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Developmental Biology

विवो में मैक्रोफेज भर्ती के परीक्षण के लिए एक एटोपिक चेमोकिन अभिव्यक्ति मॉडल

Published: September 25, 2019 doi: 10.3791/60161
Automatic Translation
1, 1, 2
1Department of Developmental Biology, School of Basic Medical Sciences, Southern Medical University, 2Division of Cell, Developmental and Integrative Biology, School of Medicine, South China University of Technology

Summary

विवो में मैक्रोफेज भर्ती पर एक chemokine के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए, situ संकरीकरण में पूरे माउंट chemokine के अस्थानिक अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया था, और इम्यूनोस्टिपिंग मैक्रोफेज लेबल करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। मैक्रोफेज प्रवास के वास्तविक समय अवलोकन के लिए लाइव इमेजिंग का उपयोग किया गया था।

Abstract

ज़ेब्राफ़िश व्यापक रूप से बुनियादी और जैव चिकित्सा अनुसंधान में उपयोग किया जाता है। कई ज़ेब्राफ़िश ट्रांसजेनिक लाइनों वर्तमान में कोशिकाओं के विभिन्न प्रकार के लेबल के लिए उपलब्ध हैं. जेब्राफ़िश के पारदर्शी भ्रूण ीय शरीर के कारण, विवो में एक निश्चित प्रकार की कोशिकाओं के व्यवहार पर एक कीमोकीन के प्रभाव का अध्ययन करना हमारे लिए सुविधाजनक है। यहाँ हम vivo में मैक्रोफेज प्रवास पर एक chemokine के समारोह की जांच करने के लिए एक कार्यप्रवाह प्रदान की है. हमने आईएल-34 को अधिक एक्स्प्रेस करने के लिए एक ऊतक-विशिष्ट ओवरएक्सप्रेशन प्लाज्मिड का निर्माण किया और एक-सेल चरण ट्रांसजेनिक मछली भ्रूण में प्लाज्मिड को इंजेक्ट किया, जिनके मैक्रोफेज को विशेष रूप से फ्लोरोसेंट प्रोटीन द्वारा लेबल किया गया था। हम तो situ संकरीकरण और इम्यूनोस्टेनिंग में पूरे माउंट फ्लोरोसेंट का इस्तेमाल किया chemokine अभिव्यक्ति के पैटर्न और संख्या या मैक्रोफेज के स्थान का पता लगाने के लिए. इंजेक्शन WT भ्रूण एक स्थिर ट्रांसजेनिक लाइन उत्पन्न करने के लिए उठाया गया था. अंत में, हम confocal लाइव इमेजिंग का इस्तेमाल किया सीधे स्थिर ट्रांसजेनिक मछली में मैक्रोफेज व्यवहार का निरीक्षण करने के लिए vivo में मैक्रोफेज पर आईएल-34 के समारोह का अध्ययन.

Introduction

ज़ेब्राफ़िश भारत में उत्पन्न होने वाली एक छोटी उष्णकटिबंधीय हार्ड-हड्डियों की मीठे पानी की मछली है। जीन संरक्षण के संबंध में, जेब्राफ़िश मानव1के लिए 87% की समानता है। यह हमें जीन विनियमन, प्रोटीन समारोह और इस तरह के प्रवास के रूप में सेल व्यवहार का अध्ययन करके मानव से संबंधित विषयों पर अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं, प्रसार et.al ज़ेब्राफ़िश में. ज़ेब्राफ़िश भ्रूण वर्णक को रोकने के बाद विभिन्न चरणों में प्रारंभिक भ्रूण के विकास का निरीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस बीच, यह यौन परिपक्वता में विकसित करने के लिए जेब्राफ़िश के लिए केवल तीन महीने लगते हैं, तो जेब्राफ़िश हर 4 दिनों में अंडे के सैकड़ों का उत्पादन कर सकते हैं। मिनी आकार, सरल प्रजनन, मजबूत प्रजनन क्षमता, इन लाभों ज़ेब्राफ़िश संस्कृति बहुत अंतरिक्ष की बचत, बड़े पैमाने पर संस्कृति के लिए अनुकूल बनाते हैं। पारंपरिक स्तनधारी मॉडल माउस ज़ेब्राफ़िश की तुलना में एक उच्च रखरखाव लागत है, इसलिए माउस उठाने के पैमाने को सीमित. प्रारंभिक भ्रूण के विकास के पहलू में, माँ के गर्भ में माउस भ्रूण विकास की विशेषताओं के कारण माउस भ्रूण को लाइव स्थिति में देखना मुश्किल है। इसके विपरीत, जेब्राफिश भ्रूण बाह्य रूप से विकसित होते हैं और पारदर्शी होते हैं, इसलिए उन्हें सूक्ष्मदर्शी के नीचे देखना आसान होता है। इसके अलावा, ज़ेब्राफ़िश संबंधित जीन समारोह अनुसंधान के लिए ट्रांसजेनिक लाइनों की एक किस्म का निर्माण करने के लिए बहुत आसान है। वर्तमान में, विभिन्न ज़ेब्राफ़िश ट्रांसजेनिक लाइनें विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं को लेबल करने के लिए उपलब्ध हैं। यह विशिष्ट स्थानों में chemokines overexpress करने के लिए ट्रांसजेनिक लाइनों का निर्माण और ज़ेब्राफ़िश में सेल व्यवहार पर chemokines समारोह का अध्ययन करने के लिए अब बहुत सुविधाजनक है।

