Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

Medium forberedelse til dyrking av mikroorganismer under strengt anaerob/anoksisk forhold

doi: 10.3791/60155 Published: August 15, 2019
* These authors contributed equally

Summary

Som forplikte anaerobe organismer er ute av stand til å vokse på oksygen eksponering, bruk av anaerob dyrking teknikker er uunnværlig. Her viser vi en enkel og effektiv metode for å dyrke en blandet kultur avledet fra et biogass-anlegg fra Media forberedelse til gass og flyktige fatty acid kvantifisering.

Abstract

I motsetning til aerobe organismer, strengt anaerobe mikroorganismer krever fravær av oksygen og vanligvis en lav Redox potensial til å initiere vekst. Som oksygen er allestedsnærværende i luft, beholde O2-frie forhold under alle trinn av dyrking er utfordrende, men en forutsetning for anaerob dyrking. Protokollen som presenteres her demonstrerer vellykket dyrking av en anaerob blandet kultur avledet fra en biogass anlegg ved hjelp av en enkel og rimelig metode. En presis beskrivelse av hele anoksisk dyrking prosessen er gitt inkludert Media forberedelse, fylling av dyrking flasker, tilskudd med Redox indikator og redusere agenter for å gi lave Redox potensialer samt utveksle Headspace å holde medier uten oksygen. Videre er det gitt en detaljert oversikt over aseptisk vaksinere gasstette serum flasker (ved bruk av sterile sprøyter og nåler) og egnede inkubasjons forhold. Den nåværende protokollen omhandler videre gass og væske prøvetaking for senere analyser vedrørende gass sammensetning og flyktige fettsyrer konsentrasjoner ved hjelp av gass kromatografi (GC) og høy ytelse flytende kromatografi (HPLC), henholdsvis, og beregning av biogass og metan yield vurderer den ideelle gass loven.

Introduction

På jorden er molekylær oksygen i bemerkelsesverdige konsentrasjoner tilgjengelig i områder som har direkte kontakt med atmosfæren eller i nærvær av oxygenic phototrophs. Miljøer der oksygen er fraværende kalles anaerob. Imidlertid er energi konvertering fortsatt mulig under anaerobe forhold via to forskjellige metabolske prosesser, gjæring og anaerob åndedrett1.

Mens organismer som gjennomgår aerob åndedrett bruker oksygen som Terminal elektron Acceptor, krever anaerob åndedrett alternative elektron aksept Orer som nitrat eller sulfat2. I den såkalte "elektron tårn", er Redox par organisert i henhold til deres Redox potensial, med de mest negative som ligger på toppen (elektron givere) og sterkeste oksidasjonsmidler med positiv Redox potensial på bunnen (elektron aksept Orer). Elektron overføringen mellom donorer og aksept Orer fører til energisparing via den såkalte luftveis kjeden og elektroner kan fanges opp av elektron aksept Orer-å bo i bildet-i forskjellige etasjer i tårnet. Derved, jo høyere fall av elektroner gjennom elektron tårnet, jo mer energi kan bli bevart av de respektive reaksjon. Derfor er åndedrett også mulig i anaerobe habitater, for eksempel med Redox par, inkludert ingen3-/no2-, fumar acid/ravsyre acid, så32-/H2S, s °/H2s, MN (IV)/MN (II ), Fe (III)/fe (II)2,3. Først blir den resulterende energien bevart som membran potensial, som senere brukes av elektron transport fosforylering for adenosin-trifosfat (ATP) syntese av membran-bundet ATP-synthases. I motsetning til aerob åndedrett, kan mengden energi som kan bevares ved anaerob åndedrett reduseres dramatisk; Imidlertid er energiproduksjonen av de fleste anaerobe respirations fortsatt høyere sammenlignet med gjæring, en anaerob energisparing bane i habitater som mangler oksygen og andre Terminal elektron aksept Orer2.

