Summary
Præsenteret her er en simpel metode til at måle chitinase aktivitet i biologiske væsker såsom bronalveolær skylning eller serum.
Abstract
Chitinaser er de enzymer, der kløver chitin. Selv i fravær af chitin, mammalianere har betydelige mængder af chitinaser til stede i kroppen, herunder ved baseline. Den præcise rolle chitinase er ikke kendt, men det menes at spille en vigtig rolle i fordøjelsen og vært forsvar mod chitin-holdige fødevarer og patogener, hhv. Nylige arbejde, herunder vores, har vist en vigtig rolle af chitinase og chitinase-lignende proteiner i værts immunitet og allergiske sygdomme. Vigtigere, chitinase aktiviteter tjene som vigtige biomarkører af sygdom sværhedsgrad i en bred vifte af sygdomme, herunder type 2 inflammatoriske sygdomme som astma og pulmonal fibrose. Tilsvarende, patienter med genetiske lidelser som Gauchers sygdom har signifikant forhøjet chitinase niveauer, som ikke kun korrelerer med sygdommens sværhedsgrad, men også tjene som en pålidelig biomarkør for terapeutisk effektivitet. Den protokol, der er skitseret her, beskriver en enkel, hurtig og ligetil måde at måle chitinaseaktivitet i BAL eller serumprøver af mus og kan være bredt tilpasset til mennesker og andre modelorganismer på grund af enzymernes stærkt bevaret karakter.
Introduction
Chitin er den næstmest rigelige polysaccharid på jorden efter cellulose, der tjener som en vigtig strukturel bestanddel af en række organismer, herunder exoskelettet af insekter, svampe, gær og alger; nogle hvirveldyr har også chitin1. Chitinaser er en familie af enzymer, der er i stand til at nedbryde chitin og er meget bevaret gennem udviklingen i arter lige fra bakterier til pattedyr2,3. Ud over chitinaser har pattedyr også chitinase-lignende proteiner, der ligner chitinaser i deres evne til at binde chitin, men adskiller sig ved, at de mangler enzymatisk evne til at kløve chitin4.
Selvom chitin og chitinaser længe er blevet undersøgt — med undersøgelser, som går tilbage til begyndelsen af 1900-tallet — har hovedfokus været på deres rolle i insekter og andre hvirvelløse dyr. Faktisk var det først i 1960 ' erne, hvor hvirveldyr fandtes at have chitinaser overhovedet. Ved hjælp af en chitobiase-baseret analyse blev der påvist chitinaser i fordøjelseskanalen for en række hvirveldyr, herunder firben og blackbirds — en observation, der kan tilskrives indtagelse af chitin-holdige organismer som insekter5 .
Pattedyr har to enzymatisk aktive former af chitinase: Sure pattedyr chitinase (amcase; også kendt som CHIT2 og CHIA) og at (CHIT1)4. Begge disse proteiner er i stand til hydrolyserende chitin. Men, CHIT1 er mere enzymatisk aktiv i mennesker, hvor næsten alle chitinase aktivitet er afledt af CHIT1. 4 i mus bidrager både Chit1 og amcase næsten ligeligt til den samlede chitinaseaktivitet6. På den anden side, chitinase-lignende proteiner mangler chitinase aktivitet.
Chit1 udskilles hovedsageligt af makrofager og anses ofte for at være et immunrespons på chitin-holdige patogener7. Enzymet har også vist sig at være involveret i modning af monocytter i både M1 og m2 makrofag undertyper, selv uden tilstedeværelsen af substratet chitin8. Desuden kan det også være involveret i modning af andre immunceller, herunder T Helper Type 2 (Th2) celler og eosinofiler — som det viste sig at være tilfældet i kryptokok-Lungeinfektion9. Disse undersøgelser peger på en kompleks rolle af chitinaser i immunsystemet.
