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Immunology and Infection

Medição da atividade da quitinase em amostras biológicas

doi: 10.3791/60159 Published: August 22, 2019
* These authors contributed equally

Summary

Aqui apresentamos um método simples para medir a atividade da quitinase em fluidos biológicos, como lavagem broncoalveolar ou soro.

Abstract

As quitinases são as enzimas que cliam em quitina. Mesmo na ausência de quitina, os mammalianos têm quantidades significativas de quitinases presentes no corpo, incluindo no início do estudo. O papel preciso da quitinase não é conhecido, no entanto, acreditava-se que desempenham um papel importante na digestão e defesa do hospedeiro contra a quitina contendo alimentos e patógenos, respectivamente. O trabalho recente, incluindo o nosso, tem demonstrado um papel importante de quitinase e proteínas de quitinase-like na imunidade do hospedeiro e doenças alérgicas. É importante ressaltar que as atividades de quitinase servem como biomarcadores importantes da severidade da doença em uma ampla gama de doenças, incluindo doenças inflamatórias do tipo 2, como asma e fibrose pulmonar. Da mesma forma, pacientes com distúrbios genéticos como a doença de Gaucher têm níveis significativamente elevados de quitinase, que não só se correlacionam com a severidade da doença, mas também servem como um biomarcador confiável para efetividade terapêutica. O protocolo esboçado aqui descreve uma maneira simples, rápida, e direta de medir a atividade do quitinase no Bal ou em amostras do soro dos ratos e pode extensamente ser adaptado aos assuntos humanos e aos outros organismos modelo devido à natureza altamente conservada das enzimas.

Introduction

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A quitina é o segundo polissacárido mais abundante na terra após a celulose, servindo como um componente estrutural importante de uma variedade de organismos, incluindo o exoesqueleto de insetos, fungos, leveduras e algas; alguns vertebrados também têm quitina1. Quitinases são uma família de enzimas que são capazes de quebrar a quitina e são altamente conservadas ao longo da evolução em espécies que variam de bactérias a mamíferos2,3. Além de quitinases, os mamíferos também têm quitinase-como proteínas que são semelhantes às quitinases em sua capacidade de ligar a quitina, mas diferem em que falta capacidade enzimática para Cleave a quitina4.

Embora a quitina e as quitinases tenham sido estudadas há muito tempo — com investigações que datam do início de 1900 — o foco principal tem sido o seu papel em insetos e outros invertebrados. Na verdade, não foi até a década de 1960, quando os vertebrados foram encontrados para ter quitinases em tudo. Usando um ensaio à base de quitobiase, as quitinases mostraram-se no trato digestivo de um número de vertebrados, incluindo lagartos e melros — uma observação hipotética para ser devido ao consumo de organismos contendo quitina, como insetos5 .

Os mamíferos têm duas formas enzimaticamente ativas de quitinase: quitinase de mamíferos ácidos (AMCase; também conhecida como CHIT2 e CHIA) e quitotriosidase (CHIT1)4. Ambas as proteínas são capazes de hidrolisando quitina. No entanto, CHIT1 é mais enzimaticamente ativo em seres humanos, onde quase toda a atividade de quitinase é derivada de CHIT1. 4 em camundongos, tanto o Chit1 quanto o amcase contribuem quase igualmente para a atividade geral da quitinase6. Por outro lado, as proteínas quitinase-like falta de atividade quitinase.

Chit1 é secretado principalmente por macrófagos e é muitas vezes considerado uma resposta imune aos patógenos contendo quitina7. A enzima também demonstrou estar envolvida na maturação dos monócitos nos subtipos de macrófago M1 e m2, mesmo sem a presença do substrato quitina8. Além disso, também pode estar envolvida na maturação de outras células imunes, incluindo células T auxiliares tipo 2 (Th2) e eosinófilos — como se mostrou ser o caso na infecção pulmonar criptocócica9. Estes estudos apontam para um papel complexo de quitinases no sistema imunológico.

Nos últimos anos, Chit1 níveis foram encontrados para servir como um importante biomarcador de progressão para mais de 40 diferentes doenças humanas, incluindo doenças de armazenamento lisossomal, doenças infecciosas, doenças respiratórias, doenças endocrinológicas, cardiovascular doenças neurológicas e outras (revistas10). Em muitas dessas doenças, os níveis de Chit1 são um forte preditor de severidade da doença e efetividade terapêutica10.