यहाँ, हमने विवो2,3,4,5,6,7में मैक्रोफेज व्यवहार पर आईएल-34 के कार्य की जांच करने के लिए जेब्राफ़िश ट्रांसजेनिक लाइन का उपयोग करने के लिए एक कार्यप्रवाह प्रदान किया . सबसे पहले, हम जीन il34 के एक जिगर विशिष्ट overexpression प्लाज्मिड का निर्माण किया और एक सेल चरण Tg (mpeg1: GFP) मछली भ्रूण जो विशेष रूप से फ्लोरोसेंट प्रोटीन GFP द्वारा मैक्रोफेज लेबल में प्लाज्मिड इंजेक्शन. फिर, हम il34 अभिव्यक्ति के पैटर्न और संख्या या मैक्रोफेज के स्थान का पता लगाने के लिए situ संकरीकरण और इम्यूनोस्टेनिंग में पूरे माउंट फ्लोरोसेंट का इस्तेमाल किया। इंजेक्शन WT भ्रूण एक स्थिर ट्रांसजेनिक लाइन उत्पन्न करने के लिए उठाया गया था. इन चरणों में, हमने साइटोकिन-उत्पादक लाइन की स्थापना की और उसे मान्य किया और मैक्रोफेज वितरण पर देखे जा सकने वाले प्रभावों का दृष्टिसे मूल्यांकन किया. अंत में, साइटोकाइन के प्रत्युत्तर में मैक्रोफेज व्यवहार की जांच करने के लिए, हमने विवो में मैक्रोफेज प्रवास पर il34 के कार्य की पुष्टि करने के लिए सीधे मैक्रोफेज माइग्रेशन का निरीक्षण करने के लिए confocal लाइव इमेजिंग का उपयोग किया।

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Protocol

नोट: सभी नमूनों का इलाज पिगमेंट को रोकने के लिए फिनिलथियोरिया (पीटीयू) अंडे के पानी से किया गया।

1. Tg की पीढ़ी (fabp10a:il34) ट्रांसजेनिक निर्माण और मछली इंजेक्शन

  1. clone 2.8 kb fabp10a प्रमोटर8 और आईएल-34 कोडिंग क्षेत्रों (ENSDART00000126460.3) pTol2 वेक्टर में pTol2 वेक्टर में fabp 10a-il34 निर्माण उत्पन्न करने के लिए। एक-सेल चरण Tg (mpeg1: GFP) और WT मछली भ्रूण transposase MRNA के साथ एक साथ में निर्माण इंजेक्शन. fabp10a-il34 वयस्क9 के लिए WT भ्रूण इंजेक्शन उठाएँ और situ संकरीकरण द्वारा ट्रांसजेनिक संस्थापक की पहचान.
    नोट: अन्य ट्रांसजेनिक लाइन एक ही transposon प्रणाली के साथ किया जाता है, तो एक और ट्रांसजेनिक में सीधे निर्माण Tol2 के इंजेक्शन समस्याग्रस्त हो सकता है। एक सामान्य अभ्यास के लिए एक स्वतंत्र ट्रांसजेनिक लाइन बनाने के लिए और बाद में एक और रिपोर्टर लाइन के साथ नई लाइन पार होगा. यह सुनिश्चित करता है कि वहाँ एक पहले से डाला transgene पर नए transgenesis का कोई प्रभाव नहीं होगा.

2. फ्लोरिसेंट पूरे माउंट में सीटू हाइब्रिडाइजेशन (WISH) इम्यूनोस्टेनिंग के साथ गठबंधन

