Summary
عرض هنا هو بروتوكول لاستخدام alginate كبوليمر في microencapsulation من الخلايا الخلد لتسليم على المدى الطويل من البيولوجية إلى عيون القوارض.
Abstract
العديد من العلاجات الحالية قيد التطوير لأمراض القطب الخلفي للعين هي البيولوجية. هذه الأدوية تحتاج إلى أن تدار في كثير من الأحيان، وعادة عن طريق الحقن داخل الفيتيريال. وأصبحت الخلايا المغلفة التي تعبر عن المنطق البيولوجي المفضل أداة لإنتاج البروتين المحلي وإطلاقه (على سبيل المثال، عن طريق تسليم الأدوية على المدى الطويل). بالإضافة إلى ذلك، تستخدم أنظمة التغليف مواد نفاذية تسمح بنشر المواد الغذائية والنفايات والعوامل العلاجية من وإلى الخلايا. يحدث هذا أثناء إخفاء الخلايا من الاستجابة المناعية المضيفة ، وتجنب الحاجة إلى قمع الجهاز المناعي المضيف. يصف هذا البروتوكول استخدام alginate كبوليمر في الميكروينكابسوليشن إلى جانب طريقة الرذاذ الكهربائي كتقنية microencapsulation. وقد استخدمت خلايا ARPE-19، وهو خط الخلية RPE الإنسان الناشئة تلقائيا، في تجارب العلاج بالخلايا على المدى الطويل بسبب وظائفها مدى الحياة، ويستخدم هنا لتغليف وتسليم الكبسولات إلى عيون الماوس. تلخص المخطوطة خطوات microencapsulation الخلية، ومراقبة الجودة، وتسليم العين.
Introduction
تمثل العلاجات القائمة على الخلايا التقنيات البيولوجية الثورية التي تم تطبيقها على نطاق واسع في الطب. في الآونة الأخيرة، تم تطبيقها بنجاح في علاج الأمراض العصبية، وأمراض العيون، والسرطان. تغطي علاجات الخلايا مجموعة واسعة من الحقول من استبدال الخلايا إلى تسليم الدواء ، ويركز هذا البروتوكول على هذا الأخير. وقد أظهرت كبسولات الذبحة القابلة للتحلل (MC) فعالية كنظام تسليم، وأنها أصبحت تستخدم على نطاق واسع في مجال الطب الحيوي. وقد استخدمت Alginate في microencapsulation بسبب عملية هلام بسيطة، التحلل البيولوجي، والتوافق البيولوجي ممتازة، والاستقرار تحت في ظروف الجسم الحي1،,2،,3،,4.
وقد استخدمت طريقة البخاخة الكهربائية، كتقنية microencapsulation، بنجاح لتغليف الببتيدات والبروتينات باستخدام alginate (البوليمر الأساسي) وبولي ل-ornithine (البوليمر طلاء الثانوية). تم العثور على كل من البوليمرات بشكل طبيعي واستخدامها لتوافقها البيولوجي5،6،7. ومع ذلك ، فإن التحدي الرئيسي في العلاجات القائمة على الخلايا هو قمع الجهاز المناعي المضيف لتجنب الآثار الجانبية الناجمة عن الأدوية المثبطة للمناعة. تعتبر نفاذية كبسولات الجينات الدقيقة خاصية مناسبة لتغليف الخلايا ، مما يسمح بنشر المواد الغذائية والنفايات والعوامل العلاجية داخل الخلايا والخروج منها أثناء إخفاءها من الاستجابة المناعيةالمضيفة8،9،10.
في العين ، تم استخدام الخلايا المغلفة في التجارب السريرية للتسليم المستمر للبيولوجية (أي عوامل النمو11،12 وخصم عامل النمو13)لعلاج التهاب الشبكية الصباغي أو الضمور البقعي المرتبط بالعمر. ويجري حاليا ً استكشاف أهداف أخرى مثل مثبطاتالمكملات 14 في البيئات قبل السريرية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
أجريت جميع التجارب وفقًا لبيان ARVO لاستخدام الحيوانات في أبحاث العيون والرؤية وتمت الموافقة عليها من قبل اللجنة الطبية لرعاية الحيوانات واستخدامها في ولاية كارولينا الجنوبية بموجب بروتوكول ID 00399.
1. ثقافة الخلية
- توليد خلايا الظهارية صبغية الشبكية البشرية (ARPE-19) خط الخلية تعبر بشكل ثابت عن الجين المفضل وفقا للبروتوكولات المنشورة14،15.
- الحفاظ على الخلايا في جلوبيكو تعديل متوسط النسر (DMEM) مع استكمالها مع 10٪ مصل البقر الجنين (FBS).
- احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
- استبدال المتوسط كل 2-3 أيام.
- مرور الخلايا بعد الوصول إلى 70٪ -80٪ التقاء باستخدام إجراءات زراعة الأنسجة القياسية.
2- تغليف الخلايا
- اخلطي الجينات الصوديوم مع الماء المنزوع (DI) لتركيز نهائي قدره 2% ث/في وطهرعن طريق الترشيح مع فلتر حقنة معقمة بسعة 0.2 ميكرومتر.
- إعداد الخلايا لتكون مختلطة مع محلول alginate عن طريق trypsinizing، الطرد المركزي، وغسلها مع 10 mM HEPES محلول المالحة المخزنة مؤقتا (pH = 7.4). باستخدام مقياس الهيموكيتومتر، عد الخلايا وضبط تركيز الخلية النهائية إلى 1 × 106 في محلول الذبحة الصدرية.
ملاحظة: يجب تشغيل عملية التغليف داخل غطاء محرك السيارة المعقم. - تحميل ~ 300 μL aliquots من alginate وخليط الخلايا في حقنة 3 مل ونعلق على مضخة حقنة. سيتم ضخ الحل من خلال إبرة طرف حادة 30 G إلى حمام هلام معقم يوضع في كوب 50 مل معقم تحت طرف الحقنة في 7 ملم لإبرة لحمام مسافة الرش.
- يحتوي حمام الهلام على حجم 40 مل من 10 mM HEPES المالحة المخزنة مؤقتا التي تحتوي على 100 mM كلوريد الكالسيوم (CaCl2)و 0.5٪ ث / ضد بولي L-ornithine (منظمة التحرير الفلسطينية). منظمة التحرير الفلسطينية هي طبقة بوليمر ثانوية يمكن حذفها أو تغييرها وفقا لاحتياجات المحقق.
- ضبط الجهد ومعدل التدفق والحفاظ على حد سواء ثابتة خلال عملية التغليف بمعدل تدفق 60 ملم / ساعة والجهد الأولي 6.0 كيلوفولت لإنتاج حجم microcapsules ~ 150 ميكرومتر.
- توصيل مقطع من سلك أنود (أحمر) من طرف إبرة مولد الجهد العالي إلى إبرة وربط مقطع الأرض (أسود) إلى الأسلاك النحاسية التي هي في منتصف الطريق مغمورة في حمام هلام. دفعة واحدة من خليط alginate + الخلية (1 مل) يستغرق حوالي 30 دقيقة لإعداد الخلايا المغلفة (حوالي 25،000 كبسولة صغيرة).
- اغسل الكبسولات الدقيقة المشكّلة التي تحتوي على خلايا مع محلول الغسيل (10 مل HEPES المخزنة مؤقتاً مع محلول المحلول المالح الذي يحتوي على 1.5 مل CaCl2، درجة الحموضة = 7.4) مرتين. لا تستخدم برنامج تلفزيوني للغسيل.
- احتضان الخلايا المغلفة مع 10٪ FBS تكمل وسائل الإعلام DMEM في حاضنة رطبة في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
ملاحظة: وترد أدوات عملية التغليف في الشكل 1.
3. تأكيد أن التغليف لا يؤثر على صلاحية الخلية
- بعد احتضان الخلايا المغلفة لمدة 24 ساعة في وسائل الإعلام ، قم بإعداد عينة صغيرة من 500 ميكرولتر (~ 30 كبسولة دقيقة) للتلطيخ.
- غسل microcapsules 2x باستخدام محلول الغسيل (10 mM HEPES المالحة العازلة التي تحتوي على 1.5 mM CaCl2)ووصمة عار لهم لقابلة البقاء حية ميتة باستخدام مجموعة القتلى الحية / القتلى.
- إعداد خليط تلطيخ من calcein AM (acetoxymethyl) والإيثيدييوم homodimer-1 بتركيزات نهائية من 2 ميكرومتر و 4 ميكرومتر، على التوالي.
- أضف 2 مل من خليط تلطيخ إلى الخلايا المغلفة واحتضان لمدة 30-45 دقيقة في الظلام في درجة حرارة الغرفة (RT).
- مع الطموح الدقيق، ونسخل محلول تلطيخ وغسل microcapsules 2x مع محلول الغسيل. استخدام نظام المجهر الفلورسنت لمراقبة وصورة الخلايا مغلفة.
ملاحظة: ويصور توثيق التغليف في الشكل 2.
4. تأكيد أن كبسولات هي الحجم المناسب للتسليم والتسليم من البيولوجية
- عادة ما يتم تنفيذ الحقن داخل الفيريتريال في عين الماوس مع إبرة 27 G حادة الطرف (القطر الداخلي من 210 ميكرون) تعلق على حقنة هاملتون 2.5 ميكرولتر.
- توليد كبسولات تتراوح بين 100 إلى 200 ميكرون، تمييعها في وسائل الإعلام الخالية من المصل، وسحبها بعناية حتى في حقنة هاملتون. PBS ليست وسيلة مناسبة، كما كبسولات الذبحة سوف تذوب في برنامج تلفزيوني.
- إخراج ببطء 1 μL قطرات تحتوي على كبسولات على شريحة المجهر وتحديد سلامتها باستخدام المجهر مشرق الميدان تستقيم.
- ضبط حجم كبسولة (انظر الخطوة 2.3) عن طريق ضبط الجهد ومعدل التدفق وفقا لذلك. يتم إنتاج كبسولات صغيرة بطريقة غير خطية عن طريق زيادة الجهد وانخفاض معدل التدفق قليلا8. في أيدينا، ثبت كبسولات من 150 ميكرومتر في القطر لتكون الأكثر ملاءمة. تعديل حجم كبسولة يعتمد أيضا على الحفاظ على تركيز alginate ثابت في حين تغيير المعلمات الأخرى.
- الحفاظ على مجموعة منفصلة من الخلايا في كبسولات من الحجم المناسب في وسط خالية من المصل لتحديد كمية إفراز البيولوجية المطلوبة. استخدام ELISAs الحساسة أو النشاف الغربي لتحديد تركيز البيولوجية في supernatant.
- تحديد الكمية المطلوبة من الكبسولات التي تحتاج إلى حقن على أساس PK / PD المعروف (الدوائية / الديناميكا الدوائية) العلاجية. في أيدينا، 10 كبسولات لكل عين الماوس ثبت أن تكون الأكثر فعالية.
5. تسليم كبسولة في الزجاجي الماوس
- إجراء الحقن داخل الفيتريال باستخدام المجهر تشريح. انظر الشكل 3 للإعداد الجراحي والمواد المستخدمة أثناء العملية. ويمكن الاطلاع على بروتوكول مفصل للحقن intravitreous في مكان آخر16.
- تخدير الفئران عن طريق الحقن داخل perperitoneal من xylazine والكيتامين (20 ملغ / كجم و 80 ملغ / كجم) أو غيرها من التخدير المفضل المعتمد من قبل لجنة رعاية الحيوان واستخدامه في المؤسسة المحددة. ضمان العمق المناسب للتخدير باستخدام قرصة إصبع القدم17.
- يُزلّط التلاميذ الماوس مع فينيلفرين HCL (2.5%) وكبريتات الأتروبين (1%) للسماح لرؤية جيدة من الغرفة الزجاجي وتطبيق هلام العين التشحيم على العينين للحفاظ على رطوبة لهم أثناء الإجراء.
- ثقب السكليرا في أطرافه مع إبرة 26 G كثقب دليل، والتأكد من أن 1) الإبرة في زاوية 45 درجة مع العين والجدول و 2) يتم توجيه تلميح مشقوق صعودا لتجنب ثقب العدسة.
- حقن بعناية كبسولات باستخدام إبرة 27 G حادة تلميح تعلق على حقنة هاملتون في زاوية 45 درجة تحت الفحص البصري، مع التأكد من تجنب لمس العدسة مع الإبرة. إصابة العدسة سوف تؤدي إلى تشكيل إعتام عدسة العين. يجب أن تكون الكبسولات مرئية في الجسم الزجاجي باستخدام المجهر تشريح(الشكل 4A).
- بعد التراجع عن الإبرة ، عالج موقع الحقن بمراهم المضادات الحيوية neomycin وكبريتات البولي ميكسين B بالإضافة إلى مرهم المضادات الحيوية لطب العيون ديكساميثازون.
- تطبيق goniotaire hypromellose المُحلب ة محلول العيون (2.5%) إلى كلتا العينين لمنع القرنيات من الجفاف خلال فترة الانتعاش.
- ضع الماوس على وسادة تدفئة في 37 درجة مئوية وراقب حتى مستيقظة تمامًا.
- وينبغي حقن ناجحة من الخلايا ARPE-19 مغلفة تكشف عن وجود كبسولات سليمة في الغرفة الزجاجي للفأرة مع كميات طفيفة فقط من الحطام عند تصوير العين عن طريق التصوير المقطعي التماسك البصري أو أساليب أخرى(الشكل 4B).
- العين الفأرة حقن، بعد بضعة أيام من الانتعاش بسبب الجراحة، هو الآن على استعداد لنموذج التجريبية في متناول اليد.
ملاحظة: يتم تصوير الإعداد الجراحي وتوثيق الكبسولات في العين في الشكل 3 والشكل 4، على التوالي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
خلايا ARPE-19 هي خط خلية RPE بشرية خالدة تلقائيًا ثبت أنها قابلة للتغليف والبقاء على قيد الحياة على المدى الطويل عند زرع كبسولات في العين. وترد أدوات تغليف الذبحة الصدرية في الشكل 1. في هذه الدراسة ، ثبت أنه عند التغليف في الذبحة الصدرية ، تم تأكيد الخلايا الموجودة في كبسولات الذبحة الزاهية عن طريق التصوير في المجال الساطع(الشكل 2A). تم تنفيذ المقالات الحية الميتة على الخلايا داخل الكبسولات ، مما يدل على بقاء 90٪ بعد التغليف(الشكل 2B). لضمان بقاء الخلايا على المدى الطويل داخل كبسولات ، تم إذابة الكبسولات في سترات الصوديوم ثم أعيد مطلي الخلايا(الشكل 2C). بعد تأكيد في تجارب مستقلة أن الخلايا المستقرة FECTED ARPE-19 عبرت وتفرز البيولوجية التي كانت مرغوبة14، وبعد وضع المعلمات للخلايا تغليف بأمان ، تم إنتاج كبسولات للحقن داخل العين.
الحقن داخل الفيثريفي العين الماوس يتطلب استخدام 27 G إبرة حادة الطرف (القطر الداخلي من 210 ميكرون) ونظام تسليم دقيق لحقن باستمرار حجم صغير المطلوبمن 1 μL. تم تأكيد حجم الكبسولات التي لم تتلف أثناء القذف من خلال إبرة 27 G عن طريق المجهر(الشكل 2A). وتم تحديد الحجم الأمثل لـ 150 ميكرومتر. تم إجراء الحقن داخل الفيتريال تحت الفحص البصري ، مما سمح بتصور الكبسولات في الجسم الزجاجي(الشكل 4A). وبالمثل ، تم إجراء التصوير أكتوبر ، مما أكد أن غالبية الكبسولات في الغرفة الزجاجي للفأرة كانت سليمة مع كميات صغيرة نسبيًا من الحطام(الشكل 4B). في متابعة التجارب المنشورة ، تم التأكيد على أن المنطق البيولوجي المطلوب كان موجودًا في العين بجرعات ذات صلة علاجية ، مما يثبط عملية المرض قيد التحقيق14. وأكدت هذه النتائج أن الخلايا المغلفة يمكن حقنها بأمان في عيون الماوس لتسليم على المدى الطويل من البيولوجية.
الشكل 1: أدوات عملية التغليف. ويشمل الإعداد (A) حقنة 3 مل ،(B)مرشحات 0.2 ميكرومتر ، (C)إبرة 30 G ، 1 /2 بوصة حادة الطرف ، (D)سائق حقنة إلكترونية ،(E)مولد الجهد العالي ،(F)إعداد النظام ، و (G)مسافة ثابتة 7 ملم بين طرف الإبرة وسطح محلول الهلام. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تغليف الخلية. (أ)كبسولات صغيرة مليئة بخلايا ARPE 19. (ب)القول المباشر/ الميت: يشير اللون الفلوري الأحمر إلى الخلايا الميتة، ويشير اللون الفلوري الأخضر [ب] إلى خلايا حية. (C)الخلايا المستزرعة بعد الانتعاش من microcapsules بدءا من مجموعة صغيرة تنمو إلى التقاء. أشرطة مقياس = 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: الإعداد الجراحي. يتم استخدام مجهر تشريح (1) مع كاميرا فيديو (2) لتصور الإجراء. يتم وزن الماوس (3) لإدارة الكمية المناسبة من التخدير ووضعها على منصة صغيرة (4) لتسهيل المناولة والحقن. تتمدد العيون مع الأتروبين الستيرياتيك والفينيل ادرينالين (5) ويتم الاحتفاظ بالرطوبة مع مواد التشحيم (6). ثقب ثقب دليل خارج أطرافه باستخدام إبرة 26 G (7). يتم وضع الحقنة الزجاجية (8) ، محملة بكبسولات مخففة بشكل مناسب (9) ، بزاوية 45 درجة إلى عين الماوس وتقدم من خلال ثقب الدليل ، باستخدام micromanipulator (10). يمكن تصور مسار الإبرة وكذلك الكبسولات التي يتم إصدارها [(11)؛ انظر الشكل 4]. عند التراجع عن الإبرة ، يتم ترطيب القرنية مع hypromellose (12) ومرهم المضادات الحيوية (13) المطبقة على موقع الحقن لتجنب العدوى. بعد الإجراء ، سيتم وضع الماوس على وسادة تدفئة 37 درجة مئوية ومراقبتها حتى مستيقظة تمامًا. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تكنولوجيا الخلايا المغلفة لتقديم ARPE-19 في العين. (أ)يتم تنفيذ الحقن باستخدام إبرة حادة 27 G تعلق على حقنة هاملتون. يمكن اتباع مسار الإبرة كما غيض من إبرة يدخل العين، وتجنب العدسة وكبسولات (رأس السهم) يمكن تصورها، تضخيمها من قبل النظام البصري للعين الماوس. تجدر الإشارة إلى أن انعكاس دائري لمصدر الضوء. (ب)يمكن تصوير كبسولات (رأس السهم) في الجسم الزجاجي باستخدام التصوير المقطعي التماسك البصري. أشرطة المقياس = 200 ميكرومتر. تمت إعادة طبع اللوحة B بإذن من أنامالاي وآخرين14يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هذه تقنية تغليف الخلية سريعة نسبيا وسهلة الأداء. ومع ذلك، يجب أن يوضع في الاعتبار بعض النقاط للحصول على نتائج دقيقة في المصب. وينبغي الحفاظ على الخلايا في الثقافة في طبق بيتري قبل التغليف وعقد في التقاء السليم. يجب إجراء التغليف في غطاء التهوية المناسب مع تدفق الهواء المنظم ، إذا كان ذلك ممكنًا. قوية جدا من التيار الجوي يمكن أن تؤثر على تشكيل كبسولة، وخاصة في التجارب على المدى الطويل. الأواني المعقمة والحلول ضرورية للحفاظ على المدى الطويل للخلايا داخل الكبسولة.
في الوقت الحاضر ، يستخدم تلطيخ الميت الحي كأداة تأكيدية لتحديد جدوى الخلايا داخل الكبسولات. كما يتم تحديد عدد الخلايا لكل كبسولة وفي ظل الحالة الحالية (أي عادة 12-20 خلية لكل كبسولة) بشكل بصري. يتم مراقبة صلاحية كل دفعة من دفعات الخلايا المغلفة بواسطة هذا الأسلوب. لمزيد من تحديد قابلية الخلايا للحياة، يتم حل الخلايا المغلفة وإعادة استزراعها. وهذا يدل على بقاء وسلامة الخلايا داخل الكبسولات، والتحقق من صحة التغليف الخلوي الناجح.
تم إنشاء المعلمات المستخدمة للتغليف الخلوي لهذا النوع من الخلايا. المعلمات المذكورة أعلاه هي تلك المستخدمة لتغليف خلايا ARPE 19 لهذه التجارب. معدل التدفق، تركيز الذبحة الصدرية، الجهد المطبق، والطلاء الثانوي للكبسولات كلها المتغيرات التي يمكن تعديلها للاستخدام المناسب للكبسولات. وبالمثل، فإن كمية الكبسولات المطلوبة لتجربة معينة تحتاج إلى تحديد إما تجريبيا أو استنادا إلى PK/ PD المعروفة من البيولوجية. من المهم أن تقوم دائمًا بإجراء تجارب التحكم المناسبة ، مع إضافة كبسولات فارغة للتحكم في وجود كبسولات وكبسولات محملة بخلايا ARPE-19 غير المصابة للتحكم في وجود عوامل مُفرزة. يمكن أيضًا نقل خلايا ARPE-19 بشكل ثابت بالبلازميد المسيطر ، حيث يبدو أن وجود عدد صغير من الكبسولات في الجسم الزجاجي الصغير للفأر (<10 μL) يغير فسيولوجيا العين الطبيعية. في هذا السياق ، من المهم معرفة سر خلايا APRE-19 تحت ظروف التغليف (وكذلك في وجود زجاجي في حالة مرض معين) ، حيث قد تتداخل البروتينات المفرزة مع فعالية البيولوجية قيد التحقيق.
وأخيرا، تم تنفيذ هذه التقنية لتوفير إثبات المبدأ للتسليم على المدى الطويل من مثبطات مكملة لعلاج AMD وتحسين الطريقة الحالية للحقن داخل الفيتيريال14. في المرحلة الحالية من التنمية، يتم حقن مثبطات مكملة في الزجاجي، وعادة باستخدام الحقن الشهرية. وهذا يشمل حقن عامل مكمل D منع مصباح الأجسام المضادة مصباح الليسيزوماب18, الذي فشل في المرحلة الثالثة التجارب السريرية للحد من تطور ضمور الجغرافية, أو عامل مكمل 3 مثبطAPL-219, وهو حاليا في المرحلة الثالثة التجارب السريرية.
يعوق الحقن داخل العين من الآثار الجانبية للحقن نفسه (أي خطر انفصال الشبكية، وارتفاع في الضغط داخل العين، التهاب الإنفثالميت، الخ). وبالإضافة إلى ذلك، سوف تختلف مستويات المخدرات بشكل كبير على مدار الشهر على الحقن الشهرية داخل الفيتيريال، ويمكن توقع ردود فعل مرتدة. كبديل, استراتيجيات العلاج الجيني ويجري وضع, مثل CD59 قابلة للذوبان تكملة مثبط20, الذي هو حاليا في المرحلة الأولى التجارب السريرية. تسمح الخلايا المغلفة أيضًا بالإنتاج المستمر للبيولوجيا لفترات طويلة من الزمن ويمكن إنهاؤها (أي إزالة الكبسولة) ، إذا لزم الأمر.
حتى الآن، لقد اختبرنا فقط لإنتاج البيولوجية على مدى ~ 6 أسابيع14. تجدر الإشارة إلى أن الطريقة الموصوفة هنا يجب أن تستخدم فقط لإثبات المبدأ في النماذج الحيوانية وليس للاستخدام في المرضى ، حيث أن كبسولات الذبحة ليست مستقرة بما فيه الكفاية لمنع التمزيق تمامًا أثناء الحقن ولا يتوقع أن تستمر أكثر من بضعة أسابيع. في المقابل، جهاز صلب مثل تلك التي وضعتها Neurotech يمكن أن تستمر لسنوات21 لتقديم العوامل المطلوبة22،23،24. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أيضًا دمج هذه التقنية الجديدة مع تسليم المخدرات المغلفة. وعموما، من المتوقع أن يتطور هذا المجال الناشئ بسرعة كاستراتيجية بديلة للحقن المتكرر لعلاجات العلاج الجيني.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ولا يعلن صاحبا البلاغ عن مصالح مالية متنافسة.
Acknowledgments
تم دعم الدراسة جزئيًا من خلال المنح المقدمة إلى B. R. من قبل المعاهد الوطنية للصحة (R01EY019320) ووزارة شؤون المحاربين القدامى (RX000444 و BX003050) ومؤسسة ولاية كارولينا الجنوبية الذكية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3 mL Syringe | BD | 309656 | |
| 30 G 1" Blunt needle | SAI Infusion technology | B30-100 | |
| Alginic acid sodium salt, from brown algae | Sigma | A0682 | |
| Atropine Sulfate Ophthalmolic solution (1%) | Akorn | NDC 17478-215-15 | for pupil dilation |
| BD 1 mL Syringe 26 G x 3/8 (0.45 mm x 10 mm) | Becton, Dickinson and Company | DG518105 500029609 REF 309625 | to generate the guide hole |
| Calcium chloride, Anhydrous, granular | Sigma | C1016 | |
| GenTeal Tears | Alcon | NDC 0078-0429-47 | to lubricate the eyes during anesthesia |
| Goniotaire: Hypromellose (2.5%) Ophthalmolic Demulcent Solution (Sterile) | Altaire Pharmaceuticals Inc. | NDC 59390-182-13 | to lubricate the eyes during anesthesia |
| Hamilton Needle/syringe Tip: 27 G, Small Hub RN NDL, custum length (12 mm), point style 3, 6/PK | Hamilton | 7803-01 | for intravitreal delivery of capsules |
| Hamilton Syringe: 2.5 µL, Model 62 RN SYR, NDL Sold Separately | Hamilton | 7632-01 | for intravitreal delivery of capsules |
| HEPES buffer, 1 M | Fisher Bioreagents | BP299100 | |
| High voltage generator | ESD EMC Technology | ES813-D20 | |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit | Thermofisher Scientific | L3224 | |
| L-Ornithine hydrochloride, 99% | Alfa Aesar | A12111 | |
| Neomycin and Polymyxin B Sulfates and Dexamethasone Ophthalmolic Ointment | SANDOZ | NDC 61314-631-36 | antibiotic to prevent infection after intravitreal injection |
| Phenolephrine Hydrochloride Ophthalmolic Solution (2.5%) | Akorn | NDC 17478-201-15 | for pupil dilation |
| Sodium Chloride | Sigma | S-5886 | |
| Sterile syringe filters, 0.2 μm | VWR | 28143-312 | |
| Syringe pump | GRASEBY | MS16A |
References
- Allen, T. M., Cullis, P. R. Drug delivery systems: entering the mainstream. Science. 303 (5665), 1818-1822 (2004).
- Tonnesen, H. H., Karlsen, J. Alginate in drug delivery systems. Drug Development and Industrial Pharmacy. 28 (6), 621-630 (2002).
- Vilos, C., Velasquez, L. A. Therapeutic strategies based on polymeric microparticles. Journal of Biomedical Biotechnology. 672760, (2012).
- Gasperini, L., Mano, J. F., Reis, R. L. Natural polymers for the microencapsulation of cells. Journal of the Royal Society Interface. 11 (100), 20140817 (2014).
- Gasper, D. P. R. Novel strategy to produce a drug delivery system for skin regeneration. Uma nova estratégia para produzir um dispositivo para entrega de fármacos que será usado na regeneração da pele. , (2012).
- Huang, S., Fu, X. Naturally derived materials-based cell and drug delivery systems in skin regeneration. Journal of Controlled Release. 142 (2), 149-159 (2010).
- Nograles, N., Abdullah, S., Shamsudin, M. N., Billa, N., Rosli, R. Formation and characterization of pDNA-loaded alginate microspheres for oral administration in mice. Journal of Bioscience and Bioengineering. 113 (2), 133-140 (2012).
- Moore, K., Amos, J., Davis, J., Gourdie, R., Potts, J. D. Characterization of polymeric microcapsules containing a low molecular weight peptide for controlled release. Microscopy and Microanalysis. 19 (1), 213-226 (2013).
- Xu, Y., Skotak, M., Hanna, M. Electrospray encapsulation of water-soluble protein with polylactide. I. Effects of formulations and process on morphology and particle size. Journal of Microencapsulation. 23 (1), 69-78 (2006).
- Gryshkov, O., et al. Process engineering of high voltage alginate encapsulation of mesenchymal stem cells. Materials Science and Engineering: C. 36, 77-83 (2014).
- Thanos, C. G., et al. Sustained secretion of ciliary neurotrophic factor to the vitreous, using the encapsulated cell therapy-based NT-501 intraocular device. Tissue Engineering. (11-12), 1617-1622 (2004).
- Kauper, K., et al. Two-year intraocular delivery of ciliary neurotrophic factor by encapsulated cell technology implants in patients with chronic retinal degenerative diseases. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (12), 7484-7491 (2012).
- Kauper, K., et al. Long term, sustained intraocular delivery of a VEGF antagonist using encapsulated cell technology implant for the treatment of choroidal neovascular diseases. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53, 455 (2012).
- Annamalai, B., et al. Encapsulated Cell Technology-Based Delivery of a Complement Inhibitor Reduces Choroidal Neovascularization in a Mouse Model. Translational Visual Science Technology. 7 (2), 3 (2018).
- Alge, C. S., et al. Retinal Pigment Epithelium Is Protected Against Apoptosis by αB-Crystallin. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 43 (11), 3575-3582 (2002).
- Chiu, K., Chang, R. C., So, K. F. Intravitreous injection for establishing ocular diseases model. Journal of Visualized Experiments. (8), 313 (2007).
- Jove Science Education Database. Lab Animal Research. Anesthesia Induction and Maintenance. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
- Holz, F. G., et al. Efficacy and Safety of Lampalizumab for Geographic Atrophy Due to Age-Related Macular Degeneration: Chroma and Spectri Phase 3 Randomized Clinical Trials. JAMA Ophthalmology. 136 (6), 666-677 (2018).
- Kassa, E., Ciulla, T. A., Hussain, R. M., Dugel, P. U. Complement inhibition as a therapeutic strategy in retinal disorders. Expert Opinion in Biological Therapy. 19 (4), 335-342 (2019).
- Cashman, S. M., Ramo, K., Kumar-Singh, R. A Non Membrane-Targeted Human Soluble CD59 Attenuates Choroidal Neovascularization in a Model of Age Related Macular Degeneration. PLoS ONE. 6 (4), e19078 (2011).
- Vincent, L., et al. Generation of combination PDGF / VEGF-antagonist ECT devices. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54, 3290 (2013).
- Zhang, K., et al. Ciliary neurotrophic factor delivered by encapsulated cell intraocular implants for treatment of geographic atrophy in age-related macular degeneration. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (15), 6241-6245 (2011).
- Chew, E. Y., et al. Ciliary neurotrophic factor for macular telangiectasia type 2: results from a phase 1 safety trial. American Journal of Ophthalmology. 159 (4), 659-666 (2015).
- Birch, D. G., et al. Randomized trial of ciliary neurotrophic factor delivered by encapsulated cell intraocular implants for retinitis pigmentosa. American Journal of Ophthalmology. 156 (2), 283-292 (2013).