Under gjæring, energi-rik, organiske underlag er degradert til ulike gjærings produkter som ofte definerer navnet på den samlede prosessen, for eksempel alkoholholdige gjæring. I motsetning til åndedrett prosesser, ATP generasjon under gjæring er begrenset til substrat-nivå fosforylering der en fosfat gruppe er overført til adenosin-di-fosfat (ADP) fra en energi-rik fosforylert substrat2. Gjæring mikroorganismer spiller en sentral rolle i anaerob degradering av organisk materiale som de er viktige-aktører i substrat sammenbrudd. De primære gjærings produktene, som organiske syrer, alkoholer, CO2og H2, kan senere brukes av sekundære gjærings mikroorganismer for å produsere eddiksyre, co2og H2. Eksempler for gjæring produkter inkluderer melkesyre, ulike flyktige fettsyrer (maursyre-, eddiks-, propionsyre-, smørsyre-, valeriansyre acid), n-butanol, 2, 3-butandiol, aceton, og etanol.

Dyrking av mikroorganismer under strengt anaerobe forhold krever helt forskjellige metoder og utstyr sammenlignet med dyrking av aerobe organismer. Mens oksygen-tolerante organismer er ofte dyrket på agar retter, såkalt overflate kulturer, er dette-med noen få unntak-neppe mulig for strengt anaerobe mikroorganismer. Derfor, berikelse kulturer av strengt anaerobe mikroorganismer er i hovedsak etablert i flytende Media søker kultur fartøy forseglet med gasstette septa som sikrer en oksygenfri Headspace atmosfære4,6, 7i.

Den nåværende protokollen beskrivelse vil gi hensiktsmessig dyrking metoder for mål mikroorganismer av en blandet befolkning avledet fra en anaerob biogass anlegget. Isolasjon og dyrking av rene kulturer er enda mer utfordrende, men ikke en del av dette arbeidet.

Her viser vi prosedyren for dyrking av en anaerob mikrobiell samfunn basert på en studie om dannelsen av fenyl syrer under anaerob fordøyelse av proteinaktige underlag8. Den mikrobielle samfunnet besto av medlemmer fra alle fire faser av anaerob fordøyelse: hydrolyse, acidogenesis, acetogenesis, og methanogenesis. En mineral salt medium supplert med en karbon kilde, Redox-indikator, vitamin og sporstoffet løsning, og redusere agent ble brukt9. Mediet ble endret med de respektive proteinaktige fenyl acid forløper underlag8.

Protocol

1. utarbeidelse av medium

  1. Forbered Redox indikator lagerløsning (0,1 g resazurin/100 mL vandig oppløsning).
  2. Forbered vitamin løsning (tabell 1).
  3. Klargjør løsning for sporings element (tabell 2).
    Merk: rekkefølgen på tillegg er viktig; kan du se tabell 2 og respektive protokoller.
  4. Forbered å redusere agent lagerløsning (60 g na2S/L vandig løsning).
  5. Veie mellom store ingredienser (mineral salt medium, tabell 3) i en passende kolbe (f. eks, 1 L skrue cap Lab kolbe).
    Merk: avhengig av det eksperimentelle oppsettet, kan det være nødvendig å legge til en separat karbon kilde.
  6. Tilsett halv volum av destillert vann (tabell 3) og oppløse ingrediensene.
  7. Tilsett 1 mL Redox indikator løsning i henhold til tabell 3.
  8. Legg til vitamin-og spor element løsning i henhold til tabell 3.
  9. Juster pH i henhold til medium/organisme krav i tabell 3.
    Merk: farge på Redox indikatoren er pH-avhengig og kan kreve litt tid å justere.
  10. Bring til et endelig volum på 1 L med destillert vann.
    Merk: vitamin-og sporstoff løsninger kan også legges til etter autoklavering ved aseptisk å legge til et filter-sterilisert alikvot (fortynnede oppløsninger, filter pore størrelse < 0,2 μm) i tidligere lukkede og autoklaveres serum flasker. Imidlertid bærer denne tilnærmingen en forhøyet risiko for forurensning.

2. fylling av dyrking flasker

  1. Rengjør og tørk 120 mL serum flasker grundig.
    Merk: serum flasker fås i forskjellige volum kapasiteter (f.eks. 20, 60, 120, 250 mL).
  2. Grundig ren og tørr butyl gummi septa.
  3. Veie ekstra medium komponenter (f. eks, fenyl yre forløper underlag) i dyrking flasker.
    Merk: tilleggskomponenter avhenger av eksperimentell oppsett og hypotese.
  4. Fyll serum flaskene med 50 mL medium.

