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Genetics

Generación de axolotls quiméricos con extremidades haploides mutantes a través del injerto embrionario

Published: January 29, 2020 doi: 10.3791/60156
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology, Yale University

Summary

Este objetivo de este protocolo es producir axolotls quiméricos con extremidades anteriores haploides derivadas del tejido donante mutado Cas9 utilizando técnicas de injerto de tejido embrionario.

Abstract

Un creciente conjunto de técnicas y recursos genéticos permite a los investigadores sondear los orígenes moleculares de la capacidad de algunas especies de salamandras, como los axolotls, para regenerar extremidades enteras como adultos. Aquí, delineamos las técnicas utilizadas para generar axolotls quiméricos con extremidades anteriores haploides mutagenizadas cas9 que se pueden utilizar para explorar la función génica y la fidelidad de la regeneración de las extremidades. Combinamos varias técnicas embrionarias y genéticas, incluyendo la generación de haploides a través de activación in vitro, mutagénesis CRISPR/Cas9 e injerto de tejido en un solo protocolo para producir un sistema único para el cribado genético haploide en un organismo modelo de regeneración. Esta estrategia reduce el número de animales, el espacio y el tiempo necesario para el análisis funcional de genes en la regeneración de extremidades. Esto también permite la investigación de funciones específicas de regeneración de genes que pueden ser necesarias para otros procesos esenciales, como la organogénesis, la morfogénesis tisular y otros procesos embrionarios esenciales. El método descrito aquí es una plataforma única para llevar a cabo análisis genéticos haploides en un sistema modelo de vertebrados.

Introduction

Históricamente, el injerto de tejido embrionario en anfibios ha sido una técnica importante para explorar los mecanismos fundamentales de la biología del desarrollo y la regeneración. El axolotl, una especie de salamandra, posee una impresionante capacidad para regenerar tejidos y estructuras complejas como extremidades y órganos después de una lesión o amputación. Del mismo modo, pueden recibir, sin rechazo, injertos de tejido de otros individuos en etapas embrionarias, juveniles y adultas1,2,3. Las regiones de embriones que producen estructuras enteras como extremidades, colas, ojos y cabezas, y tejidos más específicos, como neuroectoderm y somitas, pueden ser injertadas entre embriones para producir animales quiméricos1,2,4,5,6. Durante casi un siglo, los estudios de estos animales quiméricos han proporcionado información crucial sobre la regeneración, diferenciación de tejidos, control de tamaño, y el patrón1,7,8.

En la última década, numerosos estudios transcripcionales de tejidos regeneradores han producido información sobre los programas genéticos subyacentes a la regeneración de salamandras9,10,11,12,13. Estos estudios se han sumado a una lista en expansión de genes candidatos que, hasta la fecha, no se caracterizan en gran medida en el contexto de la regeneración. Las técnicas de mutagénesis dirigidas, como CRISPR/Cas, ahora permiten la investigación de estos genes, y tales enfoques genéticosse ven muy facilitados por la reciente secuenciación y montaje del gran genoma del axololo1,15,16.

Buscamos desarrollar técnicas que combinaran la biología clásica del desarrollo con la nueva tecnología genética con el propósito de disuadar los mecanismos de regeneración. Durante décadas17se han establecido métodos para generar embriones haploides de axolotls y otras salamandras. Si bien estas técnicas se han observado durante mucho tiempo como ventajas de las salamandras como organismos modelo genéticos18, pocos estudios genéticos posteriores han incorporado animales haploides. Utilizamos la activación in vitro en el axolotl para producir embriones haploides que sirven como donantes de tejido para el injerto19. Utilizando embriones portadores de marcadores genéticos fluorescentes, hemos ideado métodos fiables para generar extremidades derivadas casi en su totalidad de tejidos de donantes(Figura 1A). Mediante la combinación de estas dos técnicas, hemos evitado la letalidad embrionaria tardía asociada con la haploidy, permitiendo la producción de extremidades haploides completamente desarrolladas e injertadas(Figura 1B, Figura 1B'y Figura 2).

Mediante la realización de mutagénesis mediada por CRISPR/Cas en embriones haploides antes del injerto para crear axolotls quiméricos con extremidades haploides mutantes, podemos investigar la función génica específicamente en el contexto del desarrollo y la regeneración de las extremidades. Esto permite el rescate de las extremidades de fenotipos mutantes potencialmente embrionarios-letales. Mientras que la microinyección CRISPR/Cas puede generar animales altamente mutantes, estos animales son típicamente altamente mosaicos, con cierto grado de retención de alelos de tipo salvaje y una variedad de mutaciones distintas en los sitios objetivo14,20. La mutagénesis basada en CRISPR en células haploides aumenta la penetración de mutaciones de pérdida de función de alelos únicos, ya que no pueden enmascararse con alelos de tipo salvaje retenidos. Por esta razón, el cribado basado en CRISPR en líneas celulares haploides se utiliza cada vez más para investigar la base genética de muchos procesos celulares21,22,23. Mediante la combinación de trazas de linaje basadas en CRISPR con nuestros protocolos de injerto de cogollos de extremidades haploides, el enfoque descrito aquí puede servir como una plataforma para pantallas genéticas haploides en animales vivos20.

