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Immunology and Infection

생물학적 샘플에서 치티나제 활성 측정

doi: 10.3791/60159 Published: August 22, 2019
* These authors contributed equally

Summary

여기에 제시된 기관지 충혈 충혈 또는 혈청과 같은 생물학적 유체에서 치티나제 활성을 측정하는 간단한 방법이 있다.

Abstract

치티나제는 치틴을 갈라주는 효소입니다. 키틴이 없는 경우에도 포유류는 기준선을 포함하여 신체에 존재하는 상당한 양의 키티나아제가 있습니다. 키티나아제의 정확한 역할은 알려져 있지 않지만, 각각 키틴 함유 음식과 병원균에 대한 소화 및 숙주 방어에 중요한 역할을 하는 것으로 여겨졌다. 최근 우리 들을 포함 하 여, 숙 주 면역 및 알레르기 성 질환에 치 티 나 제와 치 티 나 제 같은 단백질의 중요 한 역할을 보이고 있다. 중요한 것은, 치티나제 활동은 천식 과 폐 섬유증과 같은 타입-2 염증성 질병을 포함하여 질병의 넓은 범위에 있는 질병 엄격의 중요한 biomarkers로 봉사합니다. 유사하게, Gaucher 질병 같이 유전 무질서를 가진 환자는 질병 엄격과 상관되는 뿐 아니라 치료 효과를 위한 믿을 수 있는 biomarker로 봉사하는 치티나제 수준을 현저하게 상승했습니다. 여기에서 설명된 프로토콜은 쥐의 BAL 또는 혈청 샘플에서 치티나제 활성을 측정하는 간단하고 빠르며 간단한 방법을 설명하며 효소의 고도로 보존된 특성으로 인해 인간 대상자 및 기타 모델 유기체에 널리 적응될 수 있습니다.

Introduction

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키틴은 셀룰로오스 에 이어 지구상에서 두 번째로 가장 풍부한 다당류이며, 곤충, 곰팡이, 효모 및 조류의 외골격을 포함한 다양한 유기체의 주요 구조 성분으로 서용; 일부 척추 동물은 또한 치틴1. 치티나제는 치틴을 분해할 수 있는 효소의 가족이며 박테리아에서 포유류에 이르는 종의 진화를통해 매우 보존되어 2,3. 키티나제 이외에, 포유동물은 또한 키틴을 결합하는 그들의 기능에 있는 키티나아제와 유사하지만 키틴 4를 갈라는 효소 능력이 부족하다는 점에서다릅니다 chitinase 같이 단백질이 있습니다.

1900년대 초로 거슬러 올라가는 조사와 함께 치틴과 치티나제는 오랫동안 연구되어 왔지만, 곤충과 다른 무척추 동물에서 그들의 역할에 중점을 두었습니다. 사실, 척추동물이 치티나제를 전혀 가지고 있는 것으로 밝혀진 1960년대까지는 아니었습니다. 키토비아제 기반 분석기를 사용하여, 키티나제는 도마뱀과 흑새를 포함한 다수의 척추동물의 소화관에서 발견되는 것으로 나타났는데, 이는 곤충과 같은 키틴 함유 유기체의 소비로 인한 것으로 추정되는관찰5 .

포유류는 치티나아제의 두 가지 효소 활성 형태를 가지고 있습니다: 산성 포유류 치티나아제 (AMCase; CHIT2 및 CHIA로도알려져 있음) 및 키토트리오시다제 (CHIT1) 4. 이 단백질의 둘 다 가을 분해 하는 치 틴 수 있습니다. 그러나, CHIT1은 거의 모든 치티나아제 활성이 CHIT1에서 파생되는 인간에서 더 효소적으로 활동적입니다. 4 마우스에서, 치트1과 AMCase 둘 다 거의 동등하게 전반적인 치티나제 활성에 기여6. 다른 한편으로는, 치티나제 같이 단백질은 치티나제 활동이 부족합니다.

Chit1은 주로 대식세포에 의해 분비되며 종종 치틴 함유 병원체 7에대한 면역 반응으로 간주됩니다. 효소는 또한 기질 키틴8의존재 없이도 M1 및 M2 대식세포 아류형 둘 다로 단핵구의 성숙에 관여하는 것으로 나타났다. 더욱이, 또한, T 도우미 타입 2(Th2) 세포 및 호산구를 포함하는 다른 면역 세포의 성숙에 관여할 수 있다-크립토코칼 폐감염의경우9로 나타났다. 이 연구 결과는 면역 계통에 있는 chitinases의 복잡한 역할을 가리킵니다.