I de seneste år, Chit1 niveauer har været fundet at tjene som en vigtig biomarkør af progression for over 40 forskellige menneskelige sygdomme, herunder lysosomale opbevarings sygdomme, smitsomme sygdomme, luftvejssygdomme, Endokrinologiske sygdomme, kardiovaskulære sygdomme, neurologiske sygdomme og andre (anmeldt10). I mange af disse sygdomme er niveauerne af Chit1 en stærk indikator for sygdommens sværhedsgrad og terapeutiske effektivitet10.
Som chitinaser har fået et ry som en biomarkør for talrige medicinske tilstande, herunder Gauchers sygdom, værktøjer og assays er blevet udviklet for at lette testning for chitinase tilstedeværelse. Ældre metoder omfatter Schales ' procedure, en protokol tilpasset fra en blodglukose test, og den 3, 5 dinitrosalicylic syre (DNS) metode. Men disse metoder er ofte tidsfølsomme og teknisk vanskelige11. Proceduren for begge disse tests kræver reduktion af uorganiske oxidanter, Ferricyanid i tilfælde af Schales ' procedure for eksempel, fremstilling af en farveændring, der kun kan måles spektrofotometrisk. Derudover, begge tests involverer en opvarmning eller kogning skridt, der er både tidskrævende og nødvendigt for farven til at udvikle12,13.
Beskrevet her er en hurtig og enkel fluorimetrisk analyse til bestemmelse af chitinaseniveauerne i pattedyrs prøver14,15. To af de prøver, der anvendes her omfatter serum og bronalveolære skylning væsker (bal); chitinaseaktiviteten er også blevet målt i modermælk og urinprøver, og teknikken kan udføres i den type prøver samt i enhver anden biologisk væske16,17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg blev udført i henhold til en IACUC-godkendt protokol på Yale University School of Medicine.
1. samling af muse prøver
-
Bedøvelse
- Anesthetize mus ved hjælp af ketamin og xylazin (100 mg/kg ketamin og 10 mg/kg af xylazin).
-
Blodprøve samling
- Bekræft dybden af anæstesi ved ikke-reaktionsevne til en tå knivspids.
- Kirurgisk åbning af brysthulen for at afsløre hjertet.
- Indsæt en 26,5 G nål i venstre ventrikel og Indsaml blod i en sprøjte.
Bemærk: Typisk, omkring 0.5 – 1 mL blod kan høstes fra en sund 20 – 25 g mus. - Blodet opsamles i hepariniserede rør, til plasma opsamling eller ikke-hepariniserede rør til serum opsamling.
-
Indsamling af bronalveolær skylning væske (bal)
- For at samle BAL, lave en lodret snit på halsen for at udsætte luftrøret.
- Kanyle røret med et kateter på 22 G og Fastgør det fast ved hjælp af en snor for at forhindre lækage ud af musens næse.
- Injicer langsomt to aliquoter af steril fosfat-bufferet saltvand (PBS, 0,75 mL hver) ind i lungerne via luftrør og hente tilbage.
- Pool aliquoter og holde på is til yderligere analyse.
-
Behandling af biologiske prøver.
- Blodprøve: enten frisk (plasma) eller efter at have ladet koagulationen i 4 timer (serum) centrifugeres ved 600 x g i 10 min. Tag supernatanten og enten fryse til opbevaring eller brug til eksperiment.
- BAL: centrifuge prøven centrifugeres ved 350 x g i 5 min. Tag supernatanten og enten fryse til opbevaring eller brug til eksperiment.
2. chitinase-analyse
Bemærk: Videnskaben bag analysen er forholdsvis enkel. Et ikke-fluorescerende substrat spaltes ved enzymatisk aktiv chitinase for at fremstille et fluorescerende produkt, som derefter måles som en indirekte markør for chitinaseaktiviteten. De chitinaser i prøverne nedbryde substratet 4-methylumbelliferyl-D-N, N'-diacetylchitobiose til stede i 1x McIlvain buffer. Et fluorescerende molekyle 4-methylumbelliferyl frigives. Ved at måle den totale fluorescens af hver brønd opnår vi en nøjagtig måling af den aktive chitinase i hver prøve. Fordi nedbrydningen af chitin af chitinase er en hydrolytisk reaktion, slutter stop bufferen, en blanding af 0,3 M Glycin og NaOH (12,0 g/L ved pH 10,6), nedbrydningen af chitin ved at skabe et miljø, der er for grundlæggende for enzymet til at fungere.