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Protocol

Los procedimientos experimentales utilizados en este protocolo fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Yale (IACUC, 2017-10557) y estaban de acuerdo con todas las políticas y directrices federales que rigen el uso de animales vertebrados. Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo en Ambystoma mexicanum (axolotls) en instalaciones de la Universidad de Yale.

1. Generación de embriones diploides

  1. Obtener embriones diploides GFP+ para servir como huéspedes de injerto a través del apareamiento natural utilizando uno o dos padres gfp 24.
  2. Recoger los huevos diploides recién puestos y colocarlos en un tamiz de metal.
  3. Enjuagar bien los huevos con 40% de solución de Holtfreter (20 mM NaCl, 0,2 mM KCl, 0,8 mM NaHCO3, 0,2 mM CaCl2, 4 mM MgSO4,pH a 7,4).
  4. Colocar los huevos en la solución fresca 40% de Holtfreter y almacenar a 12 oC.
    NOTA: Los embriones diploides siempre deben obtenerse antes de pasar a la generación de embriones haploides.

2. Generación de embriones haploides

  1. Preparación de donantes de gameto femeninos
    1. 48 h antes de realizar la activación in vitro, anestesiar un axolotl hembra blanca o blanca/RFP sexualmente madura por inmersión en 1 g/L MS-222 con búfer HEPES en la solución del 40% de Holtfreter25.
    2. Asegúrese de que el animal esté completamente anestesiado después de aproximadamente 30 minutos de inmersión pellizcando firmemente su cola entre el pulgar y el dedo índice. Los animales completamente anestesiados no responderán físicamente a ningún pellizco.
    3. Preparar una solución de gonadotropina coriónica humana (HCG) que contiene 10.000 U/ml en solución salina estéril.
    4. Con una jeringa de insulina de 30 G, inyectar 0,15 CC de HCG (1.500 unidades) en la musculatura dorsal hasta la extremidad posterior de la hembra anestesiada en un ángulo de 45o con respecto a la línea media para evitar el contacto con la médula espinal.
    5. Devuelva a la hembra a la solución fresca de Holtfreter al 40% y colóquela en un refrigerador de 8 x 12 oC.
    6. Después de 48 h, vuelva a la hembra a temperatura ambiente. Coloque algunas piedras o plantas de plástico en su recipiente como superficies para la puesta de huevos.
      NOTA: Las hembras inyectadas con HCG a menudo depositarán cajas vacías de jalea durante varias horas antes de poner huevos.
    7. Retire las piedras o plantas de plástico después de que la hembra haya comenzado a poner huevos constantemente.
    8. Deje que la hembra se sente en el tanque vacío durante 30 minutos a 1 h.
      NOTA: Los materiales de retención para que el animal laa los huevos permitirán un control más estricto de la recolección de ovocitos.
  2. Colección de gametos masculinos
    1. Mientras que la puesta de óvulos de la hembra está estancada, anestesia rinde un axolotl masculino GFP+ sexualmente maduro para servir como donante de esperma, como en el paso 2.1.1.
    2. Coloque el macho completamente anestesiado boca abajo sobre toallas de papel húmedas bajo un microscopio de disección.
    3. Si el experimentador es diestro, coloque la punta de una pipeta P1000 en la base de la cloaca con la mano derecha.
    4. Coloque el dedo índice izquierdo y el pulgar de la mano izquierda 2 x 3 cm rostral a la pelvis. Apriete suavemente al animal mientras mueve los dedos hacia las patas traseras para eliminar las muestras de orina espermática.
    5. Recoger cada uno que se expulsa de la cloaca en un tubo de microcentrífuga individual. Repita este proceso para recoger de 6 a 10 muestras.
    6. Pipetear 5,0 l de cada muestra en una placa de petri para inspeccionar la calidad de los espermatozoides utilizando un microscopio invertido.
      NOTA: Las muestras de espermatozoides concentrados son de un color blanco lechoso, por lo general oscilan entre 5 y 20 l, y generalmente se recuperan después de extraer varias muestras de orina espermática de mayor volumen. Los espermatozoides se acumularán en la parte inferior de los tubos en muestras de mayor volumen cuando se dejen sin perturbar. Las muestras concentradas de espermatozoides sanos son altamente móviles y pierden actividad a medida que disminuye su concentración. Los machos sanos pueden producir hasta 50 ml de espermatozoides concentrados.
  3. Colección de gametos femeninos
    1. Después de obtener y confirmar una muestra de espermatozoides sana, anestesiael axolotl femenino inyectado por HCG como en el paso 2.1.1.
    2. Coloque a la hembra completamente anestesiada sobre toallas de papel húmedas en la espalda.
    3. Extraiga los óvulos no fecundados de la hembra utilizando un movimiento de mano similar al del paso 2.2.4.
    4. Recoger los huevos usando fórceps húmedos y transferirlos a un plato de petri de 10 cm. Tratar los óvulos con espermatozoides irradiados dentro de los 15 minutos de recolección.
  4. Preparación de gametos masculinos y activación in vitro
    1. Utilice una pipeta P10 o P20 para pipetear los espermatozoides hacia arriba y hacia abajo, rompiendo los grumos para formar una suspensión homogénea.
    2. Aproximadamente el porcentaje de espermatozoides móviles colocando una gota de 0,5 l de suspensión de espermatozoides sin diluir en una tapa de la placa de petri o un portaobjetos de vidrio y examinando con un microscopio invertido.
    3. Añadir 9,5 ml de la solución de Timbre modificada de 0,1x Marc (MMR; Tabla de Materiales) a esta muestra para hacer una dilución de espermatozoides 20x. Pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo para mezclar.
    4. Con un microscopio invertido, cuente el esperma en tres gotas de 1,0 l de la alícuota diluida de 20x en una cubierta de plato de petri o hemocitómetro para estimar la concentración de espermatozoides de la suspensión sin diluir.
    5. Preparar los espermatozoides para la irradiación diluyendo una alícuota de la muestra de espermatozoides original a aproximadamente 80.000 células móviles/ml en MMR estéril es 0.1x.
    6. Cuente el número de óvulos obtenidos en los últimos 15 min. Añadir 0,5 l de los espermatozoides recién diluidos del paso 2.4.5 por óvulo a una placa de petri. Utilice la punta de la pipeta para esparcir esta suspensión en una capa de 1 mm de espesor.
    7. Con un elevador de plástico, coloque la muestra a 4 cm de las bombillas de un reticolador de 254 nm. Inactivar genéticamente los espermatozoides irradiando la muestra con 800.000 uJ/mm2.
    8. Con una pipeta P10, pipetee la suspensión sobre los óvulos no fecundados, cubriendo cada óvulo con 0,25 x 0,5 l de espermatozoides irradiados. Deje que los huevos se senten a temperatura ambiente durante 30 min.
    9. Después de 30 min, inundar los huevos con 0,1x MMR. Colocar inmediatamente los huevos en una incubadora de 8o10 oC para preparaciones inyectables al día siguiente o a 18 oC para preparaciones inyectables dentro de las 7 horas posteriores a la activación (hpa).
    10. Dejelly haploids usando fórceps afilados 30 min después de la hidratación. Colocar inmediatamente los huevos en una incubadora de 8oC para preparaciones inyectables al día siguiente o a 18 oC para preparaciones inyectables el mismo día.

