Summary
هذا الهدف من هذا البروتوكول هو إنتاج axolotls الوهمي مع الأطراف الأمامية haploid المستمدة من الأنسجة المانحة Cas9 المغيرة باستخدام تقنيات تطعيم الأنسجة الجنينية.
Abstract
وهناك مجموعة متزايدة من التقنيات الوراثية والموارد تمكن الباحثين من استكشاف الأصول الجزيئية لقدرة بعض أنواع السلمندر، مثل الأكسولوت، على تجديد أطرافها بأكملها كبالغين. هنا ، نحدد التقنيات المستخدمة لتوليد الأكسولوتات الشيميرية مع الأطراف الأمامية haploid Cas9 المغيرة التي يمكن استخدامها لاستكشاف وظيفة الجينات ودقة تجديد الأطراف. نحن نجمع بين العديد من التقنيات الجنينية والجينية ، بما في ذلك توليد haploid عن طريق التنشيط في المختبر ، وCRISPR / Cas9 mutagenesis ، وتطعيم الأنسجة في بروتوكول واحد لإنتاج نظام فريد للفحص الوراثي haploid في كائن نموذجي للتجديد. تقلل هذه الاستراتيجية من عدد الحيوانات والمساحة والوقت اللازم للتحليل الوظيفي للجينات في تجديد الأطراف. وهذا يسمح أيضا بالتحقيق في وظائف تجديد محددة من الجينات التي قد تكون مطلوبة لعمليات أساسية أخرى، مثل تكوين الأعضاء، ومورفولوجيا الأنسجة، وغيرها من العمليات الجنينية الأساسية. الطريقة الموصوفة هنا هي منصة فريدة لإجراء الفحص الوراثي haploid في نظام نموذج الفقاريات.
Introduction
تاريخيا، كان تطعيم الأنسجة الجنينية في البرمائيات تقنية هامة لاستكشاف الآليات الأساسية لبيولوجيا النمو والتجدد. يمتلك الأكسولوتل، وهو نوع من السلمندر، قدرة مثيرة للإعجاب على تجديد الأنسجة والهياكل المعقدة مثل الأطراف والأعضاء بعد الإصابة أو البتر. وبالمثل، فإنها يمكن أن تتلقى، دون رفض، ترقيع الأنسجة من أفراد آخرين في مراحل الجنين، والأحداث، والكبار1،2،3. مناطق الأجنة التي تنتج هياكل كاملة مثل الأطراف والذيول والعينين والرؤوس ، والأنسجة الأكثر تحديدًا ، مثل neuroectoderm والسوميتس ، يمكن تطعيمها بين الأجنة لإنتاج الحيوانات الشيمية1،2،4،5،6. على مدى ما يقرب من قرن من الزمان ، قدمت دراسات مثل هذه الحيوانات الوهمية رؤى حاسمة في التجديد ، وتمايز الأنسجة ، والتحكم في الحجم ، ونمط1،7،8.
في العقد الماضي ، أنتجت العديد من الدراسات النسخة من الأنسجة التجدد رؤى في البرامج الوراثية الكامنة وراء تجديد السلمندر9،10،11،12،13. وقد أضافت هذه الدراسات إلى قائمة موسعة من الجينات المرشحة التي، حتى الآن، غير قابلة للتوصيف إلى حد كبير في سياق التجديد. تقنيات الطفرات المستهدفة ، مثل CRISPR / Cas ، تسمح الآن بالتحقيق في مثل هذه الجينات ، ويتم تسهيل هذه النهج الجينية إلى حد كبير من خلال التسلسل والتجميع الأخير لجينوم axolotl الكبير14،15،16.
سعينا لتطوير التقنيات التي قرنت البيولوجيا التنموية الكلاسيكية مع التكنولوجيا الوراثية الجديدة لغرض تشريح آليات التجديد. وقد وضعت أساليب لتوليد الأجنة haploid من axolotls وغيرها من السلمندر لعقود17. في حين أن هذه التقنيات قد لوحظ منذ فترة طويلة لتكون مزايا السلمندر ككائنات النموذج الجيني18، إلا أن الدراسات الجينية اللاحقة قليلة أدرجت الحيوانات الهابلويد. نحن نستخدم في تنشيط المختبر في axolotl لإنتاج الأجنة haploid التي تعمل كمتبرعين الأنسجة لتطعيم19. باستخدام الأجنة التي تحمل علامات وراثية فلورية ، ابتكرنا طرقًا موثوقة لتوليد الأطراف المشتقة بالكامل تقريبًا من أنسجة المتبرعين(الشكل 1A). من خلال الجمع بين هاتين التقنيتين ، تجاوزنا الفتك الجنيني المتأخر المرتبط بالهابلويد ، مما يسمح بإنتاج أطراف هابلويد مطورة تمامًا والمطعمة(الشكل 1B، الشكل 1B"، والشكل 2).
من خلال إجراء CRISPR / Cas بوساطة الطفرات في الأجنة haploid قبل التطعيم لإنشاء axolotls الوهمي مع أطرافها هابلويد متحولة ، قد نحقق في وظيفة الجينات على وجه التحديد في سياق تطور الأطراف وتجديدها. وهذا يسمح بإنقاذ الأطراف من الأنماط الظاهرية المتحولة الجنينية المحتملة. في حين يمكن أن تولد CRISPR / Cas microinjection الحيوانات التي هي متحولة للغاية ، فإن هذه الحيوانات عادة ما تكون فسيفساء عالية ، مع درجة ما من الاحتفاظ بأليلات النمط البري ومجموعة متنوعة من الطفرات المتميزة في المواقع المستهدفة14،20. CRISPR القائم على الطفرات في خلايا haploid يزيد من penetrance واحد أليل فقدان وظيفة الطفرات، كما أنها لا يمكن أن تكون ملثمين من قبل alleles البرية المحتفظ بها. لهذا السبب ، يتم استخدام الفحص القائم على CRISPR في خطوط الخلايا haploid بشكل متزايد للتحقيق في الأساس الوراثي للعديد من العمليات الخلوية21،22،23. من خلال الجمع بين تتبع النسب CRISPR المستندة إلى بروتوكولات تطعيم برعم الأطراف haploid ، يمكن للنهج الموصوف هنا أن يكون بمثابة منصة للشاشات الوراثية haploid في الحيوانات الحية20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على الإجراءات التجريبية المستخدمة في هذا البروتوكول من قبل لجنة رعاية الحيوانات المؤسسية واستخدامها في جامعة ييل (IACUC، 2017-10557) وكانت متفقة مع جميع السياسات والمبادئ التوجيهية الاتحادية التي تحكم استخدام الحيوانات الفقارية. أجريت جميع التجارب على الحيوانات على Ambystoma mexicanum (axolotls) في مرافق في جامعة ييل.