-
Forbered substrater, standarder og løsninger.
- Forbered McIlvain-buffer. McIlvain buffer består af 0,1 M citrat og 0,2 M fosfat ved en pH-værdi på 5,2. Fortyndes med et forhold på 1:1 for 1x McIlvain buffer.
- Opløse både 4-methylumbelliferyl-D-N, N'-diacetylchitobiose og 4-methylumbelliferyl ß-D-N, N ', N "-triacetylchitotriose i 1x McIlvain buffer til en koncentration på 500 μM hver.
Bemærk: Stamopløsning kan opbevares ved-20 °C for yderligere anvendelser; bedst gemt i Aliquots. - Standard, 4-methylumbelliferone opløses i en koncentration på 0,1 mM i stop buffer (blanding af 0,3 M Glycin og NaOH (12,0 g/L ved pH 10,6)) for at skabe standardkurven stamopløsning.
-
Opret og plade arbejds løsningen.
- Kombiner 1x McIlvain buffer og chitin substrat 4-methylumbelliferyl-D-N, N'-diacetylchitobiose at skabe arbejds løsning. For hver 10 prøver blandes 100 μL substrat med 2,17 mL 1x McIlvain buffer. Se tabel 1 for yderligere beregninger baseret på stikprøvestørrelse.
Bemærk: Brug 4-methylumbelliferyl ß-D-N, N ', N "-triacetylchitotriose til humane prøver. Mens begge substrater kan spaltet af enten humane eller mus enzymer, de er blevet tildelt enten humane eller mus prøver baseret på effektiviteten af kavalergang6. - Der afpipetteres 95 μL arbejdsopløsning i hver brønd på en 96-brønd plade.
- Kombiner 1x McIlvain buffer og chitin substrat 4-methylumbelliferyl-D-N, N'-diacetylchitobiose at skabe arbejds løsning. For hver 10 prøver blandes 100 μL substrat med 2,17 mL 1x McIlvain buffer. Se tabel 1 for yderligere beregninger baseret på stikprøvestørrelse.
-
Tilsæt biopræparat prøver til arbejdsopløsningen.
- Tilsæt derefter 5 μL af prøve prøven (blod/BAL/vævs lysat/anden biologisk væske) til hver brønd.
- Bland prøven i arbejdsopløsningen for at opnå de mest nøjagtige og pålidelige resultater.
Bemærk: Prøverne skal køres i dubletter/triplicates med særlig opmærksomhed på potentielle Edge effekter. Alle prøverne skal forvarmes for at minimere kant effekten. Da analysen indebærer en reaktion mellem chitinaser i prøven og substrat i arbejdsopløsningen, er det bedst at arbejde relativt hurtigt for at minimere forskellen i tid mellem, når den første prøve er belagt, og den sidste prøve er belagt. Multikanalpipette anbefales.
-
Inkubere ved 37 °C.
- Dæk pladen til, og ryst den kortvarigt (5 s).
- Pladen inkubates ved 37 °C i 15 minutter. Dette tillader den enzymatiske reaktion at finde sted.
-
Forbered standardkurven.
- Mens prøverne inkuberer, forberede en seriel fortynding af 4-methylumbelliferone, en standard, der ofte anvendes i den fluorimetriske bestemmelse af enzymaktivitet.
- Bestanden af standardopløsningen fortyndes i stop buffer til en koncentration på 5 μM.
- Udfør en række fortyndinger som angivet i tabel 2. Tilsæt komponenterne i det angivne beløb, og bland godt.
Bemærk: Standardkurven er med til at sikre, at de målte prøver falder inden for standard kurvens lineære område.
-
Stop reaktionen med stop buffer.
- Tilsæt 200 μL stop buffer til hver brønd for at standse reaktionen.
-
Plade standarderne.
- Tilsæt 300 μL af hver standard pr. brønd i dubletter på samme plade.