3. Mutagénesis haploide y mantenimiento

  1. Microinyecciones CRISPR/Cas9
    1. Diseñe sgRNA utilizando CRISPRscan y sintete26,27.
    2. Para la mutagénesis múltiplex, prepare un stock de 5 sgRNA (10 ng/L para cada sgRNA) y proteína Cas9 (1 g/L). Preparar una dilución de 100 veces de este material (0,1 ng/L por sgRNA, 10 ng/L Cas9) para inyección. Para un solo gen, mutagénesis de alta frecuencia de mutación, siga el protocolo descrito anteriormente28.
    3. Inyectar embriones haploides en la etapa de una sola célula 7 hpa si se almacenan a 18 oC o inyectar embriones al día siguiente en la etapa de 2 a 8 células si se almacenan a 8 o10 oC.
    4. Transfiera los embriones a 1,0x MMR con 20% de polisurosa 400.
    5. Si es una sola célula, inyecte cada embrión con una gota de 5 nL de la solución inyectable (aproximadamente 1/4 de radio del óvulo) que contenga una masa total de 0,5 pg/sgRNA y 50 pg de proteína Cas9. Si es multicelular, distribuya esta masa inyectando volúmenes más pequeños en varias celdas.
    6. Dejar que los embriones sanen en la polisurosa 400 durante un mínimo de 4 h y un máximo de 18 h a 18oC.
  2. Vivienda de embriones haploides
    1. Transfiera los embriones a 0,1x MMR con antibiótico-antimicótico.
    2. Casar cada embrión en un pozo individual de una placa de 24 pocillos, ya que algunos morirán o se desarrollarán anormalmente. Mantener a 16 o 18 oC. Las temperaturas más bajas se pueden utilizar para prolongar el desarrollo, si es necesario.
    3. Sustituya el soporte por 0,1x MMR fresco por antibióticos antimicóticos cada dos días.