3. reduksjon/fjerning av oksygen i væskefasen

  1. Forbered en ~ 100 ° C vannbad.
  2. Sett fylte serum flasker i vannbadet og ruge i ca. 20-30 min. for å redusere løselighet av O2 i væskefasen.
  3. Skyll Headspace umiddelbart med N2 gass eller alternativt med andre gass eller gassblandinger som N2/co2.
    FORSIKTIG: Pass på riktig ventilasjon av rommet.
  4. Lukk flaskene med butyl gummi septa og fest med aluminiums caps.
    Merk: gummi septa kan ofte passe bedre på halsen på flasken ved å legge en dråpe vann/medium mens du borer den i.
  5. Tilsett 0,1 mL reduksjonsmiddel (lagerløsning) til hver kolbe fylt med 50 mL medium for ytterligere å redusere det Redox potensialet (0,1 mL reduksjonsmiddel per 50 mL medium).
  6. Autoklav for 20 min ved 121 ° c.
    FORSIKTIG: en autoklav som er sertifisert for sterilisering av lukkede fartøy må brukes. Ellers kan overtrykk avledet fra temperaturøkningen føre til at serum flasker eksploderer.

4. inoculation av mediet

  1. Forbered inokulum fra anaerob digester.
    1. Tilsett 400 mL destillert vann i en kolbe og få det til å koke.
    2. Avkjøl det (< 30 ° c) mens du permanent tømmer Headspace med N2.
    3. Tilsett ca. 100 g slam avledet fra en anaerob digester.
      Merk: unngå overdreven kontakt av slam med oksygen.
    4. Noter nøyaktig massen av tilsatt slam for nøyaktig bestemmelse av fortynning.
    5. Utveksle kolbe ' s Headspace med N2 og Lukk den med en butyl gummi septum.
    6. Rist flasken i 30 minutter ved 120 RPM.
  2. Fjern 5 mL inokulum ved å bruke sprøyten + kanyle og Injiser den i tilberedte serum flasker som beskrevet i trinn 1-3.

5. inkubasjons, prøvetaking og analyse

  1. Ruge inokulert serum flasker ved en temperatur som passer for det respektive eksperimentet.
    Merk: Inkubasjons temperatur er avhengig av eksperimentell oppsett og brukt inokulum.
    1. Drenerings overtrykk som følge av temperaturøkningen ved hjelp av sprøyte + kanyle, når væsken i serum flaskene har equilibrated til inkubasjons temperatur (ca. 15 – 30 min, avhengig av inkubasjons temperatur).
      FORSIKTIG: avhengig av anvendt substrat, dens konsentrasjon, temperatur, inkubasjonstid, inokulum type og konsentrasjon, kan overtrykk innenfor kanner stige med opptil > 2 bar trykk og kan føre til at serum flaks å eksplodere. Overvåking av overtrykk ved hjelp av en manometer og deretter drenering overtrykk med en kanyle er derfor obligatorisk.
  2. Evaluere produksjon og sammensetning av biogass under inkubasjonstid.
    Merk: inkubasjonsperioden kan strekke seg over noen dager til flere uker.
    1. Registrer gjeldende atmosfærisk trykk.
    2. Forbered en manometer og evaluere trykket i flaskene avledet fra mikrobiell aktivitet.
    3. Rist flaskene.
    4. Fjern 1 mL av Headspace gass ved hjelp av en sprøyte + kanyle, og måle H2, O2,4ch, og/eller co2 konsentrasjoner via gass kromatografi.
      Merk: for kvalifisering og kvantifisering av H2, O2, ch4og co2, ble en gass-kromatografisk brukt ved bruk av driftstemperaturer på 160 ° c (spalte ovn), 100 ° c (injeksjons) og 180 ° c (termisk ledningsevne detektor, TCD ). N2 ble brukt som transportør gass. For detaljer, se tidligere studier10.
  3. Overvåk konsentrasjoner av flyktige fettsyrer (VFA) og fenyl syrer. For VFA og fenyl yre analyse, bruk et HPLC-system utstyrt med en UV-detektor (ved 220 NM) som kjører med 5 mM H24 som en mobil fase. For detaljer om metoden og ytterligere informasjon om prøve lagring, henvises det til tidligere studier11.
    Merk: analysen av VFA er eksemplarisk for mange andre fysikalsk-kjemiske analyser eller mikroskopiske evalueringer. Videre, molekylærbiologiske metoder rettet mot overflod av spesifikke mikroorganismer og/eller sammensetning av mikrobiell samfunnet på et bestemt punkt av eksperimentet kan påføres ved hjelp av beskrevet prosedyren.
    1. Fjern 1 mL væske med sprøyte + kanyle.
      Merk: prøver kan fryses (-20 ° c) umiddelbart etter uttak og analysert på slutten av eksperimentet11.
    2. Sentrifuger ved 15000 – 20000 x g og passerer gjennom 0,2 μm RC-filtre (generert cellulose).
    3. Injiser 5-20 μL på et HPLC-system og analyser for VFA sammensetning og konsentrasjon av fenyl syrer.
  4. Drain kolbe overtrykk ved hjelp av en kanyle.
    Merk: etter fastsettelse av trykk og gass sammensetning, samt å ta eventuelle nødvendige prøven, plassere dyrking kolbe tilbake på respektive temperatur og ikke renne overtrykk før væsken har oppnådd den inkubasjons temperatur.
  5. Beregn produksjon av biogass og metan VCH4N med tanke på den ideelle gass loven ved hjelp av ligning 1-3. Se også Tabell 4.
    Formel 1:Equation 1
    Der
    Formel 2:Equation 2
    Og
    Formel 3:Equation 3
    Merk: for beregning av total biogass-produksjon, må mengden av CH4% og ch4% X i ligning 2 og 3 settes til 100. NmL: normalisert gassvolum under standardiserte forhold (0 ° c, 1 ATM), der molar gass volumet er 22,414 NmL/mmol.

Representative Results

Dyrking flasker ble fylt med medium under anaerobe forhold i henhold til protokollen beskrevet ovenfor, sjekket for den aktuelle fargen (figur 1), og brukes som miniatyr batch bioreaktorer gjennomfører anaerob fordøyelse. Disse ble endret med underlag potensielt forårsaker fenyl-syre dannelse og inkubert ved hjelp av anaerob digester slam som inokulum (figur 2). Tryptofan, tyrosin, og fenylalanin, samt komplekse proteinaktige forløper kjøtt ekstrakt og kasein ble brukt i to og tre forskjellige konsentrasjoner, henholdsvis. Kontroller ble utarbeidet uten ekstra substrat kosttilskudd. Ulike substrat konsentrasjoner rettet mot simulering av ulike stadier av overbelastning. Flasker ble inkubert ved 37 ° c (mesofile) i 4 uker.

Biogass produksjon og sammensetning (H2, ch4, co2) ble OVERVÅKET regelmessig via gass kromatografi (GC TCD)10 og evaluering av Headspace press. Figur 3 demonstrerer forskjeller i den kumulative metan produksjonen avledet fra fordøyelsen av anvendt underlag i varierte konsentrasjoner i løpet av 4 uker med anaerob inkubasjons. Foruten, methanogens ble visualisere av irradiirujushhaja den koenzym F420, en elektron bærer i methanogenesis, viser en blå-grønne fluorescens med en absorpsjon maksimum på 420 NM (Figur 4).

Samtidige til gassanalyse, prøver for VFA og fenyl syre konsentrasjons målinger via HPLC11 ble trukket tilbake og lagret frosset inntil videre behandling. Figur 5 viser effekten av ulike stadier av overbelastning som gjenspeiles av en opphopning i svært overbelastet prøver eksempelvis avbildet for acetate. Figur 6 viser dynamikken i fenyl acetate konsentrasjoner i løpet av inkubasjonsperioden.

Figure 1
Figur 1: Redox-indikator. Riktig Redox potensialet i dyrking flasker kan styres ved å legge en Redox indikator. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: miniatyr batch bioreaktorer. Miniatyr batch bioreaktorer utarbeidet i 120 mL dyrking flasker for anaerob fordøyelsen eksperimenter. Flasker var fylt med medium og inokulert med fortynnet digester slam. De reaktorer var gass-tett forseglet med butyl gummi propper og aluminium caps. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: produksjon av metan. Kumulativ metan-produksjon i løpet av 28 dager med mesofile inkubasjons fra reaktorer som reflekterer ulike overbelastnings forhold (lav, middels, høy). CONT: kontroll; Tryp: tryptofan; Tyr: tyrosin; Phe: fenylalanin; ME: kjøtt ekstrakt; CAS: kasein. Dette er en modifisert figur som stammer fra en tidligere studie8. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: fluorescerende methanogens. Methanogens avgir et blåaktig lys når du blir opphisset av UV-lys. Her er methanogens festet til plante partikler (lys grønn). Prøvene ble tatt fra en batch reaktor, fortynnet for mikroskopi, og umiddelbart analysert. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: acetate konsentrasjon. Acetate konsentrasjon i løpet av 28 dager med mesofile inkubasjons i reaktorer som reflekterer ulike overbelastning forhold (lav, middels, høy). CONT: kontroll; Tryp: tryptofan; Tyr: tyrosin; Phe: fenylalanin; ME: kjøtt ekstrakt; CAS: kasein. Dette er en modifisert figur som stammer fra en tidligere studie8. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: Phenylacetate konsentrasjon. Phenylacetate konsentrasjon i løpet av 28 dager med mesofile inkubasjons i reaktorer som reflekterer ulike overbelastnings forhold (lav, middels, høy). CONT: kontroll; Tryp: tryptofan; Tyr: tyrosin; Phe: fenylalanin; ME: kjøtt ekstrakt; CAS: kasein. Dette er en modifisert figur som stammer fra en tidligere studie8. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7: Resazurin reaksjon. Blå fargede resazurin gjennomgår en irreversibel reduksjon i resorufin (rosa) og en ytterligere reversibel reduksjon til den fargeløs dihydroresorufin i henhold til Uzarski et al.12. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Cyanokobalamin 0,050 g
4-aminobenzosyre syre 0,050 g
D-biotin 0,010 g
Nikotins syre 0,100 g
Pyridoksin 0,250 g
D-Pantotensyre syre 0,025 g
Thiaminium klorid HCl 0,18 g
Destillert vann 1000 mL

Tabell 1: vitamin løsning.

25% (w/v) HCl 10,0 mL
FeCl2 x 4 t2O 1,50 g
ZnCl2 0,070 g
MnCl2 x 4 t2O 0,100 g
H3bo3 0,006 g
CoCl2 x 6 t2O 0,190 g
CuCl2 x 2 t2O 0,002 g
NiCl2 x 6 t2O 0,024 g
Na2MoO4 x 2 H2O 0,036 g
Destillert vann 990,0 mL
Forberedelse anbefaling Legg HCl og oppløse FeCl2, tilsett 100 ml destillert vann, oppløse de andre ingrediensene, og utgjør opptil 1000 ml.

Tabell 2: spor element løsning.

Nacl 1,0 g
MgCl2 x 6 t2O 0,4 g
KH2PO4 0,2 g
KCl 0,5 g
CaCl2 x 2 t2O 0,15 g
L-cystein 0,5 g
Gjærekstrakt 1,0 g
Resazurin løsning 1 mL av
Vitamin løsning 1 mL av
Løsning for sporings element 1 mL av
Destillert vann 1000 mL
Ph 7,2

Tabell 3: minimal salt medium.

Variabel Enhet Beskrivelse
tY d Timepoint av måling
tX d Timepoint av foregående måling
pM mbar Målt overtrykk ved tY
pA mbar Omgivelsestrykk på tY
pAX mbar Omgivelsestrykk ved tX
pS mbar Standard trykk, 1013, 25 mbar iht. DIN 1343
Tjeg K Inkubasjons temperatur
TS K Standard temperatur, 273, 15 K (tilsvarer 0 ° C) iht. DIN 1343
VH ml Headspace volum på tY
Vhx ml Headspace volum på tX
CH4% [Vol%] Metan konsentrasjon i henhold til GC-måling på tY
CH4% X [Vol%] Metan konsentrasjon i henhold til GC-måling på tX
VCH4T NML Total mengde metan i serum flasken på tY
VCH4R NML Resterende metan beløp i Headspace på tX
VCH4N NML Nylig produserte metan fra tX til tY

Tabell 4: beskrivelse av variabler i Formel 1-3.