Como quitinases ganharam uma reputação como um biomarcador para inúmeras condições médicas, incluindo a doença de Gaucher, ferramentas e ensaios foram desenvolvidos para facilitar o teste para a presença de quitinase. Os métodos mais antigos incluem o procedimento de schales, um protocolo adaptado de um teste de glicose no sangue, e o método de ácido 3, 5 dinitrosalicílico (DNS). No entanto, esses métodos são muitas vezes sensíveis ao tempo e tecnicamente difícil11. O procedimento para ambos os testes exige a redução de oxidantes inorgânicos, ferricianeto no caso do schales ' procedimento por exemplo, produzindo uma mudança de cor que só pode ser medido espectrofotometricamente. Adicionalmente, ambos os testes envolvem um aquecimento ou uma etapa de ebulição que seja demorado e necessário para que a cor desenvolva12,13.

Descrito aqui é um ensaio fluimétrico rápido e simples para determinar os níveis de quitinase em amostras de mamíferos14,15. Duas das amostras utilizadas aqui incluem fluidos de lavagem de soro e broncoalveolar (LBA); a atividade da quitinase também foi mensurada em amostras de leite materno e urina, e a técnica pode ser realizada nessas amostras, bem como em qualquer outro fluido biológico16,17.

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Protocol

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Todos os procedimentos animais foram realizados um protocolo aprovado pela IACUC na Yale University School of Medicine.

1. coleção de amostras de mouse

  1. Anesthetization
    1. Anestesie os camundongos com cetamina e xilazina (100 mg/kg de cetamina e 10 mg/kg de xilazina).
  2. Coleta de amostras de sangue
    1. Confirme a profundidade da anestesia por não-responsividade a uma pitada do dedo do pé.
    2. Abra cirurgicamente a cavidade torácica para expor o coração.
    3. Insira uma agulha de 26,5 G no ventrículo esquerdo e colete o sangue em uma seringa.
      Nota: Tipicamente, aproximadamente 0.5 – 1 mL do sangue podem ser colhidos de um rato saudável de 20 – 25 g.
    4. Colete o sangue em tubos heparinizados, para coleta de plasma ou tubos não heparinizados para coleta de soro.
  3. Coleta de fluido de lavagem broncoalveolar (LBA)
    1. Para recolher o BAL, faça um corte vertical no pescoço para expor a traquéia.
    2. Cannulate a traquéia com um cateter de 22 G e fixe-a firmemente usando uma corda a fim impedir o escapamento fora do nariz do rato.
    3. Injete lentamente duas alíquotas de soro fisiológico tampão fosfato estéril (PBS, 0,75 mL cada) nos pulmões através da traquéia e recupere de volta.
    4. Alíquotas da associação e sustento no gelo para uma análise mais adicional.
  4. Processando as amostras biológicas.
    1. Amostra de sangue: ou fresco (plasma) ou depois de permitir a coagulação para 4 h (soro), centrifugador em 600 x g por 10 min. Tome o sobrenadante e congelar para armazenamento ou uso para experimento.
    2. BAL: Centrifugue a amostra a 350 x g durante 5 min. Tome o sobrenadante e congelar para armazenamento ou uso para experimento.

2. ensaio de quitinase

Nota: A ciência por trás do ensaio é relativamente simples. Um substrato não fluorescente é clivada por quitinase enzimaticamente ativa para produzir um produto fluorescente, que é então medido como um marcador indireto da atividade da quitinase. As quitinases dentro das amostras quebram o substrato 4-metilumbelliferyl-D-N, n'-diacetilquitobiose presente no tampão McIlvain 1x. Uma molécula fluorescente 4-methylumbelliferyl é liberada. Medindo-se a fluorescência total de cada poço, obtemos uma medida exata da quitinase ativa em cada amostra. Como a quebra da quitina por quitinase é uma reação hidrolítica, o tampão de parada, uma mistura de 0,3 M de glicina e NaOH (12,0 g/L em pH 10,6), termina a quebra da quitina, criando um ambiente que é muito básico para a enzima para funcionar.

