Summary
Aquí se presenta un método sencillo para medir la actividad de la chitinasa en fluidos biológicos como el lavado broncoalveolar o el suero.
Abstract
Las chitinasas son las enzimas que se paran la quitina. Incluso en ausencia de quitina, los mamíferos tienen cantidades significativas de chitinasis presentes en el cuerpo, incluso al inicio. El papel preciso de la chitinasa no se conoce, sin embargo se creía que desempeña un papel importante en la digestión y la defensa del huésped contra los alimentos y patógenos que contienen quitina, respectivamente. El trabajo reciente, incluido el nuestro, ha demostrado un importante papel de las proteínas de chitinasa y las proteínas similares a las chitinasas en la inmunidad al huésped y las enfermedades alérgicas. Es importante destacar que las actividades de la chitinasa sirven como biomarcadores importantes de la gravedad de la enfermedad en una amplia gama de enfermedades, incluidas enfermedades inflamatorias de tipo 2 como el asma y la fibrosis pulmonar. Del mismo modo, los pacientes con trastornos genéticos como la enfermedad de Gaucher tienen niveles significativamente elevados de chitinasa, que no sólo se correlacionan con la gravedad de la enfermedad, sino que también sirven como un biomarcador fiable para la eficacia terapéutica. El protocolo descrito aquí describe una manera simple, rápida y directa de medir la actividad de la chitinasa en BAL o muestras séricas de ratones y puede ser ampliamente adaptado a sujetos humanos y otros organismos modelo debido a la naturaleza altamente conservada de las enzimas.
Introduction
La quitina es el segundo polisacárido más abundante en la tierra después de la celulosa, sirviendo como un componente estructural importante de una variedad de organismos incluyendo el exoesqueleto de insectos, hongos, levaduras y algas; algunos vertebrados también tienen quitina1. Las chitinasas son una familia de enzimas que son capaces de descomponer la quitina y están altamente conservadas a lo largo de la evolución en especies que van desde bacterias hasta mamíferos2,3. Además de las chitinasis, los mamíferos también tienen proteínas similares a las chitinasas que son similares a las chitinasas en su capacidad para unir la quitina pero difieren en que carecen de capacidad enzimática para cortar la quitina4.
Aunque la quitina y las chitinasis han sido estudiadas durante mucho tiempo, con investigaciones que se remontan a principios de 1900, el enfoque principal ha estado en su papel en insectos y otros invertebrados. De hecho, no fue hasta la década de 1960 cuando se encontró que los vertebrados tenían chitinasis en absoluto. Utilizando un ensayo a base de chitobiase, se demostró que las chitinasas se encuentran en el tracto digestivo de una serie de vertebrados, incluyendo lagartos y mirlos, una observación que se presume que se debe al consumo de organismos que contienen quitina como insectos5 .
Los mamíferos tienen dos formas enzimáticamente activas de chitinasa: chitinasa de mamíferoá ácida (AMCase; también conocida como CHIT2 y CHIA) y chitotriosidasa (CHIT1)4. Ambas proteínas son capaces de hidrolizar la quitina. Sin embargo, CHIT1 es más activo en los seres humanos, donde casi toda la actividad chitinasa se deriva de CHIT1. 4 En ratones, tanto Chit1 como AMCase contribuyen casi por igual a la actividad general de la chitinasa6. Por otro lado, las proteínas similares a la chitinasa carecen de actividad de la chitinasa.
Chit1 se secreta principalmente por macrófagos y a menudo se considera como una respuesta inmune a los patógenos que contienen quitina7. La enzima también ha demostrado estar implicada en la maduración de monocitos en los subtipos de macrófagos M1 y M2, incluso sin la presencia de la quitinadesustrato 8. Además, también puede estar involucrado en la maduración de otras células inmunitarias, incluyendo t helper tipo 2 (Th2) células y eosinófilos, como se demostró que era el caso en la infección pulmonar criptocócica9. Estos estudios apuntan a un papel complejo de las chitinasas en el sistema inmunológico.
