Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Biyolojik Örneklerde Konitinaz Aktivitesinin Ölçülmesi

doi: 10.3791/60159 Published: August 22, 2019
* These authors contributed equally

Summary

Burada bronkoalveolar lavaj veya serum gibi biyolojik sıvılarda kitinaz aktivitesini ölçmek için basit bir yöntemdir.

Abstract

Chitinases kitin cleave enzimleridir. Hatta kitin yokluğunda, memeliler bazada da dahil olmak üzere vücutta mevcut chitinases önemli miktarda var. Konitinazın kesin rolü bilinmemektedir, ancak sırasıyla kitin içeren gıda ve patojenlere karşı sindirim ve konak savunmaönemli bir rol oynadığına inanılmaktadır. Son çalışmalar, bizim de dahil olmak üzere, konak bağışıklık ve alerjik hastalıklarda konitinaz ve konitinaz benzeri proteinlerin önemli bir rol göstermiştir. Daha da önemlisi, kitinaz aktiviteleri astım ve pulmoner fibrozis gibi tip 2 inflamatuar hastalıklar da dahil olmak üzere çok çeşitli hastalıklarda hastalık şiddetinin önemli biyobelirteçleri olarak hizmet vermektedir. Benzer şekilde, Gaucher hastalığı gibi genetik bozuklukları olan hastalar önemli ölçüde yüksek kitinaz düzeyleri var, hangi sadece hastalığın şiddeti ile ilişkili değil, aynı zamanda terapötik etkinliği için güvenilir bir biyomarker olarak hizmet vermektedir. Burada özetlenen protokol, BAL veya fare lerin serum örneklerindeki kitinaz aktivitesini ölçmenin basit, hızlı ve basit bir yolunu açıklar ve enzimlerin yüksek derecede korunmuş doğası nedeniyle insan deneklere ve diğer model organizmalara yaygın olarak adapte edilebilir.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Chitin selüloz sonra yeryüzünde ikinci en bol polisakkarit, böceklerin dış iskelet ilerlerken dahil olmak üzere organizmaların çeşitli önemli bir yapısal bileşeni olarak hizmet vermektedir, mantarlar, maya, ve yosun; bazı omurgalılar da chitin1var. Chitinases kitin yıkmak yeteneğine sahip enzimler bir aile ve son derece bakterilerden memelilere kadar türlerde evrim boyunca korunur2,3. Chitinases ek olarak, memeliler de chitin bağlamak için yeteneklerini chitinases benzer ama onlar chitin cleave enzimatik yeteneği eksikliği farklı olan kitinaz benzeri proteinler var4.

Her ne kadar chitin ve chitinases uzun incelenmiş olsa da-1900'lerin başına kadar uzanan araştırmalar ile-ana odak böcekler ve diğer omurgasızlar rollerini olmuştur. Aslında, 1960'lara kadar omurgalıların chitinases olduğu tespit edildi. Chitobiare bazlı bir test kullanılarak, kitinazların kertenkeleler ve karakuşlar da dahil olmak üzere omurgalıların sindirim sisteminde bulunduğu gösterilmiştir— bu gözlem, böcekler gibi kitin içeren organizmaların tüketimine bağlı olduğu varsayımına yol açtı5 .

Memelilerin iki enzimatik aktif kromozom formu vardır: asidik memeli kitinaz (AMCase; chit2 ve CHIA olarak da bilinir) ve kitotriosidaz (CHIT1)4. Bu proteinlerin her ikisi de kitin hidrolize yeteneğine sahiptir. Ancak, CHIT1 insanlarda daha enzimatik olarak aktiftir, hemen hemen tüm kitinaz aktivitesi CHIT1 türetilmiştir. 4 Farelerde, hem Chit1 hem de AMCase neredeyse eşitgenel kitinaz aktivitesine katkıda 6. Öte yandan, kitinaz benzeri proteinlerde kitinaz aktivitesi yok.

