, 1 atm), जिसके तहत मोलर गैस की मात्रा 22.414 NmL/

Representative Results

खेती फ्लास्क ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल के अनुसार अवायवीय परिस्थितियों के तहत माध्यम से भर रहे थे, उपयुक्त रंग के लिए जाँच की (चित्र1), और लघु बैच bioreactors अवायवीय पाचन का संचालन के रूप में इस्तेमाल किया. इन्हें उपसंवदेहितों के साथ संशोधित किया गया जिससे फ़ेनिल-एसिड का निर्माण होता है और इनक्यूबेट्ड अवायवीय डाइजेस्टर कीचड़ को इनोकुलम के रूप में उपयोग करते हुए (चित्र 2) । ट्रिप्टोफान, टायरोसिन, और फेनिलएलनिन, साथ ही जटिल प्रोटीनी अग्रदूत मांस निकालने और केसीन को क्रमशः दो और तीन अलग-अलग सांद्रता में लागू किया गया था। नियंत्रण अतिरिक्त सब्सट्रेट पूरकता के बिना तैयार किए गए थे. अधिभार के विभिन्न चरणों के अनुकरण के उद्देश्य से विभिन्न सब्सट्रेट सांद्रता। Flasks 4 सप्ताह के लिए 37 डिग्री सेल्सियस (मेसोफिलिक) पर incubated थे।

बायोगैस उत्पादन और संरचना (एच2, सीएच4, सीओ2) गैस क्रोमैटोग्राफी (जीसी टीसीडी)10 और हेडस्पेस दबाव के मूल्यांकन के माध्यम से नियमित रूप से निगरानी की गई थी। चित्रा 3 अवायवीय ऊष्मायन के 4 सप्ताह के दौरान विभिन्न सांद्रता में लागू substrates के पाचन से व्युत्पन्न संचयी मीथेन उत्पादन में अंतर को दर्शाता है. इसके अतिरिक्त, मेथेनोजन को कोएंजाइम एफ420को विकिरणित करके विरूपित किया गया था, जो मेथेनोजेनेसिस में एक इलेक्ट्रॉन वाहक था, जिसमें 420 एनएमपरअवशोषण अधिकतम के साथ नीले-हरे फ्लोरोसेंट का प्रदर्शन किया गया था ।

गैस विश्लेषण करने के लिए समवर्ती, HPLC11 के माध्यम से VFA और फ़ेनिल एसिड एकाग्रता माप के लिए नमूने वापस ले लिया और आगे प्रसंस्करण तक जमे हुए संग्रहीत किया गया. चित्र 5 ओवरलोड के विभिन्न चरणों के प्रभाव को दर्शाता है जैसा कि अत्यधिक ओवरलोड नमूनों में संचय द्वारा परिलक्षित होता है, उदाहरण के लिए एसीटेट के लिए दर्शाया गया है। चित्र 6 ऊष्मायन अवधि के दौरान फ़ेनिल ऐसीटेट सांद्रता की गतिशीलता को दर्शाया गया है।