  1. नमूना निर्धारण
    1. क्षणिक इंजेक्शन या स्थिर आईएल-34 ट्रांसजेनिक लाइन जो वांछित चरणों में Tg (mpeg1: GFP) के साथ पार के भ्रूण ले लीजिए।
      नोट: इस मामले के लिए, भ्रूण 4 डी पोस्ट निषेचन (dpf) पर एकत्र किए गए थे। (यदि आवश्यक हो) सिरिंज द्वारा कोरियोन को हटा दें।
    2. कमरे के तापमान (आरटी) (लगभग 25 डिग्री सेल्सियस) पर रात भर 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड (पीएफए) के साथ भ्रूण को ठीक करें।
    3. फॉस्फेट बफर नमकीन प्लस ट्वीन 20 (PBST) 3x 5 मिनट के साथ भ्रूण धो लें।
    4. पीबीएसटी में 50% मेथनॉल (50% मेथनॉल/पीबीएसटी) और 100% मेथनॉल, 1x 5 मिनट प्रत्येक के साथ भ्रूण को अलग से निर्जलीकरण। फिर, ताजा 100% मेथनॉल में परिवर्तन और -20 डिग्री सेल्सियस (कम से कम 2 ज) पर स्टोर।
      नोट: प्रोटोकॉल यहाँ रोका जा सकता है।
  2. जांच संकरीकरण (दिन मैं)
    1. PBST में 50% मेथनॉल (50% मेथनॉल/PBST) के साथ पिछले चरणों में भ्रूण को फिर से हाइड्रेट करें, फिर PBST 3x 5 मिनट के साथ धोएं।
    2. आरटी पर पीबीएसटी में प्रोटीन के साथ भ्रूण को डाइजेस्ट (अंतिम सांद्रता: 10 डिग्री ग्राम/एमएल; पीबीएसटी में 1:2000)।
      नोट: पाचन समय भ्रूण चरण पर निर्भर करता है: कम से कम 36 एच निषेचन (hpf), कोई ज़रूरत नहीं है; 36 hpf-2 dpf भ्रूण, 3-5 मिनट; 2-3 dpf भ्रूण, 10 मिनट; 3-4 डीपीएफ भ्रूण, 15 मिनट; 4-5 dpf भ्रूण, 15-20 मिनट; 5-6 dpf भ्रूण, 20-27 मिनट; 6 डीपीएफ भ्रूण, आरटी (लगभग 25 डिग्री सेल्सियस) पर 25-30 मिनट।
    3. पाचन समाधान को छोड़ दें और 4% पीएफए के साथ फिर से निर्धारण करें, आरटी में 20 मिनट के लिए।
    4. PBST 2x 10 मिनट के साथ भ्रूण धो लें.
    5. PBST छोड़ें, 5 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर गर्म संकरीकरण बफर (एचबी बफर) के साथ पूर्व-हाइब्रिडेशन प्रदर्शन, मूल ट्यूब में एचबी बफर रीसायकल।
    6. कम से कम 1 डिग्री सेल्सियस पर नए गर्म एचबी बफर के साथ पूर्व-हाइब्रिडाइजेशन करें।
    7. पूर्व हीजांच9 (इस मामले के लिए एक il34 जांच, 1 ng/mL) 65 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 10 मिनट था. फिर मूल ट्यूब में एचबी बफर रीसायकल. 65 डिग्री सेल्सियस पर रात भर पूर्व गर्म जांच के साथ संकरीकरण प्रदर्शन करते हैं।
  3. एंटीबॉडी उपचार (दिन द्वितीय)
    1. 50% फार्मामिड/2x लवण सोडियम साइट्रेट प्लस ट्वेन 20 (एसएससीटी), 2x एसएससीटी, 0.2x एसएससीटी को 65 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करें।
    2. मूल ट्यूब में जांच रीसायकल और -20 डिग्री सेल्सियस पर जांच की दुकान.
    3. भ्रूण को 50% formamide/2x SSCT के साथ अलग से धो लें; 2x SSCT; 0.2x SSCT, 3x 20 मिनट या 2x 30 मिनट प्रत्येक 65 डिग्री सेल्सियस पर.
    4. PBST 3x 5 मिनट के साथ भ्रूण धो लें.
    5. बफर अवरुद्ध के 600 जेडएल के साथ नमूने ब्लॉक (5% फ़िल्टर ्ड भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) PBST में 1 एच के लिए आरटी.
    6. एंटी-डिगोक्सीजेनिन-एचआरपी एंटीबॉडी समाधान (1:1,000-1:2,000 बफर को अवरुद्ध करने में) के 400 $L जोड़ें और भ्रूणों को रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। यदि संकेत कमजोर हैं, एंटीबॉडी के 1:500 कमजोर पड़ने का उपयोग करें.
  4. रंग और प्राथमिक एंटीबॉडी इनक्यूबेटिंग (दिन III)
    1. एंटीबॉडी निकालें; पीबीएसटी के साथ भ्रूण धोने, आरटी पर 6x 20 मिनट.
    2. आरटी में 5 मिनट के लिए 1x प्लस amplification Diluent के 30 $L के साथ नमूना कुल्ला.
    3. बाहर पाइपिंग द्वारा diluent छोड़ ें; तनु Fluorophore Tyramide स्टॉक समाधान (Cyanine 3 प्लस एम्प्लायफिकेशन Reagent (Cyanine 5 प्लस एम्प्लायीकरण Reagent (Cy5), इस मामले के लिए Cy3 इस्तेमाल किया गया था के लिए) 1:50 में 1x प्लस एम्प्लायफिकेशन Diluent करने के लिए Fluorophore Tyraamid कार्य समाधान बनाने के लिए. प्रत्येक नमूने के लिए कार्य समाधान के 50-100 $L तैयार करें।
    4. आरटी में अंधेरे में 5-15 मिनट के लिए फ्लोरोफोर टायरामाइड वर्किंग सोल्यूशन में नमूने को इनक्यूबेट करें। यदि सिग्नल कमजोर हैं, तो ऊष्मायन समय को 30 मिनट तक बढ़ाएं।
    5. PBST के साथ कार्य समाधान बदलकर प्रतिक्रिया बंद करो और संकेतों की जांच.
    6. आरटी में PBST 3x 10 मिनट के साथ भ्रूण धो लें।
    7. रात में 4 डिग्री सेल्सियस पर प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ नमूना इनक्यूबेट करें। इस मामले के लिए, प्राथमिक एंटीबॉडी के रूप में बकरी विरोधी GFP एंटीबॉडी का उपयोग करें.
  5. माध्यमिक एंटीबॉडी धुंधला (दिन चतुर्थ)
    1. 4x 30 मिनट के लिए PBST के साथ भ्रूण धो लें.
    2. रात में 4 डिग्री सेल्सियस पर माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ भ्रूण को इनक्यूबेट करें। इस मामले के लिए, एलेक्सा 488-एंटी-गोट एंटीबॉडी माध्यमिक एंटीबॉडी के रूप में उपयोग करें।
  6. तस्वीरें ले लो (दिन वी)
    1. आरटी में PBST 3x 10 मिनट के साथ भ्रूण धो लें।
    2. भ्रूणों को 70% ग्लिसरोल को रात में 4 डिग्री सेल्सियस या -20 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में स्टोर करें।