4. Preparación de embriones de host diploide

  1. Mantener los embriones en el recubrimiento de jalea a 12 a 16 oC hasta que lleguen a la etapa 22 a 26.
  2. Recoger los embriones que están listos para el injerto, colocarlos dentro de un tamiz (tamaño de malla de 4 mm), y enjuagar suavemente con 40% la solución de Holtfreter.
  3. Transfiera los embriones a 0,1x MMR esterilizados por filtro que contengan 1,5% de lejía durante un máximo de 2 min. Sumerjan completamente los embriones en la solución de lejía y arremolinarlos suavemente para asegurarse de que el recubrimiento de jalea entre en contacto con la solución de lejía para matar el microbios presentes en los embriones.
  4. Después de 2 min, diluir la solución de lejía que contiene los embriones con un volumen igual de 0,1x MMR esterilizado por filtro.
  5. Vierta suavemente los embriones en un tamiz de sinvida de lejía (tamaño de malla de 4 mm) y enjuague los embriones cinco veces con 0,1x MMR esterilizado por filtro.
  6. Colocar los embriones en platos estériles de petri de 10 cm con 0,1x MMR con antibióticos para dejellying (penicilina 100 unidades/ml, estreptomicina 100 g/L, 0,25 g/ml, gentamicina 25 g/ml).
  7. Bajo un estereomicroscopio fluorescente, retire las capas de gelatina y las membranas vitelinas de los embriones GFP+ utilizando fórceps afilados (dimensiones de punta 0,05 x 0,01 mm2).
  8. Transfiera los embriones GFP+ a una nueva placa de petri. Minimizar la cantidad de líquido transferido de la placa de petri donde fueron dejellied.
  9. Enjuague los embriones huésped de GFP+ con 0,1 x MMR estéril con antibióticos de cuatro a seis veces para eliminar los contaminantes.
  10. Colocar los embriones limpios a 4oC durante la noche antes del injerto.
    NOTA: El enfriamiento de los embriones hace que sean más rígidos y limpios de separación del mesodermo del endodermo factible.

5. Generación quimera haploide-diploide

  1. Preparación quirúrgica de platos y medios
    1. Preparar platos de operación quirúrgica estériles vertiendo autoclaved 2% agarosa en 0.1x MMR en platos estériles de 35 mm petri fáciles de agarrar. Llene los platos de petri a mitad de camino con agarosa.
    2. Después de que la agarosa se enfríe, utilice un bisturí estéril para cortar una vaguada de 25 mm de largo y eslanada en la agarosa para mantener los embriones en su lugar.
    3. Llene el plato con medios quirúrgicos estériles (0,1x MMR con antimicoplasma 2,5 g/ml, anfotericina B 0,25 g/ml y ciprofloxacino 10,0 g/ml) y refrigerar a 4 oC.
  2. Procedimiento de injerto de embriones
    1. Coloque un donante haploide sano con uno o dos embriones huésped diploide GFP+ emparejados dentro de la cubeta del plato de operación pretallado que contiene medios quirúrgicos(Figura 3).
      NOTA: Realice el procedimiento en una etapa de enfriamiento (10 oC o inferior) si es posible.
    2. Utilice dos fórceps autoclave ultrafinos (punta recta, dimensiones de la punta 0,05 x 0,02 mm2) para eliminar las capas de ectodermo y mesodermo del huésped con el cogollo cerca del centro(Figura 4).
      NOTA: La región del injerto de tejido rectangular abarca el cogollo de la extremidad y se extiende desde la novena somita hasta la mitad posterior de la protuberancia de la branquia, de unos 2 mm, a lo largo del eje posterior anterior. A lo largo del eje dorsoventral, la región injertada abarca aproximadamente 1,5 mm, incluyendo las somitas hasta justo más allá del borde ventral de la protuberancia de la branquia. La región injertado incluye todos los mesodermos de placa lateral y las mitades laterales de las somitas, sin perturbar el endoderm subyacente. Consulte la Figura 4 y el vídeo adjunto para obtener más información.
    3. Deje a un lado el tejido huésped y retire una lámina de tejido de tamaño equivalente del donante haploide utilizando los mismos métodos.
    4. Coloque la lámina de tejido del donante haploide en la región correspondiente del embrión del donante.
    5. Asegure el tejido cubriéndolo con un fragmento de vidrio rectangular autoclave de un vidrio de cubierta de microscopio triturado y presionando suavemente en el cuerpo del embrión huésped.
    6. Voltee el embrión del donante haploide hacia el otro lado para cosechar el brote de la extremidad para el segundo embrión huésped. Repita los pasos 5.2.2 a 5.2.5.
    7. Retire cuidadosamente el exceso restante de los tejidos huésped y el embrión del donante del plato.
    8. Deje los injertos con los anclajes de la partición de vidrio en su lugar durante 60 x 75 minutos, comprobando cada 20 minutos para asegurarse de que el vidrio no se ha deslizado.
    9. Después de que los injertos de tejido se adhieran completamente, usa los fórceps para pelar lentamente los anclajes de fragmentos de vidrio.
  3. Mantenimiento de quimeras
    1. Transfiera los embriones injertados a medios quirúrgicos frescos y manténgalos a 8 o 12 oC durante la noche para sanar. Casa individual embriones injertados en placas de 12 o 24 pocillos.
    2. Después de 36 a 48 h, transfiera los embriones injertados a antibiótico-antimicótico estéril de 0,1 x MMR. Los antibióticos fuertes en los medios quirúrgicos causan toxicidad en embriones injertados después de 3 días.
    3. Sustituya los medios por 0,1x MMR frescos y antibióticos cada 2 o 3 días.
    4. Mantener los embriones injertados a 18oC hasta que puedan alimentar28.
    5. Después de 1 a 2 meses de desarrollo y cuidado, las extremidades haploides se pueden puntuar para la pureza del injerto utilizando un microscopio de disección fluorescente.
      NOTA: La presencia de tejido GFP no neural o no derivado de la sangre en las extremidades es un indicador de injerto impuro y a menudo se asocia con el desarrollo anormal de las extremidades. Estos animales deben excluirse de un análisis posterior.