  1. Prepare os substratos, padrões e soluções.
    1. Prepare o buffer McIlvain. O tampão de McIlvain é compreendido do citrato de 0,1 M e do fosfato de 0,2 M em um pH de 5,2. Diluir em uma proporção de 1:1 para 1x McIlvain buffer.
    2. Dissolver tanto 4-metilumbelliferyl-D-N, n'-diacetilchitobiose e 4-metilumbelliferyl ß-D-N, N ', N "-triacetilchitotriose em 1x McIlvain tampão para uma concentração de 500 μM cada.
      Nota: A solução conservada em estoque pode ser armazenada no ° c-20 para umas utilizações mais adicionais; melhor armazenadas em alíquotas.
    3. Dissolva o padrão, 4-methylumbelliferone, a uma concentração de 0,1 mM em tampão de parada (mistura de 0,3 M glicina e NaOH (12,0 g/L em pH 10,6)) para criar a solução de estoque de curva padrão.
  2. Criar e chapa a solução de trabalho.
    1. Combine 1x McIlvain buffer e o substrato de quitina 4-metilumbelliferyl-D-N, n'-diacetylchitobiose para criar a solução de trabalho. Para cada 10 amostras, misture 100 μL de substrato com 2,17 mL de tampão McIlvain 1x. Consulte a tabela 1 para obter cálculos adicionais com base no tamanho da amostra.
      Nota: Use 4-metilumbelliferyl ß-D-N, N ', N "-triacetilchitotriose para amostras humanas. Quando ambos os substratos podem ser clivados por enzimas humanas ou do rato, foram atribuídos para amostras humanas ou do rato baseadas na eficiência do clivagem6.
    2. Pipeta 95 μL de solução de trabalho em cada poço de uma placa de 96 poços.
  3. Adicione amostras de bioespécime à solução de trabalho.
    1. Em seguida, adicione 5 μL da amostra de teste (sangue/BAL/lisado de tecido/outro líquido biológico) a cada poço.
    2. Misture a amostra na solução de trabalho para obter os resultados mais precisos e confiáveis.
      Nota: As amostras devem ser executadas em duplicatas/triplicates com atenção especial paga aos efeitos potenciais da borda. Todas as amostras devem ser pré-aquecido para minimizar o efeito de borda. Como o ensaio envolve uma reação entre quitinases na amostra e substrato na solução de trabalho, é melhor trabalhar de forma relativamente rápida para minimizar a diferença no tempo entre quando a primeira amostra é revestida e a última amostra é revestida. A pipeta multicanal é recomendada.
  4. Incubar a 37 ° c.
    1. Cubra a chapa e agite brevemente (5 s).
    2. Incubar a placa a 37 ° c durante 15 min. Isso permite que a reação enzimática ocorra.
  5. Prepare a curva padrão.
    1. Enquanto as amostras estão incubando, prepare uma diluição em série de 4-metilumbelliferona, um padrão frequentemente utilizado na determinação fluimétrica da atividade enzimática.
    2. Diluir o estoque da solução padrão em tampão de parada para uma concentração de 5 μM.
    3. Realize uma série de diluições conforme indicado na tabela 2. Adicione os componentes na quantidade indicada e misture bem.
      Nota: A curva padrão ajuda a garantir que as amostras medidas caiam na faixa linear da curva padrão.
  6. Pare a reacção com o tampão de paragem.
    1. Adicionar 200 μL de tampão de paragem a cada poço para interromper a reacção.
  7. Placa os padrões.
    1. Adicione 300 μL de cada padrão por poço em duplicatas na mesma placa.
  8. Leia a placa usando um leitor fluorométrica.
    1. Leia a placa em uma excitação de 360 nm, e uma emissão de 455 nm.

3. análise de dados

  1. Subtrair os espaços em branco
    1. Média dos valores das diluições padrão duplicadas que não têm 4-metilumbelliferona. Subtrair esse valor de todos os outros valores gravados.
  2. Faça a média das réplicas técnicas e Trace os padrões.
    1. Média as duas leituras para cada concentração e gráfico a leitura média pela concentração.
      Nota: O gráfico resultante deve parecer linear e ter um valor de R2 próximo a 1. Se não, pode ser necessário refazer as normas e reler a placa para garantir a qualidade da análise dos dados.
  3. Padronize os valores de leitura.
    1. Crie uma linha de melhor ajuste para os dados de padrões plotados. Divida as leituras das amostras pela inclinação da linha de melhor ajuste.
  4. Compare valores de grupo de controle e grupo de variáveis.
    1. Use um teste t ou ANOVA, para mais de dois grupos, para determinar se a diferença entre os grupos é estatisticamente significante. Os valores tomarão as unidades nmol/mL · h.

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Representative Results

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Os resultados mostrados aqui são de um estudo que mede a atividade da quitinase em amostras do soro e do Bal do tipo selvagem (C57Bl/6) e de ratos transgênicas Chit1 (no fundo C57Bl/6) que sobre-expressão o gene Chit1 em um promotor do doxiciclina. Nossos dados mostram que as amostras do soro e do Bal têm a atividade detectável do quitinase na linha de base 698,2 ± 189,9 nmol/ml · h e 485,7 ± 114 nmol/ml · h, respectivamente. A superexpressão do gene Chit1 utilizando doxiciclina em água potável por 4 semanas resultou na elevação da atividade da quitinase observada tanto no LBA (4.575 ± 673,8 nmol/mL · h, p = 0, 3) quanto no soro 1556 ± 251,2 nmol/mL · h, p = 0, 272, quando comparado ao basal amostras.