En los últimos años, se ha encontrado que los niveles de Chit1 sirven como un importante biomarcador de progresión para más de 40 enfermedades humanas diferentes, incluyendo enfermedades de almacenamiento lisosomal, enfermedades infecciosas, enfermedades respiratorias, enfermedades endocrinológicas, enfermedades neurológicas y otras (revisadas10). En muchas de estas enfermedades, los niveles de Chit1 son un fuerte predictor de la gravedad de la enfermedad y la eficacia terapéutica10.
Como las chitinasis se han ganado una reputación como un biomarcador para numerosas condiciones médicas incluyendo la enfermedad de Gaucher, se han desarrollado herramientas y ensayos para facilitar las pruebas de presencia de chitinasa. Los métodos más antiguos incluyen el procedimiento de Schales, un protocolo adaptado de una prueba de glucosa en sangre y el método de ácido dinitrosalicílico 3,5 (DNS). Sin embargo, estos métodos son a menudo sensibles al tiempo y técnicamente difíciles11. El procedimiento para ambas pruebas requiere la reducción de oxidantes inorgánicos, ferricyanida en el caso del procedimiento de los Schales, por ejemplo, produciendo un cambio de color que sólo puede medirse espectrofotométricamente. Además, ambas pruebas implican un paso de calentamiento o ebullición que consume mucho tiempo y es necesario para que el color se desarrolle12,13.
Aquí se describe un ensayo fluorado rápido y simple para determinar los niveles de chitinasa en muestras de mamíferos14,15. Dos de las muestras utilizadas aquí incluyen suero y líquidos de lavado broncoalveolar (BAL); la actividad de la chitinasa también se ha medido en muestras de leche materna y orina, y la técnica se puede realizar en ese tipo de muestras, así como en cualquier otro fluido biológico16,17.
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Protocol
Todos los procedimientos de animales se realizaron bajo un protocolo aprobado por la IACUC en la Escuela de Medicina de la Universidad de Yale.
1. Colección de muestras de ratón
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Anestesia
- Anestetizar ratones usando ketamina y xilazina (100 mg/kg de ketamina y 10 mg/kg de xilazina).
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Recogida de muestras de sangre
- Confirme la profundidad de la anestesia por falta de respuesta a un pellizco del dedo del pie.
- Abra quirúrgicamente la cavidad torácica para exponer el corazón.
- Inserte una aguja de 26,5 G en el ventrículo izquierdo y recoja sangre en una jeringa.
NOTA: Típicamente, alrededor de 0.5–1 ml de sangre se pueden cosechar de un ratón saludable de 20-25 g. - Recoger la sangre en tubos heparinizados, para la recolección de plasma, o tubos no heparinizados para la recolección de suero.
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Recolección de líquido de lavado broncoalveolar (BAL)
- Para recoger el BAL, haga un corte vertical en el cuello para exponer la tráquea.
- Canúrre la tráquea con un catéter de 22 G y fíjela firmemente con una cuerda para evitar fugas por la nariz del ratón.
- Inyectar lentamente dos alícuotas de solución salina estéril con fosfato (PBS, 0,75 ml cada una) en los pulmones a través de la tráquea y recuperarlas.
- Piscina alícuotas y mantener en hielo para su análisis posterior.
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Procesamiento de las muestras biológicas.
- Muestra de sangre: fresco (plasma) o después de permitir la coagulación durante 4 h (suero), centrífuga a 600 x g durante 10 min. Tome el sobrenadante y congele para almacenarlo o usarlo para experimentar.
- BAL: Centrifugar la muestra a 350 x g durante 5 min. Tome el sobrenadante y congele para almacenarlo o usarlo para experimentar.