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Representative Results

El desarrollo de embriones haploides puede distinguirse de los embriones diploides por su fenotipo29del "síndrome haploide". En la etapa del injerto, los embriones haploides presentan una curvatura reducida a lo largo del eje anterior-posterior y un encieimiento incompleto del tapón de la yema(Figura 3A). Se puede utilizar un microscopio fluorescente para garantizar que los embriones haploides estén libres de expresiones GFP derivadas de la paternidad(Figura 3B).

Cuando los injertos están limpios, la expresión de GFP debe limitarse principalmente al plexo braquial, la red neuronal derivada de la médula espinal del huésped, como se ve en la Figura 2. La expresión Punctate GFP también estará presente en células individuales que parecen ser neuronas sensoriales y células huésped derivadas de la sangre, que migran a la extremidad en desarrollo. Cuando se utilizan donantes RFP+, las extremidades del injerto haploide mostrarán la expresión universal de RFP(Figura 1B'). A lo largo del desarrollo, las extremidades haploides no mutagénicas son significativamente más cortas que las extremidades delanteras diploides opuestas en animales quiméricos de tamaño igualado(Figura 1B, Figura 1B'y Figura 5,n a 16 pares de extremidades, pares de extremidades, Media haploide á 0,522 cm, SD a 0,087 cm, media diploide a 0,667 cm, SD a 0,069 m, valor p de prueba en T emparejado < 0,0001, relación media a 0,784, SD a 0,113). Las extremidades haploides no mutadas también se regeneran completamente (4/4 haploide y 4/4 diploides regeneración completa, Figura 6), aunque muestran un ligero retraso en llegar a la etapa de crecimiento digital en comparación con los diploides (n x 4 haploides, n 4 diploides; 23 días después de la amputación: paleta de haploides 3 y 1 extremidad de la etapa de crecimiento de salida digital; diploides).

El injerto exitoso requiere práctica, y la consistencia variará dependiendo de las habilidades de micromanipulación del técnico y la técnica estéril. Los injertos fallidos e impuros producen una variedad de fenotipos, como se ve en la Figura 7 y la Figura 8. En nuestras manos, aproximadamente el 38,7% (SD a 8,78%) de los ovocitos se convierten en embriones haploides desarrollados normalmente y 11,1% (SD a 5,46%) de todos los injertos haploides-diploides producen animales viables con extremidades haploides normalmente desarrolladas y bien injertadas(Figura 9).