-
Læs pladen ved hjælp af en fluorometrisk læser.
- Læs pladen ved en excitation af 360 nm, og en emission på 455 nm.
3. data analyse
-
Fratræk de tomme felter
- Gennemsnit værdierne af de dobbelte standard fortyndinger, der ikke har 4-methylumbelliferone. Træk denne værdi fra alle de andre registrerede værdier.
-
Tag gennemsnittet af tekniske replikater og plot standarderne.
- Gennemsnitligt de to målinger for hver koncentration og graf den gennemsnitlige læsning af koncentration.
Bemærk: Den resulterende plot skal se lineær og har en R2 værdi tæt på 1. Hvis den ikke gør det, kan det være nødvendigt at gentage standarderne og genlæse pladen for at sikre kvaliteten af dataanalysen.
- Gennemsnitligt de to målinger for hver koncentration og graf den gennemsnitlige læsning af koncentration.
-
Standardiser læse-ud-værdierne.
- Opret en linje, der passer bedst til de afbildede standarddata. Opdel udlæsninger af prøverne ved hældningen af den bedst egnede linje.
-
Sammenlign værdier fra kontrolgruppe og Variabelgruppe.
- Brug en t-test eller ANOVA, for mere end to grupper, for at afgøre, om forskellen mellem grupperne er statistisk signifikant. Værdier vil tage enhederne nmol/mL · h.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De resultater, der er vist her, er fra en undersøgelse, der måler chitinaseaktiviteten i serum-og BAL-prøver af vildtype (C57BL/6) og Chit1 Transgene mus (på C57BL/6 baggrund), som overudtrykker det Chit1 gen på en doxycyclinpromotor. Vores data viser, at både serum-og BAL-prøverne har detekterbar chitinaseaktivitet ved baseline 698,2 ± 189,9 nmol/mL · h og 485,7 ± 114 nmol/ml · h. Overekspression af Chit1-genet ved hjælp af doxycyclin i drikkevand i 4 uger resulterede i en forhøjelse af chitinaseaktiviteten, som blev observeret i både BAL (4.575 ± 673,8 nmol/mL · h, p = 0,003) og serum 1556 ± 251,2 nmol/mL · h, p = 0,0272, sammenlignet med baseline prøver.
Ved hjælp af den her beskrevne protokol bekræfter analysen, at overekspression af Chit1-genet i mus resulterer i øget chitinaseaktivitet. En t-test blev brugt til at sammenligne de to gruppers midler. Hver gruppe indeholdt 5 mus.
Figur 1: Chitinaseaktivitet. Chitinaseaktiviteten blev målt i (A) serum og (B) bronalveolær skylning væske af vildtype (WT) og at (chittg) over-udtrykker Transgene mus. Hver prik repræsenterer en individuel muse prøve. (C) værdierne blev standardiseret ved hjælp af lineariteten af standardkurven som beskrevet i protokollen. Fluorescens niveauerne blev målt ved hjælp af en plade læser ved bølgelængde på 360 nm for excitation og 455 nm for emission og præsenteret som AU. AU = vilkårlig enhed * p < 0,05, * * * p < 0,001. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Antal prøve brønde | Substrat (μL) | McIlvain-buffer (mL) |
| 20 | 100 | 2,17 |
| 50 | 250 | 5,425 |
| 100 | 500 | 10,85 |
Tabel 1: stikprøve beregninger til oprettelse af arbejds løsningen.
| ΜL | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| Conc. (nM) | 0 | 125 | 250 | 375 | 500 | 625 | 750 | 875 |
| Standard | 0 | 20 | 40 | 60 | 80 | 100 | 120 | 140 |
| 2x McIlvian | 200 | 200 | 200 | 200 | 200 | 200 | 200 | 200 |
| Destilleret H2O | 200 | 180 | 160 | 140 | 120 | 100 | 80 | 60 |
| Stop buffer | 400 | 400 | 400 | 400 | 400 | 400 | 400 | 400 |
Tabel 2: fortyndinger til standardkurve målinger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Chitinaseaktiviteten er opstået som en vigtig biomarkør til forudsigelse af sygdoms sværhedsgrad, sygdomsprogression, terapeutisk effektivitet og tilstedeværelsen af specifikke patogener18. Selv om mange af de lang-postulerede teorier om rollen af chitinaser ikke har været eksperimentelt bevist19, nye undersøgelser har givet vigtig indsigt i rollen af chitinaser og chitinase som proteiner i forskellige sygdomme2, 9,20.