Discussion

Det viktigste og mest kritiske trinnet i dyrking anaerobe mikroorganismer er å sikre oksygen-frie forhold i dyrking av medier og kanner ' Headspace. En indikator som resazurin kan brukes til å indirekte kontrollere riktig anaerob fylling av flaskene. Resazurin er en vanlig brukt Redox fargestoff som det er billig, ikke-giftig, og allerede effektiv i lave doser og korte inkubasjons ganger 12. Når innlemmet å Media, det blåfarge farget resazurin for det første gjennomgår en irreversibel reduksjon steg å resorufin, hvilke er lyserød for nøytral pH verdier. Denne første reaksjonen kan oppstå når mediene varmes opp 13. Deretter blir resorufin redusert til fargeløs dihydroresorufin i en reversibel sekundær reaksjon (figur 7)12. Den resorufin/dihydroresorufin Redox systemet blir helt fargeløs på en standard oksidasjons-reduksjon potensialet for om Eh =-110 mv og svinger rosa over et Redox potensial av-51 mv 13.

For å ytterligere redusere Redox potensialet, for eksempel for å lette veksten av methanogenic mikroorganismer som er kjent for å kreve mindre enn-200 mV14, kan en na2S-løsning legges til. Alternativt brukes cystein-HCl, natrium-tioglykolat eller natrium dithionite ofte. Men, som reduserer agent er hensiktsmessig å bruke, avhenger av de respektive eksperimentelle oppsett og kan kreve spesiell oppmerksomhet. For eksempel trenger natrium tioglykolat temperatur aktivering (f.eks. ved autoklavering).

En godt balansert mikrobiell konsortium, bestående av ulike slekter av bakterier og Archaea, og en effektivt arbeider anaerob fornedrelse Cascade kan videre evalueres ved å bestemme den Headspace gass sammensetningen i kulturen flasker via gass kromatografi. Ved håndtering av forbindelser som fenyl syrer avledet fra ulike forløpere, er vurderingen av Headspace en rask måte å sjekke methanogenesis prosessen8. En Headspace CH4 konsentrasjon på ca. 50-60% i kontrollene på slutten av inkubasjonsperioden indikerer en vellykket utnyttelse av anvendt næringsstoffer og dermed en mineralisering av organisk materiale under anaerobe forhold. Den teoretiske metan produksjon og man metan konsentrasjoner under fordøyelsen prosessen kan bestemmes ex ante ifølge Buswell-Boyle ligningen etter elementær analyse av underlaget eller ved å estimere innholdet i karbohydrater, proteiner, og fett i underlaget. Ifølge VDI 4630 15, kan karbohydrater føre til en teoretisk biogass-produksjon på 750 L kg-1 VSS (50% ch4 og 50% CO2), proteiner til 800 l kg-1 VSS (72% ch4 og 28% co2), og fett til 1 390 l kg -1 VSS (60%4 CH og 40% co2).

Videre ble dannelse og eventuell påfølgende degradering av VFAs og fenyl syrer overvåket. Nedbrytning prosessen kan evalueres ved å analysere VFA konsentrasjoner (f. eks acetate, propionate) på ulike tidspunkt poeng. Akkumulering av Short-kjeden fettsyrer som acetate og/eller propionate kan peke på forstyrrelser i methanogenic samfunnet sammensetning og til en samlet reaktor overbelastning. Men, en godt balansert mikrobiell degradering kaskade kan selv takle svært høy VFA og acetate konsentrasjoner9. Dessuten kan acetate/propionate forholdet ytterligere gi informasjon om den samlede reaktoren tilstand16. Det er imidlertid mange parametre egnet for Prosessovervåking som må velges i henhold til den foreslåtte eksperimentelle hypoteser. I dagens eksempel var mål variablene fenyl yre konsentrasjoner (figur 6).