Figure 1
चित्र 1: Redox सूचक. खेती फ्लास्क में सही redox क्षमता एक redox सूचक जोड़कर नियंत्रित किया जा सकता है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: लघु बैच bioreactors. अवायवीय पाचन प्रयोगों के लिए 120 एमएल खेती फ्लास्क में तैयार लघु बैच बायोरिएक्टर। Flasks मध्यम से भर रहे थे और पतला डाइजेस्टर कीचड़ के साथ inoculated. रिएक्टरों गैस tightly butyl रबर stopers और एल्यूमीनियम टोपी के साथ बंद कर दिया गया. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: मीथेन उत्पादन। विभिन्न अधिभार स्थितियों (कम, मध्यम, उच्च) को दर्शाती रिएक्टरों से मेसोफिलिक ऊष्मायन के 28 दिनों के दौरान संचयी मीथेन उत्पादन। Cont: नियंत्रण; ट्रिप: ट्रिप्टोफान; टायर: टायरसिन; फी: फेनिलएलनिन; मुझे: मांस निकालने; कास: केसीन. यह एक संशोधित आंकड़ा है जो पहले के अध्ययन से उत्पन्नहोता है 8. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: Fluorescing methanogens. यूवी प्रकाश के साथ उत्साहित होने पर मेथेनोजेन एक नीले रंग की रोशनी का उत्सर्जन करते हैं। यहाँ, मेथेनोजन पौधे के कणों (हल्के हरे) से जुड़े होते हैं। नमूने एक बैच रिएक्टर से लिया गया, माइक्रोस्कोपी के लिए पतला, और तुरंत विश्लेषण किया. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: ऐसीटेट एकाग्रता. रिएक्टरों में मध्यरागी ऊष्मायन के 28 दिनों के दौरान एसीट एकाग्रता विभिन्न अधिभार स्थितियों (कम, मध्यम, उच्च) को दर्शाती है। Cont: नियंत्रण; ट्रिप: ट्रिप्टोफान; टायर: टायरसिन; फी: फेनिलएलनिन; मुझे: मांस निकालने; कास: केसीन. यह एक संशोधित आंकड़ा है जो पहले के अध्ययन से उत्पन्नहोता है 8. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्र ााााः ाााााः च आलः परायाम् । विभिन्न अधिभार स्थितियों (कम, मध्यम, उच्च) को दर्शाती रिएक्टरों में मेसोफिलिक ऊष्मायन के 28 दिनों के दौरान Phenylaceate एकाग्रता। Cont: नियंत्रण; ट्रिप: ट्रिप्टोफान; टायर: टायरसिन; फी: फेनिलएलनिन; मुझे: मांस निकालने; कास: केसीन. यह एक संशोधित आंकड़ा है जो पहले के अध्ययन से उत्पन्नहोता है 8. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 7
चित्र 7: Resazurin प्रतिक्रिया. नीले रंग का रेसाजुरिन रेसोरुफिन (गुलाबी) के लिए एक अपरिवर्तनीय कमी से गुजरता है और Uzarski एट अल के अनुसार रंगहीन dihydroresorufin के लिए एक और प्रतिवर्ती कमी से होकर गुजरतीहै। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

सायनोकोबालामिन 0.050 ग्राम
4-एमिनोबेन्जोइक अम्ल 0.050 ग्राम
डी-बायोटिन 0.010 ग्राम
निकोटिनिक अम्ल 0.100 ग्राम
Pyridoxine 0.250 ग्राम
डी-पैन्टोथेनिक अम्ल 0.025 ग्राम
थायमिनियम क्लोराइड एचसीएल 0.18 ग्राम
आसवनित जल 1000 एमएल

तालिका 1: विटामिन समाधान.

25% (w/v) एचसीएल 10.0 एमएल
FeCl2 x 4 H2हे 1.50 ग्राम
[एनसीएल2 0.070 ग्राम
MnCl2 x 4 H2हे 0.100 ग्राम
एच3बीओ3 0.006 ग्राम
कोसीएल2 x 6 एच2 0.190 ग्राम
CuCl2 x 2 H2हे 0.002 ग्राम
NiCl2 x 6 H2O 0.024 ग्राम
ना2मो4 x 2 एच2हे 0.036 ग्राम
आसवनित जल 990.0 एमएल
तैयारी सिफारिश एचसीएल जोड़ें और FeCl2भंग, 100 एमएल आसुत पानी जोड़ने, अन्य सामग्री भंग, और 1000 एमएल तक बनाते हैं।

तालिका 2: तत्व समाधान ट्रेस करें।

Nacl 1.0 ग्राम
MgCl2 x 6 H2हे 0.4 ग्राम
KH2पीओ4 0.2 ग्राम
केसीएल 0.5 ग्राम
CaCl2 x 2 H2हे 0.15 ग्राम
एल-सिस्टीन 0.5 ग्राम
खमीर निकालने 1.0 ग्राम
Resazurin समाधान 1 एमएल
विटामिन समाधान 1 एमएल
तत्व समाधान ट्रेस करें 1 एमएल
आसवनित जल 1000 एमएल
फोन 7.2

तालिका 3: न्यूनतम नमक मध्यम.

चर इकाई विवरण
टीवाई [घ] मापन का समय-बिंदु
टीएक्स [घ] पूर्ववर्ती माप का समय-बिंदु
पीएम [mbar] टीवाई पर दबाव मापा
पी [mbar] टीवाई पर परिवेश दबाव
पीए एक्स [mbar] टीएक्स पर परिवेश का दबाव
पीएस [mbar] मानक दबाव, 1013,25 mbar acc. दीन 1343
टीमैं [के] इनक्यूबेशन तापमान
टीएस [के] मानक तापमान, 273,15 K (0 डिग्री सेल्सियस के अनुरूप) acc. DIN 1343
वीएच [एमएल] टीवाई पर हेडस्पेस वॉल्यूम
वीएच एक्स [एमएल] टीएक्स में हेडस्पेस वॉल्यूम
सीएच4% [vol%] टीवाई में जीसी-माप के अनुसार मीथेन एकाग्रता
सीएच4%X [vol%] टीएक्स में जीसी-माप के अनुसार मीथेन एकाग्रता
वीCH4T [Nml] टीवाई में सीरम बोतल में कुल मीथेन राशि
वीCH4R [Nml] टीएक्स में हेडस्पेस में अवशिष्ट मीथेन की मात्रा
वीCH4N [Nml] टीएक्स से टीवाई तक नए उत्पादित मीथेन

तालिका 4: समीकरण 1 - 3 में चर का विवरण।

Discussion

अवायवीय सूक्ष्मजीवों की खेती में सबसे महत्वपूर्ण और महत्वपूर्ण कदम खेती मीडिया और फ्लास्क के हेडस्पेस में ऑक्सीजन मुक्त स्थिति सुनिश्चित करना है। रेसाजुरिन जैसे संकेतक का उपयोग अप्रत्यक्ष रूप से फ्लास्क के सही अवायवीय भरने की जांच करने के लिए किया जा सकता है। Resazurin एक आमतौर पर इस्तेमाल किया redox डाई के रूप में यह सस्ती है, गैर विषैले, और पहले से ही कम खुराक और कम ऊष्मायन समय में प्रभावी 12. जब मीडिया के लिए शामिल, नीले रंग resazurin पहले resorufin, जो तटस्थ पीएच मूल्यों पर गुलाबी है करने के लिए एक अपरिवर्तनीय कमी कदम से होकर गुजरती है. यह पहली प्रतिक्रिया तब हो सकती है जब मीडिया को 13गर्म किया जाता है . इसके बाद, रेसोरूफिन को उत्क्रमणीय द्वितीयक अभिक्रिया में बेरंग डाइहाइड्रोरेसोरूफिन में कम कर दिया जाता है (चित्र 7)12. Resorufin/dihydroresorufin redox प्रणाली के बारे में ईएच के एक मानक ऑक्सीकरण कमी क्षमता पर पूरी तरह से बेरंग हो जाता है - -110 mV और -51 mV 13की एक redox क्षमता के ऊपर गुलाबी बदल जाता है.

रेडॉक्स क्षमता को और कम करने के लिए, उदाहरण के लिए, मेथेनोजेनिक सूक्ष्मजीवों के विकास को सुविधाजनक बनाने के लिए, जिसे -200 एमवी14से कम की आवश्यकता होती है, एक ना2एस समाधान जोड़ा जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, सिस्टीन-एचसीएल, सोडियम-थायोग्लाइकोलेट, या सोडियम डाइथियोनाइट आमतौर पर उपयोग किया जाता है। हालांकि, जो एजेंट को कम करने का उपयोग करने के लिए उपयुक्त है संबंधित प्रयोगात्मक सेटअप पर निर्भर करता है और विशेष ध्यान देने की आवश्यकता हो सकती है. उदाहरण के लिए, सोडियम थायोग्लाइकोलेट को तापमान सक्रियण की आवश्यकता होती है (उदाहरण के लिए, ऑटोक्लेवन द्वारा)।