최근, Chit1 수준은 리소좀 저장 질환, 전염병, 호흡기 질환, 내분비학 질환, 심혈관 을 포함한 40 가지 이상의 인간 질병에 대한 진행의 중요한 바이오 마커역할을하는 것으로 밝혀졌다. 질병, 신경 질환 및 기타(검토 10). 이러한 질병의 많은, Chit1의 수준은 질병 심각도 및 치료 효과의 강력한 예측자10.

키티나제는 고셔 병을 포함한 수많은 의료 조건에 대한 바이오마커로 명성을 얻었기 때문에, 키티나제 존재에 대한 테스트를 용이하게 하기 위해 도구와 분석이 개발되었습니다. 이전 방법에는 Schales의 절차, 혈액 포도당 검사에서 적응된 프로토콜 및 3,5 dinitrosalicyliclicacid (DNS) 방법이 포함됩니다. 그러나, 이러한 방법은 종종 시간에 민감하고 기술적으로 어려운11. 이 두 시험에 대한 절차는 예를 들어 Schales의 절차의 경우 무기 산화제, 페리시아니드의 감소를 필요로하며, 분광광측정으로만 측정될 수 있는 색상 변화를 생성합니다. 부가적으로, 두 시험은12,13을개발하는 데 시간이 많이 걸리고 필요한 가열 또는 비등 단계를 포함한다.

여기서 기재된 포유동물 샘플 에서 치티나아제 수준을 결정하는 빠르고 간단한 형광 분석법(14,15). 여기에서 사용된 견본의 2개는 혈청 및 기관지 정맥 세척 액체 (BAL)를 포함합니다; 치티나아제 활성은 또한 모유 및 소변 샘플에서 측정되었으며, 기술은 다른 생물학적 유체16,17뿐만아니라 이러한 유형의 샘플에서 수행될 수 있다.

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Protocol

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모든 동물 절차는 예일 대학 의과 대학에서 IACUC 승인 프로토콜에 따라 수행되었다.

1. 마우스 샘플 수집

  1. 마취
    1. 케타민과 자일라진 (케타민 100 mg/ kg 및 자일라진 10 mg/kg)을 사용하여 마우스를 마취시다.
  2. 혈액 샘플 수집
    1. 발가락 핀치에 대한 반응성이 없는 마취의 깊이를 확인합니다.
    2. 외과적으로 심장을 노출하기 위해 가슴 구멍을 엽니 다.
    3. 좌심실로 26.5 G 바늘을 삽입하고 주사기로 혈액을 수집합니다.
      참고: 전형적으로, 혈액의 대략 0.5-1 mL는 건강한 20-25 g 마우스에서 수확될 수 있습니다.
    4. 혈장 수집을 위해 헤파린화 튜브, 또는 혈청 수집을 위한 비 헤파린화 튜브에서 혈액을 수집합니다.
  3. 기관지 세척액 의 컬렉션 (BAL)
    1. BAL을 수집하려면 목을 세로로 잘라 기관을 노출시십시오.
    2. 22G 카테터로 기관을 수냉하고 마우스의 코에서 누출을 방지하기 위해 끈을 사용하여 단단히 고정하십시오.
    3. 천천히 기관을 통해 폐에 멸균 인산 완충 식염수 (PBS, 0.75 mL 각)의 두 개의 aliquots를 주입하고 다시 검색합니다.
    4. aliquots를 풀하고 추가 분석을 위해 얼음을 유지하십시오.
  4. 생물학적 샘플을 처리합니다.
    1. 혈액 샘플: 신선한 (혈장) 또는 4 시간 동안 응고를 허용 한 후 (혈청), 원심 분리기 600 x g에서 10 분. 상급을 가지고 저장을 위해 동결하거나 실험에 사용.
    2. BAL: 샘플을 350 x g에서 5분 동안 원심분리합니다. 상급을 가지고 저장을 위해 동결하거나 실험에 사용.

