Summary
Presentert her er en protokoll for bruk av alginat som polymer i mikroenkapsling av udødelige celler for langsiktig levering av biologer til gnagerøyne.
Abstract
Mange nåværende terapeutiske midler under utvikling for sykdommer i den bakre stangen i øyet er biologer. Disse stoffene må administreres ofte, vanligvis via intravitreale injeksjoner. Innkapslede celler som uttrykker den biologiske av valget blir et verktøy for lokal proteinproduksjon og frigjøring (f.eks. via langsiktig legemiddellevering). I tillegg benytter innkapslingssystemer permeable materialer som tillater diffusjon av næringsstoffer, avfall og terapeutiske faktorer inn og ut av celler. Dette skjer mens du maskerer cellene fra vertens immunrespons, og unngår behovet for undertrykkelse av vertsimmunsystemet. Denne protokollen beskriver bruken av alginat som polymer i mikroenkapsling kombinert med elektrospraymetoden som mikroenkapslingsteknikk. ARPE-19 celler, en spontant oppstår menneskelig RPE cellelinje, har blitt brukt i langsiktige celleterapi eksperimenter på grunn av sin levetid funksjonalitet, og det brukes her for innkapsling og levering av kapslene til musen øyne. Manuskriptet oppsummerer trinnene for cellemikroenkapsling, kvalitetskontroll og okulær levering.
Introduction
Cellebaserte terapier representerer revolusjonerende biologiske teknikker som har blitt brukt mye i medisin. Nylig har de blitt brukt med hell i behandlingen av nevrodegenerative sykdommer, øyesykdommer og kreft. Celleterapi dekker et bredt spekter av felt fra celleerstatning til legemiddellevering, og denne protokollen fokuserer på sistnevnte. Biologisk nedbrytbare alginatmikrokapsler (MC) har vist effektivitet som leveringssystem, og de blir mye brukt i biomedisinsk felt. Alginat har blitt brukt i mikroenkapsling på grunn av sin enkle gelling prosess, biologisk nedbrytbarhet, utmerket biokompatibilitet, og stabilitet under in vivo forhold1,2,3,4.
Elektrospraymetoden, som mikroenkapslingsteknikk, har blitt brukt til å innkapsle peptider og proteiner ved hjelp av alginat (base polymer) og poly-l-ornithin (sekundær belegg polymer). Begge polymerer er naturlig funnet og brukes til deres biokompatibilitet5,6,7. Men den største utfordringen i cellebasert terapi er undertrykkelse av vertsimmunsystemet for å unngå bivirkninger forårsaket av immunsuppressive legemidler. Permeabiliteten av alginatmikrokapsler regnes som en egnet egenskap for celleinnkapsling, noe som gjør det mulig å spre næringsstoffer, avfall og terapeutiske faktorer inn og ut av celler mens du maskerer dem fra vertenimmunrespons8,9,10.
I øyet har innkapslede celler blitt brukt i kliniske studier for konstant levering av biologer (dvs. vekstfaktorer11,,12 og vekstfaktorantagonister13) for behandling av retinitt pigmentosa eller aldersrelatert makuladegenerasjon. Andre mål som komplementhemmere14 blir også undersøkt i prekliniske omgivelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter ble utført i samsvar med ARVO Statement for bruk av dyr i oftalmisk og visjonsforskning og ble godkjent av Medical University of South Carolina Animal Care and Use Committee under protokoll-ID 00399.
1. Cellekultur
- Generer humane retinal pigment epitelceller (ARPE-19) cellelinje som stabilt uttrykker genet av valget i henhold til publiserte protokoller14,15.
- Vedlikehold celler i Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) supplert med 10% føtal storfe serum (FBS).
- Inkuber cellene ved 37 °C og 5 % CO2.
- Skift ut mediet hver 2–3 dag.
- Passasje cellene etter å ha nådd 70%-80% samløpet ved hjelp av standard vevkulturprosedyrer.