Usando o protocolo descrito aqui, o ensaio confirma que a superexpressão do gene Chit1 em camundongos resulta em aumento da atividade da quitinase. Utilizou-se o teste t para comparar as médias dos dois grupos. Cada grupo continha 5 camundongos.

Figure 1
Figura 1: atividade de quitinase. A atividade da quitinase foi mensurada no soro (a)eno fluido de lavagem broncoalveolar do tipo selvagem (WT) e quitotriosidase (chittg) sobre a expressão de camundongos transgênicos. Cada ponto representa uma amostra de mouse individual. (C) os valores foram padronizados utilizando-se a linearidade da curva padrão, conforme descrito no protocolo. Os níveis de fluorescência foram medidos por meio de um leitor de placas no comprimento de onda de 360 nm para excitação e 455 nm para emissão e apresentado como AU. AU = unidade arbitrária * p < 0, 5, * * * p < 0, 1. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Número de poços de amostra Substrato (μL) Tampão de McIlvain (mL)
20 100 2,17
50 250 5,425
100 500 10,85

Tabela 1: cálculos de amostra para a criação da solução de trabalho.

ΜL 1 2 3 4 5 6 7 8
Conc. (MN) 0 125 250 375 500 625 750 875
Padrão 0 20 40 60 80 100 120 140
2x McIlvian 200 200 200 200 200 200 200 200
H destilado2O 200 180 160 140 120 100 80 60
Parar buffer 400 400 400 400 400 400 400 400

Tabela 2: diluições para medições de curvas padrão.

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Discussion

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A atividade da quitinase surgiu como um importante biomarcador para prever a severidade da doença, a progressão da doença, a efetividade terapêutica e a presença de patógenos específicos18. Embora muitas das teorias há muito postuladas sobre o papel das quitinases não tenham sido experimentalmente comprovadas19, novos estudos têm proporcionado importantes insights sobre o papel das quitinases e quitinase como proteínas em várias doenças2, 9,20.

O protocolo aqui descrito é uma forma simples, rápida e eficaz de medir a atividade da quitinase em amostras biológicas. É necessária pouca ou nenhuma modificação para medir a atividade da quitinase em uma ampla variedade de amostras biológicas e espécies devido à natureza altamente conservada das quitinases. Listados neste protocolo são dois substratos, um dos quais como foi designado para amostras de rato e um para amostras humanas; no entanto, ambos os substratos podem ser usados em qualquer espécie, como eles foram designados como tal, com base na demonstração de papéis anteriores da eficiência com que as enzimas podem cliar o substrato.

Comparado às técnicas previamente existentes, tais como o procedimento de schales e o método de DNS, o ensaio esboçado aqui remove a necessidade para etapas intensivas do tempo tais como a ebulição ou o aquecimento que eram necessários em uns métodos mais velhos. Além disso, o ensaio é menos tecnicamente difícil e requer menos passos complicados do que as técnicas de medição anteriores. Para melhores resultados, devem ser utilizadas réplicas biológicas e técnicas.

Se a atividade da quitinase for muito alta, as diluições da amostra biológica são suficientes para reduzir a atividade de quitinase para medição, e os valores verdadeiros podem ser calculados com base na diluição. Ao realizar este experimento em novas amostras biológicas, pode ser útil realizar medições repetidas na mesma placa ao longo do tempo até a saturação para garantir um tempo de incubação adequado para melhores resultados. Além disso, o protocolo pode ser dimensionado para cima ou para baixo, contanto que a consistência entre os grupos permaneça. As aplicações futuras deste protocolo são de grande alcance como a pesquisa está apenas pegando no papel da atividade quitinase em um número de doenças.

Uma da primeira categoria de doenças que a atividade do quitinase foi encontrada para ser relevante dentro era doenças lysosomal do armazenamento including Gaucher ' doença de s, Niemann-picareta A/B e C, gangliosidosis GM-1, e muitos outro21. A doença de Gaucher é uma doença lisossomal do armazenamento causada pela atividade insuficiente do Glucocerebrosidase e é caracterizada pelo acúmulo do glucosylceramide, o substrato do Glucocerebrosidase, no lisossomo dos macrófagos15. Trata-se de uma doença genética, com sintomas clínicos que incluem aumento do baço e do fígado, baixa contagem plaquetária, anemia, fadiga e problemas ósseos22. A pesquisa clínica demonstrou que a maioria dos povos que sofrem da doença de Gaucher tem uma atividade mediana do quitinase que seja sobre 600 vezes o valor mediano de voluntários normais do controle; Adicionalmente, quando as pessoas com doença de Gaucher foram colocadas na terapia de suplementação enzimática — o tratamento atual para a doença — seus níveis de atividade de quitinase caíram significativamente a atividade de quitinase de empréstimo para ser um excelente marcador de ambas as doenças progressão e monitorização do tratamento15. Nenhum papel foi encontrado ainda para Chit1 na doença entretanto. A pesquisa similar conduziu a Chit1 a monitoração da atividade para numeroso outras doenças lysosomal do armazenamento10.