3. लाइव इमेजिंग

  1. नमूना चयन
    नोट:     सीधे Tg के मैक्रोफेज का निरीक्षण करने के लिए लाइव छवि का उपयोग करें (fabp10a: il34; fabp10a: DsRed; mpeg1: GFP) मछली आईएल-34 प्रेरण के तहत जिगर में 3-3.5 dpf के दौरान माइग्रेट होगा। यहाँ Tg (fabp10a-DsRed) ट्रांसजेनिक लाइन जिगर क्षेत्र लेबल और यह दिखाई बनाने के लिए प्रयोग किया जाता है, जिगर के स्थानीयकरण की सुविधा के लिए और निर्धारित करने के लिए कि क्या मैक्रोफेज जिगर में स्थानांतरित. इमेजिंग से पहले, DsRed और GFP डबल सकारात्मक भ्रूण का चयन करने के लिए एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग करें।
  2. मछली बढ़ते
    1. एक धातु स्नान का उपयोग करने के लिए गर्मी 1% कम पिघलने agarose के ऊपर 90 डिग्री सेल्सियस करने के लिए पूरी तरह से इसे पिघला.
    2. कम पिघलने के बाद agarose शरीर के तापमान को ठंडा किया जाता है, 0.2% tricaine के 50 $L जोड़ने के लिए, और समान रूप से agarose के साथ tricaine मिश्रण.
    3. नीचे एक कवर स्लाइड के साथ घुड़सवार एक छोटे से पकवान के लिए एनेस्थेटाइज्ड भ्रूण ले जाएँ, आसपास के पानी को हटा दें, धीरे-धीरे भ्रूण पर कम पिघलने agarose ड्रॉप, ध्यान से पहले agarose ठोस है मछली की स्थिति सेट, जिगर क्षेत्र के करीब रखने के लिए पकवान के तल पर कवर स्लाइड.
    4. कम पिघलने के बाद agarose ठोस है, ध्यान से इसे मजबूत करने के लिए agarose की एक और परत के साथ कवर.
    5. confocal माइक्रोस्कोप वाहक मेज पर पकवान प्लेस, tricaine के साथ E2 समाधान10 के साथ मछली को कवर और इमेजिंग शुरू करते हैं.
  3. confocal माइक्रोस्कोप के सॉफ्टवेयर आपरेशन
    1. ज़ेन काले 2.3 सॉफ्टवेयर खोलें, माइक्रोस्कोप वाहक तालिका पर रहने वाले सेल workbench स्थापित करें.
    2. पता लगाएँ क्लिक करें | इनक्यूबेशन | तापमान 29 डिग्री सेल्सियस तक सेट करने के लिए।
    3. रहने वाले सेल workbench के केंद्र में पकवान प्लेस, tricaine के साथ E2 समाधान10 के साथ मछली को कवर.
    4. अधिग्रहण मेनू पर क्लिक करें, स्मार्ट सेटअप मेनू में आवश्यक स्कैन मोड और लेज़रों का चयन करें, फिर $-स्टैक और स्थितिका चयन करें।
    5. प्रयोग डिज़ाइनर मेनू पर क्लिक करें, कम आवर्धन के अंतर्गत नमूना ढूँढने के लिए पहले ब्लॉक में बहु ब्लॉक प्रयोग सक्षमकरें का चयन करें, फिर उच्च आवर्धन पर स्विच करें, दृश्य फ़ील्ड के मध्य में देखे गए क्षेत्र को दें.
    6. स्थिति और जेड-स्टैक जानकारी सेट करें, उपयुक्त लेजर तीव्रता का चयन करें, परतों और इमेजिंग गति स्कैनिंग।
    7. एक नया ब्लॉक बनाएँ और ऊपर दिए गए चरणों को दोहराएँ. सभी ब्लाकों की स्थापना के बाद, छोरों की उचित संख्या सेट और रिकॉर्डिंग शुरू (चित्र 1) .

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Representative Results

जेब्राफिश के प्रोटोकॉल में शामिल कदमचित्र 2में दर्शाए गए हैं। सबसे पहले, हम pBLK-fabp10a-il34-sv40 निर्माण जिसमें il34 fabp10a प्रमोटर द्वारा संचालित किया गया था उत्पन्न (चित्र 2). निर्माण एक सेल चरण Tg में microinsed किया गया था(mpeg1: GFP) ज़ेब्राफ़िश भ्रूण जो GFP और WT भ्रूण जो वयस्कों के लिए उठाया गया ट्रांसजेनिक स्थिर लाइन उत्पन्न करने के लिए के साथ मैक्रोफेज लेबल कर सकते हैं (चित्र 2). आईएल34 की अभिव्यक्ति का विश्लेषण सीटू संकरण में पूरे माउंट फ्लोरोसेंट द्वारा किया गया था (चित्र 2 और चित्र 3)। जीएफपी द्वारा लेबल किए गए मैक्रोफेज का प्रतिकता द्वारा विश्लेषण किया गया (चित्र 2 तथा चित्र 3)। हमने लाइव इमेजिंग का उपयोग सीधे यह देखने के लिए किया कि क्या मैक्रोफेज 3-3-5 डीपीएफ के दौरान आईएल34 प्रेरण के तहत यकृत में स्थानांतरित हो जाएंगे (चित्र 2, चित्र 2, अनुपूरक मूवी 1 और अनुपूरक मूवी 2) .

Figure 1
चित्र 1: confocal माइक्रोस्कोप लाइव इमेजिंग के सॉफ्टवेयर आपरेशन. ज़ेन काले 2.3 सॉफ्टवेयर खोलें, माइक्रोस्कोप वाहक तालिका पर रहने वाले सेल workbench स्थापित करें, तो पता लगाएँ (एक) पर क्लिक करें | इनक्यूबेशन | तापमान (ठ) तापमान को 29 डिग्री सेल्सियस तक सेट करने के लिए। रहने वाले सेल workbench के केंद्र में पकवान प्लेस, tricaine के साथ E2 समाधान10 के साथ मछली को कवर. इन सब के बाद, अधिग्रहण (सी) मेनू पर क्लिक करें, स्मार्ट सेटअप (डी) मेनू में आवश्यक स्कैन मोड और लेज़रों का चयन करें, तो का चयन करें $-स्टैक और स्थिति (ई). अंत में, प्रयोग डिजाइनर (F) मेनू पर क्लिक करें, बहु ब्लॉक सक्षम करें प्रयोगका चयन करें, पहले ब्लॉक में, कम आवर्धन के तहत नमूना खोजने के लिए, फिर उच्च आवर्धन के लिए स्विच, में मनाया क्षेत्र चलो दृश्य क्षेत्र के केंद्र, स्थिति सेट औरजेड-स्टैक (जी और एच) जानकारी, उपयुक्त लेजर तीव्रता का चयन करें, परतों और इमेजिंग गति स्कैनिंग. एक नया ब्लॉक बनाएँ, और ऊपर दिए गए चरणों को दोहराएँ. सभी ब्लाकों की स्थापना के बाद, छोरों की उचित संख्या सेट(मैं)और रिकॉर्डिंग शुरू करते हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: विवो में मैक्रोफेज प्रवास पर एक रसायन के कार्य की जांच करने के लिए एक वर्कफ़्लो। हमने आईएल-34 को ओवरएक्सप्रेस करने के लिए एक ऊतक-विशिष्ट (लिवर) ओवरएक्सप्रेशन प्लाज्मिड का निर्माण किया और एक-सेल चरण ट्रांसजेनिक मछली भ्रूण में प्लाज्मिड को इंजेक्ट किया जिसका मैक्रोफेज विशेष रूप से एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन(टीजी: (मप्र1: GFP) द्वारा लेबल किया गया था )). इंजेक्शन WT भ्रूण एक स्थिर ट्रांसजेनिक लाइन उत्पन्न करने के लिए उठाया गया था. हम तो पूरे माउंट फ्लोरोसेंट situ संकरीकरण और इम्यूनोस्टेनिंग में जीन अभिव्यक्ति के पैटर्न और क्षणिक इंजेक्शन भ्रूण या स्थिर लाइन भ्रूण (4 dpf) के मैक्रोफेज की संख्या या स्थान का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया। अंत में, हम confocal लाइव इमेजिंग का इस्तेमाल किया सीधे स्थिर ट्रांसजेनिक मछली में मैक्रोफेज व्यवहार का निरीक्षण (3-3.5 dpf) विवो में मैक्रोफेज पर आईएल-34 के समारोह का अध्ययन करने के लिए. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: फ्लोरोसेंट इच्छा इम्यूनोस्टेनिंग के साथ गठबंधन। यह आंकड़ा जियांग एट अल11से संशोधित किया गया है. pBLK-fabp10a-il34-sv40 निर्माण की कुल 1.8 एनएल (30 एनजी / (ए) 4 डीपीएफ भ्रूण (6x) में आईएल34 अभिव्यक्ति (लाल) और जीएफपी अभिव्यक्ति (हरा) के पूरे-माउंट एंटीबॉडी धुंधला की इच्छा। मछली के पूरे शरीर की तस्वीर confocal द्वारा ली गई दो अलग छवियों से बना है और फ़ोटोशॉप में एक साथ सिले. इनसेट संबंधित बॉक्स्ड क्षेत्रों (नारंगी डॉटेड क्षेत्रों) के उच्च आवर्धन (20x) होते हैं। (ख)संयुक्त राष्ट्र में मैक्रोफेज सेल संख्याओं का मात्रात्मक विश्लेषण और इंजेक्शन भ्रूण के यकृत (सफेद डॉटेड क्षेत्र में दिखाया गया) और पूंछ क्षेत्र (लगभग 13 वीं और 17 वीं सोमाइट के बीच, दो सफेद डॉटेड लाइनों के बीच दिखाया गया है)। डेटा मान Whitney यू परीक्षण द्वारा विश्लेषण किया गया, * पी और 0.01 नियंत्रण की तुलना में. द 5, 5 4 dpf इंजेक्शन और नियंत्रण मछली के लिए. बार: 200 डिग्री (सफेद रेखा); 50 डिग्री मीटर (पीला रेखा)। (ग)4 डीपीएफ स्टेबल लाइन भ्रूण (6x) में जीएफपी अभिव्यक्ति के इल34 अभिव्यक्ति और पूरे-माउंट एंटीबॉडी धुंधला की इच्छा। मछली के पूरे शरीर की तस्वीर confocal द्वारा ली गई दो अलग छवियों से बना है और फ़ोटोशॉप में एक साथ सिले. इनसेट संबंधित बॉक्स्ड क्षेत्रों (नारंगी डॉटेड क्षेत्रों) के उच्च आवर्धन (20x) होते हैं। (घ) टीजी (मप्र1: जीएफपी) और टीजी (fabp10a: il34; mpeg1: GFP) भ्रूण के यकृत (सफेद डॉटेड क्षेत्र में दिखाया गया है) और पूंछ क्षेत्र (लगभग 13 वीं के बीच) में मैक्रोफेज सेल संख्याओं का मात्रात्मक विश्लेषण और 17 वीं सोमाइट, दो सफेद डॉटेड लाइनों के बीच दिखाया गया है) कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र ााालों में विक्रोफेज व्यवहार का प्रत्यक्ष रूप से अवलोकन करने के लिए कॉनफोकल लाइव इमेजिंग. यह आंकड़ा जियांग एट अल11से संशोधित किया गया है. लाइव इमेजिंग के माइक्रोग्राफ एक मैक्रोफेज (हरे, सफेद तीर द्वारा लेबल) की प्रक्रिया को दिखाते हैं जो नियंत्रण मछली(ए) में 28 मिनट के भीतर जिगर (लाल) से गुजरता है और एक मैक्रोफेज (हरे, सफेद तीर द्वारा लेबल) की प्रक्रिया 28 के भीतर जिगर (लाल) में प्रवास करती है आईएल-34 में न्यूनतम मछली (बी)। स्केल बार्स - 40 डिग्री मी (सफेद रेखा)। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.