2. 치티나제 분석

참고: 분석 뒤에 과학은 상대적으로 간단합니다. 비형광 기질은 효소 활성 키티나아제에 의해 절착되어 형광 생성물, 이어서 치티나아제 활성의 간접 마커로 측정됩니다. 시료 내의 키티나제는 1x McIlvain 완충액에 존재하는 기질 4-메틸룸벨리페릴-D-N, N'-디아세틸키토바이오스를 분해한다. 형광 분자 4-메틸럼벨리퍼릴이 방출된다. 각 웰의 총 형광을 측정하여 각 샘플에서 활성 치티나아제의 정확한 측정을 얻을 수 있습니다. 치티나아제에 의한 치틴의 분해는 가수분해 반응이기 때문에, 정지 완충제는 0.3M 글리신과 NaOH(pH 10.6에서 12.0 g/L)의 혼합물이며, 효소가 기능하기에너무 기본적인 환경을 조성하여 치틴의 분해를 종료한다.

  1. 기판, 표준 및 솔루션을 준비합니다.
    1. McIlvain 버퍼를 준비합니다. 맥킬베인 버퍼는 5.2의 pH에서 0.1 M 감방 및 0.2 M 인산염으로 구성된다. 1x McIlvain 버퍼에 대해 1:1의 비율로 희석하십시오.
    2. 4-메틸룸벨리페릴-D-N, N'-디아세틸키토바이오스 및 4-메틸룸벨리페릴 ß-N, N', N"-트리아세틸키토트리오스를 1x McIlvain 완충제에 각각 500 μM의 농도로 용해시.
      참고: 스톡 용액은 추가 사용을 위해 -20 °C에서 보관할 수 있습니다. 알리쿼트에 가장 잘 저장됩니다.
    3. 표준, 4-메틸룸벨리페론을 스톱 버퍼에서 0.1 mM의 농도로 용해(0.3 M 글리신과 NaOH(pH 10.6에서 12.0 g/L)의 혼합물)을 사용하여 표준 곡선 스톡 솔루션을 생성합니다.
  2. 작업 솔루션을 만들고 플레이트합니다.
    1. 1x McIlvain 버퍼와 키틴 기판 4-메틸룸벨리페릴-D-N, N'-diacetylchitobiose를 결합하여 작업 용액을 만듭니다. 10개의 시료마다 100 μL의 기판을 1x McIlvain 버퍼의 2.17 mL와 혼합합니다. 샘플 크기에 따라 추가 계산은 1을 참조하십시오.
      참고: 인간 시료에 4-메틸룸벨리페릴 ß-D-N, N', N"-트리아세틸키토트리아제를 사용하십시오. 두 기질 모두 인간 또는 마우스 효소에 의해 절단될 수 있지만, 그들은 분열6의효율에 기초하여 인간 또는 마우스 샘플 중 하나에 할당되었다.
    2. 96웰 플레이트의 각 웰에 작업 용액의 피펫 95 μL.
  3. 작업 용액에 생물 표본 샘플을 추가합니다.
    1. 다음으로, 각 우물에 시험 샘플(혈액/BAL/조직 분해/기타 생물학적 유체)의 5 μL을 추가합니다.
    2. 가장 정확하고 신뢰할 수있는 결과를 위해 작업 솔루션에 샘플을 혼합합니다.
      참고: 샘플은 잠재적인 에지 효과에 특별한주의를 기울여 중복 / 삼중항으로 실행해야합니다. 모든 샘플을 미리 데워서 가장자리 효과를 최소화해야 합니다. 분석법은 시료내의 치티나아제와 작업 용액의 기질 사이의 반응을 수반하기 때문에, 첫 번째 시료가 도금될 때와 마지막 시료가 도금될 때의 시간 차이를 최소화하기 위해 비교적 빠르게 작업하는 것이 가장 좋습니다. 멀티채널 파이펫을 권장합니다.
  4. 37 °C에서 배양하십시오.
    1. 접시를 덮고 잠시 흔들어 주세요(5s).
    2. 플레이트를 37°C에서 15분 동안 배양합니다. 이것은 효소 반응이 일어날 수 있습니다.
  5. 표준 곡선을 준비합니다.
    1. 샘플이 인큐베이션되는 동안, 효소 활성의 형광 측정에 자주 사용되는 표준인 4-메틸룸벨리퍼론의 직렬 희석을 준비합니다.
    2. 표준 용액의 스톡을 스톱 버퍼에서 5 μM의 농도로 희석합니다.
    3. 2에 표시된 대로 일련의 희석을 수행합니다. 표시된 양에 구성 요소를 추가하고 잘 섞는다.
      참고: 표준 곡선은 측정된 샘플이 표준 곡선의 선형 범위에 속하는지 확인하는 데 도움이 됩니다.
  6. 정지 버퍼로 반응을 중지합니다.
    1. 200 μL의 스톱 버퍼를 각 웰에 추가하여 반응을 멈춥시다.
  7. 표준을 플레이트합니다.
    1. 같은 접시에 중복된 우물당 각 표준의 300 μL을 추가합니다.
  8. 형광 판독기를 사용하여 플레이트를 읽습니다.
    1. 360 nm의 흥분과 455 nm의 방출에서 플레이트를 읽습니다.