Den her beskrevne protokol er en enkel, hurtig og effektiv metode til at måle chitinaseaktiviteten i biologiske prøver. Der kræves kun lidt til ingen ændring for at måle chitinaseaktiviteten i en lang række biologiske prøver og arter på grund af chitinases meget bevaret natur. Opført i denne protokol er to substrater, hvoraf den ene er udpeget til muse prøver og en til humane prøver; begge substrater kan dog anvendes på begge arter, da de er blevet betegnet som sådanne baseret på tidligere papirer, der demonstrerer den effektivitet, hvormed enzymerne kan Kløve substratet.
Sammenlignet med tidligere eksisterende teknikker, såsom Schales ' procedure og DNS-metode, den analyse, der er skitseret her fjerner behovet for tidskrævende trin såsom kogning eller opvarmning, der var nødvendige i ældre metoder. Desuden er analysen mindre teknisk vanskelig og kræver færre komplicerede trin end tidligere måleteknikker. For de bedste resultater bør der anvendes både biologiske og tekniske replikater.
Hvis chitinaseaktiviteten er for høj, er fortyndinger af den biologiske prøve tilstrækkelig til at reducere chitinaseaktiviteten til måling, og de sande værdier kan beregnes ud fra fortyndingen. Når du udfører dette eksperiment på nye biologiske prøver, kan det være nyttigt at udføre gentagne målinger på samme plade over tid indtil mætning for at sikre en ordentlig inkubationstid for de bedste resultater. Derudover kan protokollen skaleres op eller ned, så længe der er sammenhæng mellem grupperne. De fremtidige anvendelser af denne protokol er vidtrækkende, da forskningen netop er ved at samle op i rollen som chitinaseaktivitet i en række sygdomme.
En af de første kategorier af sygdomme, som chitinase aktivitet fandtes at være relevant i var lysosomale opbevarings sygdomme, herunder Gauchers sygdom, Niemann-pick A/B og C, GM-1 gangliosidose, og mange andre21. Gauchers sygdom er en lysosomale opbevarings sygdom forårsaget af utilstrækkelig aktivitet af glucocerebrosidase og er karakteriseret ved ophobning af glucosylceramid, substratet af glucocerebrosidase, i lysosomet af makrofager15. Det er en genetisk sygdom, med kliniske symptomer, der omfatter milt og leverforstørrelse, lavt trombocyttal, anæmi, træthed, og knogleproblemer22. Klinisk forskning har vist, at et flertal af personer, der lider af Gauchers sygdom, har en median chitinaseaktivitet, som er over 600 gange den mediane værdi af normale kontrol frivillige. Derudover, når folk med Gauchers sygdom blev sat på enzym tilskud terapi-den nuværende behandling for sygdommen-deres chitinase aktivitet niveauer faldt betydeligt udlån chitinase aktivitet for at være en glimrende markør for både sygdom progression og behandling overvågning15. Ingen rolle er endnu ikke fundet for Chit1 i sygdommen dog. Lignende forskning har ført til Chit1 Aktivitetsovervågning for talrige andre lysosomale opbevarings sygdomme10.
Derudover har yderligere forskning indikeret en potentiel rolle for Chit1 aktivitet under forskellige patogen infektion, herunder svampeinfektion, malaria, tuberkulose og K. pneumoniae for at nævne et par2,3,10 . En 2012 undersøgelse viste, at chitinaseaktiviteten blev forhøjet hos patienter med aktiv tuberkulose (TB), selv når sputum smøre var negativt, hvilket indikerer, at chitinaseaktiviteten kunne anvendes som en effektiv biomarkør i TB-diagnosticering, især under lang ventetid, der ofte er nødvendigt for præcist at diagnosticere sygdommen23. Lignende fund blev observeret under Plasmodium falciparum infektion, med at serumniveauer signifikant øget hos personer med akut infektion24. Mens mange af disse sygdomme tager dage at diagnosticere, hurtige målinger af chitinase aktivitetsniveauer i blodet kan give gavnlig indsigt i diagnosen. Desuden, som malaria parasitter og tuberkulose bakterie bliver mere og mere modstandsdygtige over for behandlinger, måling af chitinase aktivitetsniveauer i serum kan hjælpe med behandling overvågning for sin effektivitet i realtid.
Mere og mere forskning er begyndt at fokusere på rollen af chitinase og chitinase-lignende proteiner i immunrespons, især dens rolle i inflammatoriske veje. Da denne forskning fortsætter, vil denne protokol give mulighed for hurtig og præcis måling af denne chitinase aktivitet til yderligere forskning. Protokollen er let justeret for et vilkårligt antal arter prøver, herunder både mus og mennesker, hvilket gør det almindeligt gældende.
Ud over forsknings fordelen vil bedre metoder til påvisning og måling af chitinaseaktivitet i prøver være gavnlig i det kliniske rige. Nyere forskning har demonstreret rollen af chitinase som en biomarkør i patologi af talrige kroniske sygdomme, herunder Gauchers sygdom, diabetes mellitus, sarkoidose, åreforkalkning, inflammatorisk tarmsygdom og kræft3, 21,25,26.
På grund af denne rolle som en biomarkør, hurtig og præcis måling af chitinase aktivitet som vist her er utroligt relevant for det medicinske område, så sundhedspersonale at have mere information til en ordentlig diagnose og behandling plan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
Denne forskning blev støttet af American Lung Association og American Thoracic Society Awards til LS. Forfattere oprigtigt ønsker at takke Dr. Jack Elias og Dr. Chun Geun Lee for at give transgene muse stammer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-methylumbelliferone | Sigma | M1381 | Standard: commonly used in flourimetric assays for determination of enzyme activity |
| 4MU-GlcNAc2 | Sigma | M9763 | fluorescent chitinase substrate for use in mouse samples |
| 4MU-GlcNAc3 | Sigma | M5639 | fluorescent chitinase substrate for use in human samples |
| Citric Acid-monohydrate | for use in McIlvain Buffer | ||
| Glycine | for use in Stop Buffer at a concentration of 0.3 M | ||
| Na2HPO4xH2O | for use in McIlvain Buffer | ||
| NaOH | for use in Stop Buffer at a concentration of 12 g/L | ||
| Vision Plate: Non-sterile, untreated black 96 well plate | 4titude | 4ti-0224 |
References
- Hamid, R., Khan, M. A., Ahmad, M. Chitinases: An update. Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 5 (1), 21-29 (2013).
- Sharma, L., et al. Regulation and Role of Chitotriosidase during Lung Infection with Klebsiella pneumoniae. Journal of Immunology. 201 (2), 615-626 (2018).
- Kanneganti, M., Kamba, A., Mizoguchi, E. Role of chitotriosidase (chitinase 1) under normal and disease conditions. Journal of Epithelial Biology & Pharmacology. 5, Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3579558/ 1-9 (2012).
- Lee, C. G., et al. Role of Chitin and Chitinase/Chitinase-Like Proteins in Inflammation, Tissue Remodeling, and Injury. Annual Review of Physiology. (73), 479-501 (2011).
- Jeuniaux, C. Chitinase: An Addition to the List of Hydrolases in the Digestive Tract of Vertebrates. Nature. 192 (4798), 135-136 (1961).
- Boot, R. G., et al. Identification of a Novel Acidic Mammalian Chitinase Distinct from Chitotriosidase. Journal of Biological Chemistry. 276 (9), 6770-6778 (2000).
- Arndt, S., Hobbs, A., Sinclaire, I., Lane, A. B. Chitotriosidase Deficiency: A Mutation Update in an African Population. JIMD Reports. 10, 11-16 (2013).
- Di Rosa, M., Malaguarnera, G., De Gregorio, C., Drago, F., Malaguarnera, L. Evaluation of CHI3L-1 and CHIT-1 Expression in Differentiated and Polarized Macrophages. Inflammation. 36 (2), 482-492 (2013).
- Wiesner, D. L., et al. Chitin Recognition via Chitotriosidase Promotes Pathologic Type-2 Helper T Cell Responses to Cryptococcal Infection. PLOS Pathogens. 11 (3), e1004701 (2015).
- Elmonem, M. A., vanden Heuvel, L. P., Levtchenko, E. N. Immunomodulatory Effects of Chitotriosidase Enzyme. Enzyme Research. 2016, 1-9 (2016).
- Ferrari, A. R., Gaber, Y., Fraaije, M. W. A fast, sensitive and easy colorimetric assay for chitinase and cellulase activity detection. Biotechnol Biofuels. 7 (37), 1-8 (2014).
- Schales, O., Schales, S. S. Simple method for the determination of glucose in blood. Proc Am Fed Clin Res. 2, Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20275623 78 (1945).
- Zarei, M., et al. Characterization of Chitinase with Antifungal Activity from a Native Serratia Marcescens B4A. Brazilian Journal of Microbiology. 42 (297), 1017-1029 (2011).
- Zhu, Z., et al. Acidic Mammalian Chitinase in Asthmatic Th2 Inflammation and IL-13 Pathway Activation. Science. 304 (5677), 1678-1682 (2004).
- Hollak, C. E., van Weely, S., van Oers, M. H., Aerts, J. M. Marked elevation of plasma chitotriosidase activity. A novel hallmark of Gaucher disease. Journal of Clinical Investigation. 93 (3), 1288-1292 (1994).
- Musumeci, M., Malaguarnera, L., Simpore, J., Barone, R., Whalen, M., Musumeci, S. Chitotriosidase activity in colostrum from African and Caucasian women. Clinical Chemistry and Laboratory. 43 (2), 198-201 (2005).
- Maddens, B., et al. Chitinase-like Proteins are Candidate Biomarkers for Sepsis-induced Acute Kidney Injury. Mol Cell Proteomics. 11, 1-13 (2012).
- Hector, A., et al. Chitinase activation in patients with fungus-associated cystic fibrosis lung disease. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 138 (4), 1183-1189 (2016).
- Hall, A. J., Morroll, S., Tighe, P., Götz, F., Falcone, F. H. Human chitotriosidase is expressed in the eye and lacrimal gland and has an antimicrobial spectrum different from lysozyme. Microbes and Infection. 10 (1), 69-78 (2008).
- Kim, L. K., et al. AMCase is a crucial regulator of type 2 immune responses to inhaled house dust mites. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (22), e2891-e2899 (2015).
- Olkhovych, N. V. Chitotriosidase activity as additional biomarker in the diagnosis of lysosomal storage diseases. Ukrainian Biochemical Journal. 88 (1), 69-78 (2016).
- Bouayadi, O., et al. Disease: An Underdiagnosed Pathology in the Eastern Moroccan Population. eJIFCC. 30 (1), 82-87 (2019).
- Tasci, C., et al. Efficacy of serum chitotriosidase activity in early treatment of patients with active tuberculosis and a negative sputum smear. Therapeutics and Clinical Risk Management. 8, 369-372 (2012).
- Barone, R., Simporé, J., Malaguarnera, L., Pignatelli, S., Musumeci, S. Plasma chitotriosidase activity in acute Plasmodium falciparum malaria. Clinica Chimica Acta. 331 (1-2), 79-85 (2003).
- Kitamoto, S., et al. Chitinase inhibition promotes atherosclerosis in hyperlipidemic mice. American Journal of Pathology. 183 (1), 313-325 (2013).
- Kzhyshkowska, J., Gratchev, A., Goerdt, S. Human Chitinases and Chitinase-Like Proteins as Indicators for Infl Ammation and Cancer. Biomark Insights. 2, 128-146 (2007).