Chit1 esas olarak makrofajlar tarafından salgılanır ve genellikle chitin içeren patojenlere karşı bağışıklık yanıtı olarak kabul edilir7. Enzim ayrıca substrat kitinvarlığıolmadan bile, hem M1 ve M2 makrofaj alt tipleri içine monositlerin olgunlaşmadahil olduğu gösterilmiştir 8 . Ayrıca, aynı zamanda T yardımcı tip 2 de dahil olmak üzere diğer bağışıklık hücrelerinin olgunlaşma dahil olabilir (Th2) hücreleri ve eozinofiller—kriptokok akciğerenfeksiyonu9 durumda olduğu gösterilmiştir . Bu çalışmalar bağışıklık sisteminde chitinases karmaşık bir rolüne işaret.

Son yıllarda, Chit1 düzeyleri lisozomal depolama hastalıkları, bulaşıcı hastalıklar, solunum yolu hastalıkları, endokrinolojik hastalıklar, kardiyovasküler dahil olmak üzere 40'tan fazla farklı insan hastalığı için ilerleme önemli bir biyomarker olarak hizmet bulunmuştur hastalıklar, nörolojik hastalıklar vediğerleri (gözden 10). Bu hastalıkların çoğunda, Chit1 düzeyleri hastalığın şiddeti ve terapötik etkinliğigüçlübir belirleyici 10 vardır.

Chitinases Gaucher Hastalığı da dahil olmak üzere çok sayıda tıbbi durumlar için bir biyomarker olarak ün kazanmıştır gibi, araçlar ve tahliller chitinaz varlığı için test kolaylaştırmak için geliştirilmiştir. Eski yöntemler arasında Schales'in prosedürü, kan şekeri testinden uyarlanmış bir protokol ve 3,5 dinitrosalislik asit (DNS) yöntemi sayılabilir. Ancak, bu yöntemler genellikle zaman duyarlı ve teknik olarak zor11. Bu testlerin her ikisi için de prosedür inorganik oksidanların azaltılmasını gerektirir, örneğin Schales prosedürü durumunda ferricyanide, sadece spektrofotometrik olarak ölçülebilen bir renk değişikliği üreten. Ayrıca, her iki test de zaman alıcı ve renk12geliştirmekiçin gerekli bir ısıtma veya kaynama adım içerir 13 .

Burada açıklanan memeli örneklerinde kitinaz düzeylerini belirlemek için hızlı ve basit bir florimetrik test14,15. Burada kullanılan örneklerden ikisi serum ve bronkoalveoler lavaj sıvıları (BAL); kitinaz aktivitesi de anne sütü ve idrar örneklerinde ölçüldü ve teknik bu tür örneklerde yanı sıra diğer biyolojik sıvı16,17yapılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Tüm hayvan işlemleri Yale Üniversitesi Tıp Fakültesi'nde IACUC onaylı bir protokol altında gerçekleştirildi.

1. Fare Örnek Toplama

  1. Anestezi
    1. Ketamin ve ksilazin kullanarak fareler anestezik (ketamin 100 mg / kg ve ksilazin 10 mg / kg).
  2. Kan örneği toplama
    1. Anestezinin derinliğini bir parmak ucuna yanıt vermeyen bir şekilde onaylayın.
    2. Cerrahi kalp ortaya çıkarmak için göğüs boşluğu açın.
    3. Sol ventriküle 26,5 G iğne yerleştirin ve şırınganın içine kan toplayın.
      NOT: Tipik olarak, yaklaşık 0.5-1 mL kan sağlıklı bir 20-25 g fareden hasat edilebilir.
    4. Plazma toplama için heparinize tüplerde veya serum toplama için heparinize olmayan tüplerde kan toplamak.
  3. Bronkoalveolar lavaj sıvısı (BAL)
    1. BAL toplamak için, nefes borusunu ortaya çıkarmak için boyunda dikey bir kesik yapın.
    2. 22 G kateter ile trakeayı kanüle getirin ve farenin burnundan sızmasını önlemek için bir ip kullanarak sıkıca sabitleyin.
    3. Yavaşça trakea yoluyla akciğerlere steril fosfat tamponlu salin iki aliquots enjekte (PBS, 0.75 mL her) ve geri almak.
    4. Havuz aliquots ve daha fazla analiz için buz üzerinde tutun.
  4. Biyolojik numuneleri işliyorum.
    1. Kan örneği: Ya taze (plazma) ya da 4 h (serum) için pıhtılaşmaya izin sonra, 10 dakika için 600 x g santrifüj. Supernatant alın ve depolama veya deneme için kullanmak için dondurun.
    2. BAL: Numuneyi 350 x g'de 5 dk santrifüj edin. Supernatant alın ve depolama veya deneme için kullanmak için dondurun.

2. Chitinase Assay

NOT: Titrenin arkasındaki bilim nispeten basittir. Floresan olmayan bir substrat enzimatik olarak aktif kitinaz tarafından bir floresan ürün üretmek için ayrılır, daha sonra kitinaz aktivitesinin dolaylı bir belirteci olarak ölçülür. Örneklerin içindeki chitinases substrat 4-methylumbelliferyl-D-N, N'-diasetylchitobiose 1x McIlvain tampon mevcut yıkmak. Bir floresan molekül 4-methylumbelliferyl serbest bırakılır. Her kuyunun toplam floresansını ölçerek, her numunedeki aktif kromozomun doğru bir ölçümlerini elde ediyoruz. Chitinin kitinaz tarafından bozulması hidrolitik bir reaksiyon olduğundan, durdurma tamponu, 0.3 M glisin ve NaOH karışımı (pH 10.6'da 12.0 g/L), enzimin çalışması için çok basit bir ortam oluşturarak kitin dökümünü sona erdirİr.

  1. Alt tabakaları, standartları ve çözümleri hazırlayın.
    1. McIlvain tamponhazırlayın. McIlvain Tampon u 5.2 pH 0.1 M sitrat ve 0.2 M fosfat oluşur. 1x McIlvain tampon için 1:1 oranında seyreltin.
    2. Her biri 500 μM'lik bir konsantrasyona kadar 1x McIlvain Tampon'da hem 4-metilumbelliferyl-D-N, N'-diasetilchitobiose hem de 4-metilumbellifßeryl-D-N, N', N"-triacetylchitotriose'u çözün.
      NOT: Stok çözeltisi daha fazla kullanım için -20 °C'de saklanabilir; en iyi aliquots saklanır.
    3. Standart eğri stok çözeltisini oluşturmak için standart, 4-metilumbelliferon,stop tamponunda 0,1 mM konsantrasyona (0,3 M glisin ve NaOH karışımı (pH 10,6'da 12,0 g/L)) çözün.
  2. Çalışma çözümlerini oluşturun ve plakalayın.
    1. 1x McIlvain Tampon ve chitin substrat 4-methylumbelliferyl-D-N, N'-diasetylchitobiose çalışma çözümü oluşturmak için birleştirin. Her 10 örnek için 100 μL substrat ile 2,17 mL 1x McIlvain tamponu karıştırın. Örnek boyutuna dayalı ek hesaplamalar için Tablo 1'e bakın.
      NOT: İnsan örnekleri için 4-metilumbelliferyl ß-D-N, N', N"-triacetylchitotriose kullanın. Her iki substrat insan veya fare enzimleri tarafından ayrılabilse de, dekolte 6'nın etkinliğinegöre insan veya fare örnekleri için atanmıştır.
    2. Pipet 95 μL çalışma çözeltisi 96 kuyuluk her kuyuya.
  3. Biyonumune örneklerini çalışma çözümüne ekleyin.
    1. Daha sonra, her kuyuya test örneğinin (kan/BAL/doku lysate/diğer biyolojik sıvı) 5 μL'sini ekleyin.
    2. En doğru ve güvenilir sonuçlar için numuneyi çalışma çözümüne karıştırın.
      NOT: Örnekler, potansiyel kenar efektlerine özel önem verilmelidir. Kenar etkisini en aza indirmek için tüm numuneler önceden ısıtılmalıdır. Titre, numunedeki kitinalar ile çalışma çözeltisindeki substrat arasında bir reaksiyon içerdiğinden, ilk numunenin kaplanması ile son numunenin kaplanması arasındaki zaman farkını en aza indirmek için nispeten hızlı bir şekilde çalışmak en iyisidir. Çok kanallı pipet önerilir.
  4. 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
    1. Plakayı kapatın ve kısa bir süre sallayın (5 s).
    2. Plakayı 37 °C'de 15 dk kuluçkaya yatırın. Bu enzimatik reaksiyon gerçekleşmesini sağlar.
  5. Standart eğriyi hazırlayın.
    1. Örnekler kuluçka yakarken, enzim aktivitesinin florimetrik tayininde sıklıkla kullanılan bir standart olan 4-metilumbelliferon seri seyreltme hazırlayın.
    2. Dur tamponundaki standart çözeltinin stoğunu 5 μM'lik bir konsantrasyona seyreltin.
    3. Tablo2'de belirtildiği gibi bir dizi seyreltme gerçekleştirin. Bileşenleri belirtilen miktarda ekleyin ve iyice karıştırın.
      NOT: Standart eğri, ölçülen örneklerin standart eğrinin doğrusal aralığında düşmesini sağlamaya yardımcı olur.
  6. Durdurma arabelleği ile reaksiyonu durdurun.
    1. Reaksiyonu durdurmak için her kuyuya 200 μL stop arabelleği ekleyin.
  7. Standartları plakalayın.
    1. Aynı plaka üzerindeki yinelemelere kuyu başına her standarttan 300 μL ekleyin.
  8. Florometrik okuyucu kullanarak plakayı okuyun.
    1. 360 nm uyarma ve 455 nm bir emisyon plaka okuyun.

3. Veri Analizi

  1. Boşlukları çıkarma
    1. 4-metilumbelliferon olmayan yinelenen standart seyreltmelerin ortalama değerleri. Bu değeri diğer kaydedilen değerlerin tümünden çıkarın.
  2. Teknik çoğaltmaların ortalamasını alın ve standartları çizin.
    1. Her konsantrasyon için ortalama iki okuma ve konsantrasyona göre ortalama okuma grafiği.
      NOT: Ortaya çıkan çizim doğrusal görünmeli ve 1'e yakın bir R2 değerine sahip olmalıdır. Yoksa, veri analizi kalitesini sağlamak için standartları yeniden yapmak ve plakayı yeniden okumak gerekebilir.
  3. Okuma değerlerini standartlaştırın.
    1. Çizilen standartlar verileri için en uygun çizgi oluşturun. Örneklerin okumalarını en uygun çizginin eğimine bölün.
  4. Kontrol grubundan ve değişken grubundaki değerleri karşılaştırın.
    1. Gruplar arasındaki farkın istatistiksel olarak anlamlı olup olmadığını belirlemek için ikiden fazla grup için bir t-testi veya ANOVA kullanın. Değerler nmol/mL·h birimlerini alacaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Burada gösterilen sonuçlar, yabani tip (C57BL/6) ve Chit1 transgenik farelerin (C57BL/6 arka planda) serum ve BAL örneklerinde (C57BL/6 arka planda) kitinaz aktivitesini ölçen ve Chit1 genini doksisiklin promotöründe aşırı eksprese eden bir çalışmadan elde edilebilmektedir. Verilerimiz hem serum hem de BAL örneklerinin bazal 698.2 ± 189.9 nmol/mL·h ve 485.7 ± 114 nmol/ml·h'de saptanabilir kitinaz aktivitesine sahip olduğunu göstermektedir. 4 hafta boyunca içme suyunda doksisiklin kullanılarak Chit1 geninin aşırı ekspresyonu hem BAL (4.575 ± 673.8 nmol/mL·h, p = 0.003) hem de serum 1556 ± 251.2 nmol/mL·h, p = 0.0272, taban çizgisiile karşılaştırıldığında gözlenen kitinaz aktivitesinin yükselmesi ile sonuçlandı. ) örnekleri.

Burada açıklanan protokolü kullanarak, taht farelerde Chit1 geninin aşırı ekspresyonunun artan kitinaz aktivitesine yol açtığını doğrular. İki grubun araçlarını karşılaştırmak için bir t-testi kullanıldı. Her grupta 5 fare bulunuyordu.

Figure 1
Şekil 1: Kitinaz aktivitesi. (A) serumve ( B) yabani tipbronkoalveolar lavaj sıvısı (WT) ve kitotriosidaz (ChitTg) aşırı ekspres transgenik farelerde kitinaz aktivitesi ölçüldü. Her nokta ayrı bir fare örneğini temsil eder. (C) Değerler protokolde açıklandığı gibi standart eğrinin doğrusallığı kullanılarak standartlaştırılmıştır. Floresan düzeyleri uyarma için 360 nm dalga boyunda bir plaka okuyucu ve emisyon için 455 nm ölçüldü ve AU olarak sunuldu. AU = rasgele birim *p < 0.05, ***p < 0.001. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Örnek Kuyu Sayısı Substrat (3L) McIlvain Tampon (mL)
20 100 2.17
50 250 5.425
100 500 10.85

Tablo 1: Çalışma çözümlerini oluşturmak için örnek hesaplamalar.

(μL) 1 2 3 4 5 6 7 8
Conc. (nM) 0 125 250 375 500 625 750 875
Standart 0 20 40 60 80 100 120 140
2x McIlvian 200 200 200 200 200 200 200 200
Distile H2O 200 180 160 140 120 100 80 60
Arabelleği Durdur 400 400 400 400 400 400 400 400

Tablo 2: Standart eğri ölçümleri için seyreltmeler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Kitinaz aktivitesi hastalığın şiddetini, hastalığın ilerlemesini, terapötik etkinliğini ve spesifik patojenlerin varlığını tahmin etmek için önemli bir biyobelirteç olarak ortaya çıkmıştır18. Chitinases rolü hakkında uzun postulated teorilerin çoğu deneysel olarak kanıtlanmamıştır rağmen19, Yeni çalışmalar çeşitli hastalıklarda proteinler gibi chitinases ve kitinaz rolü içine önemli bilgiler sağlamıştır2, 9,20.

Burada açıklanan protokol biyolojik numunelerde kitinaz aktivitesini ölçmek için basit, hızlı ve etkili bir yoldur. Chitinases'in yüksek korunmuş doğası nedeniyle çok çeşitli biyolojik numune ve türlerde kitinaz aktivitesini ölçmek için çok az değişiklik yapılması gerekmez. Bu protokolde listelenen iki alt tabaka, biri fare örnekleri için, diğeri insan örnekleri için belirlenmiş; ancak, her iki substrat da her iki türde de kullanılabilir, çünkü önceki kağıtların enzimlerin substratı katabilecekleri verimlilik gösterilerine dayanarak bu şekilde belirlenmiştir.

Schales prosedürü ve DNS yöntemi gibi daha önce var olan tekniklerle karşılaştırıldığında, burada özetlenen analiz, eski yöntemlerde gerekli olan kaynama veya ısıtma gibi zaman yoğun adımlara duyulan ihtiyacı ortadan kaldırır. Ayrıca, tsurc teknik olarak daha az zordur ve önceki ölçüm tekniklerine göre daha az karmaşık adımlar gerektirir. En iyi sonuçlar için hem biyolojik hem de teknik kopyalar kullanılmalıdır.

Eğer kitinaz aktivitesi çok yüksekse, biyolojik numunenin seyreltmeleri ölçüm için kitinaz aktivitesini azaltmak için yeterlidir ve gerçek değerler seyreltme esas alınabilmek için hesaplanabilir. Yeni biyolojik numuneler üzerinde bu deneyicra ederken, en iyi sonuçlar için uygun bir kuluçka süresi sağlamak için doygunluğa kadar zaman içinde aynı plaka üzerinde tekrar ölçümleri yapmak yararlı olabilir. Ayrıca, gruplar arasındaki tutarlılık devam ettiği sürece protokol yukarı veya aşağı ölçeklendirilebilir. Araştırma sadece hastalıkların bir dizi kitinaz aktivitesi rolü toplanmaktadır gibi bu protokolün gelecekteki uygulamaları çok ulaşmaktadır.

Chitinaz aktivitesinin ilgili olduğu tespit edilen hastalıkların ilk kategorilerinden biri Gaucher hastalığı, Niemann-Pick A/B ve C, GM-1 gangliosidosis vediğerleri 21 gibi kemikozomal depolama hastalıklarıydı. Gaucher hastalığı glucocerebrosidase yetersiz aktivitesi nedeniyle bir lisozomal depolama hastalığıdır ve glucosylceramide birikimi ile karakterizedir, glucocerebrosidase substrat, makrofajların lizozom15. Bu genetik bir hastalıktır, dalak ve karaciğer büyütme, düşük trombosit sayısı, anemi,yorgunluk ve kemik sorunları 22 dahil klinik belirtileri ile . Klinik araştırmalar, Gaucher hastalığından muzdarip insanların çoğunun normal kontrol gönüllülerinin medyan değerinin 600 katından fazla bir ortanca koninaz aktivitesine sahip olduğunu göstermiştir; ayrıca, Gaucher hastalığı olan kişiler enzim takviyesi tedavisi konulduğunda-hastalığın mevcut tedavisi-onların kitinaz aktivite düzeyleri önemli ölçüde her iki hastalığın mükemmel bir belirteç olarak konan kitinaz aktivitesi ödünç düştü progresyon ve tedavi takibi15. Ancak hastalıkta Chit1 için henüz bir rol bulunamadı. Benzer araştırmalar çok sayıda diğer lysozomal depolama hastalıkları için Chit1 aktivite izleme yol açmıştır10.

Ayrıca, daha fazla araştırma mantar enfeksiyonu, sıtma, tüberküloz ve K. pnömoni birkaç2,3,10 isim dahil olmak üzere çeşitli patojen enfeksiyon sırasında Chit1 aktivitesi için potansiyel bir rol göstermiştir . 2012 yılında yapılan bir çalışmada, aktif tüberküloz (TB) enfeksiyonu olan hastalarda, balgam yayma negatif olsa bile, kitinaz aktivitesinin tüberküloz tanısında etkili bir biyomarker olarak kullanılabileceğini gösteren bir çalışma, özellikle genellikle doğru hastalık tanısı için gerekli olan uzun bekleme süresi23. Benzer bulgular Plasmodium falciparum enfeksiyonu sırasında görüldü, akut enfeksiyonlularda chitotriosidaz serum düzeyleri anlamlı olarak artmıştır24. Bu hastalıkların birçoğunun teşhisi günler sürse de, kandaki konitinaz aktivite düzeylerinin hızlı ölçümleri tanıda yararlı bilgiler sağlayabilir. Ayrıca, sıtma parazitleri ve tüberküloz bakterisi tedavilere karşı giderek daha dirençli hale geldikçe, serumdaki kitinaz aktivite düzeylerinin ölçülmesi, gerçek zamanlı olarak etkinliğinin izlenmesine yardımcı olabilir.

Daha fazla araştırma bağışıklık yanıtı, inflamatuar yollar özellikle rolü konitinaz ve kitinaz benzeri proteinlerin rolü üzerinde odaklanmaya başlamıştır. Bu araştırma devam ettikçe, bu protokol daha fazla araştırma için bu kitinaz aktivitesinin hızlı ve doğru ölçüm için izin verecektir. Protokol, fare ve insan dahil olmak üzere herhangi bir sayıdaki tür numunesi için kolayca ayarlanır ve bu da yaygın olarak uygulanabilir hale gelir.