3. 데이터 분석

  1. 공백 빼기
    1. 4-메틸룸벨리퍼론이 없는 중복 표준 희석값의 평균값. 기록된 다른 모든 값에서 이 값을 뺍니다.
  2. 평균적인 기술 복제를 취하고 표준을 플로팅합니다.
    1. 각 농도에 대한 두 개의 판독값을 평균화하고 농도별 평균 판독값을 그래프로 그립니다.
      참고: 결과 플롯은 선형으로 보이며 R2 값이 1에 가깝습니다. 그렇지 않은 경우 데이터 분석의 품질을 보장하기 위해 표준을 다시 실행하고 플레이트를 다시 읽어야 할 수 있습니다.
  3. 판독 값을 표준화합니다.
    1. 플롯된 표준 데이터에 가장 적합한 선을 만듭니다. 샘플의 판독을 최적 선의 경사로 나눕니다.
  4. 대조군과 가변 그룹의 값을 비교합니다.
    1. 두 개 이상의 그룹에 대해 t-검정 또는 ANOVA를 사용하여 그룹 간의 차이가 통계적으로 유의한지 확인합니다. 값은 단위 nmol/mL·h를 취할 것입니다.

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Representative Results

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여기에 표시된 결과는 독시 사이클린 프로모터상에서 Chit1 유전자를 과발현하는 야생형(C57BL/6) 및 Chit1 형질전환 마우스(C57BL/6 배경)의 혈청 및 BAL 샘플에서키티나제 활성을 측정하는 연구에서 나온 것이다. 우리의 데이터는 혈청과 BAL 샘플이 각각 기준선 698.2 ±189.9 nmol/mlh 및 485.7 ±114 nmol/ml/h에서 검출 가능한 키티나아제 활성을 가지고 있음을 보여줍니다. 4주 동안 식수에서 독시사이클린을 이용한 Chit1 유전자의 과발현은 BAL(4,575±673.8 nmol/h, p=0.003) 및 혈청 15566.2nmol/mLh, p=02에 비해 두 가지 모두에서 관찰된 치티나아제 활성의 고도를 초래하였다. )을 샘플링합니다.

여기에 기재된 프로토콜을 사용하여, 분석은 마우스에서 Chit1 유전자의 과발현이 치티나제 활성을 증가시키는 결과를 초래한다는 것을 확인한다. t-검정은 두 그룹의 수단을 비교하기 위해 사용되었다. 각 그룹은 5개의 마우스를 포함하였다.

Figure 1
그림 1: 치티나제 활성. 치티나아제 활성은 (A) 혈청 및 (B) 기관지 베올라 세척액의 야생형(WT) 및 치토트리오시다아제(ChitTg) 과발형 형질전환 마우스에서 측정하였다. 각 점은 개별 마우스 샘플을 나타냅니다. (C) 값은 프로토콜에 설명된 바와 같이 표준 곡선의 선형성을 사용하여 표준화되었다. 형광 수준은 360 nm의 파장에서 플레이트 리더를 사용하여 여기및 방출을 위한 455 nm를 사용하여 측정하고 AU로 제시되었다. AU = 임의 단위 *p < 0.05, ***p & 0.001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

샘플 웰 수 기판(μL) 맥킬베인 버퍼 (mL)
20 100 2.17
50 250 5.425
100 500 10.85

표 1: 작업 솔루션을 만들기 위한 샘플 계산입니다.