Adicionalmente, uma pesquisa mais adicional indicou um papel potencial para a atividade Chit1 durante a vária infecção do micróbio patogénico que inclui a infecção fungosa, a malária, a tuberculose e o K. pneumoniae para nomear alguns2,3,10 . Um estudo de 2012 constatou que a atividade da quitinase foi elevada em pacientes com infecção tuberculosa ativa (TB) mesmo quando o esfregaço de escarro foi negativo, indicando que a atividade da quitinase poderia ser utilizada como um biomarcador efetivo no diagnóstico de TB, especialmente durante a tempo de espera longo que muitas vezes é necessário para o diagnóstico preciso da doença23. Os resultados similares foram vistos durante a infecção do falciparum do Plasmodium , com os níveis do soro do quitotriosidase aumentados significativamente naqueles com infecção aguda24. Quando muitas destas doenças tomam dias para diagnosticar, as medidas rápidas de níveis da atividade do quitinase no sangue podem fornecer introspecções benéficas no diagnóstico. Adicionalmente, como os parasitas da malária e a bactéria da tuberculose se tornam cada vez mais resistentes aos tratamentos, medir os níveis de atividade da quitinase no soro pode ajudar no monitoramento do tratamento para sua efetividade em tempo real.

Mais e mais pesquisas começaram a se concentrar no papel das proteínas quitinase e quitinase-like na resposta imune, particularmente seu papel nas vias inflamatórias. Como esta pesquisa continua, este protocolo permitirá a medida rápida e exata desta atividade do quitinase à pesquisa mais adicional. O protocolo é ajustado facilmente para todo o número de amostras da espécie que incluem o rato e o ser humano, fazendo o extensamente aplicável.

Além do benefício da pesquisa, melhores métodos para detectar e medir a atividade da quitinase em amostras serão benéficos na esfera clínica. Pesquisas recentes demonstraram o papel da quitinase como um biomarcador na patologia de inúmeras doenças crônicas, incluindo doença de Gaucher, diabetes mellitus, sarcoidose, aterosclerose, doença inflamatória intestinal e cânceres3, 21,25,26.

Devido a este papel como um Biomarker, a medida rápida e exata da atividade do quitinase como mostrado aqui é incredibly relevante ao campo da medicina, permitindo que os prestadores de cuidados médicos tenham mais informação para um plano apropriado do diagnóstico e do tratamento.

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Disclosures

Nenhum.

Acknowledgments

Esta pesquisa foi apoiada pela American Lung Association e American Thoracic Society Awards para LS. Os autores sinceramente querem agradecer ao Dr. Jack Elias e Dr. Chun Geun Lee por fornecer cepas de camundongo transgênicos.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-methylumbelliferone Sigma M1381 Standard: commonly used in flourimetric assays for determination of enzyme activity
4MU-GlcNAc2 Sigma M9763 fluorescent chitinase substrate for use in mouse samples
4MU-GlcNAc3 Sigma M5639 fluorescent chitinase substrate for use in human samples
Citric Acid-monohydrate for use in McIlvain Buffer
Glycine for use in Stop Buffer at a concentration of 0.3 M
Na2HPO4xH2O for use in McIlvain Buffer
NaOH for use in Stop Buffer at a concentration of 12 g/L
Vision Plate: Non-sterile, untreated black 96 well plate 4titude 4ti-0224

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Medição da atividade da quitinase em amostras biológicas
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Amick, A. K., Liu, Q., Gautam, S., Chupp, G., Dela Cruz, C. S., Sharma, L. Measurement of Chitinase Activity in Biological Samples. J. Vis. Exp. (150), e60159, doi:10.3791/60159 (2019).More

Amick, A. K., Liu, Q., Gautam, S., Chupp, G., Dela Cruz, C. S., Sharma, L. Measurement of Chitinase Activity in Biological Samples. J. Vis. Exp. (150), e60159, doi:10.3791/60159 (2019).

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