Figure 1
Figura 1: Descripción general del protocolo y un ejemplo de un axolotl quimérico. (A) Esquema que describe el momento relativo de las medidas tomadas para obtener embriones huésped diploides, espermatozoides y óvulos con el fin de generar haploides y embriones quiméricos. (B) Imagen brillante compuesta de un axololol juvenil producido por el injerto de cogollo de extremidad embrionario de un embrión haploide RFP+ a un huésped diploide GFP+ (B') Superposición de imágenes fluorescentes verdes y rojas del mismo axololol juvenil de 8 cm. La extremidad haploide es muy normal, pero más corta que la extremidad diploide opuesta. Barra de escala 1 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Imagen fluorescente de una extremidad haploides normalmente desarrollada y limpiamente injertada. GFP- extremidad haploides injertado en un huésped diploide GFP+ muestra patrón de expresión de GFP que parece estar restringido a los nervios espinales que inervan la extremidad (flecha amarilla) y las neuronas sensoriales individuales y las células derivadas de la sangre (flechas blancas). La extremidad en la imagen pertenecía a un juvenil de 4 cm. Barra de escala 1 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Comparación de embriones diploides y haploides. (A) Imagen de luz de diploides (izquierda) y haploides (derecha). Observe la curvatura reducida del eje AP y el endodermo saliente de los embriones haploides (flechas blancas). (B) Imagen fluorescente verde de los mismos embriones. Los haploides GFP se generaron utilizando óvulos de una hembra de GFP e espermatozoides irradiados a partir de un GFP+. Los diploides son GFP+. Los embriones en la foto son aproximadamente la etapa 2530. Serie de ensayo. Barra de escala 1 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Esquema que describe la extensión de un injerto de cogollo de extremidad escaloides. (A) Vista lateral de un embrión haploide en etapa 25. Las líneas punteadas muestran el área aproximada que debe ser trasplantada, en relación con la protuberancia de la branquia y el brote de las extremidades. (B) Esquema transversal de la etapa 25. Las líneas punteadas muestran el área aproximada y los tipos de tejido que se deben eliminar del huésped y reemplazarse con el tejido del donante haploide correspondiente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Comparación de longitudes de extremidades haploides y diploides. (A) Gráfico de dispersión de las longitudes de las extremidades haploides (rosa) y las extremidades diploides opuestas (verde) de 16 animales quiméricos de tamaño similar (media haploides a 0,522 cm, SD a 0,087 cm, media diploide a 0,667 cm, SD a 0,069 cm). Las extremidades se midieron desde la base del zeugopod hasta la unión de los dígitos 2 y 3. (B) Gráfico de dispersión de la longitud de las extremidades haploides a las proporciones de longitud de las extremidades diploides de los 16 animales (relación media de 0,784, SD a 0,113 cm). (C) Gráfico de dispersión de las longitudes del cuerpo (cm) de las 16 quimeras medidas (longitud media del animal a 8,72 cm a 0,456 cm). Los animales se midieron desde la punta del hocico hasta la punta de la cola. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Comparación de la regeneración en extremidades haploides y diploides. (A) Extremidad haploides previa a la amputación. (B) La misma extremidad haploides después de la regeneración. (C) Extremidad diploide pre-amputación. (D) La misma extremidad diploide después de la regeneración. 4/4 extremidades haploides y 4/4 extremidades diploides regeneradas con morfología normal. Las líneas de puntos negras indican el plano de amputación. Barras de escala de 1 mm. Se realizaron amputaciones en animales juveniles de tamaño igualado (8,5 cm). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: Ejemplos de desarrollo normal y anormal de extremidades haploides. (A) Una extremidad haploides con morfología groseramente normal. (B-E) Ejemplos de injertos que no apoyaron el desarrollo completo de haploides. (B) Oligodactyly. (C) Más grave oligodactiliamente. (D) No existen estructuras digitales distintas. (E) Sin extremidad. Las extremidades que se muestran pertenecen a juveniles de tamaño similar (8,0 a 10 cm). Barras de escala de 1 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 8
Figura 8: Ejemplos de células GFP+ en injertos de extremidades haploides impuros. (A,A') Extremidad de injerto haploide morfológicamente normal con células diploides GFP+ en la piel y dermis (contorno blanco discontinuo) revelado por microscopía fluorescente. (B,B') Una extremidad haploides anormal injertada con células diploides GFP+ que contribuyen extensamente a la dermis y la piel (esquema blanco). (C,C') Una extremidad haploides anormal injertada en la que la epidermis ha sido reemplazada por células diploides GFP+ (contorno blanco). Las extremidades que se muestran pertenecen a juveniles de tamaño similar (8,0 a 10,0 cm). Barra de escala 1 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 9
Figura 9: Tasas de éxito de la generación de embriones haploides y extremidades haploides. (A) Porcentaje de embriones haploides viables generados mediante activación in vitro. Se recopilaron datos de cinco experimentos independientes de activación in vitro. El verde indica la fracción de los óvulos que produjeron embriones haploides en la etapa 25 que podrían utilizarse para el injerto (media de 38,7%, SD a 8,78%). El gris indica la fracción de huevos que no mostraban signos de escote, no eran viables o eran normales en desarrollo. (B) Porcentaje de extremidades haploides normalmente desarrolladas y limpiamente injertas. El púrpura indica la fracción de los injertos que dieron lugar a extremidades haploides limpias y normalmente desarrolladas (media de 11,1%, SD a 5,46%). El verde indica las extremidades que se desarrollaron normalmente pero tenían tejidos huésped que contaminaban gFP+ (media de 11,3%, SD a 8,64%). El rojo indica las extremidades del injerto que no se desarrollaron normalmente (media de 27,1%, SD a 30,3%). El azul indica todos los embriones y animales injertados que no sobrevivieron para completar el desarrollo de las extremidades (media de 50,5%, SD a 31,2%). La pérdida de animales injertados se distribuyó en etapas embrionarias tardías y larvarias. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Hay algunos pasos críticos en nuestro protocolo para generar quimeras haploide-diploides que el técnico operativo debe considerar para obtener resultados consistentes de injerto.

La razón más probable para que la generación de haploides falle es debido a las malas condiciones de activación in vitro. Se deben utilizar las cantidades adecuadas de espermatozoides móviles para activar los óvulos. Para prolongar la motilidad, las muestras de espermatozoides deben mantenerse siempre a 4 oC. Antes de aplicar cualquier muestra de espermatozoides a los óvulos, compruebe la viabilidad de los espermatozoides utilizando un microscopio invertido. Nunca se deben utilizar espermatozoides completamente no móviles, y la concentración debe ajustarse a 80.000 células móviles/ml. Demasiado espermatozoides en el paso de activación también puede prevenir el desarrollo normal del óvulo. Los pozos de esperma, que aparecen como pequeñas hendiduras oscuras en la superficie del óvulo, son una indicación física de que un espermatozoide ha penetrado en el óvulo y normalmente aparecen de 20 a 60 minutos después de aplicar los espermatozoides. Es posible que los óvulos con diez o más espermatozoides no se activen correctamente.

Los óvulos no fertilizados se pueden activar si se recogen dentro de los 15 minutos después de ser colocados bajo el agua, colocados en un plato de petri seco y secados a fondo con toallas de papel antes de la aplicación de espermatozoides. Alternativamente, como se muestra en el video, los óvulos pueden ser exprimidos de una hembra inyectada con hormonas. Encontramos que estos huevos "secos" dan resultados más consistentes, aunque regularmente empleamos ambos métodos.