1. جيل الأجنة الديلويد
- الحصول على GFP + الأجنة diploid لتكون بمثابة المضيفين الكسب غير المشروع من خلال التزاوج الطبيعي باستخدام واحد أو اثنين من الآباء gfp 24.
- جمع البيض الديبلويد وضعت حديثا ووضعها في منخل معدني.
- شطف البيض جيدا مع محلول هولترريتر 40٪ (20 mM NaCl، 0.2 mM KCl، 0.8 mM NaHCO3،0.2 mM CaCl2،4 mM MgSO4،درجة الحموضة إلى 7.4).
- ضع البيض في محلول هولتفريتر الطازج بنسبة 40٪ وخزنه عند درجة حرارة 12 درجة مئوية.
ملاحظة: يجب دائما الحصول على أجنة الدوبلويد قبل الانتقال إلى توليد الأجنة هابلويد.
2. توليد الأجنة Haploid
- الإناث إعداد المانحين gamete
- 48 ح قبل إجراء في تنشيط المختبر، وجنسة الناضجة جنسيا الأبيض أو الأبيض / RFP الإناث axolotl عن طريق الغمر في 1 ز / L HEPES العازلة MS-222 في 40٪ حل Holtfreter25.
- تأكد من أن يتم تم تهيأ الحيوان بالكامل بعد ما يقرب من 30 دقيقة من الغمر عن طريق قرص ذيله بقوة بين الإبهام والسبابة. لن تستجيب الحيوانات المحملة بالكامل فعليًا لأي قرصة.
- إعداد حل من gonadotropin المشيمي البشري (HCG) التي تحتوي على 10،000 U / مل في المالحة المعقمة.
- باستخدام حقنة الأنسولين 30 G، حقن 0.15 CC من قوات حرس السواحل الهايتية (1500 وحدة) في الظهرية العضلية إلى الطرف الخلفي للأنثى بزاوية 45 درجة إلى خط الوسط لتجنب ملامسة الحبل الشوكي.
- أعد الأنثى إلى محلول Holtfreter الطازج بنسبة 40٪ وضعها في ثلاجة 8-12 درجة مئوية.
- بعد 48 ساعة، أعد الأنثى إلى درجة حرارة الغرفة. وضع بعض الحجارة أو النباتات البلاستيكية في حاويتها كأسطح لوضع البيض.
ملاحظة: الإناث حقن مع قوات حرس السواحل الهايتية سوف إيداع حالات هلام فارغة في كثير من الأحيان لعدة ساعات قبل وضع البيض. - إزالة الحجارة أو النباتات البلاستيكية بعد أن بدأت الأنثى باستمرار وضع البيض.
- السماح للأنثى للالجلوس في خزان فارغ لمدة 30 دقيقة إلى 1 ساعة.
ملاحظة: حجب المواد للمنال لوضع البيض على سيسمح تشديد السيطرة على جمع البويضات.
- مجموعة من الرُمّية
- في حين أن وضع بويضة الأنثى متوقف ، يتم تحديد جنس GFP + axolotl الذكور الناضج جنسيًا ليكون بمثابة متبرع بالحيوانات المنوية ، كما هو الحال في الخطوة 2.1.1.
- وضع الذكور بولاية كاملة على ظهره على مناشف ورقية رطبة تحت المجهر تشريح.
- إذا كان المجرب هو اليد اليمنى، ضع طرف ماصة P1000 في قاعدة الكلوكا باليد اليمنى.
- ضع السبابة اليسرى وإبهام اليد اليسرى 2−3 سم على الحوض. ضغط بلطف على الحيوان أثناء تحريك الأصابع نحو الساقين الخلفيتين لطرد عينات البول المنوية.
- جمع كل ما يتم مسح من cloaca في أنبوب microcentrifuge الفردية. كرر هذه العملية لجمع 6 إلى 10 عينات.
- ماصة 5.0 μL من كل عينة على طبق بتري لفحص نوعية الحيوانات المنوية باستخدام المجهر مقلوب.
ملاحظة: عينات الحيوانات المنوية المركزة هي لون أبيض حليبي، وعادة ما تتراوح بين 5 إلى 20 ميكرولتر، وعادة ما يتم استردادها بعد عدة، يتم استخراج عينات البول الحيوانات المنوية أعلى حجم. سوف الحيوانات المنوية جمع في الجزء السفلي من الأنابيب في عينات حجم أعلى عندما تركت دون عائق. عينات مركزة من الحيوانات المنوية صحية هي كبيرة والمتحركة وتفقد النشاط مع انخفاض تركيزها. يمكن للذكور الأصحاء إنتاج ما يصل إلى 50 ميكرولتر من الحيوانات المنوية المركزة.
- مجموعة الإناث gamete
- بعد الحصول على عينة الحيوانات المنوية صحية وتأكيدها، وحقن HCG أنثى axolotl كما هو الحال في الخطوة 2.1.1.
- وضع الأنثى المحملة بالنساء بشكل كامل على مناشف ورقية رطبة على ظهرها.
- استخراج البويضات غير المخصبة من الأنثى باستخدام حركة اليد مماثلة لتلك الموجودة في الخطوة 2.2.4.
- جمع البيض باستخدام ملقط الرطب ونقلها إلى طبق بيتري 10 سم. علاج البيض مع الحيوانات المنوية المشععة في غضون 15 دقيقة من جمع.
- إعداد ألعاب الذكور وتفعيل المختبر
- استخدام P10 أو P20 ماصة لpipette الحيوانات المنوية صعودا وهبوطا، وكسر كتل لتشكيل تعليق متجانسة.
- تقريب النسبة المئوية للحيوانات المنوية المتحركة عن طريق وضع قطرة 0.5 ميكرولتر من تعليق الحيوانات المنوية غير المخفف على غطاء طبق بتري أو شريحة زجاجية والفحص بمجهر مقلوب.
- إضافة 9.5 ميكرولتر من 0.1x مارك تعديل حل رينغر (MMR; جدول المواد) إلى هذه العينة لجعل تخفيف الحيوانات المنوية 20x. ماصة بلطف صعودا وهبوطا لخلط.
- مع المجهر المقلوب، عد الحيوانات المنوية في ثلاث قطرات 1.0 ميكرولتر من aliquot 20x المخفف على غطاء طبق بتري أو مقياس الهيوكتومتر لتقدير تركيز الحيوانات المنوية من تعليق غير مخفف.
- إعداد الحيوانات المنوية للتشعيع عن طريق تخفيف aliquot من عينة الحيوانات المنوية الأصلية إلى حوالي 80،000 الخلايا المتحركة / مل في 0.1x MMR المعقمة.