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Denne forskningen ble finansiert av Austrian Science Fund (FWF): prosjektnumre P 29360 og P 29143. Publisering ble støttet av Publikationsfonds der Universität Innsbruck. Vi erkjenner sterkt EIG.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
culture flasks (120 mL, N20) Ochs, Germany 102046
buty rubber septa (N20) Ochs, Germany 102049
aluminium caps (N20) Ochs, Germany 102050
N2 gas Messer, Austria purity 5.0
syringes + cannulae various
crimper Ochs, Germany 102051
de-crimper Ochs, Germany 102052
GC2010 Shimadzu
Shin-carbon GC column Restek chromatographic separation of H2, O2, CH4, and CO2
HPLC Prominence Shimadzu
Fast Fruit HPLC Column Phenomenex chromatographic separation of VFAs, phenyl acids, etc.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wiebe, W. J., et al. Anaerobic Respiration and Fermentation. The Ecology of a Salt Marsh. Pomeroy, L. R., Wiegert, R. G. Springer New York. New York, NY. 137-159 (1981).
  2. Kim, B. H., Gadd, G. M. Anaerobic fermentation. Bacterial physiology and metabolism. Kim, B. H., Gadd, G. M. Cambridge University Press. Cambridge. 252-297 (2008).
  3. Stolz, J. F., Oremland, R. S. Bacterial respiration of arsenic and selenium). FEMS Microbiology Reviews. 23, (5), 615-627 (1999).
  4. Lackner, N., Hintersonnleitner, A., Wagner, A. O., Illmer, P. Hydrogenotrophic Methanogenesis and Autotrophic Growth of Methanosarcina thermophila. Archaea. 2018, (5), 1-7 (2018).
  5. Mutschlechner, M., Praeg, N., Illmer, P. The ecological importance of grazing to methane fluxes and engaged microbial communities in alpine forest soils. FEMS Microbiology Ecology. (2018).
  6. Prem, E. M., Reitschuler, C., Illmer, P. Livestock grazing on alpine soils causes changes in abiotic and biotic soil properties and thus in abundance and activity of microorganisms engaged in the methane cycle. European Journal of Soil Biology. 62, 22-29 (2014).
  7. Praeg, N., Wagner, A. O., Illmer, P. Effects of fertilisation, temperature and water content on microbial properties and methane production and methane oxidation in subalpine soils. European Journal of Soil Biology. 65, 96-106 (2014).
  8. Wagner, A. O., Prem, E. M., Markt, R., Kaufmann, R., Illmer, P. Formation of phenylacetic acid and phenylpropionic acid under different overload conditions during mesophilic and thermophilic anaerobic digestion. Biotechnology for Biofuels. 12, (1), 359 (2019).
  9. Lins, P., Malin, C., Wagner, A. O., Illmer, P. Reduction of accumulated volatile fatty acids by an acetate-degrading enrichment culture. FEMS Microbiology Ecology. 71, (3), 469-478 (2010).
  10. Wagner, A. O., Hohlbrugger, P., Lins, P., Illmer, P. Effects of different nitrogen sources on the biogas production - a lab-scale investigation. Microbiological research. 167, (10), 630-636 (2012).
  11. Wagner, A. O., et al. Sample preparation, preservation, and storage for volatile fatty acid quantification in biogas plants. Engineering in Life Sciences. 17, (2), 132-139 (2017).
  12. Uzarski, J. S., DiVito, M. D., Wertheim, J. A., Miller, W. M. Essential design considerations for the resazurin reduction assay to noninvasively quantify cell expansion within perfused extracellular matrix scaffolds. Biomaterials. 129, 163-175 (2017).
  13. Costilow, R. N., Breznak, J. A., et al. Physicochemical Factors in Growth. Methods for General and Molecular Microbiology. Marzluf, G. A. Third Edition, 309-329 (2007).
  14. Le Mer, J., Roger, P. Production, oxidation, emission and consumption of methane by soils: a review. European Journal of Soil Biology. 37, (1), 25-50 (2001).
  15. Verein deutscher Ingenieure VDI 4630: Fermentation of organic material. VDI Richtlinien. (2006).
  16. Wagner, A. O., Reitschuler, C., Illmer, P. Effect of different acetate: Propionate ratios on the methanogenic community during thermophilic anaerobic digestion in batch experiments. Biochemical Engineering Journal. 90, 154-161 (2014).
Medium forberedelse til dyrking av mikroorganismer under strengt anaerob/anoksisk forhold
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wagner, A. O., Markt, R., Mutschlechner, M., Lackner, N., Prem, E. M., Praeg, N., Illmer, P. Medium Preparation for the Cultivation of Microorganisms under Strictly Anaerobic/Anoxic Conditions. J. Vis. Exp. (150), e60155, doi:10.3791/60155 (2019).More

Wagner, A. O., Markt, R., Mutschlechner, M., Lackner, N., Prem, E. M., Praeg, N., Illmer, P. Medium Preparation for the Cultivation of Microorganisms under Strictly Anaerobic/Anoxic Conditions. J. Vis. Exp. (150), e60155, doi:10.3791/60155 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter