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Bioengineering

마우스 아이에 생물학적 제제의 전달을 위한 캡슐화된 세포 기술

Published: March 30, 2020 doi: 10.3791/60162

Summary

여기에 제시된 것은 설치류 눈에 생물학적 제제의 장기 전달을 위한 불멸화된 세포의 미세 캡슐화에서 중합체로서 알긴산을 사용하기 위한 프로토콜이다.

Abstract

눈의 후방 극의 질병에 대한 개발 중인 많은 현재 치료법은 생물학적 제제입니다. 이 약은 빈번하게 관리될 필요가 있습니다, 일반적으로 intravitreal 주사를 통해. 선택의 생물학적을 발현하는 캡슐화된 세포는 국소 단백질 생산 및 방출을 위한 도구가 되고 있다(예를 들어, 장기 약물 전달을 통해). 또한 캡슐화 시스템은 세포 안팎으로 영양분, 폐기물 및 치료 요인을 확산시키는 투과성 물질을 활용합니다. 이것은 숙주 면역 반응에서 세포를 마스킹하는 동안 발생, 숙주 면역 계통의 억제에 대한 필요성을 피하고. 이 프로토콜은 마이크로 캡슐화 기술로 전기 분무 방법과 결합된 마이크로 캡슐화에서 중합체로서 알긴산의 사용을 설명합니다. ARPE-19 세포, 자발적으로 발생 하는 인간 RPE 세포 주, 그것의 수명 기능 으로 인해 장기 세포 치료 실험에 사용 되었습니다., 그리고 캡슐 화 및 마우스 눈에 캡슐전달에 대 한 여기 사용 됩니다. 원고는 세포 미세 캡슐화, 품질 관리 및 안구 전달에 대한 단계를 요약합니다.

Introduction

세포 기반 치료법은 의학에서 널리 적용된 혁신적인 생물학적 기술을 나타냅니다. 최근에는 퇴행성 신경질환, 안구질환, 암 치료에 성공적으로 적용되고 있다. 세포 치료는 세포 보충에서 약 납품에 의하여 광범위한 필드를 커버하고, 이 프로토콜은 후자에 집중합니다. 생분해성 알긴산 마이크로캡슐(MC)은 전달 시스템으로서 효과를 보였으며, 생물의학 분야에서 널리 사용되고 있습니다. 알긴산은 간단한 겔화 공정, 생분해성, 우수한 생체 적합성 및 생체조건 하에서 의 안정성1,2,,3,,4로인해 마이크로 캡슐화에 사용되어 왔다.

전기 분무 방법은, 마이크로 캡슐화 기술로, 알긴산 (염기 중합체) 및 폴리-l-오르니틴 (이차 코팅 폴리머)를 사용하여 펩티드와 단백질을 캡슐화하는 데 성공적으로 활용되었습니다. 두 폴리머 는 자연적으로 발견되고 생체 적합성5,,6,,7에사용됩니다. 그러나, 세포 기반 치료법의 주요 과제는 면역억제약물에 의한 부작용을 피하기 위해 숙주 면역계의 억제이다. 알긴산 마이크로캡슐의 투과성은 숙주 면역반응으로부터그들을 마스킹하는 동안 세포 내로 영양분, 폐기물 및 치료 인자를 확산시키는 세포 캡슐화에 적합한 특성으로 간주된다8,9,,10.

눈에서, 캡슐화된 세포는 망막색소변성증 또는 노화관련 황반변성의 치료를 위해 생물학적 제제(즉, 성장인자11,,12 및 성장 인자 길항제13)의지속적인 전달을 위한 임상 시험에서 사용되어 왔다. 보체 억제제 와 같은 그밖표적은 또한 전임상 조정에서 현재 탐구되고 있습니다.

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Protocol

모든 실험은 안과 및 시력 연구에서 동물 사용에 대한 ARVO 성명서에 따라 수행되었으며 프로토콜 ID 00399에 따라 사우스 캐롤라이나 동물 관리 및 사용 위원회의 의과 대학에 의해 승인되었습니다.

1. 세포 배양

  1. 인간 망막 색소 상피 세포(ARPE-19) 세포주를 생성하여 발표된 프로토콜14,,15에따라 선택한 유전자를 안정적으로 발현한다.
  2. Dulbecco의 수정 된 독수리 매체 (DMEM)에서 세포를 10 % 태아 소 혈청 (FBS)으로 보충하십시오.
  3. 세포를 37°C 및 5%CO2에서배양한다.
  4. 2-3일마다 매번 매체를 교체하십시오.
  5. 표준 조직 배양 절차를 사용하여 70%-80% 합류에 도달한 후에 세포를 통로.

2. 세포 캡슐화

  1. 나트륨 알긴산나트륨을 탈이온화(DI) 물과 혼합하여 최종 농도를 2%v로 만들고 0.2 μm 멸균 주사기 필터로 여과하여 정화합니다.
  2. 10 mM HEPES 완충 식염수 (pH = 7.4)로 트립시니화, 원심 분리 및 세척하여 알긴산 용액과 혼합 될 세포를 준비시다. 혈세포계를 사용하여 세포를 계산하고 알긴산 용액에서 최종 세포 농도를 1 x 106으로 조정합니다.
    참고: 캡슐화 과정은 멸균 된 후드 내부에서 실행되어야합니다.
  3. ~ 300 μL 알긴산과 세포 혼합물을 3 mL 주사기에 넣고 주사기 펌프에 부착합니다. 용액은 30 G 무딘 팁 바늘을 통해 멸균 겔링 욕조에 7 mm의 주사기 팁 아래의 멸균 50 mL 비커에 배치되어 바늘을 목욕 분무 거리까지 펌핑한다.
  4. 겔화 목욕은 100 mM 염화 칼슘 (CaCl2)과0.5 % w / v 폴리 L-오르니틴 (PLO)을 포함하는 10 mM HEPES 완충 식염수의 40 mL의 부피를 포함합니다. PLO는 조사자의 필요에 따라 생략하거나 변경할 수 있는 보조 폴리머 코팅이다.
  5. 전압 및 유량을 조정하고 캡슐화 공정 중에 60mm/h 유량 및 6.0 kV 초기 전압을 일정하게 유지하여 ~ 150 μm의 마이크로 캡슐 크기를 생성합니다.
  6. 바늘에 고전압 발생기 바늘 팁의 양극 와이어 (빨간색)의 클립을 연결하고 겔링 욕조에 잠기는 구리 와이어에 접지 클립 (검은 색)을 연결합니다. 알긴산 + 세포 혼합물(1 mL)의 1회 배치는 캡슐화된 세포(약 25,000마이크로캡슐)를 준비하는 데 약 30분이 소요된다.
  7. 세척 액 (1.5 mM CaCl 2, pH = 7.4를 포함하는 10 mM HEPES 완충 식염수)로 세포를 포함하는 형성된 마이크로캡슐을두 번 세척한다. 세탁시 PBS를 사용하지 마십시오.
  8. 캡슐화된 세포를 10% FBS로 배양하여 37°C 및 5%CO2에서가습된 인큐베이터에서 DMEM 매질 보충제를 보충하였다.
    참고: 캡슐화 공정 계측기는 그림 1에도시되어 있습니다.

3. 캡슐화가 세포 생존력에 영향을 미치지 않는다는 확인

  1. 캡슐화된 세포를 24시간 동안 배양한 후, 염색을 위해 500 μL(~30 마이크로캡슐)의 작은 샘플을 준비한다.
  2. 세척 용액 (1.5 mM CaCl2를포함하는 10 mM HEPES 완충 식염수)을 사용하여 마이크로 캡슐을 2 x 씻어 내고 살아있는 / 죽은 분석 키트를 사용하여 살아있는 죽은 생존을 위해 얼룩을 지으십시오.
  3. 칼세인 AM(아세톡시메틸)과 에티듐 호모디머-1의 염색 혼합물을 각각 2 μM 및 4 μM의 최종 농도에서 준비한다.
  4. 캡슐화된 세포에 염색 혼합물 2 mL를 넣고 실온(RT)에서 어둠 속에서 30-45분 동안 배양한다.
  5. 신중한 포부로 염색 용액을 흡인하고 세척 용액으로 마이크로 캡슐을 2 x 씻어 내세요. 형광 현미경 시스템을 사용하여 캡슐화된 세포를 관찰하고 이미지화합니다.
    참고: 캡슐화 문서는 그림 2에나와 있습니다.

4. 캡슐이 생물학적 제제의 전달 및 전달에 적합한 크기임을 확인

  1. 마우스 눈에 있는 Intravitreal 주사는 전형적으로 2.5 μL 해밀턴 주사기에 붙어 있는 27 G 무딘 끝 바늘 (210 μm의 내경)로 수행됩니다.
  2. 100 ~200 μm에 이르는 캡슐을 생성하고, 혈청이 없는 매체로 희석한 다음, 조심스럽게 해밀턴 주사기로 끌어올리십시오. 알긴산 캡슐이 PBS에서 용해될 것이기 때문에 PBS는 적합한 차량이 아닙니다.
  3. 캡슐을 함유한 1 μL 방울을 현미경 슬라이드에 천천히 꺼내고 직립 된 밝은 필드 현미경을 사용하여 무결성을 결정하십시오.
  4. 그에 따라 전압 및 유량을 조정하여 캡슐 크기(단계 2.3 참조)를 조정합니다. 더 작은 마이크로 캡슐은 전압을 증가시키고 유량8을약간 감소시킴으로써 비선형 방식으로 생산됩니다. 우리의 손에, 직경 150 μm의 캡슐이 가장 적합한 것으로 판명되었습니다. 캡슐 크기의 조정은 또한 다른 파라미터를 변경하는 동안 알긴산 농도를 일정하게 유지하는 것에 달려 있습니다.
  5. 원하는 생물학적 제제의 분비량을 결정하기 위해 혈청 이없는 배지에서 적절한 크기의 캡슐에 별도의 세포 세트를 유지한다. 민감한 ELISA 또는 서쪽 블로팅을 사용하여 상급제에서 생물학적 제제의 농도를 결정하십시오.
  6. 치료의 알려진 PK/PD(약동학/약력학)에 따라 주입해야 하는 캡슐의 필요한 양을 결정합니다. 우리의 손에, 10 마우스 눈 당 캡슐은 가장 효과적인 것으로 판명.

5. 마우스 유리체로 캡슐 전달

  1. 해부 현미경을 사용하여 인트라비트 주사를 수행합니다. 수술 시 사용되는 수술 설정 및 재료는 그림 3을 참조하십시오. intravitreous 주사에 대한 자세한 프로토콜은 다른 곳에서 찾을 수 있습니다16.
  2. 자일라진과 케타민 (20 mg/kg 및 80 mg/kg) 또는 특정 기관의 동물 관리 및 사용 위원회에서 승인 한 다른 선호 하는 마 필적의 복 강 주사에 의해 마우스를 마 세. 발가락 핀치17을사용하여 마취의 적절한 깊이를 확인합니다.
  3. 페닐에프린 HCL로 마우스 동공을 넓히다 (2.5%) 및 아트로핀 황산염 (1%) 유리체 챔버의 좋은 가시성을 허용하고 시술 중에 수분을 유지하기 위해 눈에 윤활유 아이 젤을 적용합니다.
  4. 가이드 구멍으로 26G 바늘로 팔다리에 공막구멍을 뚫고 1) 바늘이 눈과 테이블이 있는 45° 각도에 있고 2) 경정맥이 렌즈에 구멍을 뚫지 않도록 위쪽으로 향하게 됩니다.
  5. 육안으로 검사를 통해 45° 각도로 해밀턴 주사기에 부착된 27G 무딘 팁 바늘을 사용하여 캡슐을 조심스럽게 주입하여 바늘로 렌즈를 만지지 않도록 하십시오. 렌즈의 부상은 백내장 형성으로 이어질 것입니다. 캡슐은 해부 현미경을 사용하여 유리체에서 볼 수 있어야합니다(도 4A).
  6. 바늘의 철회 후, 덱사메타손 안과 항생제 연고 이외에 항생제 연고 네오마이신 및 폴리믹신 B 황산염으로 주사 부위를 치료하십시오.
  7. 고니오테르 하이프로멜로스 데멀센트 안과 용액 적용 (2.5%) 회복 기간 동안 각막이 건조하지 않도록 두 눈으로.
  8. 37°C에서 유지된 가열 패드에 마우스를 놓고 완전히 깨어날 때까지 모니터합니다.
  9. 캡슐화된 ARPE-19 세포의 성공적인 주입은 광학 적인 일관성 단층 촬영 또는 다른 방법에 의해 눈을 이미징 할 때 약간의 파편으로 마우스의 유리체 챔버에서 손상되지 않은 캡슐의 존재를 밝혀야합니다(그림 4B).
  10. 주입 된 마우스 눈, 수술로 인해 회복의 몇 일 후, 지금 손에 실험 패러다임에 대한 준비가되어 있습니다.
    참고: 눈에 있는 캡슐의 외과 적 설치 및 문서화는 각각 그림 3및 그림 4에묘사됩니다.

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Representative Results

ARPE-19 세포는 캡슐을 눈에 이식할 때 캡슐화 및 장기 생존을 가능하게 하는 것으로 나타난 자발적인 불멸의 인간 RPE 세포주입니다. 알긴산 캡슐화 도구는 그림 1에나와 있습니다. 본 연구에서, 알긴산캡슐에 캡슐화시, 알긴산 캡슐의 세포가 밝은 필드 이미징에 의해 확인되었다는 것이 입증되었다(도2A). 살아있는 죽은 세포는 캡슐 내부의 세포에서 수행되었고, 캡슐화 후 90%의 생존가능성을 입증하였다(도2B). 캡슐 내부의 세포의 장기적인 생존을 보장하기 위해, 캡슐을 구연산나트륨에 용해시키고 세포를 다시 도금하였다(그림2C). 독립적인 실험에서 안정된 형질감염 ARPE-19 세포가 원하는 생물학적 제제를 발현및 분비한 것을 확인한후,세포를 안전하게 캡슐화하기 위한 파라미터를 확립한 후, 캡슐을 안구 주사를 위해 생산하였다.

마우스 눈에 Intravitreal 주사는 27 G 무딘 끝 바늘 (210 μm의 내경)의 사용을 요구하고 1 μL의 필요한 소량을 일관되게 주입하기 위하여 정확한 전달 시스템을 요구합니다. 27 G 바늘을 통해 배출하는 동안 손상되지 않은 캡슐의 크기는 현미경 검사법에 의해 확인되었다(그림 2A). 150 μm의 최적 크기가 확인되었다. Intravitreal 주사는 유리체에서 캡슐의 시각화를 허용육개 검사하에 수행되었다(그림 4A). 마찬가지로, OCT 이미징이 수행되었으며, 이는 마우스의 유리체 챔버내의 캡슐의 대다수가 비교적 적은 양의 파편과 함께 손상되지 않음을 확인하였다(도4B). 후속 발표된 실험에서, 원하는 생물학적 제제가 치료학적 관련 용량으로 눈에 존재하였음이 확인되었으며, 조사14에서질병 과정을 저해하였다. 이 결과는 캡슐화된 세포가 생물학적 제제의 장기 납품을 위해 마우스 눈에 안전하게 주입될 수 있다는 것을 확인했습니다.

Figure 1
그림 1: 캡슐화 공정 기기. 셋업은(A)3 mL 주사기,(B)0.2 μm 필터,(C)30 G, 1/2 인치 무딘 팁 바늘,(D)전자 주사기 드라이버,(E)고전압 발생기,(F)시스템 셋업, 및(G)바늘 팁과 겔링 용액 표면 사이의 7 mm 고정 거리를 포함한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 셀 캡슐화. (A)ARPE 19 세포로 채워진 마이크로 캡슐. (B)살아있는/죽은 분석: [a] 적색 형광색은 죽은 세포를 나타내고[b] 녹색 형광색은 살아있는 세포를 나타낸다. (C)작은 클러스터가 동급으로 성장하는 것으로 시작하여 마이크로캡슐로부터 회수한 후 배양된 세포. 배율 막대 = 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: 외과 적 설정. 비디오 카메라(2)를 이용한 해부 현미경(1)은 시술을 시각화하는데 사용된다. 마우스를 칭량(3)하여 적절한 양의 마취제를 투여하고 취급 및 주입을 용이하게 하기 위해 작은 플랫폼(4)에 놓는다. 눈은 미드리아틱 아트로핀과 페닐레피네프린(5)으로 팽창시키고 윤활유(6)로 수분을 유지한다. 가이드 구멍은 26G 바늘 (7)을 사용하여 팔다리 바깥쪽에 구멍을 뚫습니다. 적절하게 희석된 캡슐(9)으로 적재된 유리 주사기(8)는 마우스 눈에 45° 각도로 배치되고 마이크로매니퓰레이터(10)를 사용하여 가이드 구멍을 통해 진행된다. 바늘 트랙뿐만 아니라 방출되는 캡슐은 시각화될 수 있다[(11; 도 4참조]. 바늘을 철회하면, 각막은 감염을 피하기 위해 주사 부위에 적용된 히프로멜로오스(12)와 항생제 연고(13)로 적신다. 절차에 따라, 마우스는 37°C 가열 패드 에 배치되고 완전히 깨어날 때까지 모니터링됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4: ARPE-19를 눈에 전달하기 위해 캡슐화된 세포 기술. (A)주사는 해밀턴 주사기에 부착된 무딘 27G 바늘을 사용하여 수행된다. 바늘 트랙은 바늘의 끝이 눈으로 들어오면서, 렌즈와 캡슐(화살촉)을 피하면서 마우스 눈의 광학 시스템에 의해 확대되고 확대될 수 있다. 그것은 광원의 원형 반사 것을 주목해야한다. (B)캡슐(화살촉)은 광학 적인 일관성 단층 촬영을 사용하여 유리체에서 이미지화 될 수 있다. 배율 막대 = 200 μm. 패널 B는 Annamalai 등의 허가를 받아 재인쇄되었습니다.14이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

이 세포 캡슐화 기술은 상대적으로 빠르고 수행하기 쉽습니다. 그러나 정확한 다운스트림 결과를 얻으려면 특정 지점을 염두에 두어야 합니다. 세포는 캡슐화 하기 전에 페트리 접시에 배양에서 유지 되어야 하 고 적절 한 합류에서 개최. 캡슐화는 가능하면 조절 된 공기 흐름이있는 적절한 환기 후드에서 수행해야합니다. 공기 전류가 너무 강하면 캡슐 형성에 영향을 미칠 수 있으며, 특히 장기 실험에서 영향을 미칠 수 있습니다. 멸균 기구 및 용액은 캡슐 내의 세포를 장기적으로 유지 보수하는 데 매우 중요합니다.

현재, 살아있는 죽은 염색 캡슐 내에서 세포의 생존을 결정 하기 위해 확인 도구로 사용 됩니다. 캡슐 당 및 현재 조건 하에 세포의 수 (즉, 일반적으로 캡슐 당 12-20 세포) 또한 시각적으로 결정 됩니다. 캡슐화된 셀 일괄 처리의 각 배치의 실행 가능성은 이 방법으로 모니터링됩니다. 세포의 생존 가능성을 추가로 결정하기 위해 캡슐화된 세포는 용해되고 다시 배양됩니다. 이것은 또한 성공적인 세포 캡슐화를 검증하는 캡슐 내의 세포의 생존력 그리고 무결성을 보여줍니다.

세포 캡슐화에 사용되는 매개 변수는이 특정 세포 유형에 대해 확립되었습니다. 위에 명시된 파라미터는 이러한 실험을 위해 ARPE 19 세포의 캡슐화에 사용되는 것들이다. 캡슐의 유량, 알긴산 농도, 전압 적용 및 이차 코팅은 캡슐의 적절한 사용을 위해 조정할 수 있는 모든 변수입니다. 마찬가지로, 주어진 실험에 필요한 캡슐의 양은 경험적으로 또는 생물학적 제제의 알려진 PK / PD에 따라 결정될 필요가있다. 항상 적절한 제어 실험을 수행하는 것이 중요합니다, 캡슐과 캡슐의 존재를 제어하는 빈 캡슐을 추가하는 것은 분비 된 요인의 존재를 제어하기 위해 트랜스 감염 ARPE-19 세포로로드. ARPE-19 세포는 또한 마우스의 작은 유리체에 소수의 캡슐조차도 존재하기 때문에 대조군 플라스미드로 안정적으로 형질감염될 수 있다(&10 μL)는 눈의 정상적인 생리학을 변화시키는 것으로 나타난다. 이러한 맥락에서, 분비된 단백질이 조사 중인 생물학적 효능을 방해할 수 있기 때문에 캡슐화 조건 하에서 APRE-19 세포의 분비를 아는 것이 중요합니다(특정 질병 조건에서 유리체가 있을 뿐만 아니라).

마지막으로, 이 기술은 AMD의 치료를 위한 보체 억제제의 장기 전달을 위한 원리 증명을 제공하고 현재의 인트라비티트주사(14)의방법을 개선하기 위해 구현되었다. 개발의 현재 단계에서, 보체 억제제는 유리체에 주입, 일반적으로 매월 주사를 사용하여. 이는 지리위축의 진행을 감소시키기 위한 III 상 임상시험에서 실패한 항체 D차단 항체 Lampalizumab18의주사, 또는 현재 III 상 임상시험에 있는 보체인자 3 억제제 APL-219를포함한다.

Intravitreal 주사는 주사 자체의 부작용에 의해 방해됩니다 (즉, 망막 분리의 위험, 안구 내 압력의 상승, 안과 염, 등등). 또한, 약물 수준은 매월 intravitreal 주사에 달의 과정을 통해 크게 다를 것입니다, 반등 반응은 예상 될 수있다. 대안으로, 용해성 CD59 보체억제제(20)와같은 유전자 치료 전략이 개발되고 있으며, 이는 현재 임상 1상 임상 시험 중이다. 캡슐화된 세포는 또한 장기간 동안 생물학적 제제의 지속적인 생산을 허용하고 필요한 경우(즉, 캡슐의 박베식) 종결될 수 있다.

현재까지, 우리는 ~ 6 주14의과정을 통해 생물학적 의 생산을 위해 테스트했습니다. 여기에 설명 된 방법은 알긴산 캡슐이 주사 중에 파쇄를 완전히 방지할 만큼 충분히 안정적이지 않으며 몇 주 이상 지속될 것으로 예상되지 않기 때문에 동물 모델에서 원리 증명을 위해만 사용되어야하며 환자에서 사용하지 않아야합니다. 대조적으로, Neurotech에 의해 개발된 것과 같은 고체 장치는22,,23,,24를요구하는 인자를 전달하기 위하여21년 동안 지속될 수 있다. 또한,이 새로운 기술은 캡슐화 된 약물 전달과 결합 될 수 있습니다. 전반적으로, 이 신흥 분야는 유전자 치료의 반복적인 주사를 위한 대체 전략으로 급속히 발전할 것으로 예상된다.

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Disclosures

저자는 경쟁적인 재정적 이익을 선언하지 않습니다.

Acknowledgments

이 연구는 국립 보건원 (R01EY019320), 재향 군인 업무부 (RX000444 및 BX003050), 사우스 캐롤라이나 스마트 스테이트 인다우먼트에 의해 B. R. 수여 보조금에 의해 부분적으로 지원되었습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3 mL Syringe BD 309656
30 G 1" Blunt needle SAI Infusion technology B30-100
Alginic acid sodium salt, from brown algae Sigma A0682
Atropine Sulfate Ophthalmolic solution (1%) Akorn NDC 17478-215-15 for pupil dilation
BD 1 mL Syringe 26 G x 3/8 (0.45 mm x 10 mm) Becton, Dickinson and Company DG518105 500029609 REF 309625 to generate the guide hole
Calcium chloride, Anhydrous, granular Sigma C1016
GenTeal Tears Alcon NDC 0078-0429-47 to lubricate the eyes during anesthesia
Goniotaire: Hypromellose (2.5%) Ophthalmolic Demulcent Solution (Sterile) Altaire Pharmaceuticals Inc. NDC 59390-182-13 to lubricate the eyes during anesthesia
Hamilton Needle/syringe Tip: 27 G, Small Hub RN NDL, custum length (12 mm), point style 3, 6/PK Hamilton 7803-01 for intravitreal delivery of capsules
Hamilton Syringe: 2.5 µL, Model 62 RN SYR, NDL Sold Separately Hamilton 7632-01 for intravitreal delivery of capsules
HEPES buffer, 1 M Fisher Bioreagents BP299100
High voltage generator ESD EMC Technology ES813-D20
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit Thermofisher Scientific L3224
L-Ornithine hydrochloride, 99% Alfa Aesar A12111
Neomycin and Polymyxin B Sulfates and Dexamethasone Ophthalmolic Ointment SANDOZ NDC 61314-631-36 antibiotic to prevent infection after intravitreal injection
Phenolephrine Hydrochloride Ophthalmolic Solution (2.5%) Akorn NDC 17478-201-15 for pupil dilation
Sodium Chloride Sigma S-5886
Sterile syringe filters, 0.2 μm VWR 28143-312
Syringe pump GRASEBY MS16A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Belhaj, M., Annamalai, B., Parsons,More

Belhaj, M., Annamalai, B., Parsons, N., Shuler, A., Potts, J., Rohrer, B. Encapsulated Cell Technology for the Delivery of Biologics to the Mouse Eye. J. Vis. Exp. (157), e60162, doi:10.3791/60162 (2020).

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