2. Ensayo de chitinase
NOTA: La ciencia detrás del ensayo es relativamente simple. Un sustrato no fluorescente es cegado por chitinasa enzimáticamente activa para producir un producto fluorescente, que luego se mide como un marcador indirecto de actividad de la chitinasa. Las chitinasas dentro de las muestras descomponen el sustrato 4-methylumbelliferyl-D-N, N'-diacetylchitobiose presente en el 1x tampón McIlvain. Se libera una molécula fluorescente 4-methylumbelliferyl. Al medir la fluorescencia total de cada pozo, obtenemos una medición precisa de la chitinasa activa en cada muestra. Debido a que la descomposición de la quitina por chitinasa es una reacción hidrolítica, el tampón de parada, una mezcla de 0,3 M de glicina y NaOH (12,0 g/L a pH 10,6), termina la descomposición de la quitina creando un entorno que es demasiado básico para que la enzima funcione.
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Prepare los sustratos, estándares y soluciones.
- Preparen el buffer de McIlvain. El tampón de McIlvain se compone de citrato de 0,1 M y fosfato de 0,2 M a un pH de 5,2. Diluir en una proporción de 1:1 para 1x amortiguador McIlvain.
- Disolver 4-methylumbelliferyl-D-N, N'-diacetylchitobiose y 4-methylumbelliferyl -D-N, N', N"-triacetylchitotriose en 1x McIlvain Buffer a una concentración de 500 m cada uno.
NOTA: La solución de stock se puede almacenar a -20 oC para usos posteriores; mejor almacenado en alícuotas. - Disolver estándar, 4-metilumbelliferona, a una concentración de 0,1 mM en tampón de tope (mezcla de 0,3 M de glicina y NaOH (12,0 g/L a pH 10,6)) para crear la solución de stock de curva estándar.
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Cree y pelar la solución de trabajo.
- Combine 1 x tampón de McIlvain y sustrato de quitina 4-methylumbelliferyl-D-N, N'-diacetylchitobiose para crear la solución de trabajo. Por cada 10 muestras, mezcle 100 ml de sustrato con 2,17 ml de 1 l de tampón McIlvain. Consulte la Tabla 1 para obtener cálculos adicionales basados en el tamaño de la muestra.
NOTA: Utilice 4-methylumbelliferyl -D-N, N', N"-triacetilchitotriose para muestras humanas. Mientras que ambos sustratos pueden ser acuchillados por enzimas humanas o de ratón, se hanasignado para muestras humanas o de ratón basadas en la eficiencia del escote 6. - Pipetear 95 l de solución de trabajo en cada pocal de una placa de 96 pocillos.
- Combine 1 x tampón de McIlvain y sustrato de quitina 4-methylumbelliferyl-D-N, N'-diacetylchitobiose para crear la solución de trabajo. Por cada 10 muestras, mezcle 100 ml de sustrato con 2,17 ml de 1 l de tampón McIlvain. Consulte la Tabla 1 para obtener cálculos adicionales basados en el tamaño de la muestra.
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Agregue muestras de bioespecímenes a la solución de trabajo.
- A continuación, añadir 5 l de la muestra de prueba (sangre/BAL/lisato tisado/otro líquido biológico) a cada poca.
- Mezcle la muestra en la solución de trabajo para obtener los resultados más precisos y fiables.
NOTA: Las muestras deben ejecutarse en duplicados/triplicados con especial atención a los posibles efectos de borde. Todas las muestras deben precalentarse para minimizar el efecto de borde. Como el ensayo implica una reacción entre las chitinasas en la muestra y el sustrato en la solución de trabajo, es mejor trabajar con relativa rapidez para minimizar la diferencia de tiempo entre el momento en que se chapa la primera muestra y la última muestra. Se recomienda pipeta multicanal.
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Incubar a 37oC.
- Cubra el plato y agite brevemente (5 s).
- Incubar la placa a 37oC durante 15 min. Esto permite que la reacción enzimática tenga lugar.
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Prepare la curva estándar.
- Mientras las muestras están incubando, preparar una dilución en serie de 4-metilumbelliferone, un estándar utilizado a menudo en la determinación fluorimétrica de la actividad enzimática.
- Diluir el stock de la solución estándar en tampón de tope a una concentración de 5 m.
- Realice una serie de diluciones como se indica en la Tabla2. Agregue los componentes en la cantidad indicada y mezcle bien.
NOTA: La curva estándar ayuda a garantizar que las muestras medidas caigan en el rango lineal de la curva estándar.
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Detenga la reacción con el búfer de parada.
- Añadir 200 l de tampón de parada a cada pozo para detener la reacción.
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Placa los estándares.
- Añadir 300 s de cada estándar por pozo en duplicados en la misma placa.
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Lea la placa con un lector fluorométrico.
- Lea la placa a una excitación de 360 nm, y una emisión de 455 nm.
3. Análisis de datos
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Restar los espacios en blanco
- Promedio de los valores de las diluciones estándar duplicadas que no tienen 4-metilumbelliferone. Reste este valor de todos los demás valores registrados.
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Tome el promedio de réplicas técnicas y trace los estándares.
- Promedio de las dos lecturas para cada concentración y graficar la lectura promedio por concentración.
NOTA: La gráfica resultante debe parecer lineal y tener un valor R2 cercano a 1. Si no lo hace, puede ser necesario rehacer las normas y volver a leer la placa para garantizar la calidad del análisis de datos.
- Promedio de las dos lecturas para cada concentración y graficar la lectura promedio por concentración.
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Estandarizar los valores de lectura.
- Cree la línea de ajuste más adecuada para los datos de normas trazados. Divida las lecturas de las muestras por la pendiente de la línea de mejor ajuste.
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Compare los valores del grupo de control y el grupo de variables.
- Utilice una prueba t o Un ANOVA, para más de dos grupos, para determinar si la diferencia entre grupos es estadísticamente significativa. Los valores tomarán las unidades nmol/mL-h.
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Representative Results
Los resultados mostrados aquí provienen de un estudio que mide la actividad de la chitinasa en muestras de suero y BAL de tipo silvestre (C57BL/6) y ratones transgénicos Chit1 (sobre fondo C57BL/6) que sobreexpresan el gen Chit1 en un promotor de doxiciclina. Nuestros datos muestran que tanto las muestras de suero como de BAL tienen una actividad de chitinasa detectable en la línea de base 698,2 a 189,9 nmol/mL-h y 485,7 a 114 nmol/ml-h, respectivamente. La sobreexpresión del gen Chit1 utilizando doxiciclina en el agua potable durante 4 semanas dio lugar a la elevación de la actividad de la chitinasa que se observó tanto en BAL (4.575 a 673,8 nmol/mL-h, p a 0,003) como en suero 1556 a 251,2 nmol/mL-h, p a 0,0272, en comparación con la línea de base ) muestras.
Utilizando el protocolo descrito aquí, el ensayo confirma que la sobreexpresión del gen Chit1 en ratones da lugar a un aumento de la actividad de la chitinasa. Se utilizó una prueba t para comparar los medios de los dos grupos. Cada grupo contenía 5 ratones.
Figura 1: Actividad de la chitinasa. La actividad de la chitinasa se midió en el suero (A) y en el líquido de lavado broncoalveolar (B) de tipo silvestre (WT) y quitotriosidasa (ChitTg) que expresan excesivamente ratones transgénicos. Cada punto representa una muestra de mouse individual. (C) Los valores se estandarizaron utilizando la linealidad de la curva estándar tal como se describe en el protocolo. Los niveles de fluorescencia se midieron utilizando un lector de placas a longitud de onda de 360 nm para excitación y 455 nm para la emisión y presentadocomo UA. AU - unidad arbitraria *p < 0.05, ***p < 0.001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Número de pozos de muestra | Sustrato (L) | Búfer de McIlvain (ml) |
| 20 | 100 | 2.17 |
| 50 | 250 | 5.425 |
| 100 | 500 | 10.85 |
Tabla 1: Cálculos de muestra para crear la solución de trabajo.
| (L) | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| Conc. (nM) | 0 | 125 | 250 | 375 | 500 | 625 | 750 | 875 |
| Estándar | 0 | 20 | 40 | 60 | 80 | 100 | 120 | 140 |
| 2x McIlvian | 200 | 200 | 200 | 200 | 200 | 200 | 200 | 200 |
| Destilado H2O | 200 | 180 | 160 | 140 | 120 | 100 | 80 | 60 |
| Detener búfer | 400 | 400 | 400 | 400 | 400 | 400 | 400 | 400 |
Tabla 2: Diluciones para mediciones de curvas estándar.