एक अच्छी तरह से संतुलित माइक्रोबियल संघ, बैक्टीरिया और Archaea के विभिन्न वंश के शामिल है, और एक कुशलता से काम अवायवीय गिरावट झरना आगे गैस के माध्यम से संस्कृति फ्लास्क में headspace गैस संरचना का निर्धारण करके मूल्यांकन किया जा सकता है क्रोमैटोग्राफी. जब विभिन्न अग्रदूतों से व्युत्पन्न फ़ेनिल एसिड जैसे यौगिकों को संभालते हैं, तो हेडस्पेस का मूल्यांकन मेथेनोजेनेसिस प्रक्रिया8की जांच करने का एक तेज़ तरीका है। ऊष्मायन अवधि के अंत में नियंत्रण में लगभग 50-60% की एक हेडस्पेस CH4 एकाग्रता लागू पोषक तत्वों का सफल उपयोग इंगित करती है और इस प्रकार अवायवीय परिस्थितियों में कार्बनिक सामग्री का एक खनिज। पाचन प्रक्रिया के दौरान सैद्धांतिक मीथेन उत्पादन और उम्मीद मीथेन सांद्रता सब्सट्रेट के प्राथमिक विश्लेषण के बाद या की सामग्री का आकलन करके Buswell-Boyle समीकरण के अनुसार पूर्व निर्धारित किया जा सकता है कार्बोहाइड्रेट, प्रोटीन, और सब्सट्रेट में वसा. VDI 4630 15के अनुसार , कार्बोहाइड्रेट 750 एल किलो-1 वीएसएस (50% CH4 और 50% सीओ2), प्रोटीन से 800 एल किलो-1 वीएसएस (72% CH4 और 28 % CO2) और वसा का सैद्धांतिक बायोगैस उत्पादन हो सकता है 1,390 एल किलो -1 वीएसएस (60% CH4 और 40% सीओ2)।

इसके अलावा, VFAs और फ़ेनिल एसिड के गठन और संभव बाद में गिरावट की निगरानी की गई. गिरावट की प्रक्रिया VFA सांद्रता का विश्लेषण करके मूल्यांकन किया जा सकता है (उदा., एसीटेट, propionate) अलग अलग समय बिंदुओं पर. एसीटेट और/या प्रोपिओनेट जैसे शॉर्ट-चेन फैटी एसिड का संचय मेथेनोजेनिक समुदाय संरचना में गड़बड़ी को इंगित कर सकता है और एक समग्र रिएक्टर अधिभार के लिए। हालांकि, एक अच्छी तरह से संतुलित माइक्रोबियल गिरावट झरना भी बहुत उच्च VFA और एसीटेट सांद्रता9के साथ सामना कर सकते हैं. इसके अलावा, ऐसीटेट / प्रोपिओनेट अनुपात समग्र रिएक्टर स्थिति16के बारे में जानकारी प्रदान कर सकता है। हालांकि, वहाँ कई प्रक्रिया की निगरानी है कि प्रस्तावित प्रयोगात्मक hypotheses के अनुसार चयन किया जाना है के लिए उपयुक्त पैरामीटर हैं. वर्तमान उदाहरण में लक्ष्य चर फ़ेनिल अम्ल सांद्रता थे (चित्र 6)।

Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

इस शोध ऑस्ट्रियाई विज्ञान कोष (FWF): परियोजना संख्या P 29360 और पी 29143 द्वारा वित्त पोषित किया गया. प्रकाशन Publikationsfonds der Universit]t Innsbruck द्वारा समर्थित किया गया था. हम बहुत EIG स्वीकार करते हैं.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
culture flasks (120 mL, N20) Ochs, Germany 102046
buty rubber septa (N20) Ochs, Germany 102049
aluminium caps (N20) Ochs, Germany 102050
N2 gas Messer, Austria purity 5.0
syringes + cannulae various
crimper Ochs, Germany 102051
de-crimper Ochs, Germany 102052
GC2010 Shimadzu
Shin-carbon GC column Restek chromatographic separation of H2, O2, CH4, and CO2
HPLC Prominence Shimadzu
Fast Fruit HPLC Column Phenomenex chromatographic separation of VFAs, phenyl acids, etc.

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References

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कड़ाई से एनारोबिक/
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Wagner, A. O., Markt, R., Mutschlechner, M., Lackner, N., Prem, E. M., Praeg, N., Illmer, P. Medium Preparation for the Cultivation of Microorganisms under Strictly Anaerobic/Anoxic Conditions. J. Vis. Exp. (150), e60155, doi:10.3791/60155 (2019).More

Wagner, A. O., Markt, R., Mutschlechner, M., Lackner, N., Prem, E. M., Praeg, N., Illmer, P. Medium Preparation for the Cultivation of Microorganisms under Strictly Anaerobic/Anoxic Conditions. J. Vis. Exp. (150), e60155, doi:10.3791/60155 (2019).

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