2. Celleinnkapsling
- Bland natriumalginat med deionisert (DI) vann for en endelig konsentrasjon på 2% w / v og rense ved filtrering med et 0,2 μm sterilt sprøytefilter.
- Forbered cellene til å blandes med alginatoppløsningen ved å prøve, sentrifugere og vaske dem med 10 mM HEPES bufret saltvannsløsning (pH = 7,4). Ved hjelp av et hemocytometer, telle cellene og justere den endelige cellekonsentrasjonen til 1 x 106 i alginat løsning.
MERK: Innkapslingsprosessen skal kjøres inne i en sterilisert hette. - Last ~ 300 μL aliquots av alginat og celler blandingen i en 3 ml sprøyte og fest den til en sprøytepumpe. Løsningen vil bli pumpet gjennom en 30 G stump spiss nål til et sterilt gelling bad plassert i et sterilt 50 ml beger under sprøytespissen på 7 mm for en nål til bad sprøyting avstand.
- Gelling badet inneholder et volum på 40 ml 10 mM HEPES bufret saltvann som inneholder 100 mM kalsiumklorid (CaCl2) og 0,5% w/ v poly-L-ornithine (PLO). PLO er et sekundært polymerbelegg som kan utelates eller endres i henhold til søkens behov.
- Juster spennings- og strømningshastigheten og hold dem begge konstante under innkapslingsprosessen med 60 mm/t strømningshastighet og 6,0 kV innledende spenning for å produsere mikrokapsler størrelse på ~ 150 μm.
- Koble klipsen av anodewire (rød) av en høyspenningsgenerator nålspiss til nålen og koble den malte klipsen (svart) til kobbertråden som er halvveis nedsenket i gellingbadet. En batch av alginat + celleblanding (1 ml) tar ca 30 min å forberede innkapslede celler (ca 25.000 mikrokapsler).
- Vask de dannede mikrokapslene som inneholder celler med vaskeoppløsning (10 mM HEPES bufret saltvann som inneholder 1,5 mM CaCl2, pH = 7,4) to ganger. Ikke bruk PBS til vasking.
- Inkuber de innkapslede cellene med 10% FBS supplert DMEM media i en fuktet inkubator ved 37 °C og 5% CO2.
MERK: Innkapslingsprosessinstrumenter er avbildet i figur 1.
3. Bekreftelse på at innkapsling ikke påvirker cellelevedyktighet
- Etter å ha inkubert de innkapslede cellene i 24 timer i media, må du lage en liten prøve på 500 μL (~ 30 mikrokapsler) for farging.
- Vask mikrokapslene 2x ved hjelp av vaskeoppløsning (10 mM HEPES bufret saltvann som inneholder 1,5 mM CaCl2) og beis dem for levende død levedyktighet ved hjelp av et live/dødt analysesett.
- Forbered en fargingblanding av kalsen AM (acetoxymethyl) og etidium homodimer-1 ved endelige konsentrasjoner på henholdsvis 2 μM og 4 μM.
- Tilsett 2 ml av fargeblandingen til de innkapslede cellene og inkuber i 30–45 minutter i mørket ved romtemperatur (RT).
- Med forsiktig aspirasjon, aspirere fargingsløsningen og vask mikrokapslene 2x med vaskeløsningen. Bruk et fluorescerende mikroskopsystem for å observere og bilde de innkapslede cellene.
MERK: Dokumentasjon av innkapsling er avbildet i figur 2.
4. Bekreftelse på at kapsler er riktig størrelse for levering og levering av biologiske
- Intravitreal injeksjoner i et museøye utføres vanligvis med en 27 G stump-tip nål (indre diameter på 210 μm) festet til en 2,5 μL Hamilton sprøyte.
- Generer kapsler fra 100 til 200 μm, fortynn dem i serumfrie medier, og trekk dem forsiktig opp i Hamilton-sprøyten. PBS er ikke et egnet kjøretøy, da alginatkapsler vil oppløses i PBS.