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Discussion
La actividad chitinasa ha surgido como un biomarcador importante para predecir la gravedad de la enfermedad, la progresión de la enfermedad, la eficacia terapéutica y la presencia de patógenos específicos18. Aunque muchas de las teorías de largo postulado sobre el papel de las chitinasis no han sido probadas experimentalmente19, nuevos estudios han proporcionado información importante sobre el papel de las chitinasis y las chitinasas como proteínas en varias enfermedades2, 9,20.
El protocolo descrito aquí es una forma sencilla, rápida y eficaz de medir la actividad de la chitinasa en muestras biológicas. Se requiere poca o ninguna modificación para medir la actividad de la chitinasa en una amplia variedad de muestras biológicas y especies debido a la naturaleza altamente conservada de las chitinasis. En este protocolo se enumeran dos sustratos, uno de los cuales ha sido designado para muestras de ratón y otro para muestras humanas; sin embargo, ambos sustratos se pueden utilizar en cualquiera de las especies, ya que han sido designados como tales sobre la base de la demostración de papeles anteriores de la eficiencia con la que las enzimas pueden cleave el sustrato.
En comparación con las técnicas existentes anteriormente, como el procedimiento de los Schales y el método DNS, el ensayo descrito aquí elimina la necesidad de pasos intensivos en tiempo, como la ebullición o el calentamiento que eran necesarios en los métodos más antiguos. Además, el ensayo es menos difícil técnicamente y requiere menos pasos complicados que las técnicas de medición anteriores. Para obtener los mejores resultados, se deben utilizar réplicas biológicas y técnicas.
Si la actividad de la chitinasa es demasiado alta, las diluciones de la muestra biológica son suficientes para reducir la actividad de la chitinasa para la medición, y los valores verdaderos se pueden calcular en función de la dilución. Al realizar este experimento en nuevas muestras biológicas, puede ser útil realizar mediciones repetidas en la misma placa con el tiempo hasta la saturación para garantizar un tiempo de incubación adecuado para obtener mejores resultados. Además, el protocolo se puede escalar hacia arriba o hacia abajo mientras permanezca la coherencia entre los grupos. Las futuras aplicaciones de este protocolo son de gran alcance, ya que la investigación está repuntando en el papel de la actividad chitinasa en una serie de enfermedades.
Una de las primeras categorías de enfermedades en las que se encontró que la actividad chitinasa era relevante fue la enfermedad de almacenamiento de lisosomal, incluida la enfermedad de Gaucher, Niemann-Pick A/B y C, la gangliosidosis GM-1 y muchas otras21. La enfermedad de Gaucher es una enfermedad de almacenamiento lisosomal causada por una actividad insuficiente de glucocerebrosidasa y se caracteriza por la acumulación de glucococoesterida, el sustrato de glucosidalesrea, en el lisosode de los macrófagos15. Es una enfermedad genética, con síntomas clínicos que incluyen agrandamiento del bazo y del hígado, bajo recuento de plaquetas, anemia, fatiga, y problemas óseos22. La investigación clínica ha demostrado que la mayoría de las personas que sufren de la enfermedad de Gaucher tienen una mediana de actividad de la chitinasa que es más de 600 veces el valor medio de los voluntarios de control normal; además, cuando las personas con la enfermedad de Gaucher fueron puestas en terapia de suplementación enzimática, el tratamiento actual para la enfermedad, sus niveles de actividad de la chitinasa disminuyeron significativamente prestando actividad de chitinasa para ser un excelente marcador de ambas enfermedades seguimiento de la progresión y el tratamiento15. Sin embargo, todavía no se ha encontrado ningún papel para Chit1 en la enfermedad. Investigaciones similares han llevado a Chit1 monitoreo de la actividad de numerosas otras enfermedades de almacenamiento lisosomal10.