Araştırma yararına ek olarak, örneklerdeki kitinaz aktivitesini saptamak ve ölçmek için daha iyi yöntemler klinik alanda yararlı olacaktır. Son araştırmalar Gaucher hastalığı, diabetes mellitus, sarkoidoz, ateroskleroz, inflamatuar barsak hastalığı ve kanserler de dahil olmak üzere çok sayıda kronik hastalıkların patolojisinde bir biyomarker olarak chitinaz rolünü göstermiştir3, 21,25,26.

Bir biyomarker olarak bu rolü nedeniyle, burada gösterildiği gibi konitinaz aktivitesinin hızlı ve doğru ölçümü inanılmaz tıp alanında ilgili, sağlık sağlayıcıları uygun bir tanı ve tedavi planı için daha fazla bilgiye sahip izin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Hiçbiri.

Acknowledgments

Bu araştırma Amerikan Akciğer Derneği ve Amerikan Toraks Derneği ls ödülleri tarafından desteklenmiştir. Yazarlar içtenlikle Transgenik fare suşları sağlamak için Dr Jack Elias ve Dr Chun Geun Lee teşekkür etmek istiyorum.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-methylumbelliferone Sigma M1381 Standard: commonly used in flourimetric assays for determination of enzyme activity
4MU-GlcNAc2 Sigma M9763 fluorescent chitinase substrate for use in mouse samples
4MU-GlcNAc3 Sigma M5639 fluorescent chitinase substrate for use in human samples
Citric Acid-monohydrate for use in McIlvain Buffer
Glycine for use in Stop Buffer at a concentration of 0.3 M
Na2HPO4xH2O for use in McIlvain Buffer
NaOH for use in Stop Buffer at a concentration of 12 g/L
Vision Plate: Non-sterile, untreated black 96 well plate 4titude 4ti-0224