- عد عدد البويضات التي تم الحصول عليها خلال الـ 15 دقيقة الماضية. أضف 0.5 ميكرولتر من الحيوانات المنوية المخففة الطازجة من الخطوة 2.4.5 لكل بويضة إلى طبق بتري. استخدم طرف الماصة لنشر هذا التعليق في طبقة سميكة 1 مم.
- باستخدام رفع من البلاستيك، ضع العينة 4 سم من المصابيح من 254 نانومتر crosslinker. تعطيل الحيوانات المنوية وراثيا عن طريق تشعيع العينة مع 800،000 uJ/mm2.
- باستخدام ماصة P10، ماصة التعليق على البيض غير المخصبة، وطلاء كل بويضة مع 0.25-0.5 ميكرولتر من الحيوانات المنوية المشععة. السماح للبيض للالجلوس في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
- بعد 30 دقيقة، تغمر البيض بـ 0.1x MMR. ضع البيض على الفور في حاضنة 8-10 درجة مئوية للحقن في اليوم التالي أو عند 18 درجة مئوية للحقن في غضون 7 ساعات بعد التنشيط (hpa).
- Dejelly haploids باستخدام ملقط حادة 30 دقيقة بعد الترطيب. ضع البيض على الفور في حاضنة 8-10 درجة مئوية للحقن في اليوم التالي أو عند 18 درجة مئوية للحقن في نفس اليوم.
3. Haploid Mutagenesis والصيانة
- حقن ميكروفير/كاس9
- تصميم sgRNAs باستخدام CRISPRscan وتوليف26،27.
- بالنسبة للطفرات المتعددة الطفرات، قم بإعداد مخزون من 5 sgRNAs (10 نانوغرام/ميكرولتر لكل sgRNA) وبروتين Cas9 (1 ميكروغرام/ميكرولتر). إعداد تخفيف 100 مرة من هذا المخزون (0.1 نانوغرام / ميكرولتر لكل sgRNA، 10 نانوغرام / μL Cas9) للحقن. لجين واحد، طفرة عالية التردد mutagenesis، اتبع البروتوكول المبين سابقا28.
- حقن الأجنة الهابلويد في مرحلة الخلية الواحدة 7 hpa إذا تم تخزينها في 18 درجة مئوية أو حقن الأجنة في اليوم التالي في مرحلة الخلية 2-8 إذا تم تخزينها في 8-10 درجة مئوية.
- نقل الأجنة إلى 1.0x MMR مع 20٪ من البوليسوكروز 400.
- إذا كانت خلية واحدة، حقن كل جنين مع قطرة 5 مل من محلول الحقن (حوالي 1/4 نصف قطر من البيضة) التي تحتوي على كتلة إجمالية من 0.5 pg/sgRNA و 50 PG Cas9 البروتين. إذا كانت متعددة الخلايا، قم بتوزيع هذه الكتلة عن طريق حقن وحدات تخزين أصغر في خلايا متعددة.
- السماح للأجنة للشفاء في البوليسوروز 400 لمدة لا تقل عن 4 ساعة والحد الأقصى من 18 ساعة في 18 درجة مئوية.
- إسكان جنين هابلويد
- نقل الأجنة إلى 0.1x MMR مع مضاد المضادات الحيوية.
- منزل كل جنين في بئر الفردية من لوحة 24 جيدا، كما أن البعض سوف يموت أو تتطور بشكل غير طبيعي. الحفاظ على 16-18 درجة مئوية. يمكن استخدام درجات حرارة أقل لإطالة أمد التطور، إذا لزم الأمر.
- استبدال وسائل الإعلام مع MMR الطازجة 0.1x مع مضاد المضادات الحيوية كل يومين.
4. Diploid إعداد الجنين المضيف
- الحفاظ على الأجنة في طلاء هلام في 12 إلى 16 درجة مئوية حتى تصل إلى المرحلة 22 إلى 26.
- جمع الأجنة التي هي جاهزة للتطعيم، ووضعها داخل منخل (4 ملم حجم شبكة)، وشطف بلطف لهم مع محلول Holtfreter 40٪.
- نقل الأجنة إلى 0.1x MMR المعقم مرشح يحتوي على 1.5٪ التبييض لمدة تصل إلى 2 دقيقة. غمر تماما الأجنة في محلول التبييض ودوامة لهم بلطف لضمان أن طلاء هلام يجعل الاتصال الكامل مع محلول التبييض لقتل الميكروبات موجودة على الأجنة.
- بعد 2 دقيقة، تمييع محلول التبييض الذي يحتوي على الأجنة بحجم متساوٍ من التعقيم بالفلتر 0.1x MMR.
- صب بلطف الأجنة في منخل مطهر التبييض (4 مم حجم شبكة) وشطف الأجنة خمس مرات مع مرشح تعقيم 0.1x MMR.
- ضع الأجنة في أطباق بتري معقمة مقاس 10 سم مع 0.1x MMR مع المضادات الحيوية لإزالة الهلام (البنسلين 100 وحدة /mL ، العقدتومايسين 100 ميكروغرام / ميكرولتر ، 0.25 ميكروغرام / مل ، جنتاميسين 25 ميكروغرام / مل).
- تحت المجهر الفلوري، قم بإزالة معاطف الهلام وأغشية الفيتلين من أجنة GFP+ باستخدام ملقط حادة (أبعاد تلميح 0.05 × 0.01 مم2).
- نقل الأجنة GFP + إلى طبق بتري جديد. تقليل كمية السائل المنقولة من طبق بتري حيث كانت dejellied.
- شطف GFP + الأجنة المضيفة مع معقمة 0.1x MMR مع المضادات الحيوية أربع إلى ست مرات من أجل إزالة الملوثات.
- ضع الأجنة النظيفة عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها قبل التطعيم.
ملاحظة: تبريد الأجنة يجعلها أكثر صلابة ونظيفة فصل mesoderm من endoderm ممكن.
5. Haploid - diploid كيميرا جيل
- الطبق الجراحي وإعداد وسائل الإعلام
- إعداد الأطباق الجراحية العقيمة التشغيل عن طريق صب autoclaved 2٪ أغاروز في 0.1x MMR في العقيمة 35 ملم سهلة قبضة بيتري الأطباق. ملء أطباق بيتري في منتصف الطريق مع agarose.
- بعد يبرد agarose، استخدم مشرط معقم لقطع حوض طويل بطول 25 مم مائل في الأغروز لعقد الأجنة في مكانها.
- ملء الطبق مع وسائل الإعلام الجراحية المعقمة (0.1x MMR مع مكافحة الميكوبلازما 2.5 ميكروغرام / مل، أمبوشوتريكسين B 0.25 ميكروغرام / مل، وسيبروفلوكساسين 10.0 ميكروغرام / مل) والتبريد في 4 درجة مئوية.
- إجراء تطعيم الأجنة
- ضع متبرعًا صحيًا واحدًا مع واحد أو اثنين من الأجنة المضيفة GFP + diploid المتطابقة مع مرحلة داخل الحوض الصغير لطبق التشغيل السابق الذي يحتوي على وسائط جراحية(الشكل 3).
ملاحظة: قم بإجراء الإجراء على مرحلة تبريد (10 درجة مئوية أو أقل) إذا كان ذلك ممكناً. - استخدام اثنين من غرامة فائقة، ملقط الأوتوكلاف (طرف مستقيم، وأبعاد تلميح 0.05 × 0.02 ملم2)لإزالة طبقات ectoderm وmesoderm من المضيف مع برعم الطرف بالقرب من المركز(الشكل 4).
ملاحظة: منطقة ترقيع الأنسجة المستطيلة تشمل برعم الأطراف وتمتد من السوميت التاسع إلى النصف الخلفي من انتفاخ الخيشوم، حوالي 2 ملم، على طول المحور الخلفي الأمامي. على طول المحور الظهري، تمتد المنطقة المطعمة حوالي 1.5 مم، بما في ذلك السوميتس إلى ما وراء الحافة البطنية لانتفاخ الخيشوم. وتشمل المنطقة المطعمة جميع الألواح الجانبية mesoderm والأنصاف الجانبية للsomites ، دون إزعاج البطانة الكامنة. راجع الشكل 4 والفيديو المصاحب للحصول على التفاصيل. - وضع جانبا الأنسجة المضيفة وإزالة ورقة الأنسجة مكافئ الحجم من المانح haploid باستخدام نفس الطرق.
- ضع ورقة الأنسجة المانحة haploid على المنطقة المقابلة من الجنين المتبرع.
- قم بتأمين الأنسجة من خلال تغطيتها بشظايا زجاجية مستطيلة مستطيلة من زجاج غلاف مجهري مسحوق والضغط عليها بلطف في جسم الجنين المضيف.
- اقلب جنين المانح ة الهابلويد على جانبه الآخر لحصاد برعم الأطراف للجنين المضيف الثاني. كرر الخطوات 5.2.2 من خلال 5.2.5.
- قم بإزالة الأنسجة المضيفة الزائدة المتبقية بعناية والجنين المتبرع به من الطبق.
- اترك الطعوم مع مراسي شظايا الزجاج في مكانها لمدة 60-75 دقيقة، والتحقق من كل 20 دقيقة للتأكد من أن الزجاج لم ينزلق.
- بعد ترقيع الأنسجة تلتزم تماما، واستخدام ملقط لتقشير ببطء قبالة المراسي شظايا الزجاج.
- ضع متبرعًا صحيًا واحدًا مع واحد أو اثنين من الأجنة المضيفة GFP + diploid المتطابقة مع مرحلة داخل الحوض الصغير لطبق التشغيل السابق الذي يحتوي على وسائط جراحية(الشكل 3).
- صيانة الكيميرا
- نقل الأجنة المطعمة إلى وسائل جراحية جديدة والحفاظ عليها في 8-12 درجة مئوية بين عشية وضحاها للشفاء. منزل الأجنة المطعمة بشكل فردي في 12 أو 24 لوحة بئر.
- بعد 36-48 ساعة، قم بنقل الأجنة المطعمة إلى مضادات المضادات الحيوية المعقمة 0.1x MMR. المضادات الحيوية القوية في وسائل الإعلام الجراحية تسبب سمية في الأجنة المطعمة بعد 3 أيام.
- استبدل الوسائط بـ 0.1x MMR طازجة ومضادات حيوية كل 2-3 أيام.
- الحفاظ على الأجنة المطعمة عند 18 درجة مئوية حتى تتمكن من تغذية28.
- بعد 1 إلى 2 أشهر من التطوير والرعاية ، يمكن تسجيل أطراف هابلويد لنقاء الكسب غير المشروع باستخدام مجهر تشريح الفلورسنت.
ملاحظة: إن وجود أنسجة GFP المشتقة من المضيف غير العصبي أو غير الدم في الأطراف هو مؤشر على التطعيم النجس وغالباً ما يرتبط بتطور الأطراف غير الطبيعي. وينبغي استبعاد هذه الحيوانات من مزيد من التحليل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يمكن تمييز الأجنة الهابلويد النامية من الأجنة الدوبلويد من خلال "متلازمة haploid" النمط الظاهري29. في مرحلة الكسب غير المشروع ، تعرض الأجنة الهابلويد انحناءً انحنٍ على طول المحور الأمامي الخلفي والضميمة غير المكتملة لقابس الصفار(الشكل 3A). يمكن استخدام المجهر الفلوري لضمان خلو الأجنة الهابلويدية من التعبير عن GFP المشتق من الناحية الأبوية(الشكل 3B).
عندما تكون الطعوم نظيفة ، يجب أن يقتصر تعبير GFP في المقام الأول على الضفيرة العضدية ، الشبكة العصبية المشتقة من الحبل الشوكي للمضيف ، كما رأينا في الشكل 2. سوف يكون التعبير GFP Punctate موجودًا أيضًا في الخلايا المفردة التي يبدو أنها خلايا عصبية حسية وخلايا مضيفة مشتقة من الدم ، والتي تهاجر إلى الطرف النامي. عند استخدام المتبرعين RFP+ ، سوف تظهر أطراف الكسب غير المشروع haploid التعبير العالمي لـ RFP(الشكل 1B' ). في جميع أنحاء التنمية، والأطراف haploid غير مطفرة هي أقصر بكثير من الأطراف الأمامية diploid معارضة في الحيوانات الشيمية الحجم المتطابقة(الشكل 1B، الشكل 1B'، والشكل 5، ن = 16 أزواج الأطراف، هابلويد يعني = 0.522 سم، SD = 0.087 سم، متوسط الديبويد = 0.667 سم، SD = ± 0.069 متر، يقترن T-اختبار ف القيمة < 0.0001، متوسط النسبة = 0.784، SD = ± 0.113). الأطراف haploid غير مطفرة أيضا تجديد كامل (4/4 haploid و 4/4 diploid تجديد كامل، الشكل 6)،على الرغم من أنها تظهر تأخيرطفيف في الوصول إلى مرحلة نمو النمو الرقمي مقارنة مع diploids (n = 4 haploid، ن = 4 diploid؛ 23 يوما بعد البتر: haploids = 3 لوحة و 1 أطراف مرحلة نمو رقمي؛ diploids = 4 مرحلة نمو رقمي
يتطلب التطعيم الناجح الممارسة ، وسيختلف الاتساق اعتمادًا على مهارات التلاعب الدقيق للفني والتقنية المعقمة. الطعوم الفاشلة والنجسة تنتج مجموعة متنوعة من الأنماط الظاهرية ، كما رأينا في الشكل 7 والشكل 8. في أيدينا، ما يقرب من 38.7٪ (SD = ± 8.78٪) من البويضات تتطور إلى أجنة هابلويد المتقدمة عادة و 11.1٪ (SD = ± 5.46٪) من جميع الطعوم haploid-diploid إنتاج الحيوانات القابلة للحياة مع الأطراف haploid المتقدمة عادة، المطعمة بشكل نظيف(الشكل 9).
الشكل 1: نظرة عامة على البروتوكول ومثال على axolotl الوهمي. (أ)التخطيطي يحدد التوقيت النسبي للخطوات المتخذة للحصول على الأجنة المضيفة الديرويد، والحيوانات المنوية، والبويضات من أجل توليد الهابلويدات والأجنة الشيمية. (ب)صورة ساطعة مركبة لaxolotl الأحداث التي تنتجها برعم أطرافه الجنينية التطعيم من جنين RFP + haploid إلى GFP + diploid المضيف(B') تراكب من الصور الفلورية الخضراء والحمراء من نفس 8 سم axolotl الأحداث. الطرف haploid هو طبيعي بشكل صارخ، ولكن أقصر من الطرف الديبلويد المعارض. مقياس شريط = 1 ملم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: صورة فلورية لطرف هابلويد تم تطويره بشكل طبيعي وبتطعيم نظيف. GFP- haploid الطرف المطعمة إلى GFP + diploid المضيف يظهر نمط التعبير GFP التي يبدو أن تقتصر على الأعصاب الشوكية تهوية الطرف (السهم الأصفر) والخلايا العصبية الحسية الفردية والخلايا المشتقة من الدم (الأسهم البيضاء). الطرف في الصورة ينتمي إلى حدث 4 سم. مقياس شريط = 1 ملم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: مقارنة الأجنة الدوبلويدية وهالولويد. (أ)صورة خفيفة من الديلويدات (يسار) وhaploids (يمين). لاحظ انحناء AP-axis المنخفض والبطانة البارزة للأجنة الهالولويدية (الأسهم البيضاء). (ب)صورة الفلورسنت الخضراء لنفس الأجنة. تم إنشاء GFP- haploids باستخدام البيض من الحيوانات المنوية GFP- أنثى والمشعمن GFP+. الديبلويدات هي GFP+. الأجنة في الصورة هي تقريبا المرحلة 2530. سلسلة التدريج. مقياس شريط = 1 ملم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: التخطيطي الذي يحدد مدى الكسب غير المشروع لبرعم الأطراف haploid. (أ)عرض جانبي للمرحلة 25 هابلويد الجنين. تُظهر الخطوط المنقطية المساحة التقريبية التي يجب زرعها، نسبة إلى انتفاخ الخيشوم وبرعم الأطراف. (ب)التخطيطي المستعرض للمرحلة 25. تظهر الخطوط المنقطية المساحة التقريبية وأنواع الأنسجة التي يجب إزالتها من المضيف واستبدالها بأنسجة المانح ة الهابلويد المقابلة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: مقارنة أطوال الأطراف الهابلويدية وثنائي الدوبلويد. (أ)مؤامرة مبعثرة لأطوال الأطراف الهابلويدية (الوردية) والأطراف المناوئية (الخضراء) من 16 من الحيوانات الشيمية ذات الحجم المماثل (متوسط haploid = 0.522 سم ، SD = ± 0.087 سم ، متوسط الديبلويد = 0.667 سم ، SD = ± 0.069 سم). تم قياس الأطراف من قاعدة الزوغوبود إلى تقاطع الرقمين 2 و3. (ب)مؤامرة مبعثرة من طول الطرف haploid إلى نسب طول الطرف diploid من الحيوانات 16 (متوسط النسبة = 0.784، SD = ± 0.113 سم). (C)قطعة مبعثرة من أطوال الجسم (سم) من الكيميرا المقاسة 16 (متوسط طول الحيوان = 8.72 سم ± 0.456 سم). تم قياس الحيوانات من طرف الانسُم إلى طرف الذيل. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: مقارنة التجدد في الأطراف الهالوية وثنائي الديبلوم. (أ)هابلويد الأطراف قبل البتر. (ب)نفس الطرف haploid بعد التجدد. (C)طرف الديبلويد قبل البتر. (د)نفس الطرف الديبلويد بعد التجدد. 4/4 أطراف هابلويد و4/4 أطراف الديبويد تتجدد مع مورفولوجيا طبيعية. خطوط سوداء منقط تشير إلى بتر الطائرة. قضبان المقياس = 1 مم. تم إجراء عمليات البتر على الحيوانات الصغيرة المتطابقة مع الحجم (8.5 سم). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: أمثلة على التطور الطبيعي وغير الطبيعي للأطراف الهابلويد. (أ)طرف هابلويد مع مورفولوجيا طبيعية بشكل صارخ. (B-E) أمثلة على الطعوم التي فشلت في دعم التنمية الكاملة لهابلويد. (ب)أوليغوداكتيلي. (C)أكثر من ذلك oligodactyly. (د)لا توجد هياكل رقمية متميزة. (E)لا يوجد طرف. تنتمي الأطراف المصورة إلى أحداث مماثلة الحجم (8.0 إلى 10 سم). مقياس القضبان = 1 ملم الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 8: أمثلة من خلايا GFP + في الطعوم الطرفية الهابلويد نجسة. (أ، أ) شكليا ً طبيعيا ً هابلويد غير مشروع طرف مع الخلايا الديرويدة GFP + في الجلد والأدمة (مخطط أبيض متقطع) كشفت عن طريق المجهر الفلوري. (B, B') وهو عامل غير طبيعي المطعمة haploid مع GFP + الخلايا diploid المساهمة على نطاق واسع في الأدمة والجلد (مخطط أبيض). (C, C' وهو أحد أطراف هابلويد غير طبيعية المطعمة التي تم استبدال البشرة مع الخلايا Diploid + GFP (مخطط أبيض). تنتمي الأطراف المصورة إلى أحداث مماثلة الحجم (8.0 إلى 10.0 سم). مقياس شريط = 1 ملم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 9: معدلات نجاح الأجنة الهابلويد وتوليد الأطراف الهابلويد. (أ)في المئة من الأجنة هابلويد قابلة للحياة ولدت باستخدام التنشيط في المختبر. تم جمع البيانات من خمس تجارب تنشيط ية مستقلة في المختبر. يشير اللون الأخضر إلى جزء من البويضات التي أنتجت المرحلة 25 أجنة هابلويد التي يمكن استخدامها للتطعيم (المتوسط = 38.7٪، SD = ± 8.78٪). يشير اللون الرمادي إلى جزء من البيض الذي لم تظهر عليه علامات الانقسام، أو كان غير قابل للحياة، أو كان طبيعيًا في التطور. (ب)في المئة من الأطراف التي تم تطويرها عادة، المطعمة بشكل نظيف haploid. الأرجواني يشير إلى جزء من الطعوم التي أسفرت عن أطراف هابلويد نظيفة ومطورة عادة (المتوسط = 11.1٪، SD = ± 5.46٪). يشير اللون الأخضر إلى الأطراف التي تطورت بشكل طبيعي ولكن كان لديها أنسجة مضيفة ملوثة GFP + (المتوسط = 11.3٪، SD = ± 8.64٪). يشير اللون الأحمر إلى أطراف الكسب غير المشروع التي لم تتطور بشكل طبيعي (المتوسط = 27.1٪، SD = ± 30.3٪). يشير اللون الأزرق إلى جميع الأجنة والحيوانات المطعمة التي لم تنجو لإكمال نمو الأطراف (المتوسط = 50.5٪، SD = ± 31.2٪). تم توزيع فقدان الحيوانات المطعمة عبر المراحل الجنينية واليرقات المتأخرة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هناك عدد قليل من الخطوات الحاسمة في بروتوكولنا لتوليد الكيميرا haploid-diploid أن فني التشغيل يجب أن تنظر في نتائج التطعيم متسقة.
السبب الأكثر احتمالاً لفشل جيل haploid يرجع إلى ظروف التنشيط السيئة في المختبر. يجب استخدام الكميات المناسبة من الحيوانات المنوية المتحركة لتنشيط البيض. لإطالة الحركة، يجب الحفاظ على عينات الحيوانات المنوية دائما عند 4 درجة مئوية. قبل تطبيق أي عينة من الحيوانات المنوية على البويضات، تحقق من صلاحية الحيوانات المنوية باستخدام مجهر مقلوب. لا ينبغي أبدا استخدام الحيوانات المنوية غير المتحركة تماما، وينبغي تعديل التركيز إلى 80،000 الخلايا المتحركة / مل. الكثير من الحيوانات المنوية في خطوة التنشيط يمكن أيضا منع نمو البويضة الطبيعية. حفر الحيوانات المنوية، التي تظهر كما الصغيرة، المسافة البادئة الداكنة على سطح البويضة، هي إشارة مادية إلى أن خلية الحيوانات المنوية قد اخترقت البويضة وعادة ما تظهر 20 إلى 60 دقيقة بعد تطبيق الحيوانات المنوية. البيض مع عشرة أو أكثر من الحيوانات المنوية الحفر قد لا تنشط بشكل صحيح.
يمكن تنشيط البويضات غير المخصبة إذا تم جمعها في غضون 15 دقيقة بعد وضعها تحت الماء ، ووضعها في طبق بتري جاف ، وتجفيفها تمامًا مع مناشف ورقية قبل تطبيق الحيوانات المنوية. بدلاً من ذلك، كما هو موضح في الفيديو، قد يتم ضغط البيض من أنثى يتم حقنها بالهرمونات. نجد أن هذه البيض "الجاف" تعطي نتائج أكثر اتساقا، على الرغم من أننا نستخدم بانتظام كلا الطريقتين.
يتطلب التطعيم الناجح الاقتران السليم للأجنة الديلويدية مع أنسجة برعم الأطراف ذات الهبلويد المُنظمة بشكل مناسب. ويتضمن هذا البروتوكول عددا من التدابير لضمان مطابقة المراحل. كما التزاوج الطبيعي لا يؤدي دائما في وضع البيض، حقن HCG للحصول على البويضات haploid لا ينبغي أن يؤديها حتى الأنثى تزاوج بشكل طبيعي يبدأ وضع البيض diploid. بعد هذه الحقنة ، يجب إيواء الأنثى المستحثة في درجة حرارة مخفضة (8 إلى 12 درجة مئوية) ، مما يقلل من معدل وضع البيض. قد يؤدي إسكان الأنثى المحفزة للهرمون في درجات الحرارة العادية إلى وضع معظم البيض في فترة قصيرة من الزمن. يشير ظهور وضع البيض في أنثى مبردة إلى أن الأنثى مستعدة للتخدير واستخراج البويضات. يجب أن يحدث تنشيط البويضات في غضون 15 دقيقة من استخراج البويضات. لأن الأجنة الهابلويد المنشطة ستكون عدة أيام وراء الأجنة الدوبلويد المنتجة بشكل طبيعي في طور النمو ، نوصي باحتضان الأجنة الديبلويدية عند 12 درجة مئوية مع زيادة المعدل النسبي لتطور الهابلويدات عن طريق احتضانها عند 18 درجة مئوية. لأنه سيكون هناك بعض الاختلاف في الفترة الفاصلة بين حقن HCG وزرع البويضة للإناث المستحثة ، قد تكون التعديلات الطفيفة في درجات حرارة الحضانة إما haploids أو diploids ضرورية بحيث يتم إقران التدريج من الأجنة المضيفة والمانحة في وقت التطعيم. يجب تبريد الأجنة إلى 4 درجات مئوية لعدة ساعات قبل التطعيم ، وهذا ما يقرب من توقف التطور. اختلاف وقت ظهور الأجنة الهالولويد وdiploid تقشعر لها الأبدان قبل التطعيم يمكن تمكين مرحلة مطابقة. في حين أن الأجنة haploid تختلف شكليا من diploids، كل من haploids وdiploids تصل إلى المرحلة 21 بعد طيات العصبية قريبة والأجنة تكمن واحدة من جوانبها. مثل الديلويدات، المرحلة 25 الأجنة haploid لديها الخياشيم البارزة والانتفاخات المعرضة. رأس كبير يبزج في زاوية بالنسبة للجسم في haploids، على الرغم من أن هذا هو انخفاض كبير بالنسبة إلى المرحلة 25 الأجنة diploid، الذي تبرز رؤوسمن الجسم في زاوية الحق30تقريبا.
تقنية العقيمة أمر بالغ الأهمية لنجاح تطعيم الأنسجة. وينبغي الحفاظ على الظروف العقيمة من خلال التجربة بأكملها من جيل haploid من خلال التنمية الجنينية للوهم. نوصي بالحفاظ على جميع الحيوانات الأم في ظروف مياه نظيفة وغير نظامية خلال فترة وضع البيض لتقليل كمية المواد العضوية الملوثة في بداية الإجراء. الإزالة المتسقة واليومية للأجنة المتوفية أو الناقهة خلال العملية بأكملها أمر مهم للحفاظ على صحة الأجنة الأخرى. نوصي بإيواء جميع الأجنة الهابلويدية والكيميرا بشكل فردي لتقليل التلوث المتبادل.
يتم اكتساب مهارات استئصال الأجنة المجهرية وتطعيم الأنسجة من خلال الممارسة. أثناء عملية التطعيم ، من المهم عدم ثقب أو تمزيق برعم الطرف نفسه. يجب أن تمتد الأنسجة التي يتم إزالتها من الأجنة المضيفة والمانحة إلى ما وراء برعم الأطراف ، كما هو في الصورة ، لتوفير منطقة عازلة. إذا تم تطعيم جزء صغير جدًا من منطقة من الأنسجة ، سيتم اختراق أطراف هابلويد بواسطة جلد GFP + diploid والأنسجة الأخرى.
واحدة من القيود المفروضة على هذه التقنية التطعيم هو أن الأنسجة العصبية والدم في الأطراف مستمدة من الجسم المضيف. في حالات نادرة قليلة، كنا قادرين على توليد أطرافها المطعمة التي تفتقر تماما إلى جميع علامات GFP + التعبير عن الأعصاب. في هذه الحالات، تمكنا من استبدال ما يكفي من الأنسجة العصبية في الحيوان المضيف مع أن المتبرع. ومع ذلك ، فإن هذا التطعيم الواسع أمر صعب ، لا يمكن الاعتماد عليه ، وغالباً ما ينتج تشوهات في النمو خارج الطرف.
Haploidy هو الجنينية القاتلة في axolotl. وبالمثل، فإن الطفرات في العديد من الجينات التي قد تكون ضرورية لتطوير الأطراف وتجديدها هي أيضاً قاتلة جنينية في وقت مبكر. يتجاوز بروتوكولنا الفتك الجنيني للهابلويد لإنتاج الأطراف التجريبية ويمكن استخدامه أيضًا في الحالات التي تنتج فيها طفرة جين التجديد المرشح نمطًا ظاهريًا قاتلًا جنينيًا. توفر تقنية تطعيم برعم الأطراف لدينا ميزة لإنجاز ذلك مقابل طرق برعم الأطراف الموصوفة سابقًا والمساهمة في تطعيم الأنسجة ، حيث يتم تنفيذها أثناء التطور الجنيني المبكر وتشمل زرع طبقات ectoderm وmesoderm الكاملة1،2.
وقد سبق وصف تطعيم برعم الأطراف Haploid; ومع ذلك ، في هذه الدراسة السابقة ، تم تطعيم براعم الأطراف haploid ectopically31. وكشف التحليل النووي المجهري للأطراف خارج الرحم المستمدة من هذه الطعوم عن مساهمات واسعة النطاق من الأنسجة الديبلويدية. في حين أن هذه الأطراف تطورت بشكل غير طبيعي ، فإنها كانت قادرة على تجديد31. بدلاً من تطعيم براعم الأطراف خارج الرحم، نستبدل براعم الأطراف الذاتية بأكملها بأنسجة هابلويد مكافئة. من خلال استخدام علامات الفلورسنت ، ونحن قادرون على تحديد بصريا أطراف هابلويد التي هي خالية من المساهمات diploid ، باستثناء الأعصاب وخلايا الدم ، دون التضحية الطرف haploid نفسها. نجد أن أطراف هابلويد تتطور وتتجدد بشكل طبيعي. ومع ذلك، فإن الأطراف التي يساهم فيها مضيفو GFP+ في أنسجة أخرى غير الخلايا العصبية والخلايا المشتقة من الدم غالبًا ما تظهر تشوهات. وهكذا، عند التحقيق في وظيفة الجينات في الأطراف haploid، يجب استبعاد أولئك الذين يعانون من المساهمات المضيف المفرطة من التحليل قبل أن يمكن أن يرتبط النمط الجيني مع أي النمط الظاهري لوحظ في الأطراف haploid متحولة.
الابتكارات الحديثة، مثل تجميع الجينوم axolotl والأساليب الأخيرة CRISPR / Cas المستندة إلى الإدراج15،16،32، قد وسعت بشكل كبير من مرونة الجينية من axolotl. إن أساليب تقييد التلاعب الجيني زمانياً ومكانية تبشر بالخير، ولكن تطبيقاتها الحالية مقيدة بالموارد اللازمة لتوليد وإيواء وتوزيع الخطوط الحيوانية. يسرع البروتوكول المفصل هنا العملية التي يمكن من خلالها بحث عواقب الاضطرابات الوراثية للجينات في تطور الأطراف وتجديدها. لم يكن هناك سوى القليل من التوصيف للعديد من الجينات التي تم العثور عليها في تجديد الأطراف ، وقد تشارك هذه الجينات في مجموعة متنوعة من العمليات التنموية والخلوية الأساسية. في حين أننا نتوقع أن العديد من الجينات المطلوبة لتجديد الأطراف ستكون مطلوبة أيضًا لتطوير الأطراف ، فإن هذه الطريقة قد تكشف ما إذا كانت أي جينات متورطة في التجديد لها أنماط ظاهرية لفقدان الوظيفة خاصة بالتجدد. CRISPR / Cas mutagenesis في axolotls تنتج عادة الفسيفساء أليليالذي يشمل الأليل ة البرية المحتفظ بها، وهذه الفسيفساء نفسها يمكن أن تعتبر كما هو النمط الظاهري قابلة للقياس الكمي20. باستخدام الجيل القادم من تسلسل الأطراف الأصلية والمجددة المبتورة ، قد يحدد الباحثون ما إذا كانت الخلايا الهالولويدية ذات الطفرات في جين محل اهتمام مفقودة بشكل تفضيلي بعد التجديد. قد يسمح هذا النهج بالتحقيق في الأنماط الظاهرية للتجديد الناتجة عن اضطراب الجينات التنموية الأساسية.
