Summary
Présenté ici est un protocole pour l’utilisation de l’alginate comme un polymère dans la microencapsulation des cellules immortalisées pour la livraison à long terme des produits biologiques aux yeux de rongeur.
Abstract
Beaucoup de thérapies actuelles en cours de développement pour les maladies du pôle postérieur de l’œil sont des produits biologiques. Ces médicaments doivent être administrés fréquemment, généralement par injections intravitréennes. Les cellules encapsulées exprimant le produit biologique de choix deviennent un outil de production et de libération de protéines locales (p. ex., par l’entremise de l’administration de médicaments à long terme). En outre, les systèmes d’encapsulation utilisent des matériaux perméables qui permettent la diffusion de nutriments, de déchets et de facteurs thérapeutiques dans et hors des cellules. Cela se produit tout en masquant les cellules de la réponse immunitaire de l’hôte, en évitant la nécessité de la suppression du système immunitaire hôte. Ce protocole décrit l’utilisation de l’alginate comme polymère dans la microencapsulation couplée à la méthode d’électrospray comme technique de microencapsulation. Les cellules ARPE-19, une lignée de cellules humaines de RPE qui se produisent spontanément, ont été utilisées dans des expériences de thérapie cellulaire à long terme en raison de sa fonctionnalité de vie, et il est utilisé ici pour l’encapsulation et la livraison des capsules aux yeux de souris. Le manuscrit résume les étapes de la microencapsulation cellulaire, du contrôle de la qualité et de la livraison oculaire.
Introduction
Les thérapies à base de cellules représentent des techniques biologiques révolutionnaires qui ont été largement appliquées en médecine. Récemment, ils ont été appliqués avec succès dans le traitement des maladies neurodégénératives, des maladies oculaires et du cancer. Les thérapies cellulaires couvrent un large éventail de domaines allant du remplacement cellulaire à l’administration de médicaments, et ce protocole se concentre sur ce dernier. Les microcapsules alginate biodégradables (MC) ont montré leur efficacité en tant que système d’administration, et elles sont de plus en plus largement utilisées dans le domaine biomédical. L’alginate a été utilisé en microencapsulation en raison de son processus de gélification simple, biodégradabilité, excellente biocompatibilité, et la stabilité dans des conditions in vivo1,2,3,4.
La méthode de l’électrospray, en tant que technique de microencapsulation, a été utilisée avec succès pour encapsuler les peptides et les protéines à l’aide d’alginate (polymère de base) et de poly-l-ornithine (polymère de revêtement secondaire). Les deux polymères sont naturellement trouvés et utilisés pour leur biocompatibilité5,6,7. Cependant, le principal défi dans les thérapies à base de cellules est la suppression du système immunitaire hôte pour éviter les effets secondaires causés par les médicaments immunosuppresseurs. La perméabilité des microcapsules alginées est considérée comme une propriété appropriée pour l’encapsulation cellulaire, qui permet la diffusion de nutriments, de déchets et de facteurs thérapeutiques dans et hors des cellules tout en les masquant de la réponse immunitaire hôte8,9,10.
Dans l’œil, des cellules encapsulées ont été utilisées dans des essais cliniques pour l’administration constante de produits biologiques (c.-à-d. les facteurs de croissance11,12 et les antagonistes du facteur de croissance13) pour le traitement de la rétinite pigmentaire ou de la dégénérescence maculaire liée à l’âge. D’autres cibles telles que les inhibiteurs de complément14 sont également actuellement explorées dans des contextes précliniques.
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Protocol
Toutes les expériences ont été effectuées conformément à l’Énoncé ARVO pour l’utilisation des animaux dans la recherche ophtalmique et de la recherche sur la vision et ont été approuvées par le Medical University of South Carolina Animal Care and Use Committee en vertu du protocole ID 00399.
1. Culture cellulaire
- Générer des cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes humaines (ARPE-19) lignée cellulaire exprimant de façon stable le gène de choix selon les protocoles publiés14,15.
- Maintenir les cellules dans le medium d’aigle modifié (DMEM) de Dulbecco complété par 10 % de sérum bovin fœtal (FBS).
- Incuber les cellules à 37 oC et 5% DE CO2.
- Remplacer le milieu tous les 2 à 3 jours.
- Passer les cellules après avoir atteint 70%-80% confluence en utilisant des procédures de culture tissulaire standard.
2. Encapsulation cellulaire
- Mélanger l’alginate de sodium avec de l’eau déionisée (DI) pour une concentration finale de 2 % w/v et purifier par filtration avec un filtre à seringue stérile de 0,2 m.
- Préparer les cellules à être mélangées avec la solution alginate en trypsinisant, centrifugant, et en les lavant avec 10 mM HEPES solution saline tamponnée (pH - 7,4). À l’aide d’un hémocytomètre, comptez les cellules et ajustez la concentration de cellules finales à 1 x 106 dans la solution alginate.
REMARQUE: Le processus d’encapsulation doit être exécuté à l’intérieur d’une hotte stérilisée. - Chargez les aliquots d’alginate et de cellules de 3 ml et attachez-le à une pompe à seringues. La solution sera pompée à travers une aiguille de pointe émoussée de 30 G à un bain de gélifiant stérile placé dans un bécher stérile de 50 ml sous la pointe de la seringue à 7 mm pour une distance de pulvérisation d’aiguille à la baignoire.
- Le bain gélifié contient un volume de 40 ml de saline tampon HEPES de 10 mM contenant 100 mM de chlorure de calcium (CaCl2) et 0,5 % w/v poly-L-ornithine (OLP). L’OLP est un revêtement polymère secondaire qui peut être omis ou modifié en fonction des besoins de l’enquêteur.
- Ajustez la tension et le débit et maintenez-les constants pendant le processus d’encapsulation à un débit de 60 mm/h et une tension initiale de 6,0 kV pour produire des microcapsules de 150 m.
- Connectez le clip de fil d’anode (rouge) d’une pointe d’aiguille de générateur à haute tension à l’aiguille et connectez le coup de sol (noir) au fil de cuivre qui est à mi-chemin immergé dans le bain de gélification. Un lot du mélange alginate et cellulaire (1 ml) prend environ 30 minutes pour préparer les cellules encapsulées (environ 25 000 microcapsules).
- Laver les microcapsules formées contenant des cellules avec une solution de lavage (10 mM HEPES saline tamponnée contenant 1,5 mM CaCl2, pH - 7,4) deux fois. N’utilisez pas PBS pour le lavage.
- Incuber les cellules encapsulées avec 10% FBS complété DMEM médias dans un incubateur humidifié à 37 oC et 5% DE CO2.
REMARQUE: Les instruments de processus d’encapsulation sont représentés dans la figure 1.
3. Confirmation que l’encapsulation n’affecte pas la viabilité cellulaire
- Après avoir incubé les cellules encapsulées pendant 24 h dans les médias, préparer un petit échantillon de 500 L (30 microcapsules) pour la coloration.
- Laver les microcapsules 2x à l’aide d’une solution de lavage (10 mM HEPES saline tamponnée contenant 1,5 mM CaCl2) et les tacher pour la viabilité des morts-vivants à l’aide d’un kit d’essai vivant/mort.
- Préparer un mélange de colorants de calcéine AM (acétyoxymethyl) et d’éthidium homodimer-1 à des concentrations finales de 2 M et 4 m, respectivement.
- Ajouter 2 ml du mélange de coloration aux cellules encapsulées et incuber pendant 30 à 45 minutes dans l’obscurité à température ambiante (RT).
- Avec une aspiration prudente, aspirez la solution de coloration et lavez les microcapsules 2x avec la solution de lavage. Utilisez un système de microscope fluorescent pour observer et imager les cellules encapsulées.
REMARQUE: La documentation de l’encapsulation est représentée dans la figure 2.
4. Confirmation que les capsules sont la taille appropriée pour la livraison et la livraison de la
- Les injections intravitréales dans un œil de souris sont généralement effectuées avec une aiguille à pointe émoussée de 27 G (diamètre intérieur de 210 m) attachée à une seringue Hamilton de 2,5 L.
- Générez des capsules allant de 100 à 200 m, diluez-les dans des supports sans sérum et tirez-les soigneusement vers le haut dans la seringue de Hamilton. PBS n’est pas un véhicule approprié, car les capsules d’alginate se dissolvent dans PBS.
- Éjectez lentement des gouttes de 1 L contenant des capsules sur une glissière de microscope et déterminez leur intégrité à l’aide d’un microscope à champ lumineux droit.
- Ajuster la taille de la capsule (voir étape 2.3) en ajustant la tension et le débit en conséquence. Les microcapsules plus petites sont produites de façon non linéaire en augmentant la tension et en diminuant légèrement le débit8. Dans nos mains, des capsules de 150 m de diamètre se sont avérées les plus appropriées. L’ajustement de la taille de la capsule dépend également du maintien de la concentration alginate constante tout en changeant les autres paramètres.
- Maintenir un ensemble séparé de cellules dans des capsules de la taille appropriée dans le milieu sans sérum pour déterminer la quantité de sécrétion du biologique désiré. Utilisez des ELISA sensibles ou des ballonnements occidentaux pour déterminer la concentration des produits biologiques dans le supernatant.
- Déterminer la quantité requise de capsules qui doivent être injectées en fonction du PK/PD connu (pharmacocinétique/pharmacodynamique) de la thérapeutique. Dans nos mains, 10 capsules par œil de souris se sont avérées les plus efficaces.
5. Livraison de capsule dans la souris Vitous
- Effectuez des injections intravitréales à l’aide d’un microscope disséquant. Voir la figure 3 pour l’adion chirurgicale et les matériaux utilisés pendant l’intervention. Un protocole détaillé pour les injections intravitrées peut être trouvé ailleurs16.
- Anesthésiez les souris par injection intrapétoninenelle de xylazine et de kétamine (20 mg/kg et 80 mg/kg) ou d’autres anesthésiques préférés approuvés par le Comité de soins et d’utilisation des animaux de l’établissement spécifique. Assurer la profondeur appropriée de l’anesthésie à l’aide d’une pincéed’ateil 17.
- Dilater les pupilles de souris avec la phényléphrine HCL (2.5%) et le sulfate d’atropine (1%) pour permettre une bonne visibilité de la chambre vitrée et appliquer un gel pour les yeux lubrifiant aux yeux pour les garder hydratés pendant la procédure.
- Perforez la sclérose au limbe avec une aiguille de 26 G comme trou de guidage, en s’assurant que 1) l’aiguille est à un angle de 45 degrés avec l’œil et la table et 2) la pointe biseautée est pointée vers le haut pour éviter de perforer la lentille.
- Injectez soigneusement les capsules à l’aide d’une aiguille à pointe émoussée de 27 G fixée à une seringue Hamilton à un angle de 45 degrés sous inspection visuelle, en veillant à éviter de toucher l’aiguille à la lentille. Une blessure de la lentille entraînera une formation de cataracte. Les capsules doivent être visibles dans le vitré à l’aide du microscope disséquant(figure 4A).
- Après la rétraction de l’aiguille, traiter le site d’injection avec des onguents antibiotiques néomycine et polymyxine B sulfates en plus de la pommade antibiotique ophtalmique dexaméthasone.
- Appliquer la solution ophtalmique goniotaire hypromellose (2,5 %) aux deux yeux pour empêcher les cornées de se dessécher pendant la période de récupération.
- Placer la souris sur un coussin chauffant maintenu à 37oC et surveiller jusqu’à ce qu’elle soit complètement éveillée.
- Une injection réussie de cellules ARPE-19 encapsulées devrait révéler la présence de capsules intactes dans la chambre vitrée de la souris avec seulement des quantités mineures de débris lors de l’imagerie de l’œil par tomographie de cohérence optique ou d’autres méthodes(figure 4B).
- L’œil de souris injecté, après quelques jours de récupération en raison de la chirurgie, est maintenant prêt pour le paradigme expérimental à portée de main.
REMARQUE: L’agle-up chirurgical et la documentation des capsules dans l’œil sont représentés respectivement dans la figure 3 et la figure 4.
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Representative Results
Les cellules ARPE-19 sont une lignée cellulaire humaine de RPE spontanément immortalisée qui s’est avérée favorable à l’encapsulation et à la survie à long terme lors de l’implantation de capsules dans l’œil. Les outils d’encapsulation alginate sont indiqués à la figure 1. Dans cette étude, il a été démontré qu’encapsulation dans l’alginate, les cellules des capsules d’alginate ont été confirmées par l’imagerie à champ lumineux(figure 2A). Des essais morts-vivants ont été effectués sur les cellules à l’intérieur des capsules, démontrant une viabilité de 90 % après l’encapsulation(figure 2B). Afin d’assurer la viabilité à long terme des cellules à l’intérieur des capsules, les capsules ont été dissoutes dans le citrate de sodium et les cellules ont ensuite été réécortrées(figure 2C). Après avoir confirmé dans des expériences indépendantes que les cellules d’ARPE-19 transfected stables ont exprimé et sécrété le produit biologique qui était désiré14, et après avoir établi les paramètres pour les cellules encapsulantes en toute sécurité, des capsules ont été produites pour l’injection intraoculaire.
Les injections intravitréennes dans l’œil de la souris nécessitent l’utilisation d’une aiguille à pointe émoussée de 27 G (diamètre intérieur de 210 m) et d’un système de livraison précis pour injecter systématiquement le petit volume requis de 1 ll. La taille des capsules qui n’ont pas été endommagées lors de l’éjection par l’aiguille de 27 G a été confirmée par microscopie(figure 2A). Une taille optimale de 150 m a été identifiée. L’injection intravitréenne a été effectuée sous inspection visuelle, ce qui a permis la visualisation de capsules dans le vitré (figure 4A). De même, l’imagerie OCT a été effectuée, ce qui a confirmé qu’une majorité de capsules dans la chambre vitrée de la souris étaient intactes avec des quantités relativement mineures de débris(figure 4B). Dans les expériences publiées de suivi, il a été confirmé que le produit biologique désiré était présent dans l’oeil aux doses thérapeutiquement pertinentes, inhibant le processus de la maladie à l’étude14. Ces résultats ont confirmé que les cellules encapsulées peuvent être injectées en toute sécurité dans les yeux de souris pour la livraison à long terme des produits biologiques.
Figure 1 : Instruments de processus d’encapsulation. La configuration comprend (A) une seringue de 3 ml, (B) 0,2 m filtres, (C) une aiguille de 30 G, 1/2 pouce à pointe émoussée, (D) un conducteur de seringue électronique, (E) un générateur à haute tension, (F) le système mis en place, et (G) une distance fixe de 7 mm entre la pointe d’aiguille et la surface de gelling. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Encapsulation cellulaire. (A) Microcapsules remplies de cellules ARPE 19. (B) Live/ dead assay: [a] rouge couleur fluorescente indique les cellules mortes, et [b] la couleur fluorescente verte indique les cellules vivantes. (C) Cellules cultivées après récupération des microcapsules commençant par un petit groupe se développant à la confluence. Barres d’échelle à 100 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Mise en place chirurgicale. Un microscope disséquant (1) avec une caméra vidéo (2) est utilisé pour visualiser la procédure. La souris est pesée (3) pour administrer la quantité appropriée d’anesthésique et placée sur une petite plate-forme (4) pour faciliter la manipulation et l’injection. Les yeux sont dilatés avec l’atropine et la phénylépinephrine (5) et sont hydratés avec du lubrifiant (6). Un trou de guide est perforé juste à l’extérieur du limbe à l’aide d’une aiguille de 26 G (7). La seringue en verre (8), chargée de capsules diluées appropriées (9), est placée à un angle de 45 degrés à l’œil de la souris et avancée à travers le trou de guidage, à l’aide d’un micromanipulateur (10). La piste d’aiguille ainsi que les capsules libérées peuvent être visualisées [(11); voir la figure 4]. Lors de la rétraction de l’aiguille, la cornée est humidifiée avec de l’hypromellose (12) et la pommade antibiotique (13) appliquée sur le site d’injection pour éviter l’infection. Après la procédure, la souris sera placée sur un coussin chauffant de 37 oC et surveillée jusqu’à ce qu’elle soit complètement éveillée. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Technologie cellulaire encapsulée pour livrer ARPE-19 dans l’œil. (A) Les injections sont effectuées à l’aide d’une aiguille émoussée de 27 G attachée à une seringue Hamilton. La piste d’aiguille peut être suivie lorsque le bout de l’aiguille pénètre dans l’œil, évitant la lentille et les capsules (pointe de flèche) peuvent être visualisées, amplifiées par le système optique de l’œil de la souris. Il convient de noter que le reflet circulaire de la source lumineuse. (B) Capsules (pointe de flèche) peut être illustrée dans le vitré à l’aide de la tomographie de cohérence optique. Barres d’échelle de 200 m. Le panneau B a été réimprimé avec la permission d’Annamalai et coll.14S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Cette technique d’encapsulation cellulaire est relativement rapide et facile à exécuter; toutefois, il faut garder certains points à l’esprit pour obtenir des résultats précis en aval. Les cellules doivent être maintenues en culture dans un plat Petri avant l’encapsulation et maintenues à la confluence appropriée. L’encapsulation doit être effectuée dans un capot de ventilation approprié avec le flux d’air réglementé, si possible. Un courant d’air trop fort peut affecter la formation de capsules, en particulier dans les expériences à long terme. Les ustensiles et les solutions sont essentiels pour l’entretien à long terme des cellules dans la capsule.
À l’heure actuelle, la coloration vivante est utilisée comme outil de confirmation pour déterminer la viabilité des cellules dans les capsules. Le nombre de cellules par capsule et dans l’état actuel (c.-à-d. normalement 12 à 20 cellules par capsule) est également déterminé visuellement. La viabilité de chaque lot de lots cellulaires encapsulés est surveillée par cette méthode. Pour déterminer plus en détail la viabilité des cellules, les cellules encapsulées sont dissoutes et re-cultivées. Ceci démontre en outre la viabilité et l’intégrité des cellules dans les capsules, validant l’encapsulation cellulaire réussie.
Les paramètres utilisés pour l’encapsulation cellulaire ont été établis pour ce type de cellule particulier. Les paramètres indiqués ci-dessus sont ceux utilisés pour l’encapsulation des cellules ARPE 19 pour ces expériences. Le débit, la concentration d’alginate, la tension appliquée et le revêtement secondaire des capsules sont autant de variables qui peuvent être ajustées pour une utilisation appropriée des capsules. De même, la quantité de capsules requises pour une expérience donnée doit être déterminée empiriquement ou basée sur le PK/PD connu des produits biologiques. Il est important de toujours effectuer des expériences de contrôle appropriées, en ajoutant des capsules vides pour contrôler la présence des capsules et des capsules chargées de cellules ARPE-19 non transfectedes pour contrôler la présence de facteurs sécrétés. Les cellules ARPE-19 peuvent également être transphylomées par un plasmide témoin, car la présence même d’un petit nombre de capsules dans la petite vitreuse de la souris (lt;10 l) semble altérer la physiologie normale de l’œil. Dans ce contexte, il est important de connaître le sécréome des cellules APRE-19 dans des conditions d’encapsulation (ainsi que dans la présence de vitreux dans une maladie particulière), car les protéines sécrétées peuvent interférer avec l’efficacité du biologique à l’étude.
Enfin, cette technique a été mise en œuvre pour fournir une preuve de principe pour la livraison à long terme d’inhibiteurs de complément pour le traitement de la DMLA et pour améliorer la méthode actuelle d’injections intravitréales14. Au stade actuel du développement, les inhibiteurs de complément sont injectés dans le vitré, généralement en utilisant des injections mensuelles. Cela comprend l’injection du facteur de complément D bloquant l’anticorps lampalizumab18, qui a échoué dans un essai clinique de phase III pour réduire la progression de l’atrophie géographique, ou le facteur de complément 3 inhibiteur APL-219, qui est actuellement dans un essai clinique de phase III.
L’injection intravitréenne est entravée par les effets secondaires de l’injection elle-même (c.-à-d. le risque de décollement rétinien, augmentation de la pression intraoculaire, endophtalmite, etc.). En outre, les niveaux de médicaments varieront considérablement au cours du mois sur les injections intravitréennes mensuelles, et des réactions de rebond peuvent être attendues. Comme alternative, des stratégies de thérapie génique sont en cours d’élaboration, comme l’inhibiteur soluble de complément CD5920, qui est actuellement dans un essai clinique de phase I. Les cellules encapsulées permettent également la production continue d’un produit biologique pendant de longues périodes de temps et peuvent être terminées (c.-à-d. l’explanète de la capsule), si nécessaire.
À ce jour, nous n’avons testé que pour la production d’un produit biologique au cours de 6 semaines14. Il convient de noter que la méthode décrite ici ne devrait être utilisée que pour la preuve de principe dans les modèles animaux et non pour une utilisation chez les patients, car les capsules d’alginate ne sont pas suffisamment stables pour empêcher complètement le déchiquetage pendant l’injection et ne devraient pas durer plus de quelques semaines. En revanche, un dispositif solide tel que celui développé par Neurotech peut durer pendant des années21 pour fournir les facteurs requis22,23,24. En outre, cette nouvelle technique peut également être combinée avec l’administration de médicaments encapsulés. Dans l’ensemble, on s’attend à ce que ce domaine émergent se développe rapidement comme stratégie alternative pour les injections répétées de thérapies géniques.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.
Acknowledgments
L’étude a été appuyée en partie par des subventions accordées à B. R. par les National Institutes of Health (R01EY019320), le ministère des Anciens Combattants (RX0004444 et BX003050) et la South Carolina SmartState Endowment.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3 mL Syringe | BD | 309656 | |
| 30 G 1" Blunt needle | SAI Infusion technology | B30-100 | |
| Alginic acid sodium salt, from brown algae | Sigma | A0682 | |
| Atropine Sulfate Ophthalmolic solution (1%) | Akorn | NDC 17478-215-15 | for pupil dilation |
| BD 1 mL Syringe 26 G x 3/8 (0.45 mm x 10 mm) | Becton, Dickinson and Company | DG518105 500029609 REF 309625 | to generate the guide hole |
| Calcium chloride, Anhydrous, granular | Sigma | C1016 | |
| GenTeal Tears | Alcon | NDC 0078-0429-47 | to lubricate the eyes during anesthesia |
| Goniotaire: Hypromellose (2.5%) Ophthalmolic Demulcent Solution (Sterile) | Altaire Pharmaceuticals Inc. | NDC 59390-182-13 | to lubricate the eyes during anesthesia |
| Hamilton Needle/syringe Tip: 27 G, Small Hub RN NDL, custum length (12 mm), point style 3, 6/PK | Hamilton | 7803-01 | for intravitreal delivery of capsules |
| Hamilton Syringe: 2.5 µL, Model 62 RN SYR, NDL Sold Separately | Hamilton | 7632-01 | for intravitreal delivery of capsules |
| HEPES buffer, 1 M | Fisher Bioreagents | BP299100 | |
| High voltage generator | ESD EMC Technology | ES813-D20 | |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit | Thermofisher Scientific | L3224 | |
| L-Ornithine hydrochloride, 99% | Alfa Aesar | A12111 | |
| Neomycin and Polymyxin B Sulfates and Dexamethasone Ophthalmolic Ointment | SANDOZ | NDC 61314-631-36 | antibiotic to prevent infection after intravitreal injection |
| Phenolephrine Hydrochloride Ophthalmolic Solution (2.5%) | Akorn | NDC 17478-201-15 | for pupil dilation |
| Sodium Chloride | Sigma | S-5886 | |
| Sterile syringe filters, 0.2 μm | VWR | 28143-312 | |
| Syringe pump | GRASEBY | MS16A |
References
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