(μL) 1 2 3 4 5 6 7 8
Conc. (nM) 0 125 250 375 500 625 750 875
표준 0 20 40 60 80 100 120 140
2x 맥킬비안 200 200 200 200 200 200 200 200
증류H2O 200 180 160 140 120 100 80 60
버퍼 중지 400 400 400 400 400 400 400 400

표 2: 표준 곡선 측정을 위한 희석.

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Discussion

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치티나아제 활성은 질병 중증도, 질병 진행, 치료 효과 및 특정 병원체의존재를 예측하기 위한 중요한 바이오마커로서 18로 나타났다. 키티나아제의 역할에 대한 많은 이론이 실험적으로 입증되지 는 않았지만19,새로운 연구는 다양한 질병의 단백질과 같은 키티나제와 치티나아제의 역할에 대한 중요한 통찰력을 제공했습니다2, 9,20.

여기에 설명된 프로토콜은 생물학적 샘플에서 치티나제 활성을 측정하는 간단하고 빠르며 효과적인 방법입니다. 치티나아제의 고도로 보존된 특성으로 인해 다양한 생물학적 샘플 및 종에서 치티나아제 활성을 측정하기 위해 거의 또는 전혀 변형이 필요하지 않습니다. 이 프로토콜에 나열된 두 개의 기판이 있으며, 그 중 하나는 마우스 샘플용으로 지정되었으며 하나는 인간 샘플용으로 지정됩니다. 그러나, 두 기판은 효소가 기판을 갈라질 수 있는 효율성의 이전 논문의 데모에 근거하여 그(것)들이 지정되었기 때문에 어느 종든에 이용될 수 있습니다.

Schales의 절차 및 DNS 방법과 같은 기존의 기술과 비교하여 여기에 설명된 분석법은 이전 방법에서 필요한 끓이거나 가열과 같은 시간 집약적 인 단계의 필요성을 제거합니다. 또한, 이 분석법은 기술적으로 덜 어렵고 이전 측정 기술보다 더 적은 복잡한 단계가 필요합니다. 최상의 결과를 얻으려면 생물학적 및 기술적 복제를 모두 사용해야 합니다.

치티나아제 활성이 너무 높으면, 생물학적 시료의 희석은 측정을 위한 치티나제 활성을 감소시키기에 충분하며, 실제 값은 희석에 기초하여 계산될 수 있다. 새로운 생물학적 샘플에 대한 이 실험을 수행할 때, 최상의 결과를 위해 적절한 배양 시간을 보장하기 위해 포화 될 때까지 시간이 지남에 따라 동일한 플레이트에서 반복 측정을 수행하는 것이 유용 할 수 있습니다. 또한 그룹 간의 일관성이 유지되는 한 프로토콜을 확장하거나 축소할 수 있습니다. 이 프로토콜의 미래 응용은 연구가 다만 다수 질병에 있는 chitinase 활동의 역할에 픽업으로 멀리 도달하고 있습니다.

치티나아제 활성이 관련이 있는 것으로 밝혀진 질환의 첫 번째 범주 중 하나는 고셔병, 니만-픽 A/B 및 C, GM-1 간글리오시증 및 기타21개국을 포함하는 리소좀 저장 질환이었다. 고셔 병은 글루코세레브로시다아제의 불충분한 활성으로 인한 리소좀 저장 질환이며, 글루코세레브로시다제의 기질인 글루코실체라미드의 축적을 특징으로하며, 대식세포(15)의 리소좀에서. 비장 및 간 확대, 낮은 혈소판 수, 빈혈, 피로 및 뼈 문제를 포함하는 임상 증상이 있는 유전 질환입니다22. 임상 연구는 Gaucher 질병으로 고통받는 사람들의 대다수가 정상 대조군 자원 봉사자의 중앙값의 600 배 이상인 중앙치나제 활성을 가지고 있음을 입증했습니다. 또한, Gaucher 질병을 가진 사람들이 효소 보충 치료에 넣어 때-질병에 대 한 현재 치료-그들의 치 티 나 제 활동 수준 크게 두 질병의 우수한 마커로 치 티 나 제 활동을 빌려 떨어졌다 진행 및 치료 모니터링15. 그러나 질병에서 Chit1에 대한 역할은 아직 발견되지 않았습니다. 유사한 연구는 수많은 다른 리소좀 저장 질병10에대한 Chit1 활동 모니터링을 주도하고있다.

추가적으로, 추가 연구는 곰팡이 감염, 말라리아, 결핵 및 K. 폐렴을 포함하여 각종 병원체 감염 도중 Chit1활동에 대한 잠재적인 역할을 몇몇 2,3,10를 표시했습니다 . 2012년 한 연구에 따르면 치티나제 활성은 가래 얼룩이 음성일 때에도 활성 결핵(TB) 감염 환자에서 상승했으며, 이는 치티나제 활성이 결핵 진단에서 효과적인 바이오마커로 사용될 수 있음을 나타내는 것으로 나타났습니다. 질병23을정확하게 진단하는 데 필요한 긴 대기 시간. 유사한 사실 인정은 급성 감염을 가진 사람들에서 현저하게 증가한 chitotriosidase 혈청 수준으로, Plasmodium falciparum 감염 도중 보였습니다24. 이러한 질병의 많은 진단 하는 데 일 걸릴 하는 동안, 혈액에서 치 티 나 제 활동 수준의 빠른 측정 진단에 유익한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 또한, 말라리아 기생충과 결핵 박테리아는 치료에 점점 저항하게되면, 혈청의 치티나제 활성 수준을 측정하는 것은 실시간으로 그 효과에 대한 치료 모니터링에 도움이 될 수 있습니다.

점점 더 많은 연구는 면역 반응에 있는 chitinase와 chitinase 같이 단백질의 역할에 집중하기 시작했습니다, 특히 선동적인 통로에 있는 그것의 역할. 이 연구가 계속됨에 따라,이 프로토콜은 추가 연구에이 치티나제 활동의 빠르고 정확한 측정을 허용할 것입니다. 이 프로토콜은 마우스와 인간을 포함한 모든 종 샘플에 대해 쉽게 조정되므로 널리 적용 가능합니다.

연구 이점 이외에, 견본에 있는 키티나아제 활동을 검출하고 측정하기 위한 더 나은 방법은 임상 영역에서 유익할 것입니다. 최근 연구는 고셔 질환, 당뇨병, 사르코이드증, 동맥경화증, 염증성 장질환 및 암 등 수많은 만성 질환의 병리학에서 치티나아제의 역할을 입증하였다3, 21,25,26.

여기에 표시된 바와 같이 바이오마커로서의 역할 때문에, 치티나제 활성을 빠르고 정확하게 측정하는 것은 의학 분야와 매우 관련이 있으므로 의료 제공자가 적절한 진단 및 치료 계획에 대한 자세한 정보를 가질 수 있습니다.

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Disclosures

없음.

Acknowledgments

이 연구는 LS에 미국 폐 협회와 미국 흉부 학회 상에 의해 지원되었다. 저자는 진심으로 박사 잭 엘리아스와 이춘근 박사에게 형질전환 마우스 균주를 제공해 준 것에 대해 감사드립니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-methylumbelliferone Sigma M1381 Standard: commonly used in flourimetric assays for determination of enzyme activity
4MU-GlcNAc2 Sigma M9763 fluorescent chitinase substrate for use in mouse samples
4MU-GlcNAc3 Sigma M5639 fluorescent chitinase substrate for use in human samples
Citric Acid-monohydrate for use in McIlvain Buffer
Glycine for use in Stop Buffer at a concentration of 0.3 M
Na2HPO4xH2O for use in McIlvain Buffer
NaOH for use in Stop Buffer at a concentration of 12 g/L
Vision Plate: Non-sterile, untreated black 96 well plate 4titude 4ti-0224

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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생물학적 샘플에서 치티나제 활성 측정
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Amick, A. K., Liu, Q., Gautam, S., Chupp, G., Dela Cruz, C. S., Sharma, L. Measurement of Chitinase Activity in Biological Samples. J. Vis. Exp. (150), e60159, doi:10.3791/60159 (2019).More

Amick, A. K., Liu, Q., Gautam, S., Chupp, G., Dela Cruz, C. S., Sharma, L. Measurement of Chitinase Activity in Biological Samples. J. Vis. Exp. (150), e60159, doi:10.3791/60159 (2019).

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