अनुपूरक मूवी 1: लाइव इमेजिंग मैक्रोफेज की प्रक्रिया को दर्शाती है (हरा, सफेद तीर द्वारा लेबल) आईएल-34 में 2 एच के भीतर जिगर (लाल) में पलायन मछली overexpressing. स्केल बार्स ] 20 डिग्री मी (सफेद रेखा)। इस फिल्म जियांग एट अल11से पुनर्प्रकाशित किया गया है. कृपया यहाँ क्लिक करें इस वीडियो को देखने के लिए. (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)


अनुपूरक मूवी 2: लाइव इमेजिंग मैक्रोफेज की प्रक्रिया दिखा (हरा, सफेद तीर द्वारा लेबल) नियंत्रण मछली में 2 एच के भीतर जिगर (लाल) के आसपास घूम रहा है। स्केल बार्स ] 20 डिग्री मी (सफेद रेखा)। इस फिल्म जियांग एट अल11से पुनर्प्रकाशित किया गया है. कृपया यहाँ क्लिक करें इस वीडियो को देखने के लिए. (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

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Discussion

यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल हमें मैक्रोफेजिन विवो के व्यवहार पर एक chemokine के समारोह की जांच करने की अनुमति देता है और प्रक्रिया कुछ तकनीकी विशेषज्ञता की आवश्यकता है. सारांश में, प्रोटोकॉल में जटिलताओं से बचने के लिए कई महत्वपूर्ण कदम उठाए गए हैं: 1) एक उपयुक्त ट्रांसजेनिक लाइन का चयन करें जो ब्याज के सेल को लेबल करने के लिए विशिष्ट और मजबूत ट्रांसजेनिक संकेत दिखाता है; 2) एक उपयुक्त ऊतक जो इमेजिंग और ट्रांसजेनिक जीन overexpression के लिए सुलभ है का चयन करें; 3) एक संवेदनशील और विशिष्ट आरएनए जांच करना; 4) सही सेल व्यवहार पर कब्जा करने के लिए एक उपयुक्त अवलोकन समय विंडो का चयन करें।

immunostaining के साथ संयुक्त situ संकरीकरण में पूरे माउंट फ्लोरोसेंट की प्रक्रिया में, जीन अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया आरएनए जांच संवेदनशील होना चाहिए और संकेत काफी मजबूत होने की जरूरत है। आदेश में सेल व्यवहार पर जीन समारोह पर कब्जा करने के लिए, समय अंक की एक श्रृंखला का परीक्षण किया जाना चाहिए. उदाहरण के लिए, मैक्रोफेज प्रवास पर il34 के प्रभाव को देखने में, हालांकि fabp10a प्रमोटर 2-3 dpf पर व्यक्त करने के लिए शुरू किया, जिगर में मैक्रोफेज संचय उस समय स्पष्ट नहीं था. यह केवल 4 dpf द्वारा है कि जिगर में मैक्रोफेज का संवर्धन स्पष्ट हो जाता है. इसके अलावा, situ संकरीकरण के बाद, बाद में इम्यूनोस्टेनिंग के सिग्नल की तीव्रता प्रभावित होगी। उदाहरण के लिए, GFP के साथ तुलना, DsRed situ संकरीकरण में के बाद इम्यूनोफ्लोरेसेंस ेशन में रंग करने के लिए मुश्किल है, शायद विभिन्न प्रोटीन संरचनाओं की वजह से. आम तौर पर बोल रहा हूँ, situ संकरीकरण में पूरे माउंट फ्लोरोसेंट के बाद इम्यूनोस्टेनिंग के संकेत तीव्रता एकल इम्यूनोस्टेनिंग की तुलना में कम होगी।

confocal माइक्रोस्कोप के साथ लाइव इमेजिंग कदम में, यह पकवान के नीचे के करीब नमूना रखने के लिए आवश्यक है. जब भ्रूण agarose में तैरता है, उद्देश्य के काम की दूरी अपर्याप्त हो सकता है, भी, उद्देश्य और नमूने के बीच agarose इमेजिंग की गुणवत्ता को प्रभावित करेगा. इसके अलावा, हर समय इमेजिंग के लिए नमूनों की संख्या ठीक से सेट की जानी चाहिए। एक प्रत्येक मछली के दो स्कैन के बीच समय अवधि सेल व्यवहार का विवरण खोने के लिए बहुत लंबा नहीं होगा कि सुनिश्चित करना चाहिए. तो इस विधि पर नज़र रखने कोशिकाओं है कि मोटी ऊतकों में तेजी से कदम के लिए उपयुक्त नहीं है.

अंत में, इस प्रोटोकॉल का उपयोग मैक्रोफेज, न्यूट्रोफिल और टी-कोशिकाओं जैसे विभिन्न कोशिकाओं के व्यवहार पर कीमोकिन्स के कार्य का निरीक्षण करने के लिए किया जा सकता है। यहाँ, हम आईएल-34 का इस्तेमाल किया, एक हाल ही में पहचान की CHEmotaxisमेंसीएसएफ-1R समारोह के ligand6 ,7, एक अस्थानिक व्यक्त chemokine के रूप में मैक्रोफेज प्रवास प्रेरित करने के लिए. सेल chemotaxis के मौजूदा प्रयोगात्मक मॉडल के अधिकांश इन विट्रो सेल प्रयोगों पर आधारित हैं, लेकिन इन विट्रो प्रयोगों कभी कभी भी विवो में जटिल वातावरण मॉडल सरल कर रहे हैं. इसके अलावा, यह मुश्किल है कीमो-आकर्षण abilityin vivo छवि जब बस इन विट्रो स्थिति में देखो. इस विधि प्रत्यक्ष सेल व्यवहार अवलोकन जो चूहों के लिए मुश्किल है के लिए ज़ेब्राफ़िश के विशिष्ट लाभ का उपयोग किया. वर्तमान विधि हमें जल्दी से कई दिनों के भीतर सेल व्यवहार पर chemokine कार्यों का परीक्षण और ज़ेब्राफ़िश आणविक और सेल जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली मॉडल बनाने के लिए अनुमति दी.

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

हम Tg (fabp10a: DsRed) ट्रांसजेनिक लाइन साझा करने के लिए डॉ Jingrong पेंग धन्यवाद; Tg (mpeg1: GFP) ट्रांसजेनिक लाइनों को साझा करने के लिए डॉ जिलोंग वेन; pTol2 वेक्टर प्रदान करने के लिए डॉ कोइची Kawakami. यह काम चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (31771594), गुआंग्डोंग विज्ञान और प्रौद्योगिकी योजना परियोजनाओं (2019A030317001) और केंद्रीय विश्वविद्यालयों के लिए मौलिक अनुसंधान कोष (D2191450) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibody
Alexa 488-Anti-Goat antibody Invitrogen A11055
Anti-Digoxigenin-HRP  perkinelmer NEF832001EA
Goat-Anti-GFP antibody Abcam ab6658
Reagent
CaCl2· 2H2O Sigma 21097
Cyanine 3 Plus Amplification Reagent perkinelmer NEL745001KT
E2 solution 15 mM  NaCl +0.5 mM KCl +1.0 mM MgSO4+150 µM  KH2PO4 + 50 µM  Na2HPO4 +1.0 mM CaCl2 + 0.7 mM NaHCO3 
Fetal Bovine Serum (FBS) Life 10099-133
Formamide Diamond A100314
Glycerol  Sigma V900860
Heparin sodium Sigma H3149
Hybridization buffer(HB) 50% formamide+ 5×SSC+9 mM sodium citrate+50 μg/ml heparin sodium+ 500 μg/mL tRNA+ 0.1% Tween20
KCl Sigma P5405
KH2PO4 Sigma P5655
Low melting agarose Sigma A9414
Methanol GHTECH 1.17112.023
Methylene blue  Sigma M9140
MgSO4 Sigma M2643
Na2HPO4 Sigma S5136
NaCl Sigma S5886
NaHCO3  Sigma S5761
Paraformaldehyde (PFA) Sigma 158127 Suspend 16 g of PFA in 400 ml of 1x PBS, heat at 60 °C  to dissolve about 30 min. This solution can be prepared in advance and stored at -4 °C. Caution. Manipulate with mask.
10×PBS 14.2 g Na2HPO4+80 g NaCl+2 g KCl+ 2.4 g KH2PO4 in 1L ddH2O
Phenylthiourea (PTU) Sigma P7629
1×Plus Amplification Diluent perkinelmer NEL745001KT
Proteinase K  Fermentas E00492
20×Saline sodium citrate(SSC) 175.3 g NaCl+ 88.2 g sodium citrate in 1 L ddH2O, PH 7.0
Sodium citrate Sigma A5040
Tricaine Sigma E10521
tRNA  Sigma R6625
Tween20 Sigma P2287
Plasmid
pBLK-fabp10a-il34-sv40 For Tg (fab10a:il34) transgenic line generation
pBSK-il34 For il34 probe preparation
Fish
Tg (mpeg1: GFP) Label macrophages with GFP
Tg (fabp10a: DsRed) Label liver cells with DsRed
Tg (fab10a:il34) Over-expression IL-34 in liver cells

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References

  1. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
  2. Wang, Y., et al. IL-34 is a tissue-restricted ligand of CSF1R required for the development of Langerhans cells and microglia. Nature Immunology. 13 (8), 753-760 (2012).
  3. Lin, H., et al. Discovery of a cytokine and its receptor by functional screening of the extracellular proteome. Science. 320 (5877), 807-811 (2008).
  4. Wei, S., et al. Functional overlap but differential expression of CSF-1 and IL-34 in their CSF-1 receptor-mediated regulation of myeloid cells. Journal of leukocyte biology. 88 (3), 495-505 (2010).
  5. Etienne, D., Foucher, S. B. L. P., Norbert Ifrah, P. G. Y. D. IL-34 Induces the Differentiation of Human Monocytes into Immunosuppressive Macrophages. Antagonistic Effects of GM-CSF and IFNc. PLoS One. 8 (2), e56045 (2013).
  6. Segaliny, A. I., et al. Syndecan-1 regulates the biological activities of interleukin-34. Biochimica et Biophysica Acta. 1853 (5), 1010-1021 (2015).
  7. Zhou, S. L., et al. miR-28-5p-IL-34-macrophage feedback loop modulates hepatocellular carcinoma metastasis. Hepatology. 63 (5), 1560-1575 (2016).
  8. Gordon, J. I., et al. Tissue specific expression and developmental regulation of two genes coding for rat fatty acid binding proteins. Journal of Biological Chemistry. 260 (4), 1995-1998 (1985).
  9. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon. Eugene, OR. (2000).
  10. Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish: a practical approach. , Oxford University Press. New York. (2002).
  11. Jiang, Y., Chen, J., Yen, K., Xu, J. Ectopically Expressed IL-34 Can Efficiently Induce Macrophage Migration to the Liver in Zebrafish. Zebrafish. 16 (2), 165-170 (2019).

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विकासात्मक जीव विज्ञान अंक 151 सीटू संकरीकरण में पूरे माउंट फ्लोरोसेंट इम्यूनोस्टेनिंग लाइव इमेजिंग जेब्राफ़िश आईएल-34 मैक्रोफेज
विवो में मैक्रोफेज भर्ती के परीक्षण के लिए एक एटोपिक चेमोकिन अभिव्यक्ति मॉडल
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Jiang, Y., Chen, J., Xu, J. An Ectopic Chemokine Expression Model for Testing Macrophage Recruitment In Vivo. J. Vis. Exp. (151), e60161, doi:10.3791/60161 (2019).

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