El injerto exitoso requiere el acoplamiento adecuado de embriones diploides con tejido de cogollos de extremidades haploides apropiadamente escenificados. Este protocolo contiene una serie de medidas para garantizar la coincidencia de etapas. Como el apareamiento natural no siempre resulta en la puesta de óvulos, la inyección de HCG para obtener ovocitos haploides no debe realizarse hasta que la hembra apareada naturalmente comience a poner huevos diploides. Después de esta inyección, la hembra inducida debe ser alojada a temperatura reducida (8 a 12 oC), lo que reducirá la tasa de puesta de huevos. Alojar a la hembra estimulada por hormonas a temperaturas normales puede resultar en la mayoría de los huevos que se ponen en un corto período de tiempo. La aparición de óvulos en una hembra fría indica que la hembra está lista para la anestesia y la extracción de ovocitos. La activación de los ovocitos debe producirse dentro de los 15 minutos de extracción de ovocitos. Debido a que los embriones haploides activados estarán varios días detrás de los embriones diploides producidos naturalmente en desarrollo, recomendamos incubar embriones diploides a 12 oC mientras aumenta mosquela la tasa relativa de desarrollo de los haploides incubando a 18 oC. Debido a que habrá alguna variación en el intervalo entre la inyección de HCG y la puesta de óvulos de las hembras inducidas, pueden ser necesarios ligeros ajustes en las temperaturas de incubación de los haploides o diploides para que la puesta en escena de embriones de huésped y donante se emparejen en el momento del injerto. Los embriones se deben enfriar a 4 oC durante varias horas antes del injerto, y esto casi detiene el desarrollo. La diferencia del tiempo de aparición de embriones haploides y diploides escalofriantes antes del injerto puede permitir la coincidencia de etapas. Mientras que los embriones haploides difieren morfológicamente de los diploides, tanto los haploides como los diploides alcanzan la etapa 21 después de que los pliegues neurales se cierran y los embriones se encuentran uno de sus lados. Al igual que los diploides, los embriones haploides en etapa 25 tienen agallas prominentes y protuberancias propensas. La cabeza grande sobresale en un ángulo relativo al cuerpo en haploides, aunque esto se reduce en gran medida en relación con la etapa 25 embriones diploides, cuyas cabezas sobresalen del cuerpo en casi un ángulo recto30.

La técnica estéril es absolutamente crítica para el injerto de tejido exitoso. Las condiciones estériles deben mantenerse a través de la totalidad del experimento desde la generación de haploides hasta el desarrollo embrionario de las quimeras. Recomendamos mantener a todos los animales padres en condiciones de agua limpias y no sistema durante el período de puesta de huevos para minimizar la cantidad de material orgánico contaminante al inicio del procedimiento. La extirpación constante y diaria de embriones fallecidos o moribundos a través de todo el proceso es importante para mantener la salud de los otros embriones. Recomendamos alojar individualmente todos los embriones haploides y quimeras para minimizar la contaminación cruzada.

Las habilidades de microdisección embrionaria y de injerto tisular se adquieren a través de la práctica. Durante el proceso de injerto, es importante no perforar o desgarrar el propio cogollo de la extremidad. Los tejidos que se extraen del huésped y los embriones de donante deben extenderse más allá del brote de la extremidad, como se muestra en la imagen, para proporcionar una zona de amortiguación. Si se injerta una zona de tejido demasiado pequeña, las extremidades haploides serán infiltradas por la piel diploide GFP+ y otros tejidos.

Una de las limitaciones de esta técnica de injerto es que el tejido neural y la sangre en las extremidades se derivan del cuerpo huésped. En algunos casos raros, hemos sido capaces de generar extremidades haploides injertadas que carecen completamente de todos los signos de GFP+ que expresan los nervios. En estos casos, pudimos reemplazar suficiente tejido neural en el animal huésped con el del donante. Sin embargo, este injerto extenso es difícil, poco confiable, y a menudo produce anomalías en el desarrollo fuera de la extremidad.

La haploidición es letal embrionaria en el axolotl. Del mismo modo, las mutaciones en muchos genes potencialmente esenciales para el desarrollo y la regeneración de las extremidades también son letales embrionarias tempranas. Nuestro protocolo evita la letalidad embrionaria de la haploidía para la producción de extremidades experimentales y también podría utilizarse en casos en los que la mutación de un gen de regeneración candidato produce un fenotipo letal embrionario. Nuestra técnica de injerto de cogollos de extremidades proporciona una ventaja para lograr este método frente a los métodos descritos previamente de la ema de las extremidades y el injerto de tejido que contribuye, ya que se realiza durante el desarrollo embrionario temprano e implica el trasplante de ectodermo completo y capas de mesodermos1,2.