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hamid, R., Khan, M. A., Ahmad, M. Chitinases: An update. Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 5, (1), 21-29 (2013).
  2. Sharma, L., et al. Regulation and Role of Chitotriosidase during Lung Infection with Klebsiella pneumoniae. Journal of Immunology. 201, (2), 615-626 (2018).
  3. Kanneganti, M., Kamba, A., Mizoguchi, E. Role of chitotriosidase (chitinase 1) under normal and disease conditions. Journal of Epithelial Biology & Pharmacology. 5, Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3579558/ 1-9 (2012).
  4. Lee, C. G., et al. Role of Chitin and Chitinase/Chitinase-Like Proteins in Inflammation, Tissue Remodeling, and Injury. Annual Review of Physiology. (73), 479-501 (2011).
  5. Jeuniaux, C. Chitinase: An Addition to the List of Hydrolases in the Digestive Tract of Vertebrates. Nature. 192, (4798), 135-136 (1961).
  6. Boot, R. G., et al. Identification of a Novel Acidic Mammalian Chitinase Distinct from Chitotriosidase. Journal of Biological Chemistry. 276, (9), 6770-6778 (2000).
  7. Arndt, S., Hobbs, A., Sinclaire, I., Lane, A. B. Chitotriosidase Deficiency: A Mutation Update in an African Population. JIMD Reports. 10, 11-16 (2013).
  8. Di Rosa, M., Malaguarnera, G., De Gregorio, C., Drago, F., Malaguarnera, L. Evaluation of CHI3L-1 and CHIT-1 Expression in Differentiated and Polarized Macrophages. Inflammation. 36, (2), 482-492 (2013).
  9. Wiesner, D. L., et al. Chitin Recognition via Chitotriosidase Promotes Pathologic Type-2 Helper T Cell Responses to Cryptococcal Infection. PLOS Pathogens. 11, (3), e1004701 (2015).
  10. Elmonem, M. A., vanden Heuvel, L. P., Levtchenko, E. N. Immunomodulatory Effects of Chitotriosidase Enzyme. Enzyme Research. 2016, 1-9 (2016).
  11. Ferrari, A. R., Gaber, Y., Fraaije, M. W. A fast, sensitive and easy colorimetric assay for chitinase and cellulase activity detection. Biotechnol Biofuels. 7, (37), 1-8 (2014).
  12. Schales, O., Schales, S. S. Simple method for the determination of glucose in blood. Proc Am Fed Clin Res. 2, Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20275623 78 (1945).
  13. Zarei, M., et al. Characterization of Chitinase with Antifungal Activity from a Native Serratia Marcescens B4A. Brazilian Journal of Microbiology. 42, (297), 1017-1029 (2011).
  14. Zhu, Z., et al. Acidic Mammalian Chitinase in Asthmatic Th2 Inflammation and IL-13 Pathway Activation. Science. 304, (5677), 1678-1682 (2004).
  15. Hollak, C. E., van Weely, S., van Oers, M. H., Aerts, J. M. Marked elevation of plasma chitotriosidase activity. A novel hallmark of Gaucher disease. Journal of Clinical Investigation. 93, (3), 1288-1292 (1994).
  16. Musumeci, M., Malaguarnera, L., Simpore, J., Barone, R., Whalen, M., Musumeci, S. Chitotriosidase activity in colostrum from African and Caucasian women. Clinical Chemistry and Laboratory. 43, (2), 198-201 (2005).
  17. Maddens, B., et al. Chitinase-like Proteins are Candidate Biomarkers for Sepsis-induced Acute Kidney Injury. Mol Cell Proteomics. 11, 1-13 (2012).
  18. Hector, A., et al. Chitinase activation in patients with fungus-associated cystic fibrosis lung disease. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 138, (4), 1183-1189 (2016).
  19. Hall, A. J., Morroll, S., Tighe, P., Götz, F., Falcone, F. H. Human chitotriosidase is expressed in the eye and lacrimal gland and has an antimicrobial spectrum different from lysozyme. Microbes and Infection. 10, (1), 69-78 (2008).
  20. Kim, L. K., et al. AMCase is a crucial regulator of type 2 immune responses to inhaled house dust mites. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, (22), e2891-e2899 (2015).
  21. Olkhovych, N. V. Chitotriosidase activity as additional biomarker in the diagnosis of lysosomal storage diseases. Ukrainian Biochemical Journal. 88, (1), 69-78 (2016).
  22. Bouayadi, O., et al. Disease: An Underdiagnosed Pathology in the Eastern Moroccan Population. eJIFCC. 30, (1), 82-87 (2019).
  23. Tasci, C., et al. Efficacy of serum chitotriosidase activity in early treatment of patients with active tuberculosis and a negative sputum smear. Therapeutics and Clinical Risk Management. 8, 369-372 (2012).
  24. Barone, R., Simporé, J., Malaguarnera, L., Pignatelli, S., Musumeci, S. Plasma chitotriosidase activity in acute Plasmodium falciparum malaria. Clinica Chimica Acta. 331, (1-2), 79-85 (2003).
  25. Kitamoto, S., et al. Chitinase inhibition promotes atherosclerosis in hyperlipidemic mice. American Journal of Pathology. 183, (1), 313-325 (2013).
  26. Kzhyshkowska, J., Gratchev, A., Goerdt, S. Human Chitinases and Chitinase-Like Proteins as Indicators for Infl Ammation and Cancer. Biomark Insights. 2, 128-146 (2007).
Biyolojik Örneklerde Konitinaz Aktivitesinin Ölçülmesi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Amick, A. K., Liu, Q., Gautam, S., Chupp, G., Dela Cruz, C. S., Sharma, L. Measurement of Chitinase Activity in Biological Samples. J. Vis. Exp. (150), e60159, doi:10.3791/60159 (2019).More

Amick, A. K., Liu, Q., Gautam, S., Chupp, G., Dela Cruz, C. S., Sharma, L. Measurement of Chitinase Activity in Biological Samples. J. Vis. Exp. (150), e60159, doi:10.3791/60159 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter