Summary
Aquí se presenta un protocolo para el uso del alginato como polímero en la microencapsulación de células inmortalizadas para la entrega a largo plazo de productos biológicos a ojos de roedores.
Abstract
Muchas terapias actuales en desarrollo para enfermedades del polo posterior del ojo son biológicas. Estos medicamentos deben administrarse con frecuencia, por lo general a través de inyecciones intravítreas. Las células encapsuladas que expresan el biológico de elección se están convirtiendo en una herramienta para la producción y liberación de proteínas locales (por ejemplo, a través de la administración de fármacos a largo plazo). Además, los sistemas de encapsulación utilizan materiales permeables que permiten la difusión de nutrientes, desechos y factores terapéuticos dentro y fuera de las células. Esto ocurre mientras se enmascaran las células de la respuesta inmune del huésped, evitando la necesidad de supresión del sistema inmunitario huésped. Este protocolo describe el uso del alginato como polímero en microencapsulación junto con el método de electrospray como una técnica de microencapsulación. Las células ARPE-19, una línea celular de RPE humana que surge espontáneamente, se ha utilizado en experimentos de terapia celular a largo plazo debido a su funcionalidad de vida útil, y se utiliza aquí para la encapsulación y entrega de las cápsulas a los ojos del ratón. El manuscrito resume los pasos para la microencapsulación celular, el control de calidad y la entrega ocular.
Introduction
Las terapias basadas en células representan técnicas biológicas revolucionarias que se han aplicado ampliamente en la medicina. Recientemente, se han aplicado con éxito en el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas, enfermedades oculares, y el cáncer. Las terapias celulares cubren una amplia gama de campos, desde el reemplazo celular hasta la administración de fármacos, y este protocolo se centra en este último. Las microcápsulas de alginato biodegradables (MC) han demostrado eficacia como sistema de administración, y se están utilizando ampliamente en el campo biomédico. El alginato se ha utilizado en microencapsulación debido a su sencillo proceso de gelificante, biodegradabilidad, excelente biocompatibilidad y estabilidad en condiciones in vivo1,2,3,4.
El método de electrospray, como técnica de microencapsulación, se ha utilizado con éxito para encapsular péptidos y proteínas utilizando alginato (polímero base) y poli-l-ornitina (polímero de recubrimiento secundario). Ambos polímeros se encuentran naturalmente y se utilizan para su biocompatibilidad5,,6,7. Sin embargo, el principal desafío en las terapias basadas en células es la supresión del sistema inmunitario huésped para evitar efectos secundarios causados por fármacos inmunosupresores. La permeabilidad de las microcápsulas de alginato se considera una propiedad adecuada para la encapsulación celular, que permite la difusión de nutrientes, residuos y factores terapéuticos dentro y fuera de las células mientras los enmascara desde la respuesta inmune del huésped8,9,10.
En el ojo, las células encapsuladas se han utilizado en ensayos clínicos para la administración constante de productos biológicos (es decir, factores de crecimiento11,,12 y antagonistas del factor de crecimiento13) para el tratamiento de la retinitis pigmentosa o degeneración macular relacionada con la edad. Otros objetivos, como los inhibidores del complemento14, también se están explorando actualmente en entornos preclínicos.
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Protocol
Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con la Declaración de ARVO para el Uso de Animales en Investigación Oftálmica y de La Visión y fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Médica de Carolina del Sur bajo el protocolo ID 00399.
1. Cultivo celular
- Generar células epiteliales de pigmento de la retina humana (ARPE-19) que expresen de forma estable el gen de elección según los protocolos publicados14,15.
- Mantener las células en el medio de águila modificado (DMEM) de Dulbecco complementado con 10% de suero bovino fetal (FBS).
- Incubar las células a 37oC y 5%CO2.
- Sustituya el medio cada 2-3 días.
- Pasar las células después de alcanzar 70%-80% de confluencia usando procedimientos de cultivo de tejidos estándar.
2. Encapsulación celular
- Mezclar el alginato de sodio con agua desionizada (DI) para una concentración final de 2% p/v y purificar por filtración con un filtro de jeringa estéril de 0,2 m.
- Preparar las células que se van a mezclar con la solución de alginato mediante la trippsinización, centrifugación, y lavarcon 10 mM HEPES solución salina tamponada (pH a 7.4). Usando un hemocitómetro, cuente las células y ajuste la concentración celular final a 1 x 106 en solución de alginato.
NOTA: El proceso de encapsulación debe ejecutarse dentro de una capucha esterilizada. - Cargue alícuotas de alginato y células de 300 ol en una jeringa de 3 ml y adjúntela a una bomba de jeringa. La solución se bombeará a través de una aguja de punta contundente de 30 G a un baño de gelificante estéril colocado en un vaso de precipitados estéril de 50 ml debajo de la punta de la jeringa a 7 mm para una distancia de pulverización de aguja a baño.
- El baño de gelificante contiene un volumen de 40 ml de solución salina tamponada HEPES de 10 mM que contiene cloruro de calcio de 100 mM (CaCl2) y 0,5% p/v poli-L-ornitina (PLO). La OLP es un recubrimiento de polímero secundario que se puede omitir o cambiar de acuerdo con las necesidades del investigador.
- Ajuste el voltaje y el caudal y manténgalos constantes durante el proceso de encapsulación a un caudal de 60 mm/h y un voltaje inicial de 6,0 kV para producir microcápsulas de tamaño de 150 m.
- Conecte el clip del cable de ánodo (rojo) de una punta de aguja del generador de alto voltaje a la aguja y conecte el clip de tierra (negro) al cable de cobre que está medio sumergido en el baño de gelificante. Un lote de la mezcla de alginato + célula (1 ml) tarda aproximadamente 30 minutos en preparar las células encapsuladas (aproximadamente 25.000 microcápsulas).
- Lavar las microcápsulas formadas que contienen células con solución de lavado (10 mM de solución tamponada HEPES que contiene 1,5 mM de CaCl2,pH a 7,4) dos veces. No utilice PBS para lavar.
- Incubar las células encapsuladas con medios DMEM suplementados al 10% FBS en una incubadora humidificada a 37oC y 5% deCO2.
NOTA: Los instrumentos de proceso de encapsulación se muestran en la Figura 1.
3. Confirmación de que la encapsulación no afecta a la viabilidad celular
- Después de incubar las células encapsuladas durante 24 horas en medios, prepare una pequeña muestra de 500 l (30 microcápsulas) para la tinción.
- Lavar las microcápsulas 2 veces con solución de lavado (10 mM DE HEPES solución salina tamponada que contiene 1,5 mM CaCl2) y mancharlas para la viabilidad viva-muerta utilizando un kit de ensayo vivo/muerto.
- Preparar una mezcla de tinción de calceína AM (acetoxymethyl) y etidio homodímero-1 en concentraciones finales de 2 m y 4 m, respectivamente.
- Añadir 2 ml de la mezcla de tinción a las células encapsuladas e incubar durante 30-45 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente (RT).
- Con una aspiración cuidadosa, aspirar la solución de tinción y lavar las microcápsulas 2x con la solución de lavado. Utilice un sistema de microscopio fluorescente para observar e imaginar las células encapsuladas.
NOTA: La documentación de la encapsulación se muestra en la Figura 2.
4. Confirmación de que las Cápsulas son el tamaño apropiado para la entrega y entrega de la
- Las inyecciones intravítreas en el ojo del ratón se realizan típicamente con una aguja de punta contundente de 27 G (diámetro interno de 210 m) unida a una jeringa Hamilton de 2,5 ml.
- Genere cápsulas que van de 100 a 200 m, diluya en medios libres de suero y tire cuidadosamente de ellas hacia arriba en la jeringa de Hamilton. PBS no es un vehículo adecuado, ya que las cápsulas de alginato se disolverán en PBS.
- Expulse lentamente 1 l de gotas que contengan cápsulas a una diapositiva del microscopio y determine su integridad utilizando un microscopio de campo brillante vertical.
- Ajuste el tamaño de la cápsula (consulte el paso 2.3) ajustando el voltaje y el caudal en consecuencia. Las microcápsulas más pequeñas se producen de manera no lineal aumentando el voltaje y disminuyendo ligeramente el caudal8. En nuestras manos, cápsulas de 150 m de diámetro demostraron ser las más adecuadas. El ajuste del tamaño de la cápsula también depende de mantener constante la concentración de alginato mientras se cambian los otros parámetros.
- Mantener un conjunto separado de células en cápsulas del tamaño adecuado en medio libre de suero para determinar la cantidad de secreción del biológico deseado. Utilice ELISA sensibles o hincha occidental para determinar la concentración de los biológicos en el sobrenadante.
- Determinar la cantidad necesaria de cápsulas que deben inyectarse en función de la PK/PD conocida (farmacocinética/farmacodinámica) de la terapéutica. En nuestras manos, 10 cápsulas por ojo de ratón demostraron ser más eficaces.
5. Entrega de cápsulas en el vítreo del ratón
- Realice inyecciones intravítreas con un microscopio de disección. Consulte la Figura 3 para la configuración quirúrgica y los materiales utilizados durante el procedimiento. Un protocolo detallado para las inyecciones intravítreas se puede encontrar en otro lugar16.
- Anestetizar ratones por inyección intraperitoneal de xilazina y ketamina (20 mg/kg y 80 mg/kg) u otros anestésicos preferidos aprobados por el Comité de Cuidado y Uso Animal de la institución específica. Asegurar la profundidad adecuada de la anestesia usando un pellizco de dedo del dedo del día17.
- Dilatar las pupilas del ratón con fenilefrina HCL (2,5%) y sulfato de atropina (1%) para permitir una buena visibilidad de la cámara vítrea y aplicar un gel lubricante para los ojos a los ojos para mantenerlos hidratados durante el procedimiento.
- Perforar la esclerótica en el limbo con una aguja de 26 G como orificio guía, asegurándose de que 1) la aguja está en un ángulo de 45o con el ojo y la mesa y 2) la punta biselada se apunta hacia arriba para evitar perforar la lente.
- Inyecte cuidadosamente las cápsulas con una aguja de punta contundente de 27 G unida a una jeringa de Hamilton en un ángulo de 45o bajo inspección visual, asegurándose de evitar tocar la lente con la aguja. La lesión de la lente conducirá a la formación de cataratas. Las cápsulas deben ser visibles en el vítreo utilizando el microscopio de disección (Figura 4A).
- Después de la retracción de la aguja, tratar el lugar de inyección con ung enbetos antibiótico sulfatos de neomicina y polimixina B, además de dexametasona oftalmológica antibiotic pomada.
- Aplicar goniotaire hipromelosa solución oftálmica demulcente (2,5%) a ambos ojos para evitar que las córneas se sequen durante el período de recuperación.
- Coloque el ratón sobre una almohadilla de calentamiento a 37 oC y monitoree hasta que esté completamente despierto.
- Una inyección exitosa de células ARPE-19 encapsuladas debe revelar la presencia de cápsulas intactas en la cámara vítrea del ratón con sólo pequeñas cantidades de escombros al tomar imágenes del ojo por tomografía de coherencia óptica u otros métodos(Figura 4B).
- El ojo del ratón inyectado, después de unos días de recuperación debido a la cirugía, ahora está listo para el paradigma experimental en cuestión.
NOTA: La configuración quirúrgica y la documentación de las cápsulas en el ojo se describen en la Figura 3 y la Figura 4,respectivamente.
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Representative Results
Las células ARPE-19 son una línea celular de RPE humana inmortalizada espontáneamente que se ha demostrado que es susceptible de encapsulación y supervivencia a largo plazo tras la implantación de cápsulas en el ojo. Las herramientas para encapsular alginato se muestran en la Figura 1. En este estudio, se demostró que al encapsular en alginato, las células de las cápsulas de alginato fueron confirmadas por imágenes de campo brillante(Figura 2A). Se realizaron ensayos muertos vivos en las células dentro de las cápsulas, demostrando 90% de viabilidad después de la encapsulación(Figura 2B). Para garantizar la viabilidad a largo plazo de las células dentro de las cápsulas, las cápsulas se disolvieron en citrato de sodio y las células fueron re-placadas(Figura 2C). Después de confirmar en experimentos independientes que las células ARPE-19 transinfectadas estables expresaron y secretó el biológico que se deseaba14,y después de establecer los parámetros para encapsular células de forma segura, se produjeron cápsulas para la inyección intraocular.
Las inyecciones intravítreas en el ojo del ratón requieren el uso de una aguja de punta contundente de 27 G (diámetro interno de 210 m) y un sistema de administración preciso para inyectar consistentemente el pequeño volumen requerido de 1 l. El tamaño de las cápsulas que no se dañaron durante la eyección a través de la aguja de 27 G se confirmó mediante microscopía(Figura 2A). Se identificó un tamaño óptimo de 150 m. La inyección intravítrea se realizó bajo inspección visual, lo que permitió la visualización de cápsulas en el vítreo(Figura 4A). Del mismo modo, se realizaron imágenes pTU, lo que confirmó que la mayoría de las cápsulas de la cámara vítrea del ratón estaban intactas con cantidades relativamente pequeñas de escombros(Figura 4B). En los experimentos publicados de seguimiento, se confirmó que el biológico deseado estaba presente en el ojo a dosis terapéuticamente relevantes, inhibiendo el proceso de la enfermedad bajo investigación14. Estos resultados confirmaron que las células encapsuladas se pueden inyectar con seguridad en los ojos del ratón para la entrega a largo plazo de productos biológicos.
Figura 1: Instrumentos de proceso de encapsulación. La configuración incluye (A) una jeringa de 3 ml, (B) filtros de 0,2 m, (C) una aguja de punta contundente de 30 G, 1/2 pulgada, (D) un controlador de jeringa electrónica, (E) un generador de alta tensión, (F) la configuración del sistema, y (G) una distancia fija de 7 mm entre la punta de la aguja y la superficie de la solución de gelificante. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Encapsulación de celdas. (A) Microcápsulas llenas de células ARPE 19. (B) Ensayo vivo/muerto: [un] color fluorescente rojo indica células muertas, y [b] color fluorescente verde indica células vivas. (C) Células cultivadas después de la recuperación de microcápsulas comenzando con un pequeño racimo creciendo a la confluencia. Barras de escala a 100 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Configuración quirúrgica. Se utiliza un microscopio de disección (1) con una cámara de vídeo (2) para visualizar el procedimiento. El ratón se pesa (3) para administrar la cantidad adecuada de anestésico y se coloca en una plataforma pequeña (4) para facilitar el manejo y la inyección. Los ojos se dilatan con midriatics atropina y fenilepinefrina (5) y se mantienen hidratados con lubricante (6). Un orificio guía se perfora justo fuera del limbo usando una aguja de 26 G (7). La jeringa de vidrio (8), cargada con cápsulas adecuadamente diluidas (9), se coloca en un ángulo de 45o con respecto al ojo del ratón y se avanza a través del orificio guía, utilizando un micromanipulador (10). La vía de la aguja, así como las cápsulas que se liberan se pueden visualizar [(11); ver Figura 4]. Tras la retracción de la aguja, la córnea se humedece con hipromelosa (12) y pomada antibiótica (13) aplicada en el lugar de inyección para evitar la infección. Después del procedimiento, el ratón se colocará en una almohadilla de calentamiento de 37 oC y se supervisará hasta que esté completamente despierto. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Tecnología de células encapsuladas para entregar ARPE-19 en el ojo. (A) Las inyecciones se realizan con una aguja contundente de 27 G unida a una jeringa de Hamilton. La vía de la aguja se puede seguir a medida que la punta de la aguja entra en el ojo, evitando la lente y las cápsulas (cabeza de flecha) se pueden visualizar, magnificadas por el sistema óptico del ojo del ratón. Cabe señalar que el reflejo circular de la fuente de luz. (B) Las cápsulas (cabeza de flecha) se pueden fotografiarse en el vítreo mediante tomografía de coherencia óptica. Barras de escala de 200 m. Panel B fue reimpreso con el permiso de Annamalai et al.14Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Esta técnica de encapsulación de células es relativamente rápida y fácil de realizar; sin embargo, ciertos puntos deben tenerse en cuenta para obtener resultados descendentes precisos. Las células deben mantenerse en cultivo en un plato de Petri antes de la encapsulación y mantenerse en la confluencia adecuada. La encapsulación debe realizarse en una campana de ventilación adecuada con flujo de aire regulado, si es posible. Demasiado fuerte de una corriente de aire puede afectar la formación de cápsulas, especialmente en experimentos a largo plazo. Los utensilios y soluciones estériles son fundamentales para el mantenimiento a largo plazo de las células dentro de la cápsula.
En la actualidad, la tinción viva-muerta se utiliza como una herramienta de confirmación para determinar la viabilidad de las células dentro de las cápsulas. El número de células por cápsula y bajo la condición actual (es decir, normalmente 12–20 células por cápsula) también se determina visualmente. Este método supervisa la viabilidad de cada lote de lotes de celdas encapsulados. Para determinar aún más la viabilidad de las células, las células encapsuladas se disuelven y se vuelven a cultivar. Esto demuestra aún más la viabilidad e integridad de las células dentro de las cápsulas, validando la encapsulación celular exitosa.
Los parámetros usados para la encapsulación celular se han establecido para este tipo de célula en particular. Los parámetros indicados arriba son los usados para la encapsulación de las células ARPE 19 para estos experimentos. El caudal, la concentración de alginato, el voltaje aplicado y el recubrimiento secundario de las cápsulas son todas las variables que se pueden ajustar para el uso adecuado de las cápsulas. Del mismo modo, la cantidad de cápsulas necesarias para un experimento determinado debe determinarse empíricamente o en función de la PK/PD conocida de los productos biológicos. Es importante realizar siempre experimentos de control adecuados, añadiendo cápsulas vacías para controlar la presencia de las cápsulas y cápsulas cargadas con células ARPE-19 no transtrofadas para controlar la presencia de factores secretos. Las células ARPE-19 también pueden ser transfectó de forma estable con un plásmido de control, ya que la presencia de incluso un pequeño número de cápsulas en el pequeño vítreo del ratón (<10 l) parece alterar la fisiología normal del ojo. En este contexto, es importante conocer el secretode de las células APRE-19 en condiciones de encapsulación (así como en presencia de vítreo en una condición de enfermedad particular), ya que las proteínas secretadas pueden interferir con la eficacia del biológico bajo investigación.
Por último, esta técnica se implementó para proporcionar pruebas de principio para la administración a largo plazo de inhibidores de complemento para el tratamiento de la DMAE y para mejorar el método actual de inyecciones intravítreas14. En la etapa actual de desarrollo, los inhibidores del complemento se inyectan en el vítreo, por lo general utilizando inyecciones mensuales. Esto incluye la inyección del anticuerpo de bloqueo del factor de complemento D lampalizumab18, que fracasó en un ensayo clínico de fase III para reducir la progresión de la atrofia geográfica, o el factor de complemento 3 inhibidor APL-219,que se encuentra actualmente en un ensayo clínico de fase III.
La inyección intravítrea se ve obstaculizada por los efectos secundarios de la inyección en sí (es decir, riesgo de desprendimiento de retina, aumento de la presión intraocular, endoftalmitis, etc.). Además, los niveles de drogas variarán significativamente en el transcurso del mes en las inyecciones intravítreas mensuales, y pueden esperarse reacciones de rebote. Como alternativa, se están desarrollando estrategias de terapia génica, como el inhibidor soluble del complemento CD5920,que actualmente se encuentra en un ensayo clínico de fase I. Las células encapsuladas también permiten la producción continua de un biológico durante largos períodos de tiempo y pueden terminarse (es decir, la explantación de la cápsula), si es necesario.
Hasta la fecha, sólo hemos probado para la producción de un biológico en el transcurso de 6 semanas14. Cabe señalar que el método descrito aquí sólo debe utilizarse para la prueba de principio en modelos animales y no para su uso en pacientes, ya que las cápsulas de alginato no son lo suficientemente estables como para evitar completamente la trituración durante la inyección y no se espera que duren más de unas semanas. Por el contrario, un dispositivo sólido como el desarrollado por Neurotech puede durar años21 para entregar los factores requeridos22,,23,24. Además, esta nueva técnica también se puede combinar con la administración encapsulada de medicamentos. En general, se espera que este campo emergente se desarrolle rápidamente como una estrategia alternativa para inyecciones repetidas de terapias de terapia génica.
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Disclosures
Los autores no declaran intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
El estudio fue apoyado en parte por subvenciones otorgadas a B. R. por los Institutos Nacionales de Salud (R01EY019320), el Departamento de Asuntos de Veteranos (RX000444 y BX003050), y la South Carolina SmartState Endowment.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3 mL Syringe | BD | 309656 | |
| 30 G 1" Blunt needle | SAI Infusion technology | B30-100 | |
| Alginic acid sodium salt, from brown algae | Sigma | A0682 | |
| Atropine Sulfate Ophthalmolic solution (1%) | Akorn | NDC 17478-215-15 | for pupil dilation |
| BD 1 mL Syringe 26 G x 3/8 (0.45 mm x 10 mm) | Becton, Dickinson and Company | DG518105 500029609 REF 309625 | to generate the guide hole |
| Calcium chloride, Anhydrous, granular | Sigma | C1016 | |
| GenTeal Tears | Alcon | NDC 0078-0429-47 | to lubricate the eyes during anesthesia |
| Goniotaire: Hypromellose (2.5%) Ophthalmolic Demulcent Solution (Sterile) | Altaire Pharmaceuticals Inc. | NDC 59390-182-13 | to lubricate the eyes during anesthesia |
| Hamilton Needle/syringe Tip: 27 G, Small Hub RN NDL, custum length (12 mm), point style 3, 6/PK | Hamilton | 7803-01 | for intravitreal delivery of capsules |
| Hamilton Syringe: 2.5 µL, Model 62 RN SYR, NDL Sold Separately | Hamilton | 7632-01 | for intravitreal delivery of capsules |
| HEPES buffer, 1 M | Fisher Bioreagents | BP299100 | |
| High voltage generator | ESD EMC Technology | ES813-D20 | |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit | Thermofisher Scientific | L3224 | |
| L-Ornithine hydrochloride, 99% | Alfa Aesar | A12111 | |
| Neomycin and Polymyxin B Sulfates and Dexamethasone Ophthalmolic Ointment | SANDOZ | NDC 61314-631-36 | antibiotic to prevent infection after intravitreal injection |
| Phenolephrine Hydrochloride Ophthalmolic Solution (2.5%) | Akorn | NDC 17478-201-15 | for pupil dilation |
| Sodium Chloride | Sigma | S-5886 | |
| Sterile syringe filters, 0.2 μm | VWR | 28143-312 | |
| Syringe pump | GRASEBY | MS16A |
References
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