الشاشات الوراثية هابلويد فقدان وظيفة تسهيل التحقيق في الأصول الوراثية للعديد من العمليات البيولوجية دون الحاجة إلى إنشاء خطوط الخلايا المتحولة ثنائية. من خلال الجمع بين haplogenesis ، CRISPR / Cas9 الطفرات ، وتطعيم برعم الأطراف ، ونحن نقدم منصة جديدة لشاشة وراثية haploid استكشاف تطور الأطراف وتجديد في الحيوان الحي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
Acknowledgments
نود أن نشكر (كاثرين روبرتس) على رعايتها لمستعمرة (أكسولوتل) تم توفير التمويل لهذا العمل من قبل صندوق أبحاث الطب التجديدي للابتكارات في ولاية كونيتيكت (15RMA-YALE-09 و 15-RMB-YALE-01) ومعهد يونيس كينيدي شرايفر الوطني لصحة الطفل والتنمية البشرية (ما بعد الدكتوراه الفردية زمالة F32HD086942).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #55 Dumont Forceps | Fine Science Tools | 11295-1 | Only use Dumostar material (can be autoclaved) |
| Amphotericin B | Sigma Aldrich | A2942-20ML | 20 mL |
| Antibiotic-Antimycotic 100x | Thermo Fisher | 15240062 | |
| Ciprofloxacin | Sigma Aldrich | 17850-5G-F | |
| Ficoll 400 (polysucrose 400) | bioworld | 40600032-3 | Ficoll 400 |
| Gentamicin | Sigma Aldrich | G1914-250MG | |
| Heating/Cooling Incubator | RevSci | RS-IF-233 | |
| Human Chorionic Gonadotropin | Merk | Chorulon | |
| Megascript T7 Transcription Kit | Thermo Fisher | AM1334 | 40 reactions |
| Miroscope Cooling Stage | Brook Industries | Custom | Custom |
| NLS Cas9 Protein | PNAbio | CP01-200 | 4 vials of 50 µg protein each |
| Plasmocin | Invivogen | ant-mpt-1 | Treatment level |
| Recipes | |||
| 1.0x Marc's modified Ringer's solution (MMR) | 0.1 M NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 0.1 mM EDTA, 5 mM HEPES (pH 7.8), ph 7.4 | ||
| 40% Holtfreter's solution | 20 mM NaCl, 0.2 mM KCl, 0.8 mM NaHCO3, 0.2 mM CaCl2, 4 mM MgSO4, pH to 7.4 |
References
- Kragl, M., et al. Cells keep a memory of their tissue origin during axolotl limb regeneration. Nature. 460 (7251), 60-65 (2009).
- Maden, M., Goodwin, B. C. Experiments on developing limb buds of the axolotl Ambystoma mexicanum. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 57, 177-187 (1980).
- McCusker, C. D., Diaz-Castillo, C., Sosnik, J., Phan, A. Q., Gardiner, D. M. Cartilage and bone cells do not participate in skeletal regeneration in Ambystoma mexicanum limbs. Developmental Biology. 416 (1), 26-33 (2016).
- Brun, R. B. Experimental analysis of the eyeless mutant in the mexican axolotl (Ambystoma mexicanum). Integrative and Comparative Biology. 18 (2), 273-279 (1978).
- Lopez, D., et al. Mapping hematopoiesis in a fully regenerative vertebrate: the axolotl. Blood. 124 (8), 1232-1242 (2014).
- de Both, N. J. Transplantation of Axolotl Heads. Science. 162 (3852), 460-461 (1968).
- Harrison, R. G. Some Unexpected Results of the Heteroplastic Transplantation of Limbs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 10 (2), 69-74 (2006).
- Fields, E., French, V., Bryant, P. J., Bryant, S. V Pattern regulation in epimorphic fields. Science. 193 (4257), 969-981 (2013).
- Gerber, T., et al. Single-cell analysis uncovers convergence of cell identities during axolotl limb regeneration. Science. 362 (6413), (2018).
- Knapp, D., et al. Comparative transcriptional profiling of the axolotl limb identifies a tripartite regeneration-specific gene program. PloS One. 8 (5), e61352 (2013).
- Campbell, L. J., et al. Gene expression profile of the regeneration epithelium during axolotl limb regeneration. Developmental Dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 240 (7), 1826-1840 (2011).
- Bryant, D. M., et al. A Tissue-Mapped Axolotl De Novo Transcriptome Enables Identification of Limb Regeneration Factors. Cell Reports. 18 (3), 762-776 (2017).
- Gardiner, D. M., et al. Gene expression during the first 28 days of axolotl limb regeneration I: Experimental design and global analysis of gene expression. Regeneration. 2 (3), 120-136 (2015).
- Flowers, G. P., Timberlake, A. T., McLean, K. C., Monaghan, J. R., Crews, C. M. Highly efficient targeted mutagenesis in axolotl using Cas9 RNA-guided nuclease. Development. 141 (10), Cambridge, England. 2165-2171 (2014).
- Smith, J. J., et al. A Chromosome-Scale Assembly of the Enormous (32 Gb) Axolotl Genome. bioRxiv. , 373548 (2018).
- Nowoshilow, S., et al. The axolotl genome and the evolution of key tissue formation regulators. Nature. 559 (7712), 50-55 (2018).
- Fankhauser, B. Y. G. The Effects of Changes in Chromosome Number on Amphibian Development. The Quarterly Review of Biology. 20 (1), 20-78 (1945).
- Malacinski, G. M., Brothers, A. J. Mutant Genes in the Mexican Axolotl. Science. 184 (4142), 1142-1147 (1974).
- Armstrong, B. Gynogenesis in the mexican axolotl. Genetics. 83 (4), 783-792 (1976).
- Flowers, G. P., Sanor, L. D., Crews, C. M. Lineage tracing of genome-edited alleles reveals high fidelity axolotl limb regeneration. eLife. 6, 1-15 (2017).
- Shalem, O., et al. Genome - scale CRISPR - Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
- Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. Genetic Screens in Human Cells Using the CRISPR-Cas9 System. Science. 343 (6166), 80-84 (2014).
- Yin, Z., Chen, L. Simple Meets Single: The Application of. CRISPR/Cas9 in Haploid Embryonic Stem Cells. Stem Cells International. 2017, 1-6 (2017).
- Khattak, S., et al. Optimized axolotl (Ambystoma mexicanum) husbandry, breeding, metamorphosis, transgenesis and tamoxifen-mediated recombination. Nature Protocols. 9 (3), 529-540 (2014).
- Vachon, P., Zullian, C., Dodelet-Devillers, A., Roy, S. Evaluation of the anesthetic effects of MS222 in the adult Mexican axolotl (Ambystoma mexicanum). Veterinary Medicine: Research and Reports. 7, 1-7 (2016).
- Montague, T. G., et al. Efficient Mutagenesis by Cas9 Protein-Mediated Oligonucleotide Insertion and Large-Scale Assessment of Single-Guide RNAs. PLoS One. 9 (5), (2014).
- Moreno-Mateos, M. A., et al. CRISPRscan: designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo. Nature Methods. 12 (10), 982-988 (2015).
- Kumar, A., Simon, A. Salamanders in Regeneration Research: Methods and Protocols. , Humana Press. New York, NY. (2015).
- Hronowski, L., Gillespie, L. L., Armstrong, J. B. Development and Survival of Haploids of the Mexican Axolotl, Ambystoma mexicanum. Journal of Experimental Zoology. 209, 41-47 (1979).
- Schreckenberg, G. M., Jacobson, A. G. Normal stages of development of the axolotl, Ambystoma mexicanum. Developmental Biology. 42 (2), 391-399 (1975).
- Hertwig, G. Beitrage Zum Determinations- Und Regenerationsproblem Mittels Der Transplantation Haploidkerniger Zellen. Archiv f. Entwicklungsmechanik. 111, 292-316 (1927).
- Fei, J. -F., et al. Efficient gene knockin in axolotl and its use to test the role of satellite cells in limb regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (47), 12501-12506 (2017).