Además, otras investigaciones han indicado un papel potencial para la actividad de Chit1 durante diversas infecciones por patógenos, incluyendo infección por hongos, malaria, tuberculosis y K. pneumoniae, por nombrar algunos2,3,10 . Un estudio de 2012 encontró que la actividad de la chitinasa fue elevada en pacientes con tuberculosis activa (TB) incluso cuando el frotis de esputo fue negativo, lo que indica que la actividad de la chitinasa podría utilizarse como biomarcador eficaz en el diagnóstico de tuberculosis, especialmente durante el tiempo de espera largo que a menudo es necesario para diagnosticar con precisión la enfermedad23. Se observaron hallazgos similares durante la infección por Plasmodium falciparum, con niveles séricos de chitotriosidasa que aumentaron significativamente en las personas con infección aguda24. Si bien muchas de estas enfermedades tardan días en diagnosticarse, las mediciones rápidas de los niveles de actividad de la chitinasa en la sangre pueden proporcionar información beneficiosa en el diagnóstico. Además, a medida que los parásitos de la malaria y la bacteria de la tuberculosis se vuelven cada vez más resistentes a los tratamientos, medir los niveles de actividad de la chitinasa en el suero puede ayudar con el control del tratamiento para su eficacia en tiempo real.
Cada vez más investigación ha comenzado a centrarse en el papel de las proteínas de la chitinasa y la chitinasa en la respuesta inmune, particularmente su papel en las vías inflamatorias. A medida que esta investigación continúa, este protocolo permitirá una medición rápida y precisa de esta actividad de la chitinasa para seguir investigando. El protocolo se ajusta fácilmente para cualquier número de muestras de especies, incluyendo tanto ratón como humano, por lo que es ampliamente aplicable.
Además del beneficio de la investigación, mejores métodos para detectar y medir la actividad de la chitinasa en las muestras serán beneficiosos en el ámbito clínico. Investigaciones recientes han demostrado el papel de la chitinasa como biomarcador en la patología de numerosas enfermedades crónicas como la enfermedad de Gaucher, diabetes mellitus, sarcoidosis, aterosclerosis, enfermedad inflamatoria intestinal y cánceres3, 21,25,26.
Debido a este papel como biomarcador, la medición rápida y precisa de la actividad de la chitinasa como se muestra aquí es increíblemente relevante para el campo de la medicina, lo que permite a los proveedores de atención médica tener más información para un diagnóstico y un plan de tratamiento adecuados.
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Disclosures
Ninguno.
Acknowledgments
Esta investigación fue apoyada por la American Lung Association y los premios de la American Thoracic Society a LS. Los autores sinceramente quieren agradecer al Dr. Jack Elias y al Dr. Chun Geun Lee por proporcionar cepas de ratón transgénicas.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-methylumbelliferone | Sigma | M1381 | Standard: commonly used in flourimetric assays for determination of enzyme activity |
| 4MU-GlcNAc2 | Sigma | M9763 | fluorescent chitinase substrate for use in mouse samples |
| 4MU-GlcNAc3 | Sigma | M5639 | fluorescent chitinase substrate for use in human samples |
| Citric Acid-monohydrate | for use in McIlvain Buffer | ||
| Glycine | for use in Stop Buffer at a concentration of 0.3 M | ||
| Na2HPO4xH2O | for use in McIlvain Buffer | ||
| NaOH | for use in Stop Buffer at a concentration of 12 g/L | ||
| Vision Plate: Non-sterile, untreated black 96 well plate | 4titude | 4ti-0224 |
References
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