- Kast langsomt ut 1 μL dråper som inneholder kapsler på et mikroskoplysbilde og bestemmer integriteten ved hjelp av et oppreist lysbilde med lysfelt.
- Juster kapselstørrelsen (se trinn 2.3) ved å justere spennings- og strømningshastigheten tilsvarende. Mindre mikrokapsler produseres på en ikke-lineær måte ved å øke spenningen og noe redusere strømningshastigheten8. I våre hender viste kapsler på 150 μm i diameter seg å være mest egnet. Justering av kapselstørrelse er også avhengig av å holde alginatkonsentrasjonen konstant mens du endrer de andre parametrene.
- Oppretthold et eget sett med celler i kapsler av riktig størrelse i serumfritt medium for å bestemme mengden sekresjon av ønsket biologisk. Bruk følsomme ELISAer eller vestlig blotting for å bestemme konsentrasjonen av biologene i supernatanten.
- Bestem den nødvendige mengden kapsler som må injiseres basert på den kjente FARMAKOKINAF/PD (farmakokinetikken/farmakodynamikken) av terapeutisk. I våre hender viste 10 kapsler per museøye seg å være mest effektive.
5. Kapsellevering i musglassisk
- Utfør intravitreale injeksjoner ved hjelp av et dissekerende mikroskop. Se figur 3 for kirurgisk oppsett og materialer som brukes under prosedyren. En detaljert protokoll for intravitreøse injeksjoner finnes andre steder16.
- Bedøvelse av mus ved intraperitoneal injeksjon av xylazin og ketamin (20 mg/kg og 80 mg/kg) eller andre foretrukne bedøvelsesmiddel godkjent av den spesifikke institusjonens dyrepleie- og brukskomité. Sørg for riktig dybde av anestesi ved hjelp av en tå klemme17.
- Dilate musen elever med fenylephrin HCL (2,5%) og atropinsulfat (1 %) for å tillate god synlighet av glasslegemet og bruke en smøremiddel øyegel til øynene for å holde dem hydrert under prosedyren.
- Punkter sclera på limbus med en 26 G nål som føringshull, og pass på at 1) nålen er i en 45° vinkel med øyet og bordet og 2) skråspissen er spisset oppover for å unngå punktering av linsen.
- Injiser kapslene forsiktig med en 27 G sløv spisskanyle festet til en Hamilton-sprøyte i en 45° vinkel under visuell inspeksjon, og pass på at du unngår å berøre linsen med nålen. Skade på linsen vil føre til kataraktdannelse. Kapslene skal være synlige i glasslegemet ved hjelp av disseksjonsmikroskopet (figur 4A).
- Etter tilbaketrekking av nålen, behandle injeksjonsstedet med antibiotikasalver neomycin og polymyxin B sulfater i tillegg til deksametason oftalmisk antibiotika salve.
- Påfør goniotaire hypromellose demulcent oftalmisk oppløsning (2,5%) til begge øynene for å hindre at hornhinnene tørker ut i gjenopprettingsperioden.
- Plasser musen på en varmepute som holdes ved 37 °C og overvåk til den er helt våken.
- En vellykket injeksjon av innkapslede ARPE-19-celler bør avsløre tilstedeværelsen av intakte kapsler i det glasslegemet i musen med bare mindre mengder rusk ved avbildning av øyet ved optisk koherenstomografi eller andre metoder (figur 4B).
- Det injiserte museøyet, etter noen dager med utvinning på grunn av operasjonen, er nå klar for det eksperimentelle paradigmet for hånden.
MERK: Det kirurgiske oppsettet og dokumentasjonen av kapsler i øyet er avbildet i henholdsvis figur 3 og figur 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ARPE-19 celler er en spontant udødeliggjort menneskelig RPE cellelinje som har vist seg å være egnet til innkapsling og langsiktig overlevelse ved implantasjon av kapsler i øyet. Verktøyene for alginatinnkapsling er vist i figur 1. I denne studien ble det vist at ved innkapsling i alginat ble cellene i alginatkapsler bekreftet av lysfeltavbildning (figur 2A). Levende døde analyser ble utført på cellene inne i kapslene, og viste 90 % levedyktighet etter innkapsling (figur 2B). For å sikre at cellenes langsiktige levedyktighet i kapslene ble oppløst i natriumsitrat og celler ble deretter re-belagt (figur 2C). Etter å ha bekreftet i uavhengige eksperimenter at de stabile transinfiserte ARPE-19-cellene uttrykte og utskilt den biologiske som var ønsket14, og etter å ha etablert parametrene for trygt innkapsling av celler, ble kapsler produsert for intraokulær injeksjon.
Intravitrealinjeksjoner i museøyet krever bruk av en 27 G stump spiss nål (indre diameter på 210 μm) og nøyaktig leveringssystem for å konsekvent injisere det nødvendige lille volumet på 1 μL. Størrelsen på kapsler som ikke ble skadet under utstøting gjennom 27 G-nålen ble bekreftet av mikroskopi (figur 2A). En optimal størrelse på 150 μm ble identifisert. Intravitreal injeksjon ble utført under visuell inspeksjon, noe som tillot visualisering av kapsler i glasslegemet (figur 4A). På samme måte ble OCT-avbildning utført, noe som bekreftet at et flertall av kapslene i det glasslegemet i musen var intakt med relativt små mengder rusk (figur 4B). I oppfølgingpubliserte eksperimenter ble det bekreftet at ønsket biologisk var tilstede i øyet ved terapeutisk relevante doser, og hemmet sykdomsprosessen under undersøkelse14. Disse resultatene bekreftet at innkapslede celler trygt kan injiseres i museøyne for langsiktig levering av biologer.
Figur 1: Innkapslingsprosessinstrumenter. Oppsettet inkluderer (A) en 3 ml sprøyte, (B) 0,2 μm filtre, (C) en 30 G, 1/2 tommers sløv spiss nål, (D) en elektronisk sprøytedriver, (E) en høyspenningsgenerator, (F) systemoppsettet, og (G) en 7 mm fast avstand mellom nålespissen og gelling løsningsoverflaten. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Celleinnkapsling. (A) Mikrokapsler fylt med ARPE 19 celler. (B) Levende / død analyse: [a] rød fluorescerende farge indikerer døde celler, og [b] grønn fluorescerende farge indikerer levende celler. (C) Kultiverte celler etter utvinning fra mikrokapsler som begynner med en liten klynge som vokser til samløp. Skala barer = 100 μm. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Kirurgisk oppsett. Et dissekerende mikroskop (1) med et videokamera (2) brukes til å visualisere prosedyren. Musen veies (3) for å administrere riktig mengde bedøvelse og plassert på en liten plattform (4) for å lette håndtering og injeksjon. Øynene er utvidet med mydriatika attropin og fenylepinphrin (5) og holdes hydrert med smøremiddel (6). Et føringshull punkteres like utenfor limbus ved hjelp av en 26 G nål (7). Glasssprøyten (8), lastet med passende fortynnede kapsler (9), er plassert i en 45° vinkel til museøyet og avansert gjennom føringshullet, ved hjelp av en mikromanipulator (10). Nålesporet samt kapslene som frigjøres, kan visualiseres [(11); se figur 4]. Ved tilbaketrekking av nålen er hornhinnen fuktet med hypromellose (12) og antibiotikasalve (13) påført injeksjonsstedet for å unngå infeksjon. Etter prosedyren vil musen bli plassert på en 37 °C varmepute og overvåkes til den er helt våken. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Innkapslet celleteknologi for å levere ARPE-19 inn i øyet. (A) Injeksjoner utføres ved hjelp av en stump 27 G nål festet til en Hamilton sprøyte. Nålen sporet kan følges som spissen av nålen kommer inn i øyet, unngå linsen og kapslene (pilhode) kan visualiseres, forstørret av det optiske systemet i museøyet. Det bør bemerkes at den sirkulære refleksjonen av lyskilden. (B) Kapsler (pilhode) kan avbildes i glasslegemet ved hjelp av optisk koherenstomografi. Skala barer = 200 μm. Panel B ble gjengitt med tillatelse fra Annamalai et al.14Vennligst klikk her for å vise en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne celleinnkapslingsteknikken er relativt rask og enkel å utføre; Visse punkter må imidlertid huskepå for å oppnå nøyaktige nedstrømsresultater. Celler bør opprettholdes i kultur i en Petri-skål før innkapsling og holdes på riktig samløp. Innkapsling bør utføres i en riktig ventilasjonshette med regulert luftstrøm, om mulig. For sterk av en luftstrøm kan påvirke kapseldannelse, spesielt i langsiktige eksperimenter. Sterile redskaper og løsninger er avgjørende for langsiktig vedlikehold av celler i kapselen.
I dag brukes levende død farging som et bekreftende verktøy for å bestemme levedyktigheten til celler i kapslene. Antall celler per kapsel og under gjeldende tilstand (dvs. normalt 12–20 celler per kapsel) bestemmes også visuelt. Levedyktigheten til hver batch av innkapslede cellepartier overvåkes av denne metoden. For ytterligere å bestemme levedyktigheten til cellene, oppløses og re-kultivert. Dette viser ytterligere levedyktigheten og integriteten til celler i kapslene, og validerer vellykket cellulær innkapsling.
Parametrene som brukes til cellulær innkapsling er etablert for denne spesielle celletypen. Parametrene nevnt ovenfor er de som brukes til innkapsling av ARPE 19 celler for disse eksperimentene. Strømningshastighet, alginatkonsentrasjon, spenning som påføres og sekundært belegg av kapslene er alle variabler som kan justeres for riktig bruk av kapslene. På samme måte må mengden kapsler som kreves for et gitt eksperiment, bestemmes enten empirisk eller basert på den kjente PK/PD av biologene. Det er viktig å alltid utføre passende kontrolleksperimenter, legge til tomme kapsler for å kontrollere for tilstedeværelsen av kapslene og kapslene lastet med utransfected ARPE-19-celler for å kontrollere for tilstedeværelse av utskillede faktorer. ARPE-19 celler kan også være stabilt transfected med en kontroll plasmid, som tilstedeværelsen av enda et lite antall kapsler i den lille glasslegemet av musen (<10 μL) ser ut til å endre den normale fysiologien i øyet. Innenfor denne sammenhenger er det viktig å vite sekome av APRE-19 celler under innkapslingsforhold (så vel som i nærvær av glasslegemet i en bestemt sykdomstilstand), da de utskillede proteinene kan forstyrre effekten av biologisk eion
Til slutt ble denne teknikken implementert for å gi proof-of-principle for langsiktig levering av komplementhemmere for behandling av AMD og for å forbedre den nåværende metoden for intravitreale injeksjoner14. På dagens utviklingsstadium injiseres komplementhemmere i glasslegemet, vanligvis ved hjelp av månedlige injeksjoner. Dette inkluderer injeksjon av komplementfaktor D som blokkerer antistofflampalizumab18, som mislyktes i en klinisk fase III-studie for å redusere utviklingen av geografisk atrofi, eller komplementfaktor 3-hemmeren APL-219, som for tiden er i en klinisk fase III-studie.
Intravitreal injeksjon hemmes av bivirkninger av selve injeksjonen (dvs. risiko for netthinneavløsning, økning i intraokulært trykk, endophthalmitt osv.). I tillegg vil legemiddelnivåene variere betydelig i løpet av måneden ved månedlige intravitreale injeksjoner, og returreaksjoner kan forventes. Som et alternativ utvikles genterapistrategier, for eksempel den oppløselige CD59-komplementhemmeren20, som for tiden er i en klinisk fase I-studie. Innkapslede celler tillater også kontinuerlig produksjon av en biologisk i lengre perioder og kan avsluttes (dvs. eksplanting av kapselen), om nødvendig.
Til dags dato har vi bare testet for produksjon av en biologisk i løpet av ~ 6 uker14. Det bør bemerkes at metoden som er beskrevet her, bare skal brukes til prinsippbevis i dyremodeller og ikke til bruk hos pasienter, da de alginatkapsler ikke er tilstrekkelig stabile til å fullstendig forhindre makulering under injeksjonen og forventes ikke å vare mer enn noen få uker. I motsetning kan en solid enhet som utviklet av Neurotech vare i år21 for å levere de nødvendige faktorene22,23,24. I tillegg kan denne nye teknikken også kombineres med innkapslet legemiddellevering. Samlet sett forventes det at dette nye feltet raskt vil utvikle seg som en alternativ strategi for gjentatte injeksjoner av terapeutiske genterapi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Studien ble delvis støttet av tilskudd tildelt B.R. av National Institutes of Health (R01EY019320), Department of Veterans Affairs (RX000444 og BX003050), og South Carolina SmartState Endowment.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3 mL Syringe | BD | 309656 | |
| 30 G 1" Blunt needle | SAI Infusion technology | B30-100 | |
| Alginic acid sodium salt, from brown algae | Sigma | A0682 | |
| Atropine Sulfate Ophthalmolic solution (1%) | Akorn | NDC 17478-215-15 | for pupil dilation |
| BD 1 mL Syringe 26 G x 3/8 (0.45 mm x 10 mm) | Becton, Dickinson and Company | DG518105 500029609 REF 309625 | to generate the guide hole |
| Calcium chloride, Anhydrous, granular | Sigma | C1016 | |
| GenTeal Tears | Alcon | NDC 0078-0429-47 | to lubricate the eyes during anesthesia |
| Goniotaire: Hypromellose (2.5%) Ophthalmolic Demulcent Solution (Sterile) | Altaire Pharmaceuticals Inc. | NDC 59390-182-13 | to lubricate the eyes during anesthesia |
| Hamilton Needle/syringe Tip: 27 G, Small Hub RN NDL, custum length (12 mm), point style 3, 6/PK | Hamilton | 7803-01 | for intravitreal delivery of capsules |
| Hamilton Syringe: 2.5 µL, Model 62 RN SYR, NDL Sold Separately | Hamilton | 7632-01 | for intravitreal delivery of capsules |
| HEPES buffer, 1 M | Fisher Bioreagents | BP299100 | |
| High voltage generator | ESD EMC Technology | ES813-D20 | |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit | Thermofisher Scientific | L3224 | |
| L-Ornithine hydrochloride, 99% | Alfa Aesar | A12111 | |
| Neomycin and Polymyxin B Sulfates and Dexamethasone Ophthalmolic Ointment | SANDOZ | NDC 61314-631-36 | antibiotic to prevent infection after intravitreal injection |
| Phenolephrine Hydrochloride Ophthalmolic Solution (2.5%) | Akorn | NDC 17478-201-15 | for pupil dilation |
| Sodium Chloride | Sigma | S-5886 | |
| Sterile syringe filters, 0.2 μm | VWR | 28143-312 | |
| Syringe pump | GRASEBY | MS16A |
References
- Allen, T. M., Cullis, P. R. Drug delivery systems: entering the mainstream. Science. 303 (5665), 1818-1822 (2004).
- Tonnesen, H. H., Karlsen, J. Alginate in drug delivery systems. Drug Development and Industrial Pharmacy. 28 (6), 621-630 (2002).
- Vilos, C., Velasquez, L. A. Therapeutic strategies based on polymeric microparticles. Journal of Biomedical Biotechnology. 672760, (2012).
- Gasperini, L., Mano, J. F., Reis, R. L. Natural polymers for the microencapsulation of cells. Journal of the Royal Society Interface. 11 (100), 20140817 (2014).
- Gasper, D. P. R. Novel strategy to produce a drug delivery system for skin regeneration. Uma nova estratégia para produzir um dispositivo para entrega de fármacos que será usado na regeneração da pele. , (2012).
- Huang, S., Fu, X. Naturally derived materials-based cell and drug delivery systems in skin regeneration. Journal of Controlled Release. 142 (2), 149-159 (2010).
- Nograles, N., Abdullah, S., Shamsudin, M. N., Billa, N., Rosli, R. Formation and characterization of pDNA-loaded alginate microspheres for oral administration in mice. Journal of Bioscience and Bioengineering. 113 (2), 133-140 (2012).
- Moore, K., Amos, J., Davis, J., Gourdie, R., Potts, J. D. Characterization of polymeric microcapsules containing a low molecular weight peptide for controlled release. Microscopy and Microanalysis. 19 (1), 213-226 (2013).
- Xu, Y., Skotak, M., Hanna, M. Electrospray encapsulation of water-soluble protein with polylactide. I. Effects of formulations and process on morphology and particle size. Journal of Microencapsulation. 23 (1), 69-78 (2006).
- Gryshkov, O., et al. Process engineering of high voltage alginate encapsulation of mesenchymal stem cells. Materials Science and Engineering: C. 36, 77-83 (2014).
- Thanos, C. G., et al. Sustained secretion of ciliary neurotrophic factor to the vitreous, using the encapsulated cell therapy-based NT-501 intraocular device. Tissue Engineering. (11-12), 1617-1622 (2004).
- Kauper, K., et al. Two-year intraocular delivery of ciliary neurotrophic factor by encapsulated cell technology implants in patients with chronic retinal degenerative diseases. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (12), 7484-7491 (2012).
- Kauper, K., et al. Long term, sustained intraocular delivery of a VEGF antagonist using encapsulated cell technology implant for the treatment of choroidal neovascular diseases. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53, 455 (2012).
- Annamalai, B., et al. Encapsulated Cell Technology-Based Delivery of a Complement Inhibitor Reduces Choroidal Neovascularization in a Mouse Model. Translational Visual Science Technology. 7 (2), 3 (2018).
- Alge, C. S., et al. Retinal Pigment Epithelium Is Protected Against Apoptosis by αB-Crystallin. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 43 (11), 3575-3582 (2002).
- Chiu, K., Chang, R. C., So, K. F. Intravitreous injection for establishing ocular diseases model. Journal of Visualized Experiments. (8), 313 (2007).
- Jove Science Education Database. Lab Animal Research. Anesthesia Induction and Maintenance. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
- Holz, F. G., et al. Efficacy and Safety of Lampalizumab for Geographic Atrophy Due to Age-Related Macular Degeneration: Chroma and Spectri Phase 3 Randomized Clinical Trials. JAMA Ophthalmology. 136 (6), 666-677 (2018).
- Kassa, E., Ciulla, T. A., Hussain, R. M., Dugel, P. U. Complement inhibition as a therapeutic strategy in retinal disorders. Expert Opinion in Biological Therapy. 19 (4), 335-342 (2019).
- Cashman, S. M., Ramo, K., Kumar-Singh, R. A Non Membrane-Targeted Human Soluble CD59 Attenuates Choroidal Neovascularization in a Model of Age Related Macular Degeneration. PLoS ONE. 6 (4), e19078 (2011).
- Vincent, L., et al. Generation of combination PDGF / VEGF-antagonist ECT devices. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54, 3290 (2013).
- Zhang, K., et al. Ciliary neurotrophic factor delivered by encapsulated cell intraocular implants for treatment of geographic atrophy in age-related macular degeneration. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (15), 6241-6245 (2011).
- Chew, E. Y., et al. Ciliary neurotrophic factor for macular telangiectasia type 2: results from a phase 1 safety trial. American Journal of Ophthalmology. 159 (4), 659-666 (2015).
- Birch, D. G., et al. Randomized trial of ciliary neurotrophic factor delivered by encapsulated cell intraocular implants for retinitis pigmentosa. American Journal of Ophthalmology. 156 (2), 283-292 (2013).