Se ha descrito previamente el injerto de los miembros háloides; sin embargo, en este estudio anterior, los cogollos de las extremidades haploides fueron injertados ectópicamente31. El análisis nuclear microscópico de las extremidades ectópicas derivadas de estos injertos reveló extensas contribuciones del tejido diploide. Mientras que estas extremidades se desarrollaron anormalmente, fueron capaces de regenerar31. En lugar de injertar los cogollos ectópicos de las extremidades, reemplazamos todo el cogollo endógeno de las extremidades por tejidos haploides equivalentes. Mediante el uso de marcadores fluorescentes, somos capaces de identificar visualmente las extremidades haploides que están libres de contribuciones diploides, con la excepción de los nervios y las células sanguíneas, sin sacrificar la extremidad haploides en sí. Encontramos que las extremidades haploides se desarrollan y regeneran normalmente. Sin embargo, las extremidades en las que los huéspedes de GFP+ contribuyen a tejidos distintos de las células neuronales y derivadas de la sangre a menudo muestran anomalías. Por lo tanto, al investigar la función génica en las extremidades haploides, las personas con contribuciones excesivas al huésped deben ser excluidas del análisis antes de que un genotipo pueda asociarse con cualquier fenotipo observado en las extremidades haploides mutantes.

Las innovaciones recientes, como el montaje del genoma del axolotl y los recientes métodos de inserción basados en CRISPR/Cas15,16,32,han ampliado drásticamente la maleabilidad genética del axolotl. Los métodos para restringir las manipulaciones genéticas temporal y espacialmente son muy prometedores, pero sus aplicaciones actuales están restringidas por los recursos necesarios para generar, albergar y distribuir líneas animales. El protocolo detallado aquí acelera el proceso por el cual las consecuencias de las perturbaciones genéticas de los genes pueden ser investigadas en el desarrollo y regeneración de las extremidades. Ha habido poca caracterización de muchos de los genes que se encuentran como regulados en las extremidades regeneradoras, y estos genes pueden estar involucrados en una variedad de procesos esenciales de desarrollo y celulares. Si bien anticipamos que muchos genes necesarios para la regeneración de extremidades también serán necesarios para el desarrollo de las extremidades, este método puede descubrir si los genes implicados en la regeneración tienen fenotipos de pérdida de función que son específicos de la regeneración. La mutagénesis CRISPR/Cas en axolotls normalmente produce mosaico alélico que incluye alelos de tipo salvaje retenidos, y este mosaico en sí puede considerarse como un fenotipo cuantificable20. Utilizando la secuenciación de próxima generación de las extremidades originales y regeneradas amputadas, los investigadores pueden cuantificar si las células haploides con mutaciones en un gen de interés se pierden preferentemente después de la regeneración. Este enfoque puede permitir la investigación de fenotipos de regeneración producidos por la perturbación de genes de desarrollo esenciales.

Las pantallas genéticas de pérdida de función haploides facilitan la investigación de los orígenes genéticos de muchos procesos biológicos sin necesidad de establecer líneas celulares mutantes bialélicas. Al combinar haplogénesis, mutagénesis CRISPR/Cas9 e injerto de cogollos de extremidades, proporcionamos una plataforma novedosa para una pantalla genética haploide que explora el desarrollo y la regeneración de extremidades en un animal vivo.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Nos gustaría agradecer a Katherine Roberts por su cuidado de la colonia de axolotl. La financiación de este trabajo fue proporcionada por el Connecticut Innovations Regenerative Medicine Research Fund (15RMA-YALE-09 y 15-RMB-YALE-01) y el Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (Individual Postdoctoral Beca F32HD086942).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
#55 Dumont Forceps Fine Science Tools 11295-1 Only use Dumostar material (can be autoclaved)
Amphotericin B Sigma Aldrich A2942-20ML 20 mL
Antibiotic-Antimycotic 100x Thermo Fisher 15240062
Ciprofloxacin Sigma Aldrich 17850-5G-F
Ficoll 400 (polysucrose 400) bioworld 40600032-3 Ficoll 400
Gentamicin Sigma Aldrich G1914-250MG
Heating/Cooling Incubator RevSci RS-IF-233
Human Chorionic Gonadotropin Merk Chorulon
Megascript T7 Transcription Kit Thermo Fisher AM1334 40 reactions
Miroscope Cooling Stage Brook Industries Custom Custom
NLS Cas9 Protein PNAbio CP01-200 4 vials of 50 µg protein each
Plasmocin Invivogen ant-mpt-1 Treatment level
Recipes
1.0x Marc's modified Ringer's solution (MMR) 0.1 M NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 0.1 mM EDTA, 5 mM HEPES (pH 7.8), ph 7.4
40% Holtfreter's solution 20 mM NaCl, 0.2 mM KCl, 0.8 mM NaHCO3, 0.2 mM CaCl2, 4 mM MgSO4, pH to 7.4

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References

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Genética Número 155 axolotl haploide injerto de tejido trasplante regeneración extremidad cardo de miembros quimera CRISPR Cas9 mutagénesis multiplex
Generación de axolotls quiméricos con extremidades haploides mutantes a través del injerto embrionario
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Sanor, L. D., Flowers, G. P., Crews, C. M. Generation of Chimeric Axolotls with Mutant Haploid Limbs Through Embryonic Grafting. J. Vis. Exp. (155), e60156, doi:10.3791/60